Caracterização microbiológica de sumos e néctares de fruta ao longo do processo de fabrico e validação dos processos térmicos. Engenharia Biológica

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1 Caracterização microbiológica de sumos e néctares de fruta ao longo do processo de fabrico e validação dos processos térmicos Sofia Santos Paredes Quartin de Macedo Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Biológica Orientadores: Prof. Marília Clemente Velez Mateus Eng. Marina Isabel de Castanheira Torre Marques Júri Presidente: Prof. Jorge Humberto Gomes Leitão Orientador: Eng. Marina Isabel de Castanheira Torre Marques Vogal: Prof. Ana Cristina Anjinho Madeira Viegas Outubro 2016

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3 AGRADECIMENTOS Primeiramente, agradeço à minha orientadora, Engenheira Marina Marques por ter aceite orientar o meu estágio e principalmente pelo apoio e amizade demonstrado ao longo do mesmo, pela supervisão e partilha de conhecimento na realização deste trabalho. À Engenheira Ana Martinho pelo acompanhamento e ajuda na área técnica e por toda a disponibilidade. À Professora Marília Mateus por toda a ajuda e orientação prestadas ao longo destes meses. Um especial agradecimento aos colaboradores da empresa Sumol+Compal Marcas, S.A pelo bom ambiente proporcionado e pelo acolhimento e contribuição para o desenvolvimento do meu trabalho, nomeadamente às colegas do Laboratório de Microbiologia, Sónia Soares e Paula Matos, pelo acompanhamento diário e amizade. Também aos colaboradores da secção de Formulações pela recolha de todas as amostras fundamentais para o meu trabalho, em especial ao Nuno D Almeida pelo maior esforço e dedicação e todos os momentos de convívio. À Carmo Aragão pela companhia nestes meses e pela discussão de ideias que ajudaram a ultrapassar fases de maior dificuldade no desenvolvimento da dissertação. Aos amigos e colegas, da geração 2011, pelo companheirismo, esforço e apoio nestes 5 anos, pois sem eles teria sido mais difícil ultrapassar os obstáculos que se atravessaram neste caminho. Por fim, endereço o meu maior agradecimento aos meus pais e avós pelas palavras de força, amor, carinho e incentivo e por todo o apoio com o qual sempre pude contar ao longo deste percurso. Também ao meu irmão por todos estes motivos e pela ajuda e conselhos nesta dissertação. iii

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5 RESUMO Na indústria dos sumos e néctares de fruta, o processo térmico de conservação procura conciliar a preservação das propriedades organoléticas dos produtos com a inativação dos microrganismos e enzimas capazes de os degradar. Nesta dissertação foi avaliada a adequabilidade do processo de pasteurização dos sumos de fruta da linha Tetra Pak da fábrica de Almeirim da Sumol+Compal Marcas, S.A face à contaminação inicial detetada. Foi estudada a flora microbiana das matérias primas e do produto antes de pasteurizado e aplicadas ferramentas de cálculo da cinética de destruição térmica dos microrganismos identificados. Os resultados foram comparados com análises do respetivo produto acabado. Os dados obtidos permitiram concluir que as condições de temperatura e tempo utilizadas na pasteurização são válidas no sentido em que a modelação aplicada prevê a inativação de todas as células vegetativas de bactérias, leveduras e bolores, facto que é comprovado pela análise do produto acabado. Adicionalmente, apesar da presença de bolores termorresistentes e do modelo de cinética de destruição dos mesmos indicar a sua sobrevivência e prever a contaminação de todas as embalagens de produto acabado, a amostragem não detetou qualquer contaminação, o que indicou uma falha na modelação. Os microrganismos resistentes ao processo, esporos de bactérias aeróbias e acidófilas, apesar de sobreviverem às condições de pasteurização, demonstraram uma incapacidade de desenvolvimento na matriz dos sumos estudados, impossibilitando a sua deterioração. Todas as observações referidas permitiram concluir que existe uma esterilidade comercial nos produtos, o que valida o processo térmico em utilização nesta indústria de sumos e néctares. Palavras-chave: pasteurização, contaminação inicial, cinética de destruição térmica, esterilidade comercial v

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7 ABSTRACT In the juices and nectars industry, the thermal preservation process conciliates the preservation of the organoleptic properties of the products and the inactivation microorganisms and enzymes capable of deteriorate them. During this work, the adequacy of the pasteurization process of the fruit juices produced at the Tetra Pak production lines at the Almeirim plant of Sumol+Compal Marcas S.A, was evaluated, regarding their initial contamination. The microbial flora of the raw materials and product before pasteurization was studied and a model of the thermal destruction kinetics of the identified microorganisms applied. These results were compared with the final product analysis. The model predicted a total inactivation of the vegetative cells of the bacteria, yeast and molds identified in the raw materials and products before pasteurization. Examination of the collected data allowed to conclude that the time-temperature profiles of the process are adequate for the inactivation of these microorganisms, since the final product analysis confirmed their inexistence. Furthermore, the final product sampling showed a total absence of the heat-resistant molds found before pasteurization. This observation indicates a flaw in the model that predicted the heatresistant molds spores survival and total contamination of the final product packages. Some microorganisms, including spores from aerobic and acidophilic bacteria, showed resistance to the process. However, their incapacity to develop in the matrix of the juices studied guarantees they do not deteriorate the product. The mentioned observations allowed to conclude that the products studied are commercially sterile, which authenticates the thermal process presently used in this factory. Keywords: pasteurization, initial contamination, thermal destructions kinetics, commercial sterility vii

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9 ÍNDICE Agradecimentos... iii Resumo...v Abstract... vii Índice de tabelas... xi Índice de figuras... xix Lista de abreviaturas... xx 1. Enquadramento e objetivos Revisão da literatura Introdução Microbiologia da fruta e dos sumos/néctares de fruta Bactérias Endósporos bacterianos Fungos Curva de crescimento de microrganismos Fatores que afetam o crescimento microbiano Métodos de preservação dos sumos de fruta Pasteurização Modelação da morte térmica dos microrganismos Valores de D e z característicos de microrganismos de interesse Descrição do processo de produção de bebidas na S+C Materiais e métodos Produtos em estudo Colheita de amostras Análises microbiológicas Determinação da contaminação em teores totais Determinação da contaminação em bolores e leveduras Determinação da contaminação em esporos de bactérias aeróbias Determinação da contaminação em esporos de bactérias acidófilas Determinação da contaminação em esporos de bolores termorresistentes Teste de esterilidade... 29

10 3.4. Identificação microbiológica Coloração de Gram Teste da oxidase Teste da catalase API Estudo do crescimento de ACB em Compal 100% Maçã e da produção de guaiacol Estudo da influência da matriz no crescimento de ACB Estudo da influência da pasteurização no crescimento de ACB Estudo da influência da contaminação de ACB na produção de guaiacol Resultados e discussão Caracterização microbiológica das matérias-primas, produto formulado e produto final Compal Clássico Laranja Algarve Compal Vital Frutos Vermelhos Um Bongo Morango Compal Clássico Pera Rocha Compal 100% Laranja Compal 100% Maçã Estudo do crescimento do ACB e produção de guaiacol no produto Compal 100% Maçã Conclusões e perspetivas futuras Referências Bibliográficas Bibliografia Webgrafia Procedimentos internos da S+C Anexos... I Anexo 1. Resultados das análises microbiológicas realizadas aos diversos produtos em UFC/ml... I Anexo 2. Modelação da resistência térmica de alguns dos microrganismos identificados...xvii

11 ÍNDICE DE TABELAS Tabela 1 - Gama de temperatura e ph de crescimento de algumas espécies do género Bacillus (ii)(14) Tabela 2 - Exemplos de frutas e sumos de fruta e respetivos valores de atividade de água (30) Tabela 3 - Caracterização dos microrganismos em função da sua temperatura de crescimento, com indicação do intervalo de temperatura ótimo e temperaturas mínima e máxima de crescimento (2)(26) Tabela 4 - Espécies características da flora de diversos alimentos, com o seu tempo de redução decimal Dθ (s) à temperatura de referência θ ( C) e valor-z (ºC), no meio em que os parâmetros foram determinados e a sua referência Tabela 5 - Produtos da S+C e respetivas matérias primas estudadas, com o número de lotes analisados Tabela 6 - Número de amostras de sumo de laranja do Algarve analisado no primeiro lote de Compal Clássico Laranja Algarve, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml Tabela 7 - Número de amostras de sumo de laranja do Algarve analisado no segundo lote de Compal Clássico Laranja Algarve, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml Tabela 8 - Número de amostras de sumo de laranja do Algarve analisado no terceiro lote de Compal Clássico Laranja Algarve, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml Tabela 9 - Caracterização microbiológica em termos de teores totais de uma carga de sumo de laranja do Algarve utilizado na produção de Compal Clássico Laranja do Algarve, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses parâmetros Tabela 10 - Caracterização microbiológica em termos de bolores e leveduras de uma carga de sumo de laranja do Algarve utilizado na produção de Compal Clássico Laranja do Algarve, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses parâmetros Tabela 11 - Testes bioquímicos realizados para a identificação de colónias como bactérias ácido lácticas e os seus resultados Tabela 12 - Número de amostras de cargas de produto formulado analisado no primeiro lote de Compal Clássico Laranja Algarve, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, xi

12 mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml Tabela 13 - Número de amostras de cargas de produto formulado analisado no segundo lote de Compal Clássico Laranja Algarve, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml Tabela 14 - Número de amostras de cargas de produto formulado analisado no terceiro lote de Compal Clássico Laranja Algarve, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml Tabela 15 - Caracterização microbiológica em termos de teores totais de uma carga de produto formulado utilizado na produção de Compal Clássico Laranja do Algarve, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses parâmetros Tabela 16 - Caracterização microbiológica em termos de bolores e leveduras de uma carga de produto formulado utilizado na produção de Compal Clássico Laranja do Algarve, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses parâmetros Tabela 17 - Testes bioquímicos realizados para a identificação de colónias como enterobactérias e os seus resultados e a sua identificação Tabela 18 - Contaminação inicial (UFC/ml) do Compal Clássico Laranja Algarve baseada no produto formulado discriminada em termos de microrganismo e número de embalagens contaminadas após a pasteurização, estimado através da modelação, com base nos tempos de redução decimal desses microrganismos. A verde está indicada uma pasteurização eficaz e a rosa uma pasteurização que não garante os padrões definidos pela empresa Tabela 19 - Número de amostras de bidões de morango à peça analisado no primeiro lote de Compal Vital Frutos Vermelhos, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml Tabela 20 - Número de amostras de bidões de morango à peça analisado no segundo lote de Compal Vital Frutos Vermelhos, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml Tabela 21 - Número de amostras de bidões de morango à peça analisado no terceiro lote de Compal Vital Frutos Vermelhos, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml xii

13 Tabela 22 - Caracterização microbiológica em termos de teores totais de um bidão de morango à peça utilizado na produção de Compal Vital Frutos Vermelhos, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses parâmetros Tabela 23 - Caracterização microbiológica em termos de bolores e leveduras de um bidão de morango à peça utilizado na produção de Compal Vital Frutos Vermelhos, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses parâmetros Tabela 24 - Número de amostras de bidões de framboesa à peça analisado no primeiro lote de Compal Vital Frutos Vermelhos, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml Tabela 25 - Número de amostras de bidões de framboesa à peça analisado no segundo lote de Compal Vital Frutos Vermelhos, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml Tabela 26 - Número de amostras de bidões de framboesa à peça analisado no terceiro lote de Compal Vital Frutos Vermelhos, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml Tabela 27 - Caracterização microbiológica em termos de teores totais de um bidão de framboesa à peça utilizado na produção de Compal Vital Frutos Vermelhos, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses parâmetros Tabela 28 - Caracterização microbiológica em termos de bolores e leveduras de um bidão de framboesa à peça utilizado na produção de Compal Vital Frutos Vermelhos, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses parâmetros Tabela 29 - Número de amostras de cargas de produto formulado do primeiro lote de Compal Vital Frutos Vermelhos, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml Tabela 30 - Número de amostras de cargas de produto formulado do segundo lote de Compal Vital Frutos Vermelhos, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml Tabela 31 - Número de amostras de cargas de produto formulado do terceiro lote de Compal Vital Frutos Vermelhos, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml xiii

14 Tabela 32 - Caracterização microbiológica em termos de teores totais de uma carga de produto formulado utilizado na produção de Compal Vital Frutos Vermelhos, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses parâmetros Tabela 33 - Caracterização microbiológica em termos de bolores e leveduras de uma carga de produto formulado utilizado na produção de Compal Vital Frutos Vermelhos, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses parâmetros Tabela 34 - Contaminação inicial (UFC/ml) do Compal Vital Frutos Vermelhos baseada no produto formulado discriminada em termos de microrganismo e número de embalagens contaminadas após a pasteurização, estimado através da modelação, com base nos tempos de redução decimal desses microrganismos. A verde está indicada uma pasteurização eficaz e a rosa uma pasteurização que não garante os padrões definidos pela empresa Tabela 35 - Proporção de resultados negativos no teste de esterilidade aos 3 lotes de produto acabado Compal Vital Frutos Vermelhos, 3 dias, 30 dias e 45 dias após a produção Tabela 36 - Número de amostras de bidões de concentrado fruit-mix analisados no Um Bongo Morango, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml Tabela 37 - Caracterização microbiológica em termos de teores totais de um bidão de concentrado fruit-mix utilizado na produção de Um Bongo Morango, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses parâmetros Tabela 38 - Caracterização microbiológica em termos de bolores e leveduras de um bidão de concentrado fruit-mix utilizado na produção de Um Bongo Morango, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses parâmetros Tabela 39 - Proporção de resultados negativos no teste de esterilidade ao produto acabado Um Bongo Morango, 3 dias, 30 dias e 45 dias após a produção Tabela 40 - Número de amostras de bidões de polpa de pera analisados no primeiro lote de Compal Clássico Pera Rocha, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml Tabela 41 - Número de amostras de bidões de polpa de pera analisados no segundo lote de Compal Clássico Pera Rocha, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml xiv

15 Tabela 42 - Caracterização microbiológica em termos de teores totais de um bidão de polpa de pera utilizado na produção de Compal Clássico Pera Rocha, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses Tabela 43 - Caracterização microbiológica em termos de bolores e leveduras de um bidão de polpa de pera utilizado na produção de Compal Clássico Pera Rocha, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses Tabela 44 - Número de amostras de cargas de produto formulado analisado no primeiro lote de Compal Clássico Pera Rocha, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml Tabela 45 - Número de amostras de cargas de produto formulado analisado no segundo lote de Compal Clássico Pera Rocha, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml Tabela 46 - Caracterização microbiológica em termos de teores totais de uma carga de produto formulado utilizado na produção de Compal Clássico Pera Rocha, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses Tabela 47 - Caracterização microbiológica em termos de bolores e leveduras de uma carga de produto formulado utilizado na produção de Compal Clássico Pera Rocha, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses Tabela 48 - Contaminação inicial (UFC/ml) do Compal Clássico Pera Rocha baseada no produto formulado discriminada em termos de microrganismo e número de embalagens contaminadas após a pasteurização, estimado através da modelação, com base nos tempos de redução decimal desses microrganismos. A verde está indicada uma pasteurização eficaz e a rosa uma pasteurização que não garante os padrões definidos pela empresa Tabela 49 - Número de amostras de bidões de concentrado de laranja analisado no primeiro lote de Compal 100% Laranja, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml Tabela 50 - Número de amostras de bidões de concentrado de laranja analisado no segundo lote de Compal 100% Laranja, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml Tabela 51 - Caracterização microbiológica em termos de teores totais de um bidão de concentrado de laranja utilizado na produção de Compal 100% Laranja, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses parâmetros Tabela 52 - Caracterização microbiológica em termos de bolores e leveduras de um bidão de concentrado de laranja utilizado na produção de Compal 100% Laranja, com a respetiva xv

16 contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses parâmetros Tabela 53 - Número de amostras de cargas de produto formulado analisado no primeiro lote de Compal 100% Laranja, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml Tabela 54 - Número de amostras de cargas de produto formulado analisado no segundo lote de Compal 100% Laranja, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml Tabela 55 - Caracterização microbiológica em termos de teores totais de uma carga de produto formulado utilizado na produção de Compal 100% Laranja, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses parâmetros Tabela 56 - Caracterização microbiológica em termos de bolores e leveduras de uma carga de produto formulado utilizado na produção de Compal 100% Laranja, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses parâmetros Tabela 57 - Contaminação inicial (UFC/ml) do Compal 100% Laranja baseada no produto formulado discriminada em termos de microrganismo e número de embalagens contaminadas após a pasteurização, estimado através da modelação, com base nos tempos de redução decimal desses microrganismos. A verde está indicada uma pasteurização eficaz e a rosa uma pasteurização que não garante os padrões definidos pela empresa Tabela 58 - Proporção de resultados negativos no teste de esterilidade ao primeiro lote de produto acabado Compal 100% Laranja, após 3 e 30 dias após a produção Tabela 59 - Número de amostras de bidões de sumo clarificado e concentrado de maçã analisados no primeiro lote de Compal 100% Maçã, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml Tabela 60 - Número de amostras de bidões de sumo clarificado e concentrado de maçã analisados no segundo lote de Compal 100% Maçã, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml Tabela 61 - Número de amostras de bidões de sumo clarificado e concentrado de maçã analisados no terceiro lote de Compal 100% Maçã, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml Tabela 62 - Caracterização microbiológica em termos de teores totais de um bidão de sumo clarificado e concentrado de maçã utilizado na produção de Compal 100% Maçã, com a xvi

17 respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses parâmetros Tabela 63 - Caracterização microbiológica em termos de bolores e leveduras de um bidão de sumo clarificado e concentrado de maçã utilizado na produção de Compal 100% Maçã, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses parâmetros Tabela 64 - Número de amostras de cargas de produto formulado analisado no primeiro lote de Compal 100% Maçã, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml Tabela 65 - Número de amostras de cargas de produto formulado analisado no segundo lote de Compal 100% Maçã, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml Tabela 66 - Número de amostras de cargas de produto formulado analisado no terceiro lote de Compal 100% Maçã, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml Tabela 67 - Caracterização microbiológica em termos de teores totais de uma carga de produto formulado utilizado na produção de Compal 100% Maçã, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses parâmetros Tabela 68 - Caracterização microbiológica em termos de bolores e leveduras de uma carga de produto formulado utilizado na produção de Compal 100% Maçã, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses parâmetros Tabela 69 - Contaminação inicial (UFC/ml) do Compal 100% Maçã baseada no produto formulado discriminada em termos de microrganismo e número de embalagens contaminadas após a pasteurização, estimado através da modelação, com base nos tempos de redução decimal desses microrganismos. A verde está indicada uma pasteurização eficaz e a rosa uma pasteurização que não garante os padrões definidos pela empresa xvii

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19 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1 - Espécies do género Alicyclobacillus, com a sua fonte de isolamento, gama de temperaturas de crescimento, temperatura ótima de crescimento, gama de ph e ph ótimo e ácido gordo constituinte da sua membrana lipídica (5) Figura 2 - Curva de crescimento dos microrganismos, representada pelo logaritmo do número de células viáveis por ml em função do tempo (25) Figura 3 - Gama de ph favoráveis ao crescimento dos microrganismos representados (26) Figura 4 Representação esquemática do potencial de oxidação-redução necessário ao crescimento dos microrganismos representados (26) Figura 5 - Representação de um permutador de placas (37) Figura 6 Representação de permutadores de calor de tubos concêntricos, à esquerda simples e à direita de tubos múltiplos (37) Figura 7 - Logaritmo da concentração células viáveis em função do tempo a uma temperatura específica. Desta representação é possível retirar o tempo de redução decimal, D (2) Figura 8 - Logaritmo do tempo de redução decimal em função da temperatura do processo térmico, do qual se retira o valor-z (2) Figura 9 - Bolor Psathyrella candolleana detetado no teste dos bolores termorresistentes numa das cisternas de sumo de laranja do Algarve estudadas Figura 10 Bolores identificados na análise de bolores termorresistentes do produto formulado do Compal Clássico Laranja Algarve, 1) Cladosporium sp. (1ºlote) 2) Penicillium cinnamopurpureum (3ºlote) 3) Aspergillus sp. (2ºlote) Figura 11 Bolores identificados no teste de bolores termorresistentes no morango à peça 1) Dothideomycetes sp. (1ºlote) 2) Aspergillus sp. (2ºlote) 3) Trichocladium pyriforme (2ºlote) Figura 12 - Bolores identificados no teste de bolores termorresistentes no morango à peça 1) Neosartorya fischeri (1º e 3º lotes) 2) Byssochlamys nivea (2ºlote) Figura 13 - Bolores identificados no teste de bolores termorresistentes na framboesa à peça 1) Aspergillus sp.(1ºlote) 2) Penicillium sp (colónia verde) e Gnomoniopsis sp. (colónia rosada) (3ºlote) Figura 14 - Bolor identificado no teste de bolores termorresistentes no produto formulado de Compal Vital Frutos Vermelhos, Lecanicillium psalliotae/lecanicillium aphanocladii Figura 15 - Bolores identificados no teste de bolores termorresistentes na polpa de pera 1) Aspergillus sp. 2) Trichoderma atroviride/trichoderma viride 3) Penicillium cecidicola 4) Penicillium wortmannii xix

20 Figura 16 - Bolor Aspergillus sp. identificado no teste dos bolores termorresistentes numa carga de produto formulado de Compal Pera Rocha estudado Figura 17 - Bolor Aspergillus sp. identificado no teste dos bolores termorresistentes num bidão de concentrado de laranja estudado Figura 18 - Log N (nº células viáveis) de ACB em função do tempo (horas) em meio BAT broth, inoculado com 100 UFC/ml, sem pasteurização ou após pasteurização, a) a 44ºC e b) à temperatura ambiente Figura 19 - Log N (nº células viáveis) de ACB em função do tempo (horas) em Compal 100% Maçã, inoculado com 100 UFC/ml, sem pasteurização ou após pasteurização, a) a 44ºC e b) à temperatura ambiente Figura 20 Log N (nº células viáveis) de ACB em função do tempo (horas) em Compal 100% Maçã, inoculado com 10 5 UFC/ml, sem pasteurização ou após pasteurização, a) a 44ºC e b) à temperatura ambiente LISTA DE ABREVIATURAS ACB Alicyclobacillus acidoterrestris API Analytical Profile Index ATP adenosina trifosfato aw atividade de água BAT Bacillus acidoterrestris thermophilic D tempo de redução decimal DNA ácido desoxirribonucleico Eh potencial de oxidação-redução OSA orange serum agar OSB orange serum broth PCA plate count agar HR humidade relativa rrna ácido ribonucleico ribossomal S+C Sumol+Compal Marcas S.A. UFC unidade formadora de colónia YGC yeast extract glucose chloramphenicol agar z - Incremento de temperatura necessário para que o tempo de redução decimal se reduza em 90% xx

21 1. ENQUADRAMENTO E OBJETIVOS A presente dissertação de Mestrado em Engenharia Biológica tem como objetivo a caracterização e validação do processo de esterilização comercial dos sumos de fruta produzidos pela empresa Sumol+Compal Marcas S.A., no âmbito de um estágio curricular realizado na unidade fabril de Almeirim. O processo de esterilização comercial dos sumos de fruta é um passo de elevada importância nesta indústria, uma vez que é necessária a conjugação de três fatores fundamentais, a garantia da esterilidade comercial dos produtos, a inativação de enzimas capazes de degradar o produto e a preservação das propriedades organoléticas dos mesmos. Deste modo, a seleção do processo e das condições utilizadas no mesmo é determinante para a qualidade e garantia de segurança inerente aos sumos produzidos por esta empresa. A necessidade da realização do presente trabalho está relacionada com o facto de existir uma relação direta entre a contaminação final dos produtos e a sua contaminação inicial, baseada na resistência térmica dos microrganismos presentes e nas condições utilizadas nesse passo de processamento. Compreendeu-se, deste modo, que seria importante realizar uma caracterização microbiológica das matérias primas utilizadas na produção dos sumos e dos respetivos produtos formulados, antes de serem pasteurizados, e, tendo em conta os microrganismos identificados, fazer uma previsão da sua sobrevivência após pasteurização. Deste modo, os objetivos desta dissertação passaram por: Caracterizar microbiologicamente as matérias primas e produtos antes e depois da pasteurização dos sumos e néctares selecionados; Utilizar ferramentas de cálculo da cinética de destruição térmica dos microrganismos; Verificar a adequabilidade dos processos térmicos aplicados face à contaminação inicial. Para além dos mencionados, o trabalho apresenta objetivos mais gerais e a longo prazo, bastante significativos para a empresa. A informação obtida permitirá tornar o processo mais previsível, ao permitir obter respostas rápidas e assertivas perante eventuais problemas de processo e qualidade e reúne uma vasta informação de suporte para posteriores trabalhos de otimização do processo. A motivação para a realização deste estágio surgiu da vontade de ter contacto com o trabalho desenvolvido na indústria, ligando os conhecimentos adquiridos ao longo do Mestrado com situações reais de fabrico dos produtos consumidos diariamente. A oportunidade deste se realizar na Sumol+Compal Marcas, S.A. permitiu esse contacto e um aprofundamento de conhecimentos em diversas áreas, com especial foco na microbiologia. 1

22 2. REVISÃO DA LITERATURA 2.1. Introdução Os alimentos que são consumidos diariamente raramente são totalmente estéreis, estando associados a uma flora microbiana cuja composição depende dos microrganismos que tiveram acesso aos produtos e como estes cresceram, sobreviveram e interagiram com o alimento ao longo do tempo. Os microrganismos presentes nos alimentos provêm da microflora natural das matérias primas utilizadas e da sua introdução ao longo do processo de colheita, processamento, armazenamento e distribuição (1). Na grande maioria dos casos, esta flora não afeta o alimento e este é consumido sem qualquer problema ou consequência. No entanto, os microrganismos podem manifestar a sua presença das seguintes formas: Capacidade para deteriorar o produto; Causar doenças de origem alimentar; Transformar as propriedades do produto trazendo benefícios para o mesmo, através de processos como a fermentação (1). A conservação dos produtos alimentares é um dos pontos críticos que influencia e determina toda a gama de resultados, que vão desde a preservação da qualidade nutricional, à segurança alimentar, à natureza dos alimentos, textura, sabor e qualidades sensoriais e ao apelo ao consumidor, juntamente com a conformidade com vários pontos para a cadeia de valor, que incluem o armazenamento a longo prazo, o transporte a longas distâncias e o marketing (2). Neste contexto, os sumos de fruta apresentam uma característica muito específica, o seu reduzido ph, devido ao ph da fruta e à adição de ácidos orgânicos. Este parâmetro representa um fator inibidor para a grande maioria dos microrganismos e a principal vantagem ao nível desta indústria é a inibição do crescimento de microrganismos especificamente patogénicos. Deste modo, a principal preocupação em torno da flora microbiana dos sumos e néctares prende-se com a presença de microrganismos capazes de deteriorar o produto (3). O presente estudo seguinte tem como objetivo de perceber se a flora microbiana presente nas matérias primas e produto formulado resiste ao processo térmico utilizado e nesse caso se esta consegue desenvolver-se e promover a deterioração do produto acabado Microbiologia da fruta e dos sumos/néctares de fruta A fruta tem uma proteção externa que funciona como barreira à entrada de microrganismos patogénicos, podendo ser à prova de água ou possuir uma pelicula protetora encerada. Esta pele permite, no entanto, a passagem de uma enorme variedade de microrganismos que correspondem à flora natural da fruta incluindo bactérias e fungos. Estes associam-se à fruta através de inúmeras fontes de contaminação, como o ar, o solo ou os insetos, como a Drosophila melanogaster ou a mosca da 2

23 fruta. Todos os microrganismos se mantêm na superfície da fruta enquanto esta permanece intacta, conseguindo entrar nos tecidos internos quando ocorrem cortes ou deformações no processo póscolheita (1). Os métodos utilizados no processamento pós-colheita incluem uma variada gama de tratamentos físicos e químicos. Os produtos que sofrem um mínimo de processamento, sendo apenas lavados, cortados, descascados e armazenados perdem a sua pelicula natural devido aos processos referidos e são facilmente acedidos por microrganismos, possuindo uma elevada carga microbiológica. Para além disso, a lavagem desta fruta também pode levar à adição de bactérias patogénicas se a água estiver contaminada, pelo que toda a água de processo deve ser controlada (1). Para desativar as diversas fontes de contaminação das matérias primas referidas, os sumos e néctares de fruta são processados e pasteurizados. Este último passo elimina as suas células vegetativas de bactérias, leveduras e bolores, podendo manter-se, no entanto, os ascósporos de bolores termorresistentes ou o esclerócio de bolores como Paecilomyces sp., Aspergillus sp., e Penicillum sp. Recentemente, foi também reportado o aparecimento de endósporos bacterianos provenientes de Alicyclobacillus acidoterrestris em sumos de laranja e maçã (1) Bactérias A maioria das bactérias não resiste aos valores de ph dos produtos estudados, uma vez que estas condições de acidez são tóxicas para as mesmas. Desta forma, as bactérias predominantemente encontradas no tipo de produto em estudo pertencem ao grupo das bactérias ácido-lácticas, com maior incidência de Lactobacillus e Leuconostoc, visto serem bactérias acidófilas. Estas bactérias podem ser divididas em dois grupos baseados na sua capacidade de metabolizar açúcares, as homofermentativas, que produzem unicamente ácido láctico como metabolito e não produzem gás, e as heterofermentativas, que produzem outros metabolitos, como o ácido acético, etanol, diacetilo e outros voláteis e para além do ácido láctico produzem dióxido de carbono. Estas bactérias podem ser bacilos ou cocos, não produzem esporos, são catalase-negativas, acidotolerantes, anaeróbias ou microaeróbias facultativas, psicrotróficas a termófilas e apresentam capacidade de crescimento entre 1-4% NaCl (IV). A total eliminação deste tipo de microrganismos é fundamental, pois se este permanecerem no produto acabado este pode fermentar com a consequente degradação Endósporos bacterianos Os esporos bacterianos são bastante mais problemáticos que as células vegetativas, sendo um importante caso de estudo deste trabalho, pois estes são consideravelmente mais termorresistentes do que as partes vegetativas. Em produtos de acidez elevada não se realiza uma esterilização comum no processo de tratamento térmico, que elimina esporos patogénicos de bactérias muito comuns em produtos alimentar, como o Clostridium botulinum. Estes esporos estão vastamente presentes no ambiente e 3

24 produzem uma toxina causadora da doença botulismo, quando estão num estado de célula vegetativa. No entanto, a germinação destes esporos em condições de anaerobiose é controlada pela garantia de um ph inferior a 4,6 na matriz, pelo armazenamento a baixas temperaturas ou pela adição de conservantes. Nos produtos em estudo, o baixo valor de ph é o fator chave que mantém uma pressão seletiva na flora microbiana sobrevivente, não permitindo a germinação dos esporos referidos ou a produção de toxinas pelas suas células vegetativas ou de esporos do género Bacillus, comumente identificados nos solos e consequentemente em frutas que contactam com os mesmos (V). O principal problema dos produtos de baixo ph é a germinação de esporos de bactérias acidófilas, como é o caso de Bacillus coagulans, de Alicyclobacillus acidoterrestris e de Alicyclobacillus acidocaldarius, já que estes resistem aos valores normais de ph dos sumos de fruta (V) Género Alicyclobacillus Um dos casos mais estudados nos últimos anos devido à sua grande emergência como causador de deterioração dos sumos de fruta é o do género Alicyclobacillus, ocorrendo cada vez mais frequentemente em alimentos ácidos à base de frutas, como as polpas e concentrados e os sumos (4). Os Alicyclobacillus são bacilos Gram-positivos pertencentes à família dos Alicyclobacillaceae, com características termófilas e acidófilas, estritamente aeróbias e heterotróficas e são formadores de esporos. A sua temperatura ótima de crescimento depende da estirpe, situando-se entre os 28-65ºC e apresenta extremos inferiores e superiores de 4ºC e 70ºC, respetivamente. Este género cresce a valores de ph entre os 0,5 e os 6,5 (5). Algumas espécies e respetivas condições de crescimento estão representadas na Figura 1. Inicialmente, este tipo de bactéria foi inserido no género Bacillus, visto existir uma semelhança ao nível da formação de endósporos. No entanto, através de uma comparação de rrna 16S, verificouse uma diferença ao nível da composição G+C destas bactérias e concluiu-se que pertenceriam a uma linha de bactérias Gram-positivas do reino Bacteria, com uma %G+C inferior. Posteriormente, em 1992, este tipo de microrganismo foi reclassificado e levou à criação de um novo género denominado Alicyclobacillus. Esta alteração deveu-se à demonstração de que a grande maioria da membrana lipídica destas bactérias é constituída pelos ácidos gordos ω-ciclohexano e ω-cicloheptano. São estes constituintes que conferem aos Alicyclobacillus as suas características termófilas e consequente sobrevivência às condições de pasteurização utilizadas no tratamento térmico dos sumos de fruta (5). O primeiro caso de deterioração por Alicyclobacillus acidoterrestris (ACB) de um sumo de fruta pasteurizado foi reportado na Alemanha em 1982 e alguns outros casos começaram a aparecer mais tarde no Japão, EUA e na Europa, em A partir daí, verificou-se que estes não se trataram de situações esporádicas e muitos outros casos foram surgindo, chegando um estudo feito pela National Food Processors Association, em 1998, a mostrar que até então, nos EUA, 35% dos produtores de sumos de fruta já tinham tido problemas de deterioração provocada por ACB (5). 4

25 Figura 1 - Espécies do género Alicyclobacillus, com a sua fonte de isolamento, gama de temperaturas de crescimento, temperatura ótima de crescimento, gama de ph e ph ótimo e ácido gordo constituinte da sua membrana lipídica (5). A contaminação por estas bactérias é proveniente de diversas fontes, nomeadamente o solo e poeiras. Deste modo, o principal veículo de contaminação é a matéria-prima utilizada, uma vez que transporta estas bactérias para o produto, essencialmente quando é mal lavada e mal desinfetada. Pode ainda ser introduzida na área de produção através dos operadores ou da água de processo. Esta contaminação não é de deteção fácil, uma vez que não há produção de gás durante o crescimento deste tipo de microrganismo, nem variação do ph do produto. Por vezes pode observar-se alguma turbidez ou um pequeno sedimento mas a grande alteração que ocorre e que permite a identificação da deterioração do sumo é um odor fumacento, medicinal e antisséptico associado à produção de guaiacol (2-methoxyphenol) e halofenóis (6). O guaiacol é um produto do metabolismo microbiano que ocorre nos frutos e sumos de fruta. O ciclo metabólico do guaiacol por Alicyclobacillus sp. ainda não está totalmente estudado, no entanto os estudos realizados até ao presente defendem que a sua produção ocorre durante o metabolismo do ácido ferúlico. O ácido ferúlico é bastante comum na natureza e é encontrado em frutas, vegetais, grão, feijão, folhas, sementes, ervas e flores e é ainda um componente estrutural do polímero constituinte da parede celular das células vegetais, lignina, sendo o responsável pela ligação desta aos polissacáridos(7). Esta capacidade de metabolizar o ácido ferúlico é comum a algumas leveduras, fungos e bactérias. O ciclo metabólico começa pela descarboxilação do ácido ferúlico para 4-vinilguaiacol ou diretamente a vanilina, sendo o primeiro composto responsável pelo odor a podre e fruta velha nos citrinos. Posteriormente, o 4-vinilguaiacol é metabolizado em vanilina, passando esta a ácido vanílico, 5

26 ou então diretamente a ácido vanílico. A vanilina é rapidamente oxidada ou reduzida a ácido vanílico ou álcool vanílico, respetivamente. Finalmente, o ácido vanílico pode ser convertido em diversos produtos, como metoxihidroquinona, ácido protocatecuico e guaiacol. O guaiacol é produzido por uma reação de descarboxilação não-oxidativa e posteriormente pode transformar-se em outros compostos, como o catecol. O ACB consegue produzir guaiacol a partir da vanilina e do ácido vanílico, sendo a conversão a partir deste último mais rápida sendo por isso considerado o percursor imediato do ciclo metabólico do guaiacol (8). Apesar dos muitos casos reportados de contaminações de Alicyclobacillus sp. em produtos acidúricos finais, a sua presença não garante necessariamente a deterioração dos produtos. Em estudos anteriores já se demonstrou que a contaminação de sumos de fruta com concentrações de ACB na ordem das 10 3 UFC/ml não alterou a qualidade dos mesmos. Demonstrou-se que mesmo para concentrações superiores a essas ainda não existia mudança a nível sensorial do produto, verificandose apenas para contaminações na ordem de UFC/ml. Concluiu-se assim que o grau de contaminação por ACB é um fator importante na deterioração dos sumos mas, no entanto, outras características influenciam a produção de guaiacol, como a temperatura, o choque térmico ou a matriz do produto em que o ACB está inserido (9). O aumento de temperatura influencia de forma positiva a produção de guaiacol. Quanto maior a temperatura, mais cedo começa a produção de guaiacol. Pettipher et al. (1997) mostraram que em sumo armazenado a 25ºC, a produção de guaiacol começava ao dia 6-10 enquanto que a 44ºC tinha início ao dia 3-6. Bahçeci et al. (2005) demonstraram que sumo de maçã inoculado com UFC/ml, formava concentrações elevadas de guaiacol ao fim de 75h quando armazenados a 46ºC, enquanto que a 25ºC a concentrações de guaiacol formadas foram mínimas (9)(10) Género Bacillus A definição do largo e diverso género dos Bacillus foi iniciado por Ferdinand Cohn, em 1872, que constituiu uma parte da família Bacillaceae. Esta família é caracterizada pela produção de endósporos, que são redondos, ovais ou cilíndricos e se formam no interior de células bacterianas. Os microrganismos pertencentes ao género Bacillus são aeróbios ou anaeróbios facultativos e as células vegetativas apresentam temperaturas ótimas de crescimento entre os 25ºC e 37ºC, embora os termófilos e os psicrófilos sejam capazes de crescer a temperaturas tão elevadas como os 75ºC e baixas como os 3ºC, respetivamente. Também existem espécies capazes de crescer a valores extremos de ph, numa gama de ph 2 a ph 10 (11)(12). Este género apresenta uma vasta heterogeneidade que é refletida em uma variedade de nichos ecológicos e o seu conteúdo G+C de DNA pode ir entre os 32% e os 69%, o que leva a uma constante reclassificação das espécies em grupos taxonómicos diferentes, já que um género não deve teoricamente diferir mais de 10-15% (12). Diversos métodos foram utilizados para fazer a classificação das espécies, mas todos apresentam algumas restrições. O uso da formação de esporos como critério principal de classificação bacteriana é complicado no género Bacillus uma vez que a esporulação 6

27 depende consideravelmente das condições de cultura na qual os testes se realizam. A reação Gram é outro problema no momento da caracterização de estirpes não esporuladas deste género pois se esta não for realizada numa fase muito inicial os microrganismos são muitas vezes identificados como Gramnegativos e consequentemente são mal classificados logo de início. Estudos taxonómicos adicionais necessitam de ser realizados, especialmente de homologia de rrna ou semelhança ao nível do oligonucleótido 16S, de forma a constituir uma base sólida de divisão do género Bacillus (13). Os esporos podem sofrer um processo de ativação com diversos efeitos que passam pela germinação e aumento do número de esporos a germinarem e da velocidade a que este processo ocorre. Os esporos podem ser ativados por uma variedade de tratamentos, sendo a exposição ao calor o processo mais corrente (12). A estrutura e composição das partes dormentes de bactérias formadoras de endósporos é diferente das restantes o que lhes confere a resistência ao stress provocado por diversos fatores ambientais. O protoplasto, que contém as partes lábeis, como o DNA, RNA, ribossomas, enzimas e outras proteínas, é circundado por uma parede celular primitiva. Em torno desta, existe uma outra camada denominada córtex, constituída por peptidoglicano, que é da mesma natureza que a parede da célula vegetativa, mas contém diferenças relevantes como o facto de existirem menos ligações entre os péptidos. Uma segunda membrana celular envolve o córtex e toda a estrutura referida até ao momento está inserida em camadas de coberturas proteicas (12). Comparativamente com as células vegetativas, os esporos são mais resistentes ao calor num fator de 10 5 ou superior, à radiação UV e ionizante e a químicos, como antibióticos e desinfetantes (12). As gamas de temperatura e ph de crescimento de algumas espécies importantes no estudo realizado estão representadas na Tabela 1. É ainda importante referir que nenhuma destas espécies apresenta patogenicidade. Tabela 1 - Gama de temperatura e ph de crescimento de algumas espécies do género Bacillus (ii)(14). Microrganismo Gama de temperatura (ºC) Gama de ph Bacillus amyloliquefaciens ,0 1 Bacillus subtilis ,5-8,5 Bacillus megaterium ,7-7,0 Bacillus mycoides ,7-7,0 Geobacillus stearothermophilus ,0-8,0 1. ph ótimo de crescimento Fungos Bolores Os bolores representam um grupo bastante vasto e diverso de microrganismos que podem ser facilmente encontrados no solo e no ar e apresentam uma forte capacidade de adaptação às diversas condições. São, por estes motivos, fortes contaminantes a considerar na indústria alimentar. Para além de crescerem numa larga gama de valores de ph (ph 2,0-9,0), a sua germinação é despoletada pela ausência de oxigénio e as condições acidófilas e anaeróbias do interior das embalagens não são suficientes para garantir a sua morte (15). 7

28 Os problemas associados a este grupo de microrganismos dividem-se em dois tipos, bolores comuns, como Penicillium, Aspergillus, Mucor, Rhizopus e Fusarium, que crescem durante o processo de desenvolvimento das matérias-primas ou processamento das mesmas e esporos de bolores termorresistentes que são ativados no passo de tratamento térmico do sumo de fruta (15). O primeiro grupo de bolores pode ser proveniente de diferentes fontes, nomeadamente das matérias-primas utilizadas, especialmente se estiverem podres ou foram apanhadas do chão, má higienização dos equipamentos de processo ou comprometimento das condições assépticas de processo devido à presença de bolores no ar (15). Aqueles que são provenientes de matérias primas ou do processo, cuja contaminação ocorre anteriormente à pasteurização, não apresentam risco já que a maioria dos bolores comuns referidos apresenta uma baixa resistência térmica. Os esporos assexuados (conídios) dos géneros mais comuns são mortos depois de aquecimento por 5 minutos a 60ºC (16). Os esporos de bolores termorresistentes são um caso mais preocupante pois as temperaturas e tempos utilizados no processo de pasteurização podem não ser suficientes para eliminar este tipo de esporo. Os bolores mais comuns nos produtos em questão são Byssochlamys fulva, B. nivea, Neosartorya fischeri, Talaromyces macrosporus, T. bacillisporus e Eupenicillium brefeldianum (17). O primeiro caso reportado de um problema ocasionado por um bolor termorresistente ocorreu na Grã-Bretanha, nos anos 30, tratando-se de um bolor Byssochlamys sp (18). Deste então muitos outros casos foram documentados no resto do mundo e diversos trabalhos vêm a ser realizados com o intuito de estudar as suas fontes de contaminação, ocorrência e condições influentes na sua ativação, crescimento e resistência térmica. Estes bolores produzem ascósporos termorresistentes que lhes permite sobreviver a determinadas condições de processamento térmico. Essa resistência térmica deve-se à produção de uma forma teleomorfa do bolor, a forma capaz de se reproduzir sexuadamente a partir da formação dos ascósporos termorresistentes. Estes são geralmente produzidos em grupos de 8 dentro de uma bolsa fechadas, designada por asco. Quando amadurecem sofrem uma rutura por onde são libertados os ascósporos. Os ascos dos géneros de interesse são cobertos por um grande corpo, o ascocarpo, que pode ser de dois tipos, o cleistotécio que corresponde a uma membrana rígida totalmente fechada e de parede lisa, e o gimnotécio, uma parede formada por um emaranhado de hifas (15). A tolerância térmica dos ascósporos apresenta variedade de estirpe para estirpe e é influenciada pelo meio em que se dá o aquecimento. O uso de determinados químicos como acidulantes e conservantes é um método alternativo ou complementar ao tratamento térmico para atingir a esterilidade comercial pretendida (19)(20). Os problemas relacionados com este tipo de fungos passam pela germinação dos seus esporos, consequente origem de sumos bolorentos e pela produção de micotoxinas. As micotoxinas constituem um grupo de compostos tóxicos sendo as aflatoxinas carcinogénicas. Por esse motivo, a preocupação com este assunto tem vindo a aumentar. Algumas espécies de Byssochlamys produzem patulina, byssotoxina A e ácido byssoclâmico, apresentando efeitos tóxicos em experiências 8

29 laboratoriais com animais, e a espécie Neosartorya fischeri produz fumitremorginas A, B e C, terreína e verruculogena (17). a) Género Byssochlamys Este género de fungo termorresistente é quase exclusivamente associado a casos de deterioração de alimentos e em particular de alimentos ácidos processados com calor. O seu habitat natural é o solo, o que explica a sua associação à fruta colhida e utilizada na produção dos sumos de fruta (15). Este bolor é caracterizado pela ausência de cleistotécio, gimnotécio ou quaisquer estruturas de proteção de seus ascos durante o desenvolvimento e maturação. Os ascos deste género são produzidos em cachos irregulares, abertos, contendo geralmente oito ascósporos em associação através de fragmentos de hifas brancas (15). A forma anamorfa deste género é conhecida como Paecilomyces, sendo Paecilomyces fulvus e Paecilomyces niveus os anamorfos dos bolores B. fulva e B. nivea, respetivamente (15). b) Neosartorya fischeri Este é um dos bolores termorresistentes mais frequentes no que diz respeito a casos de deterioração de produtos com fruta. Os seus ascósporos são bastante termorresistentes e podem ser causadores de deterioração de alimentos, particularmente de alimentos frescos e processados com calor. Os ascos desta espécie são recobertos por cleistotécio causando uma aparência granular às colónias (15). A presença de ascósporos destes bolores tem sido reportada em solos, matéria orgânica em deterioração, fruta estragada, vegetais e equipamento de processo. Estes bolores são capazes de promover a desintegração da fruta devido à sua capacidade de produção de diversas enzimas pectinolíticas e desintegrantes (21). A influência dos ácidos orgânicos presentes no meio na resistência térmica tem vindo a ser estudado, sendo os ascósporos do microrganismo em questão fortemente influenciada pelo ácido fumárico e moderadamente pelos ácidos acético, cítrico e tartárico (19). Obteve-se uma destruição térmica mais eficaz em sumo de manga contendo ácidos láctico, málico ou cítrico quando comparada com a adição de ácido tartárico (20). A forma anamorfa deste bolor é a espécie Aspergillus fischerianus (15) Leveduras As leveduras constituem uma parte da flora natural da fruta, no entanto os microrganismos identificados variam em termos de localização, pois as espécies encontradas são influenciadas pelo meio ambiente, as condições de colheita e de armazenamento. Os sumos de fruta contêm elevadas 9

30 quantidades de compostos orgânicos azotados e de vitaminas, o que os torna bastante suscetíveis a contaminações por leveduras (22). Géneros de basidiomicetas como Cryptococcus, Cystofilobasidium, Sporobolomyces, Rhodotorula e Trichosporon e espécies de ascomicetas como Candida maltosa, Debaryomyces occidentalis, Metschnikowia pulcherrima, e Williopsis saturnos são frequentemente provenientes dos solos (22). As leveduras podem ainda ser encontradas em águas doces e salgadas, sendo a sua ocorrência dependente do tipo e estado de pureza da água. As espécies comuns em água doce são Aureobasidium pullulans, Cryptococcus albidus, C. laurentii, Debaryomyces hansenii, Issatchenkia orientalis, e Rhodotorula mucilaginosa (22). Uhitil, S. et al. (2009) realizaram um estudo de identificação de leveduras contaminantes do sumo de laranja que incluíram Cryptococus neoformans, Candida guillermondii, Candida famata, Candida sphaerica, Kloeckera spp., Trichosporon mucoides, Candida Krusei, Candida colliculosa e Candida albicans. Os géneros referidos e outros como Saccharomyces, Torulopsis, Pichia, Hansenula e Rhodotorula estão fortemente associados à deterioração de bebidas na indústria alimentar (23). Para além da contaminação proveniente da matéria prima, esta é aumentada na linha de processamento do sumo, sendo a sua deterioração por parte de leveduras geralmente provocada por contaminações de processo (22). A gama de temperaturas e os valores mínimos e máximos suportada por leveduras é bastante variável, no entanto os limites gerais encontram-se entre alguns graus abaixo dos 0ºC e alguns graus acima dos 50ºC. As gamas de cada espécie individualmente não ultrapassam os 40ºC e são geralmente mais estreitas. Um estudo que abrangeu 594 estirpes diferentes e 112 espécies, tais como Saccharomyces, Kluyveromyces, Debaryomyces, Pichia e Candida, demonstrou que o limite superior de 98% das leveduras se encontra entre os 24ºC e os 48ºC e nunca está acima dos 50ºC (24). A deterioração provocada pelo crescimento de leveduras está geralmente associada à formação de um sedimento, névoa e mau sabor e, caso ocorra fermentação, há produção de dióxido de carbono e as embalagens ficam opadas e podem rebentar (22) Curva de crescimento de microrganismos O crescimento microbiano é um processo autocatalítico, ou seja, não ocorre qualquer crescimento se não existir a presença de pelo menos uma célula viável e a sua reprodução é exponencial, segundo a Equação 1: dx dt = μx (1) com dx/dt a velocidade de variação da biomassa e µ a taxa específica de crescimento (2). Este crescimento é caracterizado por quatro fases, representadas na Figura 2. 10

31 1) Fase de latência (A-B) Fase imediatamente seguinte à inoculação das células, caracterizada pela síntese de novos componentes celulares, sem ocorrência de crescimento. A duração desta fase varia com a condição em que se encontra o microrganismo e com a natureza do meio onde é inserido. Ocorre a síntese de enzimas, proteínas, RNA e aumenta a atividade metabólica (25). 2) Fase exponencial (B-C) Esta fase é caracterizada pela divisão celular e consequente crescimento microbiano, a uma taxa constante e dependente do meio e das condições de incubação. Esta fase chega ao fim por diversos motivos, entre os quais o consumo de todos os nutrientes e a produção de metabolitos tóxicos ao próprio microrganismo (25). 3) Fase estacionária (C-D) Nesta fase, a taxa de crescimento microbiano é igual à de morte e o número de células viáveis mantem-se constante (25). 4) Fase de morte (D-E) Nesta última fase, as alterações ambientais como a falta de nutrientes e o aumento de produtos tóxicos são significativas e conduzem a um declínio no número de células viáveis, como resultado de uma maior taxa de morte celular (25). Figura 2 - Curva de crescimento dos microrganismos, representada pelo logaritmo do número de células viáveis por ml em função do tempo (25) Fatores que afetam o crescimento microbiano A flora característica dos sumos de fruta referida anteriormente é resultado da composição da fruta em polissacáridos, ácidos orgânicos, vitaminas e minerais, que funcionam como substratos e ditam o tipo de microrganismos que crescem neste tipo de ambiente (1). Esta é controlada por inúmeros fatores intrínsecos e extrínsecos, que dizem respeito às características do próprio produto e do ambiente que o rodeia, respetivamente. É necessário ter estes fatores em conta para que, após o processo térmico aplicado, se garanta que não ocorre a deterioração do produto final por microrganismos que permaneceram no mesmo, uma contaminação por microrganismos patogénicos ou a produção de toxinas (i). 11

32 Fatores intrínsecos a) Acidez (ph) e adição de ácidos orgânicos O aumento da acidez dos alimentos por fermentação ou adição de ácidos fracos tem sido um método de preservação muito utilizado. O ph interage com os outros parâmetros nos alimentos, como é o caso da atividade de água, sal, temperatura, potencial oxidação-redução e conservantes para inibir o crescimento de microrganismos patogénicos e outros não patogénicos. Para além disso, tem um grande impacto na resistência térmica dos microrganismos, que diminui para valores de ph mais baixos (i). Os microrganismos não apresentam uma boa capacidade de adaptação a variações no ph, não conseguindo ajustar o seu ph interno às mesmas. Isto deve-se à impermeabilidade da membrana celular aos iões H + e OH -. Esta característica representa uma proteção da célula ao facto de certos compostos, como o ATP e o DNA, necessitarem de neutralidade e de pequenas alterações apresentarem um grande impacto nos microrganismos, afetando a produção correta de enzimas e o transporte de nutrientes para dentro da célula. As bactérias apresentam um ph ótimo neutro (6,6-7,5) e uma baixa tolerância a oscilações, principalmente as bactérias patogénicas, sendo os fungos mais acido-tolerantes (1)(26). As gamas de ph de crescimento de alguns microrganismos característicos em alimentos estão representadas na Figura 3. Figura 3 - Gama de ph favoráveis ao crescimento dos microrganismos representados (26). Os ácidos orgânicos utilizados nessa redução de acidez também promovem diferentes reações nos microrganismos presentes. Diversos casos de inibição de crescimento de microrganismos com ácidos orgânicos foram até hoje reportados. A inibição de L. monocytogenes foi bem-sucedida em trypticase soy yeast broth ajustado a ph 5,0 com ácido propiónico, 4,5 com ácido acético e ácido láctico e 4,0 com ácido cítrico e ácidos hidroclóricos. Este efeito também dependeu da temperatura não sendo 12

33 o microrganismo detetável ao fim de 1 a 3 semanas a 30ºC, enquanto a 10ºC, a L. monocytogenes sobreviveu durante 11 a 12 semanas com ácidos acético, cítrico e propiónico e 6 semanas com ácido clorídrico e ácido láctico (27). Os ascósporos são difíceis de eliminar durante o processamento de produtos com fruta. Diversos estudos foram realizados ao bolor Neosartorya fischeri em sumo de manga e uva, aquecidos a 75ºC, 80ºC, 85ºC e 90ºC, nos quais os ascósporos apresentaram uma resistência de 6 horas a 75ºC, 5 horas a 80ºC e 3 a 4 horas a 85ºC. Posteriormente, realizaram-se estudos nos quais o ph dos sumos foi ajustado a 3,5 com ácidos, cítrico, láctico, málico e tartárico. O sumo ao qual se adicionou ácido cítrico foi aquele que apresentou maior destruição dos ascósporos a 85ºC (20). Uma concentração de 0,75% de ácido cítrico ou ácido lático mostrou um retardamento no crescimento de A.parasiticus e apenas 0,25% de ácido reduziu consideravelmente a produção de toxinas. Uma concentração de 0,5% de ácido cítrico e 0,75% de ácido láctico inibiu o crescimento de Aspergillus versicolor e 0,25% de ácido cítrico e 0,5% de ácido láctico preveniu a produção de toxinas (28). b) Atividade de água (aw) Nos alimentos, a água encontra-se presente de duas formas distintas, imobilizada por estar quimicamente ligada a outras moléculas, ou livre, estando disponível para utilização para o crescimento microbiano. Esta última é designada atividade de água (aw), definida pela razão entre a pressão parcial de vapor na atmosfera, em equilíbrio com a amostra, e a pressão de vapor da água pura à temperatura da amostra. Deste modo, os seus valores podem variar entre 0 e 1, sendo que 1 corresponde à total disponibilidade da água e 0 à inexistência de água livre (29). A atividade de água pode relacionar-se com a humidade relativa de equilíbrio segundo a Equação 2, sendo que, no caso da fruta, quanto menor for a atividade de água mais seca é a superfície do alimento e vice-versa. HR= a w 100 (2) A fruta em geral apresenta valores de aw acima de 0,99, que indicam a presença de moléculas de água de mobilidade elevada, retidas entre tecidos ou em macro-capilares. Este valor é suficiente para o crescimento tanto de bactérias como de bolores, sendo que estes últimos apresentam alguma flexibilidade em termos de aw e as bactérias têm uma maior sensibilidade a este fator. A Tabela 2 apresenta alguns valores de aw de diversas frutas e sumos de fruta. Tabela 2 - Exemplos de frutas e sumos de fruta e respetivos valores de atividade de água (30). Fruta/Sumo de fruta a w Maçã 0,981 Cereja 0,959 0,986 Uva 0,963 0,986 Laranja 0,979 0,987 Sumo de maçã 0,986 Sumo de cereja 0,986 Sumo de uva 0,983 Sumo de laranja 0,988 13

34 A grande maioria das bactérias não cresce abaixo de aw=0,91 e os fungos conseguem crescer até valores tão baixos como 0,80 (i)(26). No entanto, a quantidade de água presente no meio, necessária para o crescimento celular, varia de microrganismo para microrganismo. As bactérias halófilas, os fungos xerófilos e as leveduras osmófilas são os microrganismos que toleram atividades de água dentre 0,61-0,75 por acumulação de iões de potássio na célula, de álcoois polihidricos e polióis como osmorreguladores e protetores de enzimas, respetivamente (1). Este parâmetro é característico de cada microrganismo e depende da temperatura, ph, oxigenação, propriedades nutritivas do substrato e presença de ácidos orgânicos e outros metabolitos secundários, que têm influência no intervalo de aw suportado pelo microrganismo (1). c) Potencial oxidação-redução (Eh) As reações de oxidação-redução ocorrem quando existe uma transferência de eletrões entre moléculas. O Eh de um meio diz respeito à facilidade com que este aceita e doa eletrões, para oxidar ou reduzir. Quando o equilíbrio dos diversos pares redox presentes favorecer reações de oxidação, a amostra tende a receber eletrões do elétrodo, criando um potencial positivo. No caso oposto, quando o equilíbrio é inverso, a amostra tende a doar eletrões ao elétrodo, registando um potencial negativo e indicando um meio redutor (2)(26). Diversos fatores influenciam o valor de Eh dos alimentos, como os pares redox presentes, a proporção dos grupos oxidantes e redutores, o ph, a capacidades de equilíbrio, a disponibilidade de oxigénio e a atividade microbiana (2). O potencial redox exerce um efeito seletivo na flora microbiana dos alimentos, apresentando os microrganismos uma ampla faixa de potenciais redox favoráveis ao seu crescimento. Apesar da existência deste intervalo, cada microrganismo apresenta uma gama estreita, bastante influenciada pela sua necessidade de oxigénio. Microrganismos aeróbios exigem Eh positivo para o seu crescimento, com presença de oxigénio, e são representados pelos bolores, algumas bactérias, como do género Bacillus e leveduras oxidativas. Os microrganismos anaeróbios requerem Eh negativo e ausência de oxigénio. Para além destes grupos, destacam-se ainda os anaeróbios facultativos que se multiplicam a Eh positivo e negativo, representadas pelas leveduras fermentativas, enterobactérias e alguns Bacillus e os microrganismos microaerófilos que se multiplicam melhor a Eh baixo, como é o caso das bactérias lácticas (2). Os sumos de fruta apresentam valores positivos de potencial redox, entre os +300 mv e os +400 mv, podendo observar-se na Figura 4 esse intervalo e as gamas de crescimento dos microrganismos aeróbios e anaeróbios, com os respetivos mínimo e máximo (26). 14

35 Figura 4 Representação esquemática do potencial de oxidação-redução necessário ao crescimento dos microrganismos representados (26). A gama de valores de potencial redox dos sumos de fruta favorece o aparecimento de bactérias aeróbias e de fungos, que correspondem aos casos mais comuns de deterioração dos sumos. A estes produtos é adicionado ácido ascórbico para manter condições redutoras e alguns açúcares redutores da fruta também ajudam a manter as mesmas (26). d) Quantidade de nutrientes Os microrganismos utilizam a fruta como fonte de água, energia, azoto, vitaminas, fatores de crescimento e minerais (1). Como fonte de energia, os microrganismos podem utilizar açúcares, álcoois e aminoácidos e alguns são capazes de utilizar carbohidratos complexos como amido e celulose, degradando-os a açúcares simples (2). As fontes principais de azoto são os aminoácidos mas alguns microrganismos também são capazes de utilizar nucleótidos, péptidos e proteínas (2). Em termos de vitaminas, os microrganismos podem necessitar de vitamina B, principalmente aqueles que não são capazes de sintetizar as suas necessidades essenciais. É o caso das bactérias Gram-positivas que têm essa baixa capacidade e consequentemente não crescem tão facilmente na fruta, visto esta ter um baixo teor em vitamina B. Os fungos e as bactérias Gram-negativas crescem neste tipo de alimento pois conseguem sintetizar praticamente tudo o que necessitam. Este fator, associado aos baixos valores de ph e potencial oxidação-redução positivo da fruta, explica o facto da deterioração deste tipo de alimento e dos sumos de fruta se dever usualmente ao aparecimento de fungos e não de bactérias (2). 15

36 e) Constituintes antimicrobianos Certos alimentos apresentam uma capacidade de resistência ao ataque por parte de microrganismos que lhes é conferida por componentes ou substâncias que lhes estão naturalmente associadas e que expressam uma atividade antimicrobiana (1). A primeira barreira é física e passa pela pele ou casca que determinados produtos apresentam. Estes componentes são geralmente compostos por macromoléculas relativamente resistentes à degradação e fornecem um ambiente inóspito para microrganismos por terem uma baixa atividade de água, baixa concentração de nutrientes disponíveis e compostos antimicrobianos tal como os óleos essenciais, na superfície das plantas. É comumente observado que frutas e vegetais danificados são deteriorados mais rapidamente, já que estragos físicos permitem uma invasão microbiana para os tecidos inferiores, ricos em nutrientes (2). Os componentes antimicrobianos que os tecidos dos produtos possuem correspondem a uma segunda barreira de defesa, sendo que diversas frutas possuem este tipo de constituintes (1). A maçã é uma fruta cujas propriedades antimicrobianas estão largamente reportadas na literatura. Alguns extratos da pele das variedades Royal Gala e Granny Smith inibiram fortemente a Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC e Staphyloccocus aureus ATCC (31). Também a variedade Red Delicious apresentou uma atividade antimicrobiana elevada contra S. aureus, P. aeruginosa e Bacillus cereus. Neste mesmo estudo, demonstrou-se que a concentração mínima de compostos fenólicos para apresentar um efeito bactericida é de µg/ml (32). Outros estudos realizados com a variedade Annurca demonstraram que as propriedades antimicrobianas destas maçãs ocorriam devido a uma alteração na regulação do crescimento celular ou na inibição do processo de quorum sensing, um mecanismo de sinalização celular. Todas as estirpes utilizadas nestes estudos demonstraram uma clara inibição por parte dos compostos fenólicos desta variedade, sendo as bactérias mais sensíveis a E.coli e o B. cereus (33). Os três compostos fenólicos predominantes nas maçãs são a catequina, o ácido clorogénico e a florizina. Todos estes compostos inibiram a E.coli O157:H7, Listeria innocus e Penicillium chrysogenum em concentrações de 25 mm. O crescimento da Saccharomyces cerevisiea apenas foi inibido pelos dois últimos compostos enquanto que o de Lactobacillus thamnosus não apresentou qualquer inibição (34) Fatores extrínsecos a) Temperatura de armazenamento O crescimento microbiano pode ocorrer numa vasta gama de temperaturas à pressão atmosférica, podendo ir de -8ºC a 100ºC. Este intervalo deve-se ao facto de existir uma necessidade de água no estado liquido que esteja disponível para o crescimento microbiano. Nenhum microrganismo 16

37 consegue crescer em toda a gama de temperaturas, podendo fazer-se a sua divisão de acordo com o intervalo ótimo de crescimento e temperaturas mínima e máxima a que pode ocorrer crescimento (2)(26). As categorias em que os microrganismos se dividem estão representadas na Tabela 3. Tabela 3 - Caracterização dos microrganismos em função da sua temperatura de crescimento, com indicação do intervalo de temperatura ótimo e temperaturas mínima e máxima de crescimento (2)(26). Grupo Temperatura de crescimento (ºC) Mínima Ótima Máxima Termófilos Mesófilos Psicrófilos -5 a Psicrótrofilos -5 a Na indústria alimentar, os microrganismos de maior importância são os mesófilos e os psicrótrofilos uma vez que são microrganismos que se desenvolvem à temperatura ambiente e apresentam gamas largas de crescimento, conseguindo desenvolver-se ainda a temperaturas mais baixas e mais elevadas que a referida (2). A grande maioria dos microrganismos termófilos e termorresistentes nos alimentos pertencem aos géneros Bacillus, Paenibacillus, Clostridium, Geobacillus, Alicyclobacillus e Thermoanaerobacter. Apesar de nem todas as espécies destes géneros serem termófilas, algumas são bastante importantes na microbiologia de alimentos, inclusivamente na indústria dos sumos de fruta (26). A literatura indica que os bolores suportam gamas mais vastas de temperatura que as bactérias e resistem a temperaturas mais baixas, de refrigeração, como os géneros Aspergillus, Cladosporium e Thamnidium, capazes de crescer em frutas. Apesar destes dados, a prática da empresa S+C indica que produtos refrigerados têm uma menor tendência para ser deteriorados pelo aparecimento de bolores. As leveduras crescem nos intervalos das bactérias mesófilas e psicrótrofilas mas não resistem a temperaturas mais altas, toleradas pelas bactérias termófilas (2). b) Humidade relativa do ambiente Quando os alimentos são armazenados em ambientes com elevada humidade relativa, a água da fase gasosa pode ser transferida para o alimento e pode ocorrer condensação, que aumenta a atividade de água dessas regiões da superfície. Nessas zonas os microrganismos, que estão presentes e não são capazes de se reproduzir nas condições de armazenamento, começam a germinar e a crescer e a sua respiração, tendo a água como produto final, torna-se em outro fator de aumento da atividade de água, aumentando a atividade microbiológica. Por estes motivos, as condições de armazenamento da fruta utilizada na produção são um fator muito importante, já que matéria prima microbiologicamente estável facilmente deixa de o ser e entra em deterioração (2). 17

38 c) Presença e concentração de gases O oxigénio está presente na atmosfera da Terra em 21% e é o gás mais importante em contacto com os alimentos. Tal como referido anteriormente, existem microrganismos que necessitam de oxigénio para a sua sobrevivência e outros que apenas se desenvolvem na sua ausência. Os microrganismos apresentam diferentes níveis de tolerância às condições da atmosfera envolvente e o desenvolvimento de atmosferas modificadas com controlo da composição de oxigénio e outros gases, como o dióxido de carbono, tem sido uma forma de condicionar o desenvolvimento da flora microbiana e de prolongar a vida útil dos produtos armazenados. O dióxido de carbono apresenta um efeito inibidor sobre o crescimento microbiano e é aplicado em embalagens de atmosfera modificada de alimentos(2) Métodos de preservação dos sumos de fruta A utilização de calor como um agente conservante foi uma descoberta do francês Nicolas Appert. Este ganhou um prémio, em 1810, depois de vários anos a desenvolver técnicas baseadas na embalagem de alimentos em garrafas de vidro e seu posterior aquecimento em água a ferver. Uma técnica semelhante foi utilizada pelo inglês Saddington, em 1807, para preservar fruta. Appert defendeu a ideia que a principal causa da deterioração dos alimentos seria o contacto com o ar e que o sucesso da técnica dele era a eliminação do ar do produto e esta ideia persistiu durante diversos anos, com consequências desastrosas. Apenas 50 anos depois, o trabalho de Pasteur veio estabelecer uma nova relação entre a atividade microbiana e a degradação dos produtos. Este veio a desenvolver os processos de pasteurização e esterilização comercial (2). Para além dos métodos térmicos, foram desenvolvidos ao longo do tempo métodos alternativos, como o processamento a pressão hidrostática elevada, os campos elétricos pulsados, os pulsos de luz de alta intensidade, os campos magnéticos pulsados de alta intensidade ou o tratamento com ozono (29). O processo mais utilizado na inativação da flora microbiológica dos sumos de fruta é a inativação térmica. Este método, que não utiliza produtos químicos, apresenta vantagens em relação a outros por ser mais seguro e pelo facto de assegurar uma longevidade em produtos posteriormente armazenados em embalagens estéreis, por eliminação da maioria dos microrganismos e inativação das enzimas capazes de degradar os sumos serem sensíveis ao calor (35). A inativação enzimática é um dos objetivos fundamentais deste processo uma vez que frutas com um ph abaixo dos 4,5 possuem um sistema enzimático, constituído por enzimas como a catálase, a peroxidase, a polifenoloxidase e a pectinesterase. Estas são responsáveis por processos de acastanhamento ou de formação de precipitados e turbidez nos produtos (35)(36). A principal desvantagem da utilização deste processo é a perda das propriedades organoléticas da fruta por utilização de temperaturas excessivamente altas durante tempos prolongados. Isto obriga a um equilíbrio entre a preservação destas propriedades e a utilização de temperaturas suficientemente 18

39 elevadas que garantam a morte de microrganismos capazes de degradar o produto. Os processos geralmente utilizados são a pasteurização e a esterilização (35) Pasteurização Nesta indústria de sumos de fruta, a pasteurização é o processo selecionado; é um processo de tratamento térmico não severo, no qual as bebidas são aquecidas a temperaturas abaixo dos 100ºC. Este processo é utilizado para aumentar o tempo de vida dos alimentos, por diversos meses, através da destruição dos microrganismos capazes de os deteriorar e inativação das enzimas presentes. A pasteurização é preferível à esterilização tendo em conta o objetivo de minimizar as perdas dos componentes nutricionais e propriedades organoléticas dos alimentos. A esterilização necessita de temperaturas acima dos 100 C durante vários minutos, sendo por isso um processo mais severo e que tem um impacto negativo no produto. A diferença de temperaturas dos dois processos está relacionada com a diferença nos microrganismos que se querem inativar. No caso da pasteurização os microrganismos alvo são as células vegetativas enquanto na esterilização o objetivo é destruir organismos com maior resistência à ação do calor, os esporos de bactérias. Nesta indústria existe a vantagem de não ser necessário um processo de esterilização, já que o que se procura é uma esterilização comercial. Esta consiste na destruição de todos os microrganismos patogénicos e capazes de deteriorar os sumos, podendo sobreviver alguns esporos bacterianos que não se conseguem desenvolver no produto em condições não refrigeradas de armazenamento (2). Este objetivo é atingido com uma pasteurização, pois, tal como referido, as características dos sumos de fruta são inibitórias em relação ao crescimento dos microrganismos que permanecem no produto final (35) Equipamento Existe uma vasta diversidade de pasteurizadores, que podem realizar a pasteurização do produto antes e depois da sua embalagem, através de um processo contínuo ou descontínuo. a) Pasteurização de produtos embalados Os pasteurizadores utilizados na produção de produtos embalados podem funcionar em modo descontínuo ou contínuo (35). Em descontínuo, o método mais simples é a utilização de um banho de água que é aplicado, por exemplo, em produtos ácidos já que a sua temperatura de pasteurização é de 100ºC ou inferior. O produto, após ser embalado, é mergulhado no banho e posteriormente arrefecido para 40ºC (35). A operação em continuo pode ser realizada de duas formas distintas. A utilização de um pasteurizador com pulverização de água ou vapor é bastante utilizada, consistindo na passagem do produto, colocado em um tapete rolante, através de diversas zonas de temperatura: primeiro pré- 19

40 aquecimento, segundo pré-aquecimento, zona de pasteurização, pré-arrefecimento, arrefecimento e zona de arrefecimento final. Em alternativa, os tuneis de pasteurização funcionam de um modo semelhante ao anterior, com três zonas principais: aquecimento, permanência e arrefecimento (35). Este método apresenta a vantagem de eliminar qualquer contaminação que ocorra entre a pasteurização e a embalagem, visto esta última ser feita previamente ao tratamento térmico, que elimina essa contaminação. Não tem, deste modo, as exigências de higiene na instalação de embalamento asséptico comuns a outros tipos de pasteurização. Além disso é um processo mais fácil de operar e mais flexível para diferentes tamanhos de embalagem e produtos. No entanto, é necessário ter em conta que este meio de aquecimento não tem a mesma uniformidade de temperatura em todas as regiões do sistema de processamento. Assim é indispensável garantir que os recipientes que se encontram nas regiões mais frias recebem calor suficiente para atingir o valor alvo do processo (29)(37). b) Pasteurização de produtos não embalados Também para este tipo de pasteurização existem diversos métodos para realizar o processamento do produto, que podem ser fundamentalmente de dois tipos: descontínuo e contínuo. No processamento descontínuo, a utilização de permutadores de calor do tipo tanque é apropriada para métodos de longa permanência do produto no passo de pasteurização. Neste processo, o produto é inserido no tanque, aquecido até à temperatura pretendida, mantido no seu interior pelo tempo de processo definido e retirado para outro tanque onde ocorre o arrefecimento (35). Para o processo contínuo podem ser utilizados diferentes tipos de permutadores de calor. A escolha do permutador de calor apropriado para um determinado processo depende de vários parâmetros, sendo a viscosidade do produto um dos principais (37). Existem diversos pasteurizadores contínuos que diferem principalmente na geometria do equipamento. Os permutadores de placas são os que têm menor custo e maior transferência de calor, o que os torna energeticamente/termicamente mais eficientes. No entanto, apenas podem ser utilizados para fluidos com viscosidades baixas ou, caso tenham viscosidades mais elevadas, se verifique que não são atingidas pressões muito elevadas no interior do permutador (37). Na Figura 5 está esquematicamente representado um permutador de placas. Figura 5 - Representação de um permutador de placas (37). 20

41 Os permutadores tubulares de tubos concêntricos têm a preferência de utilização sobre os de placas no caso de alimentos mais viscosos e com maior teor de fibra. Atualmente a maioria dos permutadores tubulares tem superfícies rugosas que ajudam à transferência de calor, criando um regime turbulento do fluido, de forma a compensar o facto de apresentarem uma menor capacidade de transferência de calor que os permutadores de placas. Na Figura 6 estão representados dois tipos de permutador de tubos concêntricos (37)(38). Figura 6 Representação de permutadores de calor de tubos concêntricos, à esquerda simples e à direita de tubos múltiplos (37). A pasteurização dos produtos da S+C é realizada em permutadores de placas ou tubulares, sendo que a sua utilização depende da viscosidade do produto a ser processado. As temperaturas de pasteurização utilizadas nas linhas Tetra Pak, linhas selecionadas para este estudo, encontram-se entre os ºC Modelação da morte térmica dos microrganismos Como foi referido anteriormente, os microrganismos são sensíveis a certas gamas de temperatura para as quais apresentam crescimento. Mas a partir de uma temperatura máxima, as células são afetadas e morrem uma vez que os seus componentes celulares são destruídos e não conseguem ser substituídos. A velocidade com que ocorre a morte celular aumenta com o aumento de temperatura (2). A descrição desta destruição microbiana pode ser enquadrada por métodos matemáticos. Os modelos cinéticos preveem uma resposta do crescimento ou morte à variação de condições ambientais. Um dos modelos desenvolvidos foi o modelo de inativação/sobrevivência que descreve a destruição ou sobrevivência dos microrganismos ao longo do tempo. Tem sido aceite que a morte térmica se dá num processo de primeira ordem, a uma certa temperatura, em função do número de células viáveis existentes. Isto pode ser expresso através da Equação 3, em que dn dt dn dt =-cn (3) é a velocidade de morte celular, N é o número de células viáveis e c uma constante de proporcionalidade. Através da integração desta expressão é possível obter uma equação através da 21

42 qual se obtém informação acerca do número de células a sobreviver a um processo, no intervalo entre o momento de tempo 0 e t (2). log e ( N N 0 ) =-ct (4) ou N=N 0 e -ct (5) em que N e N0 são o número de células viáveis no tempo t e 0, respetivamente (2). Finalmente, é mais comum utilizar logaritmo de base 10, então chegou-se à Equação 6, log 10 ( N N 0 ) =-kt (6) com k = c/log e 10 (2). A representação do logaritmo de células sobreviventes a uma determinada temperatura em função do tempo encontra-se na Figura 7 (2). Figura 7 - Logaritmo da concentração células viáveis em função do tempo a uma temperatura específica. Desta representação é possível retirar o tempo de redução decimal, D (2). O valor D na figura, tempo de redução decimal representado, é o tempo necessário para inativar 90% da população microbiana ou reduzi-la uma ordem de grandeza logarítmica a temperatura constante. Para facilidade de leitura, essa temperatura é representada em subscrito, por exemplo, D65 corresponde ao tempo de redução decimal a 65ºC. Um valor D mais elevado indica maior resistência ao calor (2). O valor D pode ser determinado por método analítico ou gráfico. No método gráfico utiliza-se uma escala semi-logarítmica como a utilizada na Figura 7. Os diversos pontos experimentais formam uma linha reta e o inverso do declive corresponde ao tempo de redução decimal. Este tempo é especifico para cada microrganismo (2). Pelo método analítico, o valor D pode ser determinado a partir dos tempos de aquecimento e da variação das concentrações de microrganismos (Equação 7), 22

43 D = t 2 t 1 log a log b (7) onde a e b correspondem, respetivamente, à concentração inicial e final de microrganismos e t2-t1 ao intervalo de tempo necessário para a concentração passar do valor a para b. Quanto maior o número inicial de microrganismos presentes no alimento, maior será o tempo necessário para reduzir o número de sobreviventes até ao valor desejado. Deste modo, é importante garantir que as matérias primas dos produtos em processamento não apresentem elevadas cargas microbianas. Tal como referido, o tempo de redução decimal é determinado para uma temperatura constante. Posteriormente, foi desenvolvimento um modelo cinético secundário que permite descrever a variação do valor-d em função da temperatura. É possível fazer uma representação da curva de tempo de morte térmica (TDT), construída a partir de diversos valores de D para diferentes temperaturas (Figura 8) (2). Figura 8 - Logaritmo do tempo de redução decimal em função da temperatura do processo térmico, do qual se retira o valor-z (2). Este gráfico é construído com o logaritmo do tempo de redução decimal em função da temperatura e do declive infere-se o valor z, definido como o número de graus Celsius necessários para provocar uma mudança de uma ordem de grandeza no tempo de redução decimal (2). Os valores D e z são utilizados para caracterizar um microrganismo, uma enzima ou um componente químico presente nos alimentos (2) Valores de D e z característicos de microrganismos de interesse Os valores D e z utilizados na modelação da destruição térmica aplicada aos microrganismos identificados nos sumos de fruta em estudo são valores encontrados na literatura. Deste modo, procuraram-se valores determinados para condições o mais próximas possível das dos produtos em estudo, já que as características da matriz são fatores bastante influentes na resistência térmica dos microrganismos. A Tabela 4 apresenta esses valores para microrganismos importantes nesta indústria, assim como as condições em que estes foram determinados e a temperatura de referência. 23

44 Tabela 4 - Espécies características da flora de diversos alimentos, com o seu tempo de redução decimal D θ (s) à temperatura de referência θ ( C) e valor-z (ºC), no meio em que os parâmetros foram determinados e a sua referência. Microrganismo Meio θ ( C) D θ (s) z ( C) Referência Clostridium botulinum Alimentos ph neutro (iii) Bacillus subtilis Alimentos ph neutro (iii) Bacillus cereus Alimentos ph neutro (iii) Bacillus stearotermophilus Alimentos ph neutro ,5 (iii) Alicyclobacillus acidoterrestris Sumo de frutas (iii) Salmonella Alimentos ph neutro ,5 (iii) Saccharomyces cerevisiae Alimentos ph neutro ,5 (iii) Aspergillus flavus Alimentos ph neutro (iii) Penicillium roquefortii ph 4 (tampão) 60 17,4 4 (iii) Byssachlamys nivea ph 3,9 e 17 ºBrix (iii) ,8 (Sumo de uva) Neosartorya fischeri ph 3,9 e 17 ºBrix (iii) ,1 (Sumo de uva) Candida sp. ph 7 (tampão) (22) Candida parapsilosis ph neutro (tampão) (15) Klebsiella pneumoniae Leite 60 1,3 2,8 (39) Rhodotorula mucilaginosa ph 3,5 (tampão) 60 9,54 4,7 (iii) Relativamente às leveduras, uma vez que não existem dados acerca de todas as leveduras em especifico, alguns valores de outras espécies foram adotados aos da flora microbiana deste estudo, por semelhança de estrutura de reprodução. As estirpes que formam ascósporos são mais termorresistentes do que as restantes. Ao primeiro grupo pertencem os géneros Debaryomyces, Hansenula, Kluyveromyces, Lodderomyces, Pichia e Saccharomyces enquanto que géneros como Brettanomyces, Candida, Kloeckera e Torulopsis não originam esse tipo de esporos. Para leveduras identificadas como leveduras Candida ou Trichosporon utilizou-se um valor usual de tempo de redução decimal de células vegetativas de leveduras, indicado na tabela como Candida sp., com a exceção da Candida famata, cujo teleomorfo (estado sexuado) é Debaryomyces hansenii, para o qual se utilizou os valores da Saccharomyces cerevisiae visto serem ambas formadoras de ascósporos (40). Apesar de não estarem referidos na tabela os valores para a enterobactéria Pantoea sp. esta já foi anteriormente utilizada como substituta em estudos da resistência térmica do microrganismo patogénico Salmonella, já que as suas resistências térmicas são bastante semelhantes, pelo que os valores utilizados para esse microrganismo, neste estudo, são os indicados para a Salmonella (41). Finalmente, no estudo da sobrevivência de esporos de bactérias aeróbias a maioria identificada foi do tipo Bacillus amyloliquefaciens, pelo que os valores de resistência térmica utilizados para este foram os correspondentes ao Bacillus subtilis, à exceção do Geobacillus stearothermophilus que apresenta valores bastante superiores ao primeiro. A utilização dos dados da espécie Bacillus subtilis deveu-se ao facto de as diferentes espécies deste género se assemelharem todas às espécies Bacillus subtilis e Bacillus cereus e a utilização de um ou outro tempo de redução decimal e valor-z não alterar o resultado do estudo (2). 24

45 2.4. Descrição do processo de produção de bebidas na S+C O processo de produção de bebidas na fábrica de Almeirim da S+C passa por diversas etapas, desde a receção e processamento das matérias primas até à obtenção do produto final embalado. No local de abertura, as matérias primas são transferidas dos bidões, combos ou cisternas onde estão armazenadas para depósitos de abertura ou de receção de ingredientes. De seguida, estas podem ser diretamente introduzidos em depósitos de formulação ou passar por um passo de refinação ou corte para reduzir o tamanho de fibras e partículas da fruta até aos parâmetros pretendidos. Os depósitos referidos são os locais onde se faz a junção de todos os ingredientes nas proporções pretendidas para o produto final. Este passo é denominado formulação e é realizado por diversas vezes para um mesmo lote de produção, ou seja, divide-se o volume total do lote por múltiplos da capacidade dos depósitos onde é feita a formulação. A cada depósito formulado dentro do mesmo lote designa-se por carga. O produto formulado segue para o passo de processamento térmico, constituído por diversas fases em pasteurizadores, em permutadores de calor de placas ou tubulares. Em primeiro lugar, o produto passa por uma fase de pré-aquecimento. Posteriormente, dá-se um desarejamento do produto formulado de forma a que o ar introduzido na bebida durante o processo de formulação seja eliminado. Esta mistura gasosa poderia promover a modificação do sabor e consequente redução da qualidade do produto. De seguida, o produto passa por uma fase de aquecimento até à temperatura à qual ocorre a pasteurização. O produto permanece posteriormente no tubo de holding durante o tempo de pasteurização e finalmente é submetido a uma última fase, o arrefecimento. Posteriormente, ocorre um enchimento asséptico do produto. A única exceção a este procedimento ocorre nas linhas de produção em que se realiza um enchimento em vidro, em que o enchimento do produto é realizado a quente e o arrefecimento é posterior. 3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1. Produtos em estudo A escolha dos produtos para este estudo baseou-se no facto de estes serem sumos emblemáticos da empresa, sendo continuamente produzidos. Os produtos selecionados e as suas matérias primas, analisadas ao longo deste trabalho, encontram-se na Tabela 5. Tabela 5 - Produtos da S+C e respetivas matérias primas estudadas, com o número de lotes analisados. Produto final Matérias primas estudadas Número de lotes analisados Compal 100% Maçã Sumo concentrado/clarificado de maçã 3 Compal 100% Laranja Concentrado de laranja 2 Compal Clássico Pera Rocha Polpa de pera 2 Compal Vital Frutos Vermelhos Morango à peça Framboesa à peça 3 Compal Clássico Laranja Algarve Sumo de laranja do Algarve 3 Um Bongo Morango Morango Concentrado fruit-mix 1 25

46 O sumo concentrado e clarificado de maçã e o concentrado de laranja são matérias primas provenientes de fornecedores externos, enquanto que a polpa de pera é um produto produzido na S+C, pelo que se tornou interessante estudar estes diferentes casos. Os produtos Compal Vital Frutos Vermelhos e Compal Clássico Laranja Algarve são interessantes casos de estudo devido à expetativa de uma mais elevada contaminação inicial das suas matérias primas, uma vez que o morango e a framboesa à peça não sofrem qualquer tipo de tratamento após serem colhidos, inclusivamente com manipulação feita à mão. O Compal Clássico Laranja do Algarve é um produto cuja matéria prima sofre uma maior manipulação, pois o sumo é produzido e armazenado no fornecedor, transferido para cisternas para o seu transporte para a fabrica e posteriormente bombeado para o interior de depósitos na altura da sua receção na S+C. O produto Um Bongo Morango foi selecionado de forma a recolher um maior número de amostras de morango à peça, essencialmente devido à incidência de esporos de bolores termorresistentes nesta matéria prima. O Compal Vital Frutos Vermelhos é formulado com diversas matérias primas, no entanto, o morango e a framboesa à peça utilizados são os ingredientes problemáticos em termos de carga microbiana inicial. Os restantes ingredientes utilizados não apresentam contaminações significativas relativamente aos dois referidos, pelo que a sua contribuição foi desprezada. Todos os estudos foram realizados em produções em linhas Tetra Pak e em todas elas foram utilizados pasteurizadores com o mesmo tempo de holding Colheita de amostras Os testes realizados semanalmente foram programados tendo em conta o Planeamento de Produção, sendo as amostras colhidas na altura da produção dos sumos em estudo. As matérias-primas foram colhidas dos bidões no processo de abertura dos mesmos, o produto formulado foi colhido antes de ser pasteurizado através de uma válvula no depósito de formulação e o produto acabado foi recolhido na zona de enchimento. Esta colheita foi realizada com material estéril, no entanto sem condições de assepsia. Das matérias primas colheu-se cerca de 100ml de amostra do topo do bidão, do produto formulado cerca de 100ml a meio da formulação de cada carga e do produto acabado 12 embalagens do início, do meio e do fim de produção. Sempre que possível, as amostras foram retiradas de produções de embalagens de litro, com as exceções do 1º lote de 100% Laranja em embalagens de 330ml e do Um Bongo Morango em embalagens de 200ml. O número de bidões analisado variou de estudo para estudo, dependendo do número de cargas realizadas em cada lote. Do produto formulado analisaram-se todas as cargas de cada lote. Relativamente ao produto final, analisaram-se 6 embalagens do início, do meio e do fim e os restantes foram apenas utilizados na realização do teste de esterilidade descrito na secção

47 3.3. Análises microbiológicas Todos os procedimentos utilizados foram os adotados pela empresa nas análises correntes de laboratório, sendo estes procedimentos elaborados pela International Federation of Fruit Juice Producers (IFU). Na continuação, faz-se uma explicação breve de cada análise, como referenciada no procedimento interno seguido. As análises a seguir descritas foram realizadas para todas as amostras dos diversos locais de recolha, excetuando a da secção que apenas é utilizada na análise do produto acabado. Além disso, o descrito nas secções e apenas foi aplicado ao Compal 100% Maçã, sendo que nos restantes produtos apenas se utilizou o método referido na secção principal Enquanto que nas matérias primas e no produto formulado a análise foi imediata, nas amostras de produto acabado esta foi realizada após uma incubação de 3 dias a 30ºC Determinação da contaminação em teores totais A contagem dos teores totais permite contabilizar unidades formadoras de colónias de leveduras, bolores, bactérias acido-lácticas e outras bactérias acidúricas. Este método consistiu na diluição de uma amostra de 10g da matriz em estudo em 90ml de água peptonada tamponada e realização de diluições sucessivas, quando necessário. Apenas no caso das matérias primas morango e framboesa à peça, a mistura destas com o meio foi processada num Stomacher Star Blender LB 400 (VWR, EUA), cujo procedimento se repete para as restantes análises. De seguida, procedeu-se à incorporação de 1 ml de cada diluição numa placa de petri de 90 mm, no meio orange serum agar (OSA). Este meio apresenta um ph de 5,5. Posteriormente as placas foram incubadas a 30 C durante 3 dias. Após incubação determinou-se a contaminação em teores totais em unidades formadoras de colónias (UFC) por mililitro de amostra (I) Determinação da contaminação em bolores e leveduras A contagem dos bolores e leveduras permite uma seleção mais específica de leveduras e de bolores, pela adição do composto cloranfenicol que inibe o crescimento de bactérias. Este método consistiu na diluição de uma amostra de 10g da matriz em estudo em 90ml de água peptonada tamponada e realização de diluições sucessivas, quando necessário. De seguida, procedeu-se à incorporação de 1 ml de cada diluição em uma placa de petri de 90 mm, no meio yeast extract glucose chloramphenicol agar (YGC). Este meio apresenta um ph de 6,6. Posteriormente, a placa foi incubada a 25 C durante 5 dias. Determinou-se a contagem em UFC/ml, por distinção morfológica, de bolores e leveduras separadamente (II)(III). 27

48 Determinação da contaminação em esporos de bactérias aeróbias A contagem de esporos de bactérias aeróbias formadoras de esporos consistiu numa diluição de 10g de amostra da matriz em estudo em 90ml de água peptonada tamponada. Posteriormente, procedeu-se a uma inativação das formas vegetativas e ativação dos esporos por imersão da diluição anterior num banho termostático (Memmert, Alémanha) a 80ºC durante 10 minutos. De seguida, incorporou-se 1 ml numa placa de petri de 90 mm, no meio plate count agar (PCA). Este meio apresenta um ph de 7,0. A placa foi incubada a 30ºC durante 3 dias. Determinou-se a contagem de esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml (V) Determinação da contaminação em esporos de bactérias acidófilas A contagem de esporos de bactérias acidófilas formadoras de esporos consistiu numa diluição de 10g de amostra da matriz em estudo em 90ml do meio Bacillus acidoterrestris thermophilic medium (BAT) broth. Este meio apresenta um ph de 4,0. Posteriormente procedeu-se a uma inativação das formas vegetativas e ativação dos esporos por imersão da diluição num banho termostático a 80ºC durante 10 minutos. Em seguida, incorporou-se 1 ml numa placa de petri de 90 mm no meio OSA e, pela técnica de espalhamento, 100µl sobre o meio BAT agar. As placas foram incubadas a 44ºC durante 2 dias. Determinou-se a contagem de esporos de bactérias acidófilas em UFC/ml (VII) Pesquisa de ACB A diluição preparada anteriormente foi incubada a 44ºC durante 3 dias. Espalhou-se 100µl sobre BAT agar e ao fim de 2 dias verificou-se a presença ou ausência de esporos de bactérias acidófilas. As colónias detetadas foram isoladas para duas placas de BAT agar e incubadas a 30ºC e a 65ºC. Um crescimento a 30ºC geralmente é indicativo de Alicyclobacillus acidoterrestris ou outra estirpe produtora de guaiacol enquanto que a 65ºC as estirpes produtoras desse composto não apresentam crescimento. Geralmente cresce a espécie Alicyclobacillus acidocaldarius ou outra espécie não produtora de guaiacol (VII). A pesquisa de ACB em produto acabado após processamento ou retirado do mercado faz-se de formas diferentes diferindo também da pesquisa em matérias primas, descrita anteriormente. Em produto acabado após processamento o produto é incubado durante 7 dias a 45ºC e, pela técnica de espalhamento, 100µl são inoculados em meio BAT agar. Ao fim de 2 dias a 45ºC, observa-se o crescimento e realiza-se o teste de crescimento às diferentes temperaturas para confirmar se se trata de ACB. Em produto retirado do mercado o método é semelhante, no entanto quando há suspeita de presença de ACB e este não é detetado, é aconselhada a realização de um passo de choque térmico, tal como realizado na análise à matéria prima (VII). Por este motivo, neste trabalho, o método utilizado para a pesquisa de ACB em produto final foi o mesmo aplicado às matérias primas e produto formulado para garantir que a deteção era efetivamente conseguida. 28

49 Pesquisa de guaiacol As colónias isoladas foram submetidas ao teste de deteção de guaiacol da Döhler, cuja metodologia é brevemente descrita. Este teste consistiu na incubação de uma colónia em estudo em 2 ml de meio BAT broth e incubação a 44ºC durante pelo menos 3 horas. Após esse período foi adicionado pela ordem descrita: 1 ml de uma solução tampão, 20µl de peroxido de hidrogénio e 20µl de uma solução de enzima peroxidase. Observou-se a mudança de cor ao longo de 10 minutos. A mudança de cor de incolor para amarelo alaranjado na presença de bactérias formadoras de guaiacol é resultado de uma reação enzimática catalisada pela peroxidase, em que se dá a oxidação do guaiacol a guaiacol tetramérico. Desta forma, um resultado incolor indica um teste negativo e amarelo alaranjado um resultado positivo Determinação da contaminação em esporos de bolores termorresistentes A determinação dos esporos de bolores termorresistentes consistiu numa diluição de 50g de amostra da matriz em estudo em 50ml de água peptonada tamponada. Posteriormente, procedeu-se a uma inativação das formas vegetativas e ativação dos ascósporos por imersão da diluição anterior num banho termostático a 75ºC durante 30 minutos. De seguida, incorporou-se 5 ml em duas placas de petri de 90 mm no meio YGC. As placas foram incubadas a 30ºC durante 15 dias. Determinou-se a contagem de ascósporos em UFC/ml (III) Teste de esterilidade O teste de esterilidade do produto final consistiu numa diluição de 10ml de amostra da matriz em estudo em 90ml em meio de enriquecimento orange serum broth (OSB). A diluição anterior foi incubada a 30ºC durante 2 dias. Após este tempo, uma ança foi transferida para placas de meio OSA e foi observado o crescimento após 48 horas a 30ºC. A ocorrência de crescimento nas placas onde se fez o espalhamento indica um produto não estéril e um resultado negativo e a ausência de crescimento indica um produto estéril e teste de esterilidade positivo (VI). Este método foi utilizado ao fim de três dias de produção e quando possível, dependendo se foram obtidos resultados negativos no teste dos 3 dias e se foram colhidas embalagens suficientes, repetiu-se o teste ao fim de 30 e 45 dias. Estes ficaram armazenados à temperatura ambiente durante estes períodos Identificação microbiológica As colónias selecionadas para identificação e realização de uma caracterização microbiológica dos produtos em estudo foram isoladas para meio PCA e, após crescimento, o método ou métodos utilizados para a sua identificação foram escolhidos de acordo com o tipo de microrganismo em questão. 29

50 A identificação da presença de bolores foi realizada por observação morfológica, sendo distinguíveis a olho nú e a sua identificação foi realizada por sequenciação de DNA por método de Sanger, num laboratório externo à S+C. As bactérias e leveduras foram distinguidas a microscópio, por coloração de Gram. Ambas foram posteriormente identificadas por recurso a testes bioquímicos API sendo, no caso das bactérias, ainda utilizados testes bioquímicos complementares, todos descritos de seguida Coloração de Gram A coloração de Gram permitiu fazer uma distinção de bactérias Gram-positivas e Gramnegativas tal como da sua morfologia, distinguindo-se os bacilos dos cocos. Para além disso, pela morfologia dos microrganismos também foi possível distinguir leveduras através deste método. 1. Numa lâmina, colocou-se uma gota de água destilada e realizou-se um esfregaço com uma amostra do microrganismo que se pretendeu identificar. Deixou-se secar ao ar; 2. Fixou-se o esfregaço passando obliquamente na chama (zona mais quente) 3 vezes; 3. Corou-se com violeta de cristal durante 1 minuto e lavou-se rapidamente com água; 4. Cobriu-se completamente a lâmina com lugol durante 1 minuto e lavou-se com água; 5. Lavou-se com solução descolorante, 50% álcool (96% vol) e 50% acetona, durante aproximadamente 20 segundos e lavou-se com água; 6. Cobriu-se a lâmina com solução safranina durante um minuto e lavou-se com água; 7. Secou-se com papel; 8. Observou-se ao microscópio ótico (400x) e posteriormente aplicou-se uma gota de óleo de imersão e observou-se novamente com uma objetiva de imersão (1000x). As bactérias Gram-positivas apresentaram uma coloração violeta e as gram-negativas uma coloração vermelha Teste da oxidase Este teste consistiu em esfregar uma ança de inoculação em tiras constituídas por N,N-dimetil- 1,4-fenilenodiamina dicloridrato (Merck, Alémanha) e observar a possível formação de um composto colorido por oxidação do composto referido pela citocromo oxidase. Este teste permitiu distinguir as bactérias produtoras da enzima oxidase, sendo que um teste positivo apresenta uma coloração azul escura e um teste negativo, nenhuma alteração na coloração. 30

51 Teste da catalase O teste da catalase permitiu a identificação da enzima catálase em bactérias, de forma a, em conjunto com os testes da coloração de Gram e da oxidase, definir em que grupo de bactérias se incluía aquela em estudo. Este teste consistiu na colocação de duas a três gotas de peróxido de hidrogénio 3% (m/v) numa placa de petri e passagem de uma ança de inoculação do microrganismo em estudo no reagente. Observou-se se ocorreu formação de oxigénio, por borbulhamento, que indica um teste positivo API Os sistemas API (Analytical Profile Index) são sistemas padronizados para a identificação de diversos microrganismos, existindo uma variedade de testes para a distinção de diferentes grupos de microrganismos. Estes sistemas consistem na realização de diversos testes bioquímicos, através do contacto do microrganismo em estudo com galerias de substratos desidratados selecionados para o tipo de microrganismo em questão. Os sistemas comerciais API utilizados (biomérieux, França) foram o 20E, 20 C AUX, Candida, 50 CHB que fazem a identificação de enterobactérias e outros bacilos Gram-negativos não fastidiosos, leveduras, leveduras Candida e bacilos Gram-positivos, respetivamente. Os procedimentos utilizados foram os do folheto informativo que acompanha cada teste Estudo do crescimento de ACB em Compal 100% Maçã e da produção de guaiacol Estudo da influência da matriz no crescimento de ACB 1. Inoculou-se BAT broth com uma colónia de ACB, que incubou durante 24 horas a 44ºC, e determinou-se a contaminação do inóculo; 2. Contaminaram-se 9 garrafas com 200 ml de BAT broth e 9 garrafas de Compal 100% Maçã produzido na fábrica de forma a obter uma contaminação em esporos de 100 UFC/ml; 3. Realizou-se um controlo da contaminação inicial; 4. Colocou-se metade das garrafas à temperatura ambiente e a outra metade a 44ºC; 5. Realizou-se um controlo da contaminação ao fim de 7 dias de uma garrafa de cada matriz à temperatura ambiente e a 44 C; 6. Realizou-se uma análise sensorial ao Compal 100% Maçã; 7. Repetiu-se o processo de 7 em 7 dias. 31

52 Estudo da influência da pasteurização no crescimento de ACB 1. Contaminaram-se 9 garrafas com 200 ml de BAT broth e 9 garrafas da formulação de Compal 100% Maçã de forma a obter uma contaminação em esporos de 100 UFC/ml, com o inóculo descrito na secção 3.5.1; 2. Pasteurizaram-se todas as garrafas a 90ºC durante 30 segundos; 3. Realizou-se um controlo da contaminação inicial; 4. Colocou-se metade das garrafas à temperatura ambiente e a outra metade a 44ºC; 5. Realizou-se um controlo da contaminação ao fim de 7 dias de uma garrafa de cada matriz à temperatura ambiente e a 44 C; 6. Realizou-se uma análise sensorial ao Compal 100% Maçã; 7. Repetiu-se o processo de 7 em 7 dias Estudo da influência da contaminação de ACB na produção de guaiacol 1. Contaminaram-se 9 garrafas com 200 ml de Compal 100% Maçã produzido na fábrica e 9 garrafas da formulação de Compal 100% Maçã de forma a obter uma contaminação em esporos de 10 5 UFC/ml, com o inóculo descrito na secção 3.5.1; 2. Pasteurizaram-se todas as garrafas da formulação de Compal 100% Maçã, às mesmas condições descritas na secção 3.5.2; 3. Realizou-se um controlo da contaminação inicial; 4. Colocou-se metade das garrafas à temperatura ambiente e a outra metade a 44ºC; 5. Realizou-se um controlo da contaminação ao fim de 7 dias de uma garrafa de cada matriz à temperatura ambiente e a 44 C; 6. Realizou-se uma análise sensorial dos produtos em questão; 7. Repetiu-se o processo de 7 em 7 dias. 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1. Caracterização microbiológica das matérias-primas, produto formulado e produto final As contagens das análises microbiológicas realizadas a todos os produtos estudados e que permitiram chegar aos resultados apresentados nesta secção encontram-se no Anexo 1. Os resultados microbiológicos estão representados com os valores do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo para as diversas análises microbiológicas realizadas, diferenciando os diversos lotes estudados. Optou-se pela utilização deste tipo de estatística descritiva, com a mediana como medida da tendência geral dos conjuntos de dados já que é um indicador mais realista para dados microbiológicos em comparação com a média, visto esta última ser influenciada por valores muito atípicos e o seu resultado poder tornar-se distante da realidade do processo quando afetado pelos mesmos. Os primeiro e terceiro quartis permitem uma noção da variabilidade do processo visto serem 32

53 medidas de dispersão e o valor máximo é um ponto bastante importante neste trabalho já que em casos em que se afasta muito da mediana do processo se torna significativo na validação do processo térmico por caracterização da contaminação inicial. Isto deve-se ao facto de, apesar de nem sempre a carga microbiológica ser tão elevada, ser necessário ter em conta que a pasteurização tem de ser eficaz no pior caso possível de contaminação. A caracterização microbiológica dos diversos produtos baseou-se na observação das colónias formadas nas diferentes análises microbiológicas. Para identificação foram selecionadas as colónias mais frequentes, não existindo a garantia de que não estivessem presentes outras espécies de microrganismos. A modelação (ver modelo apresentado na secção 2.3.2) que permite a previsão do número de embalagens contaminadas com microrganismos identificados no produto formulado é, desta forma, realizada com a mediana do pior dos lotes analisados. Em casos em que se verificou um máximo com uma ordem de grandeza superior à mediana, esse valor foi o testado. São apresentados os valores de contaminação inicial para cada sumo, calculados através da contaminação do produto formulado. Como se verificou que diversos microrganismos são comuns aos diferentes sumos analisados a modelação apenas foi aplicada ao pior caso de todo o conjunto e apenas se se verificasse que a pasteurização não seria eficaz para esse grau de contaminação, os restantes valores seriam testados. As modelações encontram-se no Anexo 2. Nas figuras representadas, é possível observar, para a espécie indicada, o grau de contaminação inicial do microrganismo e em que produto e volume final das embalagens incide o estudo. São indicadas diferentes temperaturas e tempos de pasteurização e para cada temperatura é calculado o tempo de redução decimal do microrganismo e indicado em quantas embalagens temos 1 UFC às condições aplicadas. Valores inferiores a 1 indicam que existe pelo menos 1 UFC em todas as embalagens, ou seja, todas as embalagens estão contaminadas e estão representadas a rosa, a verde estão os casos em que pelo menos cada 10 ou mais embalagens se encontra só 1 UFC. Esta representação é apenas uma ferramenta de cálculo não correspondendo esta divisão a limites de validação definidos pela empresa. Nem todos os microrganismos estão incluídos no Anexo 2, já que para aqueles em que qualquer das condições representadas é suficiente para a sua destruição térmica, não se considerou fundamental a sua representação. São os casos dos microrganismos Pantoea sp., Klebsiella pneumoniae, Candida parapsilosis, C.famata e Trichosporon mucoides Compal Clássico Laranja Algarve Sumo de Laranja do Algarve O sumo de laranja do Algarve utilizado na produção do produto em estudo, é das matérias primas com uma carga microbiológica mais elevada. Apesar do sumo ser submetido a um tratamento de pasteurização prévio, ainda no fornecedor, a sua manipulação e transporte podem adicionar-lhe 33

54 uma contaminação elevada. Deste modo, a contaminação do sumo de laranja do Algarve é bastante variável como foi possível observar nas amostras colhidas e analisadas de sumo de Laranja do Algarve. Tabela 6 - Número de amostras de sumo de laranja do Algarve analisado no primeiro lote de Compal Clássico Laranja Algarve, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml. 1ºlote Nº de Primeiro Terceiro Mínimo Mediana amostras Máximo Teores totais Bolores Leveduras Esporos de bactérias aeróbias Tabela 7 - Número de amostras de sumo de laranja do Algarve analisado no segundo lote de Compal Clássico Laranja Algarve, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml. 2ºlote Nº de Primeiro Terceiro Mínimo Mediana amostras Máximo Teores totais Bolores Leveduras Esporos de bactérias aeróbias Tabela 8 - Número de amostras de sumo de laranja do Algarve analisado no terceiro lote de Compal Clássico Laranja Algarve, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml. 3ºlote Nº de Primeiro Terceiro Mínimo Mediana amostras Máximo Teores totais Bolores Leveduras Esporos de bactérias aeróbias Destas tabelas, é possível verificar a variabilidade no grau de contaminação através da distância inter observada. Isto é principalmente válido para os valores referentes aos teores totais, em que há uma variação de duas ordens de grandeza entre os lotes de contaminação mais baixa e mais elevada e mesmo dentro do mesmo lote. Esta contaminação poderá ser originada pela manipulação que o sumo sofre, durante a sua transferência para cisternas pode adicionar-lhe alguma carga microbiana agravada pelo tempo e condições de transporte, ocorrendo uma maior ou menor adição nos diversos lotes. Por comparação dos lotes estudados verificou-se que o primeiro e o terceiro são semelhantes em termos de caracterização apresentando um elevado número de bactérias ácido lácticas e um mais baixo de leveduras e praticamente a inexistência de bolores. No segundo lote, observa-se que a ordem de grandeza das análises de teores totais e de leveduras é bastante mais próxima que nos restantes casos, indicando uma flora bastante mais pronunciada de leveduras e menor incidência de bactérias. 34

55 Deste modo, procedeu-se à caracterização da flora microbiológica do sumo. A Tabela 9 corresponde a uma das cisternas utilizadas no primeiro lote estudado e em que se verificou que 96% dos microrganismos são possivelmente do tipo bactérias ácido lácticas (testes descritos na Tabela 11) não tendo sido a caracterização mais pormenorizada. A restante flora corresponde a 4% da levedura Trichosporon mucoides. A identificação dos microrganismos da mesma carga da análise para bolores e leveduras confirma a caracterização feita em termos de leveduras, acrescentando a identificação de Candida famata, que tendo uma contagem tão baixa não foi percetível na análise dos teores totais. Verifica-se uma diferença na ordem de grandeza da contagem da primeira levedura. Esta diferença é explicada pelo facto de a contagem de teores totais ser feita numa diluição superior e o valor obtido ser mais aproximado, para um valor superior ao real. Tabela 9 - Caracterização microbiológica em termos de teores totais de uma carga de sumo de laranja do Algarve utilizado na produção de Compal Clássico Laranja do Algarve, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses parâmetros. Tipo de microrganismo Contagem (UFC/ml) Percentagem (%) Bactérias ácido lácticas Trichosporon mucoides Total Tabela 10 - Caracterização microbiológica em termos de bolores e leveduras de uma carga de sumo de laranja do Algarve utilizado na produção de Compal Clássico Laranja do Algarve, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses parâmetros. Tipo de microrganismo Contagem (UFC/ml) Percentagem (%) Candida famata Trichosporon mucoides Total Tabela 11 - Testes bioquímicos realizados para a identificação de colónias como bactérias ácido lácticas e os seus resultados. Coloração de Gram Teste da oxidase Teste da catalase Cocos Gram-positivos Negativo Negativo Em relação aos esporos de bactérias aeróbias, as contagens foram sempre bastante baixas, sendo ligeiramente mais elevadas no último lote estudado. Um dos esporos detetados pertence à espécie Geobacillus stearothermophilus. O sumo de laranja do Algarve não apresenta qualquer esporo de bactérias acidófilas. Relativamente aos bolores termorresistentes, apenas o bolor Psathyrella candolleana (Figura 9) foi identificado numa das cisternas de sumo de laranja do Algarve estudadas, no primeiro lote. Este bolor foi identificado pontualmente pelo que não é característico desta matéria prima. 35

56 Figura 9 - Bolor Psathyrella candolleana detetado no teste dos bolores termorresistentes numa das cisternas de sumo de laranja do Algarve estudadas. Este tipo de bolor pertence à família Psatherellaceae e é encontrado em solos, debris orgânicos e erva, sendo compreensível o seu aparecimento em fruta como a laranja. Este bolor pertence à Filo Basidiomycota, pelo que é produtor de basidiomicetos, esporos produzidos no momento da reprodução sexuada deste bolor (42). Estes esporos apresentam alguma resistência térmica, no entanto não são tão termorresistentes como os ascósporos e nenhum caso de deterioração de produtos alimentares por este bolor foi até hoje reportado. Por este motivo, se estes esporos se mantiverem após a formulação de produto, considera-se que em princípio a pasteurização será suficiente para os destruir não representando um problema para o produto Produto formulado Em termos de produto formulado as contagens apresentam-se mais homogéneas. Verifica-se que o segundo lote é o que apresenta as contagens mais baixas, o que é consistente com o facto de a matéria prima apresentar uma menor carga microbiana. Tabela 12 - Número de amostras de cargas de produto formulado analisado no primeiro lote de Compal Clássico Laranja Algarve, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml. 1ºlote Nº de Primeiro Terceiro Mínimo Mediana amostras Máximo Teores totais Bolores Leveduras Esporos de bactérias aeróbias Tabela 13 - Número de amostras de cargas de produto formulado analisado no segundo lote de Compal Clássico Laranja Algarve, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml. 2ºlote Nº de Primeiro Terceiro Mínimo Mediana amostras Máximo Teores totais Bolores Leveduras Esporos de bactérias aeróbias

57 Tabela 14 - Número de amostras de cargas de produto formulado analisado no terceiro lote de Compal Clássico Laranja Algarve, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml. 3ºlote Nº de Primeiro Terceiro Mínimo Mediana amostras Máximo Teores totais Bolores Leveduras Esporos de bactérias aeróbias Relativamente à caracterização microbiológica verificou-se uma elevada percentagem de enterobactérias o que pode ser explicada por factos como a manipulação por parte dos operadores, utilização de mangueiras para a transferência da matéria prima para os depósitos de formulação ou ainda a adição de água o que torna o meio mais favorável para o desenvolvimento deste tipo de microrganismos. Foi realizada a caracterização da flora microbiana de uma das cargas de produto formulado e os resultados representados nas Tabelas 15 e 16. A Pantoea sp. corresponde a uma enterobactéria e há uma permanência das leveduras que foram identificadas na matéria prima. A identificação da enterobactéria foi realizada por diversos testes bioquímicos, representados na Tabela 17. Verifica-se ainda que não foi identificada qualquer bactéria ácido-láctica, explicado pelo facto de apenas se identificarem colónias predominantes e apesar das mesmas estarem presumivelmente presentes não foi feito o seu isolamento. Além disso, o processo de formulação ou a adição de novos compostos inibidores podem ser agressivos para estes microrganismos e levar à sua concentração reduzida. Tabela 15 - Caracterização microbiológica em termos de teores totais de uma carga de produto formulado utilizado na produção de Compal Clássico Laranja do Algarve, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses parâmetros. Tipo de microrganismo Contagem (UFC/ml) Percentagem (%) Pantoea sp Trichosporon mucoides Total Tabela 16 - Caracterização microbiológica em termos de bolores e leveduras de uma carga de produto formulado utilizado na produção de Compal Clássico Laranja do Algarve, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses parâmetros. Tipo de microrganismo Contagem (UFC/ml) Percentagem (%) Trichosporon mucoides Candida famata Total

58 Tabela 17 - Testes bioquímicos realizados para a identificação de colónias como enterobactérias e os seus resultados e a sua identificação. Coloração de Gram Teste da oxidase Teste da catalase API 20E Bacilos Gram-negativos Negativo Positivo Pantoea sp. O valor utilizado para os cálculos da contaminação inicial foi o da mediana do primeiro lote, à exceção da contaminação por Candida famata que foi determinada pela mediana do terceiro lote que indicou um pior caso em relação a contaminação por leveduras. Os esporos de bactérias aeróbias também foram determinados pela mediana do terceiro lote já que foi neste que se identificaram mais esporos na matéria prima e consequentemente no produto formulado. Tabela 18 - Contaminação inicial (UFC/ml) do Compal Clássico Laranja Algarve baseada no produto formulado discriminada em termos de microrganismo e número de embalagens contaminadas após a pasteurização, estimado através da modelação, com base nos tempos de redução decimal desses microrganismos. A verde está indicada uma pasteurização eficaz e a rosa uma pasteurização que não garante os padrões definidos pela empresa. Microrganismo Contaminação inicial (UFC/ml) Estimativa de embalagens contaminadas após pasteurização Pantoea sp Trichosporon mucoides Candida famata Geobacillus stearothermophilus 90 Todas As bactérias e leveduras identificadas apresentam valores reduzidos de tempo de redução decimal pelo que, para as contaminações iniciais determinadas, a pasteurização aplicada é suficiente para garantir que nenhuma embalagem de produto acabado fique contaminada. Observou-se, no entanto, que as bactérias aeróbias formadoras de esporos são mais termorresistentes, como referido anteriormente e, para uma contaminação de Geobacillus stearothermophilus como a calculada para este sumo, prevê-se que todas as embalagens fiquem contaminadas. Analisando a modelação para este microrganismo (Anexo 2) é possível concluir que estes esporos não são teoricamente inativados pelo processo de pasteurização utilizado e que não é possível selecionar condições de temperatura e tempo suficientes para que estes microrganismos sejam inativados sem alterar as propriedades do sumo, dado o seu muito elevado tempo de redução decimal. Apesar disso, tal como referido na secção 2.3.1, o que se procura nesta indústria é uma esterilização comercial, ou seja, a garantia de que os microrganismos que permanecem nos sumos não são capazes de se desenvolver. Esse é o caso dos esporos de bactérias aeróbias identificados neste teste que apresentam uma gama ótima de crescimento para ph neutro, e em meios ácidos como o dos sumos de fruta não conseguem crescer e acabam por morrer com o tempo. Para além disso, não são prejudiciais para a saúde pública pelo que a sua permanência no produto não representa um risco. 38

59 Neste sumo de laranja, não foram identificados quaisquer esporos de bactérias acidófilas, o que está conforme com o facto das matérias primas não os apresentarem, não sendo adicionados ao produto durante a fase de formulação. Os bolores identificados nos testes dos bolores termorresistentes, nos três lotes, estão representados na Figura 10, sendo a sua contaminação de 0,2 UFC/ml. Figura 10 Bolores identificados na análise de bolores termorresistentes do produto formulado do Compal Clássico Laranja Algarve, 1) Cladosporium sp. (1ºlote) 2) Penicillium cinnamopurpureum (3ºlote) 3) Aspergillus sp. (2ºlote) A sua identificação foi feita pelo método de Sanger mas apenas foi possível a identificação do género em dois casos, tornando-se difícil a aplicação de um tempo de redução decimal deste microrganismo. A grande maioria dos bolores do género Cladosporium e Penicillium não apresentam teleomorfos e os seus esporos assexuais não apresentam elevada resistência térmica, pelo que o seu aparecimento pode ser devido a contaminações durante a análise visto serem bolores comuns no ar. As suas formas anamorfas reproduzem-se através da produção de conídios, que apesar de mais termorresistentes que as células vegetativas, não apresentam resistências térmicas suficientes para sobreviver à pasteurização aplicada (17)(43). O mesmo se aplica ao bolor Aspergillus encontrado que, como anteriormente referido, apesar de uma espécie de Aspergillus apresentar um teleomorfo produtor de ascósporos bastante termorresistentes (Neosartorya fischeri), este não foi determinado como pertencente a essa espécie. A grande maioria dos Aspergillus não apresentam teleomorfos e é possível que o aparecimento deste bolor neste teste se deva a uma contaminação durante a análise microbiológica, já que é um caso pontual nos diversos lotes analisados (15)(17). Para além da hipótese de contaminação, estes bolores também podem ser efetivamente provenientes de ascósporos presentes se pertencerem a uma espécie produtora dos mesmos visto pertencerem à Filo Ascomycota, cuja reprodução sexuada os origina. No entanto, os ascósporos de teleomorfos de bolores do género Cladosporium e Aspergillus, exceto o caso referido anteriormente, não apresentam tão elevadas resistências térmicas como os descritos na secção (43). Apesar da maioria dos bolores Penicillium estarem associados a contaminações na análise, esse não é o caso desta espécie de Penicillium já que está associada a um teleomorfo do género Eupenicillium cujas hifas e esclerócio, uma massa compacta de micélio endurecido, apresentam resistência a condições de stress, podendo resistir às condições aplicadas nesta análise e ser efetivamente proveniente do produto (43). Pelos motivos anteriores, é necessária a confirmação de que 39

60 estes são eliminados na pasteurização. Apesar do relatado, esta espécie, entre as pertencentes a este género termorresistente, não tem sido reportada em casos de degradação de produtos alimentares. O bolor identificado na matéria prima não foi detetado em qualquer das cargas formuladas nas quais foi utilizada a cisterna referida. Isto pode dever-se ao facto de a adição dos outros componentes de formulação do produto apresentarem algum efeito inibidor destes esporos ou de o processo de fabrico ser agressivo para os microrganismos e estes poderem estar em stress e não ser revelados na análise microbiológica. Nenhuma modelação foi realizada para estes microrganismos, tanto dos identificados no produto formulado como os da matéria prima que não foram agora detetados, por falta de dados relativos à sua resistência térmica Produto acabado Segundo a modelação realizada previu-se que o produto acabado não apresentasse qualquer contaminação em termos de enterobactérias, leveduras ou bolores. Também as bactérias ácido lácticas apresentam baixa resistência térmica e mesmo que presentes, mas não identificadas, no produto formulado, estas não sobrevivem ao processo térmico aplicado. Este resultado foi confirmado pelas análises realizadas ao produto acabado dos três lotes de Compal Clássico Laranja Algarve. Em termos de esporos de bactérias aeróbias, apesar de, segundo a modelação, a contaminação inicial determinada ser suficiente para a contaminação de todas as embalagens verificouse que o produto acabado não estaria contaminado. Esta conclusão é possível ser retirada tanto pela análise direta de esporos de bactérias aeróbias como pelo teste de esterilidade que foi positivo para todos os pacotes analisados, sendo que neste último teste o meio de enriquecimento promove o crescimento deste tipo de microrganismo, caso ele esteja inibido e não seja detetado na análise direta. Este resultado pode dever-se ao facto de existir uma diferença de ph dos meios utilizados nos dois testes. Estes esporos, ainda que termófilos, conseguem crescer a 30ºC pelo que esse fator não seria inibitório do seu crescimento em qualquer destes testes, no entanto já foi provado que eles conseguem crescer a ph neutro, entre 6 e 8, e que a ph mais baixo, como 5,5, o seu crescimento é muito reduzido (14)(44). O meio utilizado no teste de esterilidade apresenta um ph em torno de 5,5, pelo que pode ser suficiente para que os esporos não se desenvolvam e o teste seja positivo. Desta forma, é possível que os esporos estejam presentes, mas tal como referido, não põem em causa a esterilidade comercial do produto, pois não irão sobreviver às condições em que estão inseridos e não são prejudiciais para a saúde humana. Não foram identificados quaisquer esporos de bactérias acidófilas. Finalmente, verificou-se que não ocorreu qualquer aparecimento de esporos de bolores termorresistentes nos pacotes de produto acabado analisados. O bolor Penicillium cinnamopurpureum, que poderia vir a ser um caso problemático devido à sua mais elevada resistência térmica, foi identificado na primeira carga formulada e alguns dos pacotes de produto acabado analisados corresponderam ao início de produção, ou seja, foram provenientes dessa mesma carga. Demonstrouse que a amostra analisada não estava contaminada por esse bolor. 40

61 Para além dos bolores referidos, nenhum dos bolores identificados na matéria prima ou no produto formulado foram encontrados no produto acabado, o que vem comprovar que eles não apresentam uma resistência térmica suficiente para sobreviver ao processo de pasteurização aplicado não sendo problemáticos para a esterilidade deste produto, tendo em conta o espaço amostral Compal Vital Frutos Vermelhos Morango O morango à peça utilizado na produção deste produto apresenta uma considerável carga microbiológica que resulta do facto de ser congelado sem qualquer tratamento térmico prévio e da sua manipulação ser feita manualmente podendo o contacto do operador aumentar a contaminação. Nos três lotes estudados verifica-se que o grau de contaminação é relativamente constante sendo os dados estatísticos bastante semelhantes. Apesar de no primeiro lote não ter sido feita uma distinção entre as leveduras e os bolores encontrados, nos restantes é possível concluir que estes tipos de microrganismos estão presentes com a mesma ordem de grandeza. Nota-se uma diferença entre as contagens da flora anterior e dos teores totais o que é indicativo da presença de bactérias nesta matéria prima. No primeiro lote, dois dos bidões de morango apresentam valores próximos do valor máximo de bolores e leveduras demonstrando que a flora do morango pode ser essencialmente constituída por estes microrganismos e não por bactérias, logo apresenta alguma variabilidade. A grande maioria das análises demonstraram, no entanto, valores mais próximos aos das medianas de todos os lotes. O valor máximo de teores totais no terceiro lote distingue-se dos outros, o que pode ser justificado pela pouca precisão dos métodos de microbiologia clássica sendo a diferença compreensível em termos de microbiologia. Tabela 19 - Número de amostras de bidões de morango à peça analisado no primeiro lote de Compal Vital Frutos Vermelhos, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml. 1ºlote Nº de Primeiro Terceiro Mínimo Mediana amostras Máximo Teores totais Bolores e leveduras Esporos de bactérias aeróbias Tabela 20 - Número de amostras de bidões de morango à peça analisado no segundo lote de Compal Vital Frutos Vermelhos, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml. 2ºlote Nº de Primeiro Terceiro Mínimo Mediana amostras Máximo Teores totais Bolores Leveduras Esporos de bactérias aeróbias

62 Tabela 21 - Número de amostras de bidões de morango à peça analisado no terceiro lote de Compal Vital Frutos Vermelhos, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml. 3ºlote Nº de Primeiro Terceiro Mínimo Mediana amostras Máximo Teores totais Bolores Leveduras Esporos de bactérias aeróbias A caracterização microbiológica foi realizada ao bidão com a maior contaminação encontrada, ou seja, em que foi identificado um maior número de enterobactérias e uma maior contaminação em bolores. Em outros lotes foi identificada uma levedura como Candida parapsilosis. Tabela 22 - Caracterização microbiológica em termos de teores totais de um bidão de morango à peça utilizado na produção de Compal Vital Frutos Vermelhos, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses parâmetros. Tipo de microrganismo Contagem (UFC/ml) Percentagem (%) Pantoea sp Aspergillus sp Total Tabela 23 - Caracterização microbiológica em termos de bolores e leveduras de um bidão de morango à peça utilizado na produção de Compal Vital Frutos Vermelhos, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses parâmetros. Tipo de microrganismo Contagem (UFC/ml) Percentagem (%) Rhodotorula glutinis 20 6 Aspergillus sp Total Relativamente aos esporos de bactérias aeróbias, a sua contagem também apresenta alguma variabilidade sendo superior no terceiro lote analisado. Foram identificadas duas espécies, Bacillus subtilis/amyloliquefaciens e Bacillus megaterium. No primeiro caso não foi possível fazer uma distinção entre as duas espécies já que a identificação foi feita com recurso ao API CHB cujos resultados bioquímicos são idênticos para as duas espécies, no entanto a identificação por sequenciação de DNA indicou que se trata de Bacillus amyloliquefaciens. Em nenhum bidão de morango foi detetado qualquer esporo de bactérias acidófilas. Em termos de bolores termorresistentes, no primeiro lote, todos os bolores detetados são da espécie Neosartorya fischeri, exceto um dos bolores da última carga que corresponde a Dothideomycetes sp. No segundo lote apenas foram identificados três bolores sendo os representados na Figura 11, correspondentes ao 2ºlote, e um da espécie Byssochlamys nivea e, finalmente, no terceiro lote todos os detetados pertenciam à espécie Neosartorya fischeri. 42

63 Os bolores representados na Figura 11 pertencem a géneros que não têm vindo a ser reportados como bolores termorresistentes deteriorantes de produtos alimentares. São casos como os anteriores que podem apresentar reprodução sexuada e cujos esporos podem apresentar alguma resistência térmica, mas é esperada a sua morte durante a pasteurização. No entanto, detetaram-se também bolores que têm vindo a ser reportados como bolores termorresistentes, pertencentes às espécies Neosartorya fischeri e Byssochlamys nivea (Figura 12). Figura 11 Bolores identificados no teste de bolores termorresistentes no morango à peça 1) Dothideomycetes sp. (1ºlote) 2) Aspergillus sp. (2ºlote) 3) Trichocladium pyriforme (2ºlote). Figura 12 - Bolores identificados no teste de bolores termorresistentes no morango à peça 1) Neosartorya fischeri (1º e 3º lotes) 2) Byssochlamys nivea (2ºlote) Framboesa Tal como o morango à peça, a framboesa não é submetida a qualquer tratamento no fornecedor pelo que apresenta contaminações da ordem das identificadas no morango. Observando os resultados, é possível concluir que a contaminação da framboesa é semelhante nos diferentes lotes situando-se sempre a mediana na mesma ordem de grandeza. Apesar disso, verifica-se que os valores máximos estão constantemente uma ordem de grandeza acima desta, casos naturalmente identificados pelo mesmo motivo da matéria prima anterior. A contaminação em termos de bolores e leveduras é natural neste tipo de fruta tal como se pode observar, no entanto, também é de notar que há uma contaminação por parte de bactérias pela diferença entre as contagens de teores totais e as de bolores e leveduras. No terceiro lote, observa-se a existência de um bidão com contaminação, em teores totais, bastante superior às restantes e é possível verificar que a contagem de leveduras também aumentou significativamente o que permite concluir que esse aumento foi provocado por esse tipo de microrganismo. 43

64 Tabela 24 - Número de amostras de bidões de framboesa à peça analisado no primeiro lote de Compal Vital Frutos Vermelhos, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml. 1ºlote Nº de Primeiro Terceiro Mínimo Mediana amostras Máximo Teores totais Bolores e leveduras Esporos de bactérias aeróbias Tabela 25 - Número de amostras de bidões de framboesa à peça analisado no segundo lote de Compal Vital Frutos Vermelhos, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml. 2ºlote Nº de Primeiro Terceiro Mínimo Mediana amostras Máximo Teores totais Bolores Leveduras Esporos de bactérias aeróbias Tabela 26 - Número de amostras de bidões de framboesa à peça analisado no terceiro lote de Compal Vital Frutos Vermelhos, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml. 3ºlote Nº de Primeiro Terceiro Mínimo Mediana amostras Máximo Teores totais Bolores Leveduras Esporos de bactérias aeróbias A análise aos esporos de bactérias aeróbias apresentou pouca variabilidade entre bidões e lotes, no entanto foram identificados casos excecionais de elevada contaminação. Um dos esporos identificado pertence à espécie Bacillus amyloliquefaciens. Esta matéria prima não apresenta qualquer esporo de bactérias acidófilas. A caracterização microbiológica de um dos bidões permitiu concluir que as bactérias presentes são Bacillus mycoides e a levedura predominante é a Candida parapsilosis, identificadas nas percentagens referidas na Tabela 27. A identificação feita em termos de bolores e leveduras permite confirmar esta última identificação com as contagens na mesma ordem de grandeza, e caracterizar os bolores encontrados como Penicillium sp. Tabela 27 - Caracterização microbiológica em termos de teores totais de um bidão de framboesa à peça utilizado na produção de Compal Vital Frutos Vermelhos, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses parâmetros. Tipo de microrganismo Contagem (UFC/ml) Percentagem (%) Bacillus mycoides Candida parapsilosis Total

65 Tabela 28 - Caracterização microbiológica em termos de bolores e leveduras de um bidão de framboesa à peça utilizado na produção de Compal Vital Frutos Vermelhos, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses parâmetros. Tipo de microrganismo Contagem (UFC/ml) Percentagem (%) Candida parapsilosis Penicillium sp Total Em termos de bolores termorresistentes, no primeiro lote todos os bolores identificados foram do género Penicillium ou Aspergillus, sendo o último mostrado na Figura 13, no segundo lote não foram identificados quaisquer bolores termorresistentes e, finalmente, no terceiro lote todos os identificados pertenciam à espécie Byssochlamys nivea. Exceção a este caso está representada na Figura 13, correspondente à carga 8, onde foram identificados dois Penicillium sp., um Gnomoniopsis sp. e um Byssochlamys nivea. Entre estes, apenas o último é reportado como um bolor cujos ascósporos apresentam elevadas resistências térmica. Os bolores termorresistentes de morfologia distinta das identificadas anteriormente estão representados na Figura 13. Figura 13 - Bolores identificados no teste de bolores termorresistentes na framboesa à peça 1) Aspergillus sp.(1ºlote) 2) Penicillium sp (colónia verde) e Gnomoniopsis sp. (colónia rosada) (3ºlote) Produto formulado Nas cargas de produto formulado verificou-se uma diferença no comportamento dos lotes. O primeiro e o segundo apresentam valores de teores totais superiores às leveduras e bolores, o que é indicativo da presença de bactérias, mais concretamente enterobactérias provenientes das matérias primas e de contaminação durante o processamento das mesmas. No terceiro lote verifica-se que a contaminação é praticamente constituída por leveduras apresentando este lote uma contagem de teores totais e leveduras bastante superior às restantes. Observando a ordem de grandeza das mesmas, é possível observar que há um grande incremento de leveduras durante a formulação do produto desse lote, já que apenas tendo em conta a contaminação das matérias primas seria de esperar uma contaminação bastante inferior. Por este motivo, é de salientar uma grande variabilidade do processo, visto os três lotes apresentarem três ordens de grandeza diferentes assim como elevadas distancias inter. Esta variabilidade está possivelmente associada à manipulação por parte dos operadores, visto as matérias primas não apresentarem em geral esta variabilidade. 45

66 Tabela 29 - Número de amostras de cargas de produto formulado do primeiro lote de Compal Vital Frutos Vermelhos, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml. 1ºlote Nº de Primeiro Terceiro Mínimo Mediana amostras Máximo Teores totais Bolores e leveduras Esporos de bactérias aeróbias Tabela 30 - Número de amostras de cargas de produto formulado do segundo lote de Compal Vital Frutos Vermelhos, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml. 2ºlote Nº de Primeiro Terceiro Mínimo Mediana amostras Máximo Teores totais Bolores Leveduras Esporos de bactérias aeróbias Tabela 31 - Número de amostras de cargas de produto formulado do terceiro lote de Compal Vital Frutos Vermelhos, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml. 3ºlote Nº de Primeiro Terceiro Mínimo Mediana amostras Máximo Teores totais Bolores Leveduras Esporos de bactérias aeróbias Devido à elevada contaminação do terceiro lote, a caracterização do produto formulado do Compal Vital Frutos Vermelhos foi feita com base neste mesmo lote. Verificou-se uma forte predominância de leveduras Candida na análise de teores totais e a identificação de algumas enterobactérias. A análise de bolores e leveduras confirmou essa caracterização e identificou a levedura Trichosporon mucoides, que, apesar de não ter sido identificada nas matérias primas deste produto, já foi anteriormente detetada como característica da fruta ou poderá ter sido incluída durante o processo de formulação. Tabela 32 - Caracterização microbiológica em termos de teores totais de uma carga de produto formulado utilizado na produção de Compal Vital Frutos Vermelhos, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses parâmetros. Tipo de microrganismo Contagem (UFC/ml) Percentagem (%) Candida parapsilosis Pantoea sp Total

67 Tabela 33 - Caracterização microbiológica em termos de bolores e leveduras de uma carga de produto formulado utilizado na produção de Compal Vital Frutos Vermelhos, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses parâmetros. Tipo de microrganismo Contagem (UFC/ml) Percentagem (%) Candida parapsilosis Trichosporon mucoides Total Em relação aos esporos de bactérias aeróbias, estes foram detetados no produto formulado tal como seria de esperar dada a contaminação de ambas as matérias primas com este tipo de microrganismos. Um dos esporos identificado pertence à espécie Bacillus amyloliquefaciens que pode ser proveniente de qualquer das matérias primas dado ter sido identificado em ambas. As restantes espécies também poderiam estar presentes, no entanto, como não se realizou a total identificação dos microrganismos, estas não foram detetadas. O produto formulado deste sumo não apresenta qualquer esporo de bactérias acidófilas. A contaminação inicial do produto formulado foi calculada utilizando as percentagens anteriores em relação às medianas das análises do terceiro lote estudado, já que nenhum máximo sobressaiu. Tabela 34 - Contaminação inicial (UFC/ml) do Compal Vital Frutos Vermelhos baseada no produto formulado discriminada em termos de microrganismo e número de embalagens contaminadas após a pasteurização, estimado através da modelação, com base nos tempos de redução decimal desses microrganismos. A verde está indicada uma pasteurização eficaz e a rosa uma pasteurização que não garante os padrões definidos pela empresa. Microrganismo Contaminação inicial (UFC/ml) Estimativa das embalagens contaminadas após pasteurização Candida parapsilosis Pantoea sp Trichosporon mucoides Bacillus amyloliquefaciens 95 Todas A estimativa das embalagens contaminadas após pasteurização indica que todas as bactérias não formadoras de esporos termorresistentes e leveduras são eliminadas, mas sobrevivem os Bacillus. A modelação dos últimos está representada no Anexo 2. Em relação a bolores termorresistentes, verificou-se que diversos bolores detetados nas matérias primas não o foram no produto formulado. Isto já foi verificado anteriormente e a justificação mantem-se. Foi o caso do bolor Byssochlamys nivea que não foi detetado em qualquer carga de produto formulado do segundo e terceiro lotes, mas tinha sido detetado nas correspondentes matérias primas. Esta é uma observação importante, já que os ascósporos deste bolor, sendo bastante termorresistentes, podem sobreviver ao processamento térmico e o facto de a matriz poder ter alguma influência direta na sua sobrevivência, mesmo antes desse passo, é mais uma garantia de que estes não vão contaminar o produto final. 47

68 Identificou-se o bolor Dothideomycetes sp. na última carga do primeiro lote, tal como no morango à peça. O bolor da Figura 14 surgiu na 7ª carga e os restantes ascósporos identificados corresponderam a Neosartorya fischeri, detetado inclusivamente na primeira e última cargas cujo produto final foi posteriormente estudado. No segundo lote nenhum bolor termorresistente foi identificado no produto formulado e no terceiro apenas uma das cargas estava contaminada com Neosartorya fischeri. Todos os bolores identificados apresentaram uma contaminação inicial de 0,20 UFC/ml. Figura 14 - Bolor identificado no teste de bolores termorresistentes no produto formulado de Compal Vital Frutos Vermelhos, Lecanicillium psalliotae/lecanicillium aphanocladii. Este bolor é idêntico aos anteriormente identificados como sendo da Filo Ascomycota, sendo a sua interpretação semelhante à realizada anteriormente. O mesmo acontece com os restantes bolores, identificados ou não no produto formulado que não estão incluídos no grupo cujo histórico está associado à deterioração de sumos de fruta e dos quais não existem dados de tempo de redução decimal na literatura (v). A modelação referente ao bolor Neosartorya fischeri encontra-se no Anexo 2 e verifica-se que a estimativa indica que todas as embalagens de produto acabado estarão contaminadas por estes esporos, para as condições do processamento térmico aplicado Produto acabado A par do produto anteriormente estudado a modelação previu que o produto acabado não apresentaria qualquer contaminação em termos enterobactérias, leveduras ou bolores. Este resultado foi confirmado pelas análises realizadas ao produto acabado dos três lotes do sumo Compal Vital Frutos Vermelhos. Por outro lado, também como esperado, o produto acabado apresentou alguns esporos de bactérias aeróbias na análise e o teste de esterilidade confirmou que grande parte das embalagens de produto acabado estavam contaminadas. Este facto está em contradição com o modelo teórico que dava uma contaminação total das embalagens, o que pode estar associado à utilização de um método de microbiologia clássica que não é totalmente eficaz. O facto de os esporos não serem identificados na análise de esporos de bactérias aeróbias e serem detetados no teste de esterilidade é consequência do pré-enriquecimento que é feito em meio apropriado ao crescimento dos microrganismos, que permite que microrganismos que se encontravam em situação de stress nas embalagens cresçam quando adicionados a um meio de enriquecimento próprio. A identificação das colónias isoladas no teste de esterilidade confirmou a presença de Bacillus amyloliquefaciens, esporos esses que tinham sido identificados em ambas as matérias primas deste produto, conseguindo identificar-se deste modo a 48

69 fonte dos mesmos. A sua permanência nos sumos não é problemática dada a sua incapacidade de germinação ao ph do produto acabado e ao facto de não serem espécies patogénicas. Realizaram-se novos testes de esterilidade ao fim de 30 dias e de 45 dias para observar a evolução da proporção de embalagens contaminadas com estes esporos, de forma a compreender a sua sobrevivência nas condições existirem no interior das embalagens dos sumos. Tabela 35 - Proporção de resultados negativos no teste de esterilidade aos 3 lotes de produto acabado Compal Vital Frutos Vermelhos, 3 dias, 30 dias e 45 dias após a produção. 3 dias 30 dias 45 dias 1º lote 13/18 (72%) 1/3 (33%) - 2º lote 10/18 (56%) 2/9 (22%) 1/9 (11%) 3º lote 18/18 (100%) 6/9 (67%) - É possível verificar um decréscimo na percentagem de testes de esterilidade negativos nos três lotes estudados. Desta forma, é confirmado que para além de estes esporos não germinarem ao ph dos sumos de fruta, também são inativados ao longo do tempo, diminuindo por isso a percentagem de embalagens contaminadas. Os esporos apresentam uma capacidade de resistir em fase de dormência durante longos períodos de tempo e é de facto possível verificar que ao fim de 30 e 45 dias ainda existe elevada sobrevivência, no entanto, os resultados sugerem que ocorre uma inativação dos esporos com o tempo. Isto pode ser explicado pela longa permanência em condições inibidoras da sua germinação e crescimento, associada à presença de compostos com efeito bactericida, como os ácidos orgânicos ou compostos constituintes da matéria prima, que poderão afetar também os esporos quando em contacto com estes durante longos períodos de tempos, que promovam a sua gradual inativação (26)(34). Dado que a concentração inicial neste tipo de microrganismos nas embalagens não é elevada isto leva a que, inclusivamente, elas deixem de estar contaminadas e apresentem esterilidade positiva na realização do teste. Apesar dos agentes antibacterianos já estarem bastante estudados e como atuam ao nível do microrganismo, o mesmo não ocorre com os compostos com capacidade esporicida, pelo que a compreensão deste resultado é um interessante caso de posterior estudo. Em nenhuma das embalagens de produto acabado foi detetado qualquer esporo de bactérias acidófilas, tal como esperado. Finalmente, não se verificou qualquer ascósporo de bolores termorresistentes na amostra de produto acabado analisado. Confirmou-se que o bolor Byssochlamys nivea, apesar de não ter sido identificado no produto formulado, não foi detetado nas embalagens de produto acabado do fim de produção do terceiro lote, no qual tinha sido detetado na framboesa à peça na última carga. Considerou-se importante esta observação pelo motivo referido de os esporos poderem estar presentes no produto formulado, mas estarem em stress provocado pelo processo e não serem detetados e este é um bolor de referência para a deterioração de sumos de fruta. Verificou-se que ao contrário do que seria de esperar através da previsão feita com base no tempo de redução decimal do microrganismo Neosartorya fischeri, este não sobreviveu à 49

70 pasteurização, não sendo identificado em nenhuma embalagem de produto acabado analisada. No segundo lote foi identificado na primeira e última cargas cujo produto final, realizado com essas mesmas cargas, foi analisado e nenhuma das embalagens testadas estava contaminada. Estes resultados podem dever-se à associação de dois fatores. O facto de a presença de ascósporos ser bastante rara e se estar a realizar uma grande aproximação ao caracterizar um volume tão grande de produto formulado por amostras de 5g, pode levar a uma contaminação inicial calculada bastante superior à real. Além disso, a matriz do sumo pode apresentar compostos que alteram a resistência dos ascósporos, tal como os ácidos orgânicos fracos adicionados, como referido na secção , e as condições aplicadas serem suficientes para a destruição térmica dos esporos existentes. Apesar da amostra de produto acabado não ser muito extensa, a modelação previa que todas as embalagens estivessem contaminadas e o facto de as analisadas não o estarem já é indicativo de que o processo é mais eficaz do que previsto na teoria. De qualquer modo é importante um estudo mais significativo em relação a estes bolores termorresistentes, sendo algumas futuras perspetivas indicadas na secção 5. Para além dos bolores referidos, nenhum dos bolores identificados na matéria prima ou no produto formulado foram encontrados no produto acabado o que vem comprovar que eles não apresentam uma resistência térmica suficiente para sobreviver ao processo de pasteurização aplicado, não sendo problemáticos para a esterilidade deste produto Um Bongo Morango A análise de um lote de Um Bongo Morango teve o intuito de verificar, uma vez mais, o tipo de contaminação do morango, apenas em termos de esporos de bactérias acidófilas e bolores termorresistentes e o seu aparecimento no produto acabado. Para além disso, caracterizou-se a flora microbiológica do concentrado fruit-mix utilizado no Um Bongo Morango e em outros sumos da empresa, o que justifica a importância do seu conhecimento. Devido à raridade com que este sumo é produzido, apenas se realizou o seu estudo num lote, tendo-se analisado apenas a matéria prima e o produto acabado Morango Uma vez mais, os bidões de morango analisados não apresentaram qualquer esporo de bactérias acidófilas, o que já tinha sido observado no estudo do Compal Vital Frutos Vermelhos. Em relação aos bolores termorresistentes, os bolores identificados corresponderam novamente ao bolor Neosartorya fischeri indicando que este é bastante frequente na flora desta matéria prima Concentrado fruit-mix Apenas se analisaram dois bidões desta matéria prima para os quais se obtiveram valores muito semelhantes como se pode observar na Tabela 36. Conclui-se que a flora microbiana é 50

71 constituída essencialmente por leveduras, sendo os valores de teores totais muito semelhantes aos da pesquisa de leveduras. Também foram identificados alguns esporos de bactérias aeróbias, embora a principal fonte de esporos de bactérias aeróbias neste produto seja o morango à peça. Tabela 36 - Número de amostras de bidões de concentrado fruit-mix analisados no Um Bongo Morango, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml. 1ºlote Nº de Primeiro Terceiro Mínimo Mediana amostras Máximo Teores totais Bolores Leveduras Esporos de bactérias aeróbias Foi realizada a caracterização de um dos bidões de matéria prima e os resultados obtidos encontram-se nas tabelas seguintes. Tabela 37 - Caracterização microbiológica em termos de teores totais de um bidão de concentrado fruit-mix utilizado na produção de Um Bongo Morango, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses parâmetros. Tipo de microrganismo Contagem (UFC/ml) Percentagem (%) Candida famata Candida krusei 20 7 Total Tabela 38 - Caracterização microbiológica em termos de bolores e leveduras de um bidão de concentrado fruit-mix utilizado na produção de Um Bongo Morango, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses parâmetros. Tipo de microrganismo Contagem (UFC/ml) Percentagem (%) Candida famata Total Relativamente aos esporos, um dos esporos de bactérias aeróbias do concentrado fruit-mix foi identificado como Bacillus amyloliquefaciens. No lote estudado, não foram detetados esporos de bactérias acidófilas ou bolores termorresistentes. Verifica-se que o grau de contaminação deste concentrado é inferior ao do morango e, sendo o concentrado adicionado em menores quantidades que o último, não adiciona uma carga microbiológica significativa ao produto sendo o morango a maior fonte de contaminação Produto acabado O produto acabado de Um Bongo Morango analisado não apresentou qualquer contaminação em teores totais, bolores, leveduras, esporos de bactérias aeróbias e acidófilos como seria de esperar. 51

72 Apesar de não terem sido detetados esporos de bactérias aeróbias na pesquisa dos mesmos estes foram identificados posteriormente no teste de esterilidade, como justificado no produto anterior. Um dos microrganismos encontrados foi identificado como Bacillus megaterium, podendo ser proveniente dos morangos, já que este já tinha sido identificado em amostras de morangos realizadas no Compal Vital Frutos Vermelhos. Verificou-se uma diminuição ao longo dos dias do número de embalagens contaminadas demonstrando a sua incapacidade de sobreviver nas condições em que se encontram. Tabela 39 - Proporção de resultados negativos no teste de esterilidade ao produto acabado Um Bongo Morango, 3 dias, 30 dias e 45 dias após a produção. 3 dias 30 dias 45 dias 1º lote 14/18 (78%) 6/9 (67%) 3/9 (33%) Em termos de bolores termorresistentes, nenhum bolor foi identificado no produto acabado comprovando-se mais uma vez que o bolor Neosartorya fischeri não resiste às condições de pasteurização na concentração em que se encontra, ao contrário do teoricamente previsto. Este estudo permitiu obter uma maior amostra de resultados para uma maior confiança na eficácia da pasteurização face a este microrganismo Compal Clássico Pera Rocha Polpa de pera A polpa de pera, matéria prima utilizada na produção do Compal Clássico Pera Rocha, é processada na S+C, o que inclui um passo de tratamento térmico seguido de enchimento asséptico. Por este facto, a contaminação da matéria prima é quase nula. Nos resultados obtidos foi possível verificar essa baixa carga microbiana, sendo ligeiramente superior em alguns bidões estudados no primeiro lote mas estas diferenças não são microbiologicamente significativas. Tabela 40 - Número de amostras de bidões de polpa de pera analisados no primeiro lote de Compal Clássico Pera Rocha, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml. 1ºlote Nº de Primeiro Terceiro Mínimo Mediana amostras Máximo Teores totais Bolores Leveduras Esporos de bactérias aeróbias

73 Tabela 41 - Número de amostras de bidões de polpa de pera analisados no segundo lote de Compal Clássico Pera Rocha, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml. 2ºlote Nº de Primeiro Terceiro Mínimo Mediana amostras Máximo Teores totais Bolores Leveduras Esporos de bactérias aeróbias Os valores correspondentes à caracterização das colónias isoladas a partir da polpa de pera encontram-se nas Tabelas 42 e 43. Verificou-se em ambos os lotes que as colónias identificadas na análise dos teores totais correspondiam a leveduras. Apenas no primeiro lote foram identificados bolores Penicillium sp na polpa apresentando todos os microrganismos identificados uma baixa resistência térmica tal como verificado anteriormente. Tabela 42 - Caracterização microbiológica em termos de teores totais de um bidão de polpa de pera utilizado na produção de Compal Clássico Pera Rocha, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses. Tipo de microrganismo Contagem (UFC/ml) Percentagem (%) Trichosporon mucoides Total Tabela 43 - Caracterização microbiológica em termos de bolores e leveduras de um bidão de polpa de pera utilizado na produção de Compal Clássico Pera Rocha, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses. Tipo de microrganismo Contagem (UFC/ml) Percentagem (%) Penicillium sp Total Nos lotes estudados não foram detetados esporos de bactérias aeróbias e acidófilos. Em termos de bolores termorresistentes, estes não foram detetados no primeiro lote e os bolores identificados no segundo lote estão representados na Figura 15, correspondendo os dois primeiros à 4ª carga, o terceiro à 6ª e o último à 5ª. Figura 15 - Bolores identificados no teste de bolores termorresistentes na polpa de pera 1) Aspergillus sp. 2) Trichoderma atroviride/trichoderma viride 3) Penicillium cecidicola 4) Penicillium wortmannii. 53

74 O aparecimento destes bolores é natural na matéria prima. São bolores que à partida não apresentam uma resistência térmica significativamente elevada, tendo o género Aspergillus sido discutido anteriormente. Da mesma forma, os bolores do género Trichoderma estão associados a formas teleomorfas que nunca terão sido associadas à degradação de produtos alimentares (45). Estas espécies de Penicillium apresentam um teleomorfo diferente do referido anteriormente, do género Talaromyces (43). Apesar de duas espécies pertencentes a este género já terem sido reportadas como deteriorantes de sumos de fruta, Talaromyces macrosporus e T. bacillisporus, nenhuma destas espécies pertence a esses casos. Estes ascósporos terão de apresentar alguma resistência térmica, para poderem ser identificados neste teste, mas à partida prevê-se que esta não será suficiente para a sua sobrevivência às condições de pasteurização. Além disso, como em casos anteriores, a sua identificação é um caso individual em todas as amostras estudadas, sendo que estes ascósporos não são regulares na flora da pera utilizada Produto formulado As tabelas relativas à contaminação dos dois lotes analisados, em termos de produto formulado, estão representadas nas Tabelas 44 e 45. Tabela 44 - Número de amostras de cargas de produto formulado analisado no primeiro lote de Compal Clássico Pera Rocha, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml. 1ºlote Nº de Primeiro Terceiro Mínimo Mediana amostras Máximo Teores totais Bolores Leveduras Esporos de bactérias aeróbias Tabela 45 - Número de amostras de cargas de produto formulado analisado no segundo lote de Compal Clássico Pera Rocha, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml. 2ºlote Nº de Primeiro Terceiro Mínimo Mediana amostras Máximo Teores totais Bolores Leveduras Esporos de bactérias aeróbias Comparando lotes entre si, verifica-se que para este sumo existe uma variabilidade em termos de grandeza de contaminação. Tal como anteriormente, isto pode ser explicado pela manipulação durante o processo de transferência da matéria prima para os depósitos de formulação e por parte dos operadores. No primeiro lote existem elevadas contagens na análise dos teores totais que não se verificam na dos bolores e leveduras que demonstra que a contaminação é feita na sua grande maioria por bactérias, que mais tarde serão caracterizadas como enterobactérias. Também existe um aumento de 54

75 leveduras relativamente às matérias primas, apesar de menos significativo. No segundo lote, o aumento de contaminação na fase de formulação também é observado, o que é natural, no entanto é menos significativo. Em termos de caracterização, no primeiro lote foi isolada uma colónia das bactérias predominantes em todas as cargas sobre os quais se realizaram os mesmos testes químicos e obtiveram-se os mesmos resultados indicados na Tabela 17. Visto a identificação através dos testes bioquímicos API feita por comparação com bases de dados e, portanto, restritiva quanto à identificação. Estes não abrangem todos os microrganismos existentes e o teste não é extensivo, o que faz com que o resultado obtido para as diversas enterobactérias não ter sido conclusivo. A identificação mais provável vem indicada na Tabela 46. Tabela 46 - Caracterização microbiológica em termos de teores totais de uma carga de produto formulado utilizado na produção de Compal Clássico Pera Rocha, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses. Tipo de microrganismo Contagem (UFC/ml) Percentagem (%) Pantoea sp Total Tabela 47 - Caracterização microbiológica em termos de bolores e leveduras de uma carga de produto formulado utilizado na produção de Compal Clássico Pera Rocha, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses. Tipo de microrganismo Contagem (UFC/ml) Percentagem (%) Trichosporon mucoides Penicillium sp Total No cálculo da contaminação inicial em relação ao produto formulado, foram utilizados os valores máximos dos diversos parâmetros do primeiro lote, já que estes apresentam uma ordem de grandeza superior à da mediana. A partir dos teores totais retirou-se a contaminação em termos de enterobactérias visto ser o único microrganismo identificado na placa caracterizada e das análises de leveduras e bolores foram extraídos os respetivos máximos. Tabela 48 - Contaminação inicial (UFC/ml) do Compal Clássico Pera Rocha baseada no produto formulado discriminada em termos de microrganismo e número de embalagens contaminadas após a pasteurização, estimado através da modelação, com base nos tempos de redução decimal desses microrganismos. A verde está indicada uma pasteurização eficaz e a rosa uma pasteurização que não garante os padrões definidos pela empresa. Microrganismo Contaminação inicial (UFC/ml) Estimativa das embalagens contaminadas após pasteurização Pantoea sp Trichosporon mucoides Penicillium sp

76 Não foram detetados quaisquer esporos de bactérias aeróbias e acidófilos, como seria de esperar já que a matéria prima também não possuía nenhum. Quanto a bolores termorresistentes foi identificado o já analisado género Aspergillus no primeiro lote, representado na Figura 16. Nenhum dos restantes bolores identificados na matéria prima foi identificado no produto formulado, com uma justificação semelhante aos restantes produtos. Figura 16 - Bolor Aspergillus sp. identificado no teste dos bolores termorresistentes numa carga de produto formulado de Compal Pera Rocha estudado Produto acabado Segundo a previsão feita pela modelação, o produto acabado não apresentaria qualquer contaminação em termos de enterobactérias, leveduras ou bolores. Este resultado foi confirmado pelas análises realizadas ao produto acabado dos dois lotes de Compal Clássico Pera Rocha que não indicaram qualquer presença destes microrganismos. O teste de esterilidade foi positivo para todos os pacotes de produto acabado analisado, o que vem comprovar essa esterilidade dos sumos, tanto em relação aos microrganismos referidos como em esporos de bactérias aeróbias, geralmente detetados neste teste. Confirmou-se que não existiam esporos de bactérias aeróbias e acidófilos na matéria prima e produto formulado, já que estes resistiriam ao processo de pasteurização e seriam identificados no produto acabado caso estivessem presentes o que não sucedeu. Concluiu-se também que o produto final não apresenta qualquer esporo de bolores termorresistentes, não tendo sido identificado qualquer dos bolores da matéria prima e produto formulado. Apesar da amostragem de produto não incluir todas as cargas, inclusivamente cargas onde foram detetados esporos de bolores termorresistentes, este produto não apresenta esporos dos bolores reportados com uma maior resistência térmica e, não existindo histórico bibliográfico ou da empresa de deterioração de produto pelos esporos identificados pressupõe-se que estes não são críticos para a validação do processo Compal 100% Laranja Concentrado de Laranja O concentrado de laranja utilizado no Compal 100% Laranja é proveniente de fornecedores externos à empresa sendo este apenas concentrado e embalado pelo que é possível e natural 56

77 apresentar alguma contaminação inicial. As tabelas seguintes indicam as contaminações dos dois lotes estudados deste sumo, que permitiram essa verificação. Tabela 49 - Número de amostras de bidões de concentrado de laranja analisado no primeiro lote de Compal 100% Laranja, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml. 1ºlote Nº de Primeiro Terceiro Mínimo Mediana amostras Máximo Teores totais Bolores Leveduras Esporos de bactérias aeróbias Tabela 50 - Número de amostras de bidões de concentrado de laranja analisado no segundo lote de Compal 100% Laranja, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml. 2ºlote Nº de Primeiro Terceiro Mínimo Mediana amostras Máximo Teores totais Bolores Leveduras Esporos de bactérias aeróbias Observou-se que a contaminação do concentrado de laranja é essencialmente devida à presença de leveduras e algumas bactérias que correspondem à diferença entre os teores totais e as leveduras. Os bolores são praticamente inexistentes. Em ambos os lotes a ordem de grandeza dos resultados é bastante baixa, embora ligeiramente superior no segundo, e não será problemática em termos de eficácia para a pasteurização. Procedeu-se à caracterização microbiológica da flora microbiológica do concentrado. Verificouse que ambos os lotes apresentavam o mesmo tipo de microrganismos. A Tabela 51 é referente a um dos bidões utilizadas no segundo lote estudado e em que se verificou que 89% dos microrganismos correspondem a leveduras Candida parapsilosis e os restantes 11% são Bacillus amyloliquefaciens. A identificação dos microrganismos da mesma carga da análise para bolores e leveduras, na Tabela 52, confirma a caracterização feita em termos de leveduras, verificando-se uma diferença em termos de contagens que não é significativa. Tabela 51 - Caracterização microbiológica em termos de teores totais de um bidão de concentrado de laranja utilizado na produção de Compal 100% Laranja, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses parâmetros. Tipo de microrganismo Contagem (UFC/ml) Percentagem (%) Bacillus amyloliquefaciens Candida parapsilosis Total

78 Tabela 52 - Caracterização microbiológica em termos de bolores e leveduras de um bidão de concentrado de laranja utilizado na produção de Compal 100% Laranja, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses parâmetros. Tipo de microrganismo Contagem (UFC/ml) Percentagem (%) Candida parapsilosis Total Em relação aos esporos de bactérias aeróbias as contagens foram baixas sendo ligeiramente mais elevadas no segundo lote estudado. Um dos esporos foi identificado como Bacillus amyloliquefaciens. Na análise de esporos de bactérias acidófilas todas as contagens foram negativas. Relativamente aos bolores termorresistentes, em ambos os lotes estudados apenas foi identificado um bolor em um dos bidões analisados no primeiro lote. Este bolor foi identificado estando a sua morfologia e identificação representados na Figura 17. Trata-se de um bolor do género Aspergillus, cujo aparecimento e sobrevivência já foram justificados e previstos anteriormente. Figura 17 - Bolor Aspergillus sp. identificado no teste dos bolores termorresistentes num bidão de concentrado de laranja estudado Produto formulado Em termos de produto formulado, as contagens apresentam-se mais homogéneas. Verifica-se que para o segundo lote há apenas um ligeiro aumento de esporos de bactérias aeróbias, o que é compatível com o facto de as matérias primas apresentarem uma maior contaminação também no segundo lote. Tabela 53 - Número de amostras de cargas de produto formulado analisado no primeiro lote de Compal 100% Laranja, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml. 1ºlote Nº de Primeiro Terceiro Mínimo Mediana amostras Máximo Teores totais Bolores Leveduras Esporos de bactérias aeróbias

79 Tabela 54 - Número de amostras de cargas de produto formulado analisado no segundo lote de Compal 100% Laranja, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml. 2ºlote Nº de Primeiro Terceiro Mínimo Mediana amostras Máximo Teores totais Bolores Leveduras Esporos de bactérias aeróbias Relativamente à caracterização microbiológica mais uma vez se verificou o aparecimento de enterobactérias como é comum nas cargas de produto formulado. Observou-se uma permanência de microrganismos provenientes da matéria prima em termos de leveduras e bacilos Gram-positivos. A caracterização da flora microbiana de uma das cargas de produto formulado do segundo lote foi realizada e está representada nas Tabelas 55 e 56. A identificação da enterobactéria foi realizada por diversos testes bioquímicos representados na Tabela 17, diferenciando apenas o resultado do API. O produto formulado deste sumo é caracterizado por 35% da enterobactéria Klebsiella pneumoniae ssp, 35% de Candida parapsilosis e 30% de Bacillus amyloliquefaciens. A contagem de leveduras da mesma carga encontra-se dentro da mesma ordem de grandeza dos teores totais, sendo a mesma levedura a identificada, o que é um resultado concordante. Tabela 55 - Caracterização microbiológica em termos de teores totais de uma carga de produto formulado utilizado na produção de Compal 100% Laranja, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses parâmetros. Tipo de microrganismo Contagem (UFC/ml) Percentagem (%) Klebsiella pneumoniae ssp Candida parapsilosis Bacillus amyloliquefaciens Total Tabela 56 - Caracterização microbiológica em termos de bolores e leveduras de uma carga de produto formulado utilizado na produção de Compal 100% Laranja, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses parâmetros. Tipo de microrganismo Contagem (UFC/ml) Percentagem (%) Candida parapsilosis Total A contaminação inicial de cada microrganismo para uma contagem equivalente à mediana do primeiro lote em estudo, encontra-se na Tabela

80 Tabela 57 - Contaminação inicial (UFC/ml) do Compal 100% Laranja baseada no produto formulado discriminada em termos de microrganismo e número de embalagens contaminadas após a pasteurização, estimado através da modelação, com base nos tempos de redução decimal desses microrganismos. A verde está indicada uma pasteurização eficaz e a rosa uma pasteurização que não garante os padrões definidos pela empresa. Microrganismo Contaminação inicial (UFC/ml) Estimativa das embalagens contaminadas após pasteurização Klebsiella pneumoniae ssp Candida parapsilosis 61 0 Bacillus amyloliquefaciens 53 Todas Tanto as enterobactérias como as leveduras são totalmente destruídas permanecendo os esporos de bactérias aeróbias, que tal como já referido, não representam um problema para a esterilidade comercial deste produto. Em nenhuma das cargas de produto formulado de Compal 100% Laranja foram detetados esporos de bactérias acidófilas nem bolores termorresistentes, o que é um resultado bastante positivo pois estes são os dois grupos fundamentais causadores da deterioração dos sumos Produto acabado As 18 embalagens de produto acabado analisado para cada lote de Compal 100% Laranja vieram demonstrar que qualquer dos microrganismos identificados anteriormente, de baixa resistência térmica, foi destruído no processo de pasteurização tendo esta sido eficaz. Em nenhuma embalagem foram detetados esporos de bactérias aeróbias, no entanto, o teste de esterilidade indicou a sua presença após o enriquecimento, em todas elas. Estas observações são coerentes com aquilo que foi previsto na abordagem à matéria prima e ao produto formulado, já que os Bacillus identificados são bastante termorresistentes e é natural que estes sobrevivam à pasteurização e sejam detetados no teste de esterilidade dos sumos. No primeiro lote, verifica-se que o teste de esterilidade foi negativo para os 18 pacotes ao fim de 3 dias de produção e no teste feito a 6 novas embalagens ao fim de 30 dias, apenas 3 dessas tiveram um resultado negativo. Isto vem demonstrar que este tipo de microrganismo não consegue sobreviver nas condições existentes no interior das embalagens e que a contaminação por parte deste microrganismo vai diminuindo ao longo do tempo. No segundo lote apenas se realizou o teste ao fim de 3 dias, apresentando todas as embalagens um resultado negativo. Tabela 58 - Proporção de resultados negativos no teste de esterilidade ao primeiro lote de produto acabado Compal 100% Laranja, após 3 e 30 dias após a produção. 3 dias 30 dias 1º lote 18/18 (100%) 3/6 (50%) 60

81 Não foram identificados quaisquer esporos de bactérias acidófilas e bolores termorresistentes pelo que se prevê que estes lotes não apresentem qualquer risco de deterioração durante o seu armazenamento Compal 100% Maçã Sumo clarificado e concentrado de maçã O sumo clarificado e concentrado de maçã provém de fornecedores externos à empresa e no seu processamento inclui-se um passo de ultrafiltração que permite a eliminação de microrganismos pelo que o grau de contaminação inicial é baixo. As tabelas seguintes indicam as contaminações dos três lotes estudados que permitiram essa verificação. Observou-se que a contaminação do sumo é essencialmente devida à presença de bolores e leveduras, embora com uma ordem de grandeza bastante baixa. Tabela 59 - Número de amostras de bidões de sumo clarificado e concentrado de maçã analisados no primeiro lote de Compal 100% Maçã, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml. 1ºlote Nº de Primeiro Terceiro Mínimo Mediana amostras Máximo Teores totais Bolores Leveduras Esporos de bactérias aeróbias Tabela 60 - Número de amostras de bidões de sumo clarificado e concentrado de maçã analisados no segundo lote de Compal 100% Maçã, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml. 2ºlote Nº de Primeiro Terceiro Mínimo Mediana amostras Máximo Teores totais Bolores Leveduras Esporos de bactérias aeróbias Tabela 61 - Número de amostras de bidões de sumo clarificado e concentrado de maçã analisados no terceiro lote de Compal 100% Maçã, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml. 3ºlote Nº de Primeiro Terceiro Mínimo Mediana amostras Máximo Teores totais Bolores Leveduras Esporos de bactérias aeróbias Procedeu-se à caracterização microbiológica da flora microbiológica do sumo. Verificou-se que os lotes apresentavam o mesmo tipo de microrganismos na análise dos teores totais, sendo estes leveduras. A Tabela 62 é referente a um dos bidões utilizadas no segundo lote estudado, no qual se 61

82 verificou que 100% dos microrganismos correspondem a leveduras Trichosporon mucoides. A identificação dos microrganismos da mesma carga da análise para bolores e leveduras, na Tabela 63, indica a presença da espécie Candida parapsilosis e do bolor Penicillium sp, diferentes da identificação feita nos teores totais o que é compreensível dada a caracterização ser feita de acordo com os microrganismos que se destaca, podendo estar presentes outros géneros, como os que são identificados no teste especifico de bolores e leveduras. Tabela 62 - Caracterização microbiológica em termos de teores totais de um bidão de sumo clarificado e concentrado de maçã utilizado na produção de Compal 100% Maçã, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses parâmetros. Tipo de microrganismo Contagem (UFC/ml) Percentagem (%) Trichosporon mucoides Total Tabela 63 - Caracterização microbiológica em termos de bolores e leveduras de um bidão de sumo clarificado e concentrado de maçã utilizado na produção de Compal 100% Maçã, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses parâmetros. Tipo de microrganismo Contagem (UFC/ml) Percentagem (%) Candida parapsilosis Penicillium sp Total Em termos de esporos, o sumo não apresenta esporos de bactérias aeróbias. Não foram quantificados esporos de bactérias acidófilas, ou seja, não foram detetados na análise imediata de quantificação. No entanto, neste produto foram posteriormente testados dois outros procedimentos, descritos nas secções e , em que se faz uma pesquisa específica de ACB. Esta pesquisa foi realizada dado o histórico da empresa apresentar alguns casos de incidência de ACB nesta matéria prima, apesar de não se refletir diretamente num histórico de reclamações de produto acabado. Através deste método obtiveram-se resultados positivos de presença de ACB em alguns dos bidões de matéria prima. Isto pode ser explicado pelo facto de estes se apresentarem em muito baixo número e em condições de stress no interior dos bidões e apenas crescerem após um enriquecimento com meio bastante especifico para o seu crescimento a 44ºC durante 3 dias, temperatura ótima para este tipo de microrganismo. No primeiro lote a deteção foi negativa em todo o clarificado estudado, no segundo foi positiva em 1/5 dos combos e no terceiro em 9/12 dos bidões. Realizou-se o teste da produção de guaiacol ao combo positivo no segundo lote e a um dos bidões do terceiro lote e ambos apresentaram um resultado positivo, indicando a presença de ACB. No primeiro e terceiro lotes não foi identificado qualquer microrganismo na análise aos bolores termorresistentes. No segundo lote foram identificados os mesmos bolores do produto formulado, do género Aspergillus sp. do Compal Clássico Pera Rocha. 62

83 Produto formulado Em termos de produto formulado as contagens continuam a ser bastante reduzidas. Enquanto que no Compal Pera Rocha um dos lotes verificou uma elevada contaminação de enterobactérias o mesmo não aconteceu com qualquer dos lotes deste sumo, possivelmente devido a agentes antimicrobianos constituintes da maçã que tornam a matriz menos suscetível a este tipo de contaminação durante a formulação do produto final. Tabela 64 - Número de amostras de cargas de produto formulado analisado no primeiro lote de Compal 100% Maçã, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml. 1ºlote Nº de Primeiro Terceiro Mínimo Mediana amostras Máximo Teores totais Bolores Leveduras Esporos de bactérias aeróbias Tabela 65 - Número de amostras de cargas de produto formulado analisado no segundo lote de Compal 100% Maçã, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml. 2ºlote Nº de Primeiro Terceiro Mínimo Mediana amostras Máximo Teores totais Bolores Leveduras Esporos de bactérias aeróbias Tabela 66 - Número de amostras de cargas de produto formulado analisado no terceiro lote de Compal 100% Maçã, incluindo os resultados do mínimo, primeiro, mediana, terceiro e máximo de contaminações em teores totais, bolores, leveduras e esporos de bactérias aeróbias em UFC/ml. 3ºlote Nº de Primeiro Terceiro Mínimo Mediana amostras Máximo Teores totais Bolores Leveduras Esporos de bactérias aeróbias Relativamente à caracterização microbiológica, mais uma vez verificou-se o aparecimento de enterobactérias, como é comum nas cargas de produto formulado, e a permanência da flora proveniente das matérias primas. A caracterização da flora microbiana de uma das cargas de produto formulado do segundo lote foi realizada e está representada nas Tabelas 67 e 68. A identificação da enterobactéria foi realizada por diversos testes bioquímicos, representados na Tabela 17, diferenciando apenas o resultado do API. O produto formulado deste sumo é caracterizado por 78% da enterobactéria Klebsiella pneumoniae sp. e 22% de Candida parapsilosis. A contagem de leveduras da mesma carga é um pouco superior à realizada no teste dos teores totais, no entanto esta diferença não é significativa existindo uma concordância em relação à espécie identificada. 63

84 Tabela 67 - Caracterização microbiológica em termos de teores totais de uma carga de produto formulado utilizado na produção de Compal 100% Maçã, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses parâmetros. Tipo de microrganismo Contagem (UFC/ml) Percentagem (%) Klebsiella pneumoniae sp Candida parapsilosis Total Tabela 68 - Caracterização microbiológica em termos de bolores e leveduras de uma carga de produto formulado utilizado na produção de Compal 100% Maçã, com a respetiva contagem e percentagem de cada microrganismo identificado e os totais desses parâmetros. Tipo de microrganismo Contagem (UFC/ml) Percentagem (%) Candida parapsilosis Total A contaminação inicial de cada microrganismo para uma contagem equivalente à mediana do primeiro lote em estudo, 85 UFC/ml, encontra-se na Tabela 69. Apesar de existir um valor máximo numa das cargas de produto formulado com uma ordem de grandeza superior essa diferença não é significativa devido à natureza dos microrganismos identificados. Anteriormente, já foi possível verificar que a resistência térmica dos mesmos é reduzida e uma diferença a este nível não levará a qualquer dúvida na eficácia do processo de pasteurização em utilização. Tabela 69 - Contaminação inicial (UFC/ml) do Compal 100% Maçã baseada no produto formulado discriminada em termos de microrganismo e número de embalagens contaminadas após a pasteurização, estimado através da modelação, com base nos tempos de redução decimal desses microrganismos. A verde está indicada uma pasteurização eficaz e a rosa uma pasteurização que não garante os padrões definidos pela empresa. Microrganismo Contaminação inicial (UFC/ml) Estimativa de embalagens contaminadas após pasteurização Klebsiella pneumoniae ssp Candida parapsilosis 19 0 Tal como seria de esperar, não foram detetados esporos de bactérias aeróbias já que a matéria prima não os contém. Os esporos de bactérias acidófilas não foram detetados na análise imediata, tal como na matéria prima, no entanto, obtiveram-se resultados positivos após o enriquecimento em BAT broth. No primeiro e segundo lotes nenhum teste foi positivo, o que seria de esperar no primeiro lote dada a matéria prima não estar contaminada. No segundo lote a carga de produto formulado na qual foi utilizado o bidão positivo deveria estar contaminada o que não acontece. Este facto deve ser devido a uma contaminação do bidão bastante reduzida e/ou a diluição e adição de ácidos orgânicos fracos e outros componentes apresentar um efeito bactericida, não sendo detetada contaminação no produto 64

85 formulado. A sua ação será explicada no próximo estudo. No terceiro lote todas as formulações apresentaram esporos de bactérias acidófilas, sendo que numa das cargas foi efetuado o teste do guaiacol que indicou presença de ACB. Este lote apresentava possivelmente uma contaminação inicial mais elevada e o efeito da matriz do produto pode não ser suficiente para inativar os esporos presentes. Para observar o resultado esperado em embalagens de produto final contaminado aplicou-se a modelação com o tempo de redução decimal considerando apenas 0,1 UFC/ml, já que não é possível a quantificação do ACB presente, visto que após o enriquecimento a contagem já não é realista. Foi escolhido este valor já que é necessário que nos 10ml de amostra enriquecida exista pelo menos um esporo para que se observe crescimento. O resultado, representado no Anexo 2, permite concluir que o ACB tem uma resistência térmica de tal forma elevada que, com apenas este nível de contaminação e para os tempos de holding dos pasteurizadores desta fábrica, seriam necessárias temperaturas de pelo menos 105ºC para que se deixasse de ter uma previsão de contaminação de todas as embalagens. Estas condições tornam-se bastante agressivas para este tipo de produto, pois levam à perda das suas características organoléticas. Por outro lado, o ACB não é um microrganismo patogénico e a sua presença nos sumos de fruta não tem impacto na saúde do consumidor, não apresentando problema ser mantido nos sumos. O fator importante a ter em conta é a garantia de que este não apresente um nível de concentração suficiente para que produza quantidades de guaiacol que levem à deterioração do sumo com possível alteração do sabor detetável pelo consumidor. Segundo a bibliografia este ponto de transição acontece quando o ACB está presente em quantidades bastantes elevadas e tornou-se importante, neste estudo, perceber qual o comportamento do ACB na matriz deste sumo no qual foi detetado (9). Este estudo encontra-se na secção 4.2. No primeiro lote estudado, em duas das cargas de produto formulado foi identificado o bolor Byssochlamys nivea também característico no caso do morango e da framboesa à peça numa contaminação inicial de 0,2 UFC/ml. No segundo lote, foi identificado o mesmo bolor identificado no sumo clarificado e concentrado de maçã deste lote, Aspergillus sp., numa contaminação inicial de 0,6 UFC/ml, e no terceiro lote não se identificou qualquer bolor termorresistente. A modelação referente ao primeiro bolor (Anexo 2) prevê que todas as embalagens de produto acabado estarão contaminadas por estes esporos Produto acabado Todas as análises de produto acabado vêm reforçar as conclusões quanto à resistência térmica dos microrganismos identificados no produto formulado. Verificou-se que nos três lotes estudados as análises dos teores totais, bolores e leveduras e dos esporos de bactérias aeróbias foram todas negativas comprovando-se que todos os microrganismos foram inativados no processo de pasteurização utilizado. Em nenhum dos lotes foram detetados esporos de bactérias aeróbias. Nos dois primeiros lotes, nenhuma das embalagens de produto acabado estava contaminada com esporos de bactérias acidófilas. Este resultado é concordante com o facto de nenhuma das formulações indicar presença de 65

86 ACB. No terceiro lote, 3 dos 18 pacotes estavam contaminados com esporos de bactérias acidófilas não sendo a sua quantificação possível. Segundo o teste da deteção de guaiacol, o microrganismo de um dos pacotes produzia guaiacol sendo identificado como ACB e os restantes não produziam guaiacol correspondendo possivelmente a contaminação por Alicyclobacillus acidocaldarius (VII). Apesar dos bidões e produto formulados analisados apenas indicarem a presença de ACB é natural que possam estar presentes as duas espécies e ser agora identificado A. acidocaldarius no produto acabado, dado que não se caracterizam todas as colónias. Segundo a simulação teórica efetuada com o tempo de redução decimal do ACB, todas as embalagens deveriam estar contaminadas, o que na prática não é observado. Este facto pode estar relacionado com o método de microbiologia clássica utilizado que ainda não foi considerado o ideal para a deteção de ACB e que tem sido constantemente revisto nos últimos anos. Isto deve-se ao facto do estudo do ACB ser recente e haver ainda vários estudos a decorrer para o compreender na totalidade. Estes resultados também se podem relacionar com o facto da matriz deste sumo não ser ideal ao crescimento deste microrganismo, como se pode deduzir no estudo seguinte, e com uma tão baixa contaminação inicial do produto que nem é quantificável pelo método utilizado, pode inativar os poucos esporos presentes em algumas das embalagens analisadas. Nenhum dos bolores termorresistentes identificados no sumo clarificado e concentrado de maçã e no produto formulado foi identificado nas embalagens de produto final de Compal 100% Maçã, inclusivamente o bolor Byssochlamys nivea que tem sido descrito como um microrganismo de elevada resistência térmica e deteriorante de sumos de fruta (15). O produto acabado produzido pela primeira carga de produto formulado, no qual foi detetado este esporo, foi testada na amostra de produto acabado e pelo menos nas 6 embalagens testadas, não foi detetado qualquer esporo. A mesma explicação encontrada no caso do produto Compal Vital Frutos Vermelhos pode ser aplicada Estudo do crescimento do ACB e produção de guaiacol no produto Compal 100% Maçã A identificação do esporo da bactéria acidófila ACB no produto Compal 100% Maçã e a sua presença no produto acabado é um importante caso de estudo já que se estes esporos foram capazes de crescer no interior dos sumos, podem levar à deterioração dos mesmos e por em causa a esterilidade comercial do produto (5)(9). A conjugação de diversos fatores intrínsecos e extrínsecos com influência no crescimento microbiano, referidos na secção 2.2.5, tornam-se assim fundamentais na garantia de que o produto está conforme em termos de esterilidade comercial. São estes fatores que garantem que os microrganismos que resistiram ao processo de pasteurização não têm capacidade de crescer durante a fase de armazenamento. Neste estudo pretendeu-se verificar a capacidade de desenvolvimento de ACB no Compal 100% Maçã, através da comparação de diversas condições de inoculação e armazenamento. Testouse sumo inoculado com 100 e 10 5 UFC/ml de esporos de ACB, sujeito ou não a posterior pasteurização. Comparou-se ainda o crescimento em meio BAT agar inoculado com 100 UFC/ml, com e sem pasteurização. 66

87 Figura 18 - Log N (nº células viáveis) de ACB em função do tempo (horas) em meio BAT broth, inoculado com 100 UFC/ml, sem pasteurização ou após pasteurização, a) a 44ºC e b) à temperatura ambiente. Os gráficos da Figura 18, a) e b), mostram que o ACB apresenta uma curva normal de crescimento em meio BAT broth, tanto a 44ºC como à temperatura ambiente. A contagem inicial do produto não pasteurizado foi de 140 UFC/ml e pasteurizado de 90 UFC/ml que, apesar de diferente, não é uma alteração significativa podendo estar relacionada com a inoculação e não com uma inativação promovida com a pasteurização. Apesar da temperatura ótima de crescimento do ACB ser cerca de 45ºC, este conseguiu crescer à temperatura ambiente sem qualquer problema, demonstrando que o seu crescimento a temperaturas como a testada também é possível, quando possui condições nutritivas ideais para tal. Foi ainda possível observar que a pasteurização não inibiu o crescimento da bactéria. Quando inoculado em Compal 100% Maçã, o ACB não apresentou o mesmo comportamento como observado nos gráficos seguintes. Os inóculos para o sumo não pasteurizado e pasteurizado foram de 100 UFC/ml e 240 UFC/ml, respetivamente, o que reforça que a pasteurização não levou à inativação dos esporos. Figura 19 - Log N (nº células viáveis) de ACB em função do tempo (horas) em Compal 100% Maçã, inoculado com 100 UFC/ml, sem pasteurização ou após pasteurização, a) a 44ºC e b) à temperatura ambiente. Verificou-se que a 44ºC existiu um ligeiro crescimento bacteriano, mas existiu um efeito inibidor que não lhes permitiu crescer para concentrações tão elevadas que a alteração de sabor provocada pela produção de guaiacol fosse percetível. Este comportamento apenas foi verificado a essa temperatura e em produto que não foi pasteurizado. Às restantes condições, as contagens diminuíram, no entanto, as células vegetativas não foram totalmente eliminadas, indicando que este sumo apresenta características bactericidas e bacteriostáticas. Observou-se que o ACB não tem capacidade de se 67

88 multiplicar para concentrações deteriorantes do sumo, quando inoculado com esporos na ordem de grandeza dos 10 2 UFC/ml. Pelos estudos realizados às matérias primas, verifica-se que os esporos deverão estar presentes em quantidades inferiores a estas já que não são detetáveis aquando da sua quantificação. A inoculação de sumo com uma concentração mais elevada, 10 5 UFC/ml, teve como objetivo, observar a produção de guaiacol já que, segundo a literatura, esta concentração já é suficiente para que o guaiacol seja notado sensorialmente, através da alteração de sabor do sumo (9). Figura 20 Log N (nº células viáveis) de ACB em função do tempo (horas) em Compal 100% Maçã, inoculado com 10 5 UFC/ml, sem pasteurização ou após pasteurização, a) a 44ºC e b) à temperatura ambiente. Essa alteração não foi verificada, a nenhuma das temperaturas utilizadas, quer haja pasteurização ou não. Verificou-se que a contagem de células vegetativas de ACB apresentou uma redução em relação à contaminação inicial em esporos ao fim de 7 dias para concentrações que já não estavam reportadas como capazes de deteriorar o sumo. Isto explica o facto de o sumo ter mantido as suas características e reforça a possibilidade de algum composto constituinte do sumo apresentar características bactericidas que, apesar de não destruir totalmente os esporos, reduz em muito a ordem de grandeza, e bacteriostáticas, que não permitem o seu crescimento. Este estudo, embora simplificado, permite concluir que, tal como no caso de esporos de bactérias aeróbias identificados em outros produtos, o ACB também não possui as condições ideais ao seu crescimento nesta matriz. Apesar de no caso do ACB o ph da matriz não ser um fator determinante, outros diversos fatores podem ser responsáveis por este comportamento, como, entre outros, a presença de ácidos orgânicos fracos no produto, neste caso o ácido cítrico, e os constituintes antimicrobianos da maçã utilizada. O efeito antimicrobiano dos ácidos orgânicos fracos deve-se a dois principais fatores, a sua influência no ph e o efeito especifico dos próprios ácidos. Neste caso, é este último que pode promover uma alteração no comportamento do ACB nas duas matrizes, dado apresentarem valores de ph semelhantes (46). Freese et al. (1973) indicaram que a inibição promovida pelos ácidos orgânicos fracos está relacionada com a concentração de ácido indissociado já que este penetra mais facilmente no interior das células e dissocia-se no seu interior, reduzindo o ph do citoplasma. Dessa forma, o seu efeito está relacionado com a constante de dissociação de cada ácido (pka). Geralmente, ácidos com valores superiores de pka apresentam uma maior capacidade inibitória do que ácidos fortes, a um dado ph. Valores de ph mais reduzidos, como o do produto em estudo, favorecem o estado indissociado 68

89 dos ácidos fracos, pelo que induzem esse efeito inibitório, podendo ser este explicativo do comportamento observado neste estudo (47)(48). A ação dos constituintes antimicrobianos da maçã já foi explicada e pormenorizada na secção Muitas vezes, a ação dos fatores referidos individualmente pode não ter um efeito significativo, mas a sua interação e atuação em conjunto leva a consideráveis alterações no comportamento dos microrganismos. Será importante a compreensão exata dos fatores indutores da inibição verificada neste produto. Concluindo, este estudo veio demonstrar que é possível considerar que este sumo apresenta esterilidade comercial, pois apesar da resistência do ACB ao processo de pasteurização, o seu desenvolvimento é inibido pela matriz. 5. CONCLUSÕES E PERSPETIVAS FUTURAS Este trabalho teve como objetivo uma caracterização da flora microbiana das matérias primas e produto formulado utilizados na produção de alguns sumos de fruta da Sumol+Compal Marcas S.A. e que se baseou na necessidade de conhecer os níveis de contaminação inicial dos sumos de fruta. A informação obtida permite prever a sobrevivência dos microrganismos detetados com o objetivo de validar o processo térmico de esterilização comercial utilizado na empresa. Além disso, a informação sintetizada através dos dados recolhidos permitirá um melhor domínio imediato do processo, de forma a evitar problemas de qualidade, e constituir uma base de suporte para futuros trabalhos de otimização de processo. O conjunto do estudo realizado sobre os diversos produtos e suas matérias primas permitiu chegar a um grupo de conclusões importantes para o conhecimento do comportamento da flora microbiana introduzida nos sumos através das matérias primas e seu processamento. Podemos concluir que a grande maioria da flora microbiana das matérias primas utilizadas em todos os produtos são leveduras e bolores sendo estes característicos de meios como a fruta. Apenas em algumas matérias primas existe outro tipo de flora, nomeadamente bacilos Gram-positivos em morango, framboesa, concentrado de laranja e sumo de laranja do Algarve. Foi ainda observada uma grande incidência de bactérias ácido-lácticas neste último sumo. O processo de formulação do produto final introduz microrganismos no produto, nomeadamente leveduras e enterobactérias. Este facto é considerado normal já que há manipulação direta sobre o produto pelo operador e existe introdução de água que promove o crescimento deste tipo de microrganismos. Alguns dos resultados demonstraram a necessidade de repetição de estudos ou realização de novos mais pormenorizados. O elevado grau de contaminação do sumo de laranja do Algarve e a sua variabilidade são um importante caso de futuro estudo, para melhor compreensão da justificação destas observações e possível otimização de processo. A repetição das análises a novos lotes dos produtos Um Bongo Morango e Compal Clássico Pera Rocha é também necessária. No primeiro caso apenas 69

90 se analisou um lote, o que se torna insuficiente, para validação do grau de contaminação e caracterização da flora microbiana da matéria prima concentrado fruit-mix. Relativamente ao segundo produto, o produto formulado do primeiro lote apresentou alguma variabilidade e um grande aumento da contaminação relativamente à matéria prima. A repetição da análise permitiria compreender qual o caso que se aproxima mais da realidade do processo. Verificou-se uma total eliminação das bactérias ácido lácticas e leveduras que poderiam degradar o produto através de processos fermentativos. Também se assiste à eliminação de bolores que poderiam tornar o produto bolorento, assim como de enterobactérias, já que todos eles apresentam baixas resistências térmicas. Observou-se que a ferramenta de simulação da cinética de destruição térmica pode conduzir a valores distantes da realidade em relação aos ascósporos de bolores termorresistentes. Esta observação pode ser explicada pelo facto da modelação aplicada ser bastante simplificada, utilizandose valores referenciados na literatura para condições próximas das dos produtos em estudo. Os valores reais são fortemente influenciados por inúmeros fatores e pela interação entre os mesmos, sendo o comportamento dos microrganismos diferente para cada situação, o que torna difícil a previsão dos valores D e z para a situação real em estudo. Além disso, a contaminação inicial com este tipo de esporos é difícil de determinar, já que a ocorrência destes esporos é bastante rara e o valor aproximado de contaminação obtido da amostra colhida pode levar a valores superiores aos reais. Apesar da modelação indicar que para a contaminação inicial calculada dos esporos de bolores termorresistentes encontrados, todas as embalagens de produto acabado ficariam contaminadas, em nenhumas das amostras colhidas foram encontrados esporos dessas espécies ou de qualquer outra. Isto demonstra que as condições de pasteurização em utilização são suficientes para o grau de contaminação inicial em questão dos ascósporos de bolores termorresistentes. Os esporos de bactérias aeróbias são bastante termorresistentes e seria necessário um processo de esterilização para que fossem totalmente eliminados dos sumos onde foram detetados, nomeadamente Compal Clássico Laranja Algarve, Compal Vital Frutos Vermelhos, Um Bongo Morango e Compal 100% Laranja. Esse tipo de processo é inviável nesta indústria já que leva à deterioração do produto, fundamentalmente por razões de alteração nutricional ou de propriedades organoléticas. No entanto, nenhum dos microrganismos identificados é problemático para os produtos em estudo já que, tal como referido, o que se procura nesta indústria é a esterilidade comercial do produto, que é compatível com alguma presença destes esporos, visto eles não germinarem às condições de baixa acidez do produto final nem apresentarem um perigo para a segurança alimentar do produto e para a saúde pública. Para além disso, demonstrou-se uma redução do número de embalagens contaminadas 30 e 45 dias após a sua produção, o que indica que há uma inativação dos esporos às condições a que eles são mantidos, no interior das embalagens. O mesmo comportamento é observado no caso dos esporos de bactérias acidófilas (ACB) detetados e identificados no sumo Compal 100% Maçã, uma vez que o estudo realizado demonstrou a sua incapacidade de germinação e crescimento bacteriano na matriz do sumo, não alcançando valores suficientemente elevados para provocar a deterioração do produto final. 70

91 Conclui-se, deste modo, que as condições de temperatura e tempo de holding utilizadas na pasteurização são suficientes na esterilização comercial de todos os produtos estudados, no sentido em que permitem a eficiente destruição térmica dos microrganismos que poderiam vir a provocar a deterioração do produto. As investigações sobre o ACB abrem algumas perspetivas de investigação futuras, que passam pela extensão do procedimento experimental (estudo realizado ao produto Compal 100% Maçã) a outros produtos da empresa S+C, de forma a determinar se este mesmo comportamento se mantem, uma vez que durante a quantificação de esporos de bactérias acidófilas estes nunca foram detetados. A determinação de quais os fatores que, relacionados entre si, promovem este comportamento do ACB seria uma extensão às conclusões do trabalho, promovendo a compreensão do mecanismo que conduz à inibição do seu crescimento. É possível planear um elevado número de ensaios, como a implementação de métodos fitoquímicos, para determinação dos constituintes orgânicos provenientes da maçã presentes e em que concentração e verificação da sua influência bacteriostática ou bactericida no ACB, a compreensão do comportamento destes esporos à concentração de ácido cítrico nesta matriz ou a influência de ambos em simultâneo. Em relação aos bolores termorresistentes, seria importante compreender o motivo pelo qual o comportamento simulado e esperado teoricamente não corresponde à realidade da amostragem analisada. Este estudo poderia ser realizado em duas fases. Numa primeira fase, análise de uma mais vasta amostragem das matérias primas onde os bolores termorresistentes foram detetados, de forma a calcular uma contaminação inicial mais próxima da real, e também uma maior amostragem de produto acabado. A segunda fase passaria pela contaminação direta dos produtos produzidos na empresa com estes ascósporos e determinação do seu tempo de redução decimal, já que os valores da literatura utilizados diferem da realidade produtiva. Finalmente, se uma redução da resistência térmica se observasse, seria também importante uma compreensão dos fatores que promovem essa alteração. 71

92 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 6.1. Bibliografia 1. Hui, Y.H. Handbook of Fruits and Fruit Processing. 1ª ed. Blackwell Publishing Ltd; Adams, M.R., Moss, M.O. Food Microbiology. 3ª ed. RSC Publishing; Sapers, G.M., Gorny, J.R., Yousef, A.E. Microbiology of Fruits and Vegetables. 1ª ed. CRC Press; Steyn, C.E., Cameron, M., Witthuh, R.C. Occurence of Alicyclobacillus in the fruit processing environment- a review. Int J Food Microbiol. 2011;147: Ciuffreda, E., Bevilacqua, A., Sinigaglia, M., Corbo, M.R. Alicyclobacillus spp.: New Insights on Ecology and Preserving Food Quality through New Approaches. Microorganisms. 2015;3: Siegmund, B., Pöllinger-Zierler, B. Growth behavior of off-flavor-forming microorganisms in apple juice. J Agric Food Chem. 2007;55(16): Rosazza, J.P.N., Huang, Z., Dostal, L., Volm, T., Rousseau, B. Review: Biocatalytic transformations of ferulic acid: An abundant aromatic natural product. J Ind Microbiol. 1995;15(6): Topakas, E., Kalogeris, E., Kekos, D., Macris, B.J., Christakopoulos, P. Bioconversion of ferulic acid into vanillic acid by the thermophilic fungus Sporotrichum thermophile. LWT - Food Sci Technol. 2003;36: Pettipher, G.L., Osmundson, M.E., Murphy, J.M. Methods for the detection and enumeration of Alicyclobacillus acidoterrestris and investigation of growth and production of taint in fruit juice and fruit juice-containing drinks. Lett Appl Microbiol. 1997;24: Bahçeri, K.S., Gökmen, V., Acar, J. Formation of guaiacol from vanillin by Alicyclobacillus acidoterrestris in apple juice: a model study. Eur Food Res Technol. 2005;220(2): Drobniewski, F.A. Bacillus cereus and related species. Clin Microbiol Rev. 1993;6(4): Dworkin, M., Falkow, S., Rosenberg, E., Schleifer, K., Stackebrandt, E. The Prokaryotes - A Handbook on the Biology of Bacteria. 3ª ed. Springer Science+Business Media; Harwood, C.R. Bacillus, Volume 2 of Biotechnology Handbooks. Ilustrada. Springer Science+Business Media; Vos, P., Garrity, G., Jones, D., Krieg, N.R., Ludwig, W., Rainey, F.A., et al. Bergey s Manual of Systematic Bacteriology: Volume 3: The Firmicutes. 2ª ed, Ilustrada. Springer Science & Business Media; Pitt, J.I., Hocking, A.D. Fungi and Food Spoilage. 3ª ed. Springer Science+Business Media;

93 16. Tournas, V. Heat-resistant fungi of importance to the food and beverage industry. Crit Rev Microbiol. 1994;40(4): Beuchat, L.R., Pitt, J.I. Detection and enumeration of heat-resistant molds. In: Downes FP, Ito K, editores. Compendium of the Methods for the Microbiological Examination of Foods p Beuchat, L.R., Rice, S.L. Byssochlamys spp. and their importance in processed fruits. Adv Food Res. 1979;25: Conner, D.E., Beuchat, L.R. Heat resistance of Neosartorya fischeri as affected by sporulation and heating medium. Int J Food Microbiol. 1987;4: Rajashekhara, E., Suresh, E.R., Ethiraj, S. Modulation of thermal resistance of ascospores of Neosartorya fischeri by acidulants and preservatives in mango and grape juice. Food Microbiol. 2000;17: Slongo, A.P., Araga, G.M.F. Heat resistance of Neosartorya fischeri in various juices. LWT - Food Sci Technol. 2007;40: Deák, T. Handbook of Food Spoilage Yeasts. 2ª ed. CRC Press; Uhitil, S., Hadina, S., Granic, K., Jaksic, S. Prevalence of Candida species in the fresh fruit juices. Arch Ind Hyg Toxicol. 2009;60: Vidal-Leiria, M., Buckley, H., Van Uden, N. Distribution of the maximum temperature for growth among yeasts. Mycologia. 1979;71: Gava, A. Princípios de Tecnologia de Alimentos. Nobel S.A.; Jay, J.M., Loessner, M.J., Golden, D.A. Modern Food Microbiology. 7ª ed. Springer Science & Business Media; Cole, M.B., Jones, M.V., Holyoak, C. The effect of ph, salt concentration and temperature on the survival and growth of Listeria monocytogenes. J Appl Bacteriol. 1990;69(1): Rajashekhara, E., Suresh, E., Ethiraj, S. Thermal death rate of ascospores of Neosartorya fisheri ATCC in the presence of organic acids and preservatives in fruit juices. J Food Prot. 1998;61(10): Pinheiro, H., Mateus, M., Empis, J. Tecnologia Alimentar - Elementos de Apoio. IST; Fontana Jr., A.J., Schmidt, S.J. Appendix E: Water Activity Values of Select Food Ingredients and Products. In: Barbosa-Cánovas, G.V.F., Fontana Jr., A.J., Schmidt, S.J., Labuza, T.P., editores. Water Activity in Foods: Fundamentals and Applications. Blackwell Publishing Ltd; p Alberto, M.R., Canavosio, M.A.R., Nadra, M.C.M. Antimicrobial effect of polyphenols from apple skins on human bacterial pathogens. Electron J Biotechnol. 2006;9(3). 32. Fattouch, S., Caboni, P., Coroneo, V., Tuberoso, C., Angioni, A., Dessi, S., et al. Comparative 73

94 analysis of polyphenolic profiles and antioxidant and antimicrobial activities of tunisian pome fruit pulp and peel aqueous acetone extracts. J Agric Food Chem. 2008;56(3): Fratianni, F., De Giulio, A., Sada, A., Nazzaro, F. Biochemical characteristics and biological properties of annurca apple cider. J Medicional Food. 2011;15(1): Muthuswamy, S., Rupasinghe, H.P.V. Fruit phenolics as natural antimicrobial agents : Selective antimicrobial activity of catechin, chlorogenic acid and phloridzin. J Food, Agric Environ. 2007;5(3&4): Rahman, M.S. Handbook of Food Preservation. 2ª ed. CRC Press; Krapfenbauer, G., Kinner, M., Gössinger, M., Schönlechner, R., Berghofer, E. Effect of thermal treatment on the quality of cloudy apple juice. J Agric Food Chem. 2006;54(15): Brennan, J.G. Food Processing Handbook. 1st ed. WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA; Tucker, G. Pasteurization process design. In: Ahmed J, Rahman MS, editores. Handbook of Food Process Design. Blackwell Publishing Ltd; Morgan, J.N., Lin, F.J., Eitenmiller, R.R., Barnhart, H.M., Romeo, T. Thermal Destruction of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae. J Food Prot. 1988;2: International Commission on Microbiological Specifications for Foods. Microrganisms in Foods 6: Microbial Ecology of Food Commodities. 2ª ed, Ilustrada. Springer Science & Business Media; Fudge, J., Dunn, M., Pike, O., Robison, R., Steele, F. The isolation and identification of Pantoea dispersa strain JFS as a non-pathogenic surrogate for Samonella typhimurium phase type 42 in flour. Int J Food Microbiol. 2016;219: Bessette, A.E., Bessete, A.R., Fischer, D.W. Mushrooms of Northeastern North America. Ilustrada. Syracuse Universty Press; Dijksterhuis, J., Samson, R.A. Food Micology - A Multifaceted Approach to Fungi and Food. 1ª ed. CRC Press; Yazdany, S., Lashkary, B.K. Effect of ph on the sporulation of Bacillus Stearothermophilus. Appl Microbiol. 1975;30(1): Gupta, R., Mukerji, K.G. Microbial Technology. 1ª ed. APH Publishing; Lund, B., Baird-Parker, T.C., Gould, G.W. Microbiological Safety and Quality of Food. Ilustrada. Springer Science & Business Media; p. 47. Freese, E., Sheu, C.W., Galliers, E. Function of lipohilic acids and antimicrobial food additives. Nature. 1973;245: Giannuzzi, L., Zaritzky, E. Effect of ascorbic acid in comparison to citric and lactic acid on Listeria monocytogenes inhibition at refrigeration remperatures. Leb Technol. 1996;29:

95 6.2. Webgrafia i. Food and Drug Administration. Disponível em: htm. (Acedido em: 17 Agosto 2016) ii. ABIS Encyclopedia. Disponível em: (Acedido: 15 Agosto 2016) iii. Althoff, T. & Schwarzer, K. Lemgo D- and z-values Database for Food. Disponível em: (Acedido em: 15 Fevereiro Agosto 2016) iv. ThermoFisher Scientific. Disponível em: (Acedido em:31 Agosto 2016) v. Mycobank. Disponível em: (Acedido em: 15 Fevereiro Agosto 2016) 6.3. Procedimentos internos da S+C I. International Federation of Fruit Juice Producers, Total Count of Potential Spoilaging Microorganisms of Fruits and Related Products, IFU method No.2 (1996). II. International Federation of Fruit Juice Producers, Yeasts Count Procedure, IFU method No.3 (1996). III. International Federation of Fruit Juice Producers, Moulds Count Procedure, IFU method No.4 (1996). IV. International Federation of Fruit Juice Producers, Lactic Acid Bacteria Count Procedure, IFU method No.5 (1996). V. International Federation of Fruit Juice Producers, Mesophilic & Thermoduric Thermophilic Bacteria: Spores Count, IFU method No.6 (1996). VI. International Federation of Fruit Juice Producers, Sterility Testing of Aseptic Filled Products, Commercial Sterile Products, Preserved Products, IFU method No.7 (1996). VII. International Federation of Fruit Juice Producers, Method on the Detection of taint producing Alicyclobacillus in Fruit Juices, IFU method No.12 (1996). 75

96 7. ANEXOS Anexo 1. Resultados das análises microbiológicas realizadas aos diversos produtos em UFC/ml Lote Produto Designação 1 Clássico Laranja Algarve Clássico Laranja Algarve Sumo Laranja Algarve Produto final Nº do bidão Formulação - Ingrediente Nº da carga de formulação - - Teores totais Leveduras Bolores Bolores termorresistentes Esporos de bactérias aeróbias Esporos de bactérias acidófilas Início Meio Fim I M F I M F I M F I M F I M F 1ª ª ª ª ª ª ª , ª ª ª 1ª ª 2ª ª 3ª ª 4ª ª 5ª I

97 Lote Produto Designação 1 2 Sumo Laranja Algarve Clássico Laranja Algarve Clássico Laranja Algarve Sumo laranja Algarve Ingrediente Produto final Nº do bidão Formulação - Ingrediente Nº da carga de formulação Teores totais Leveduras Bolores Bolores termorresistentes Esporos de bactérias aeróbias Esporos de bactérias acidófilas Início Meio Fim I M F I M F I M F I M F I M F 2ª 6ª ª 7ª , ª 8ª ª 9ª ª 10ª ª , ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª 1ª ª 2ª II

98 Lote Produto Designação 3 1 Clássico Laranja Algarve Clássico Laranja Algarve Sumo laranja Algarve Vital Frutos Vermelhos Vital Frutos Vermelhos Produto final Nº do bidão Formulação - Nº da carga de formulação - - Teores totais Leveduras Bolores Bolores termorresistentes Esporos de bactérias aeróbias Esporos de bactérias acidófilas Início Meio Fim I M F I M F I M F I M F I M F 1ª , ª ª ª ª Ingrediente 1ª 1ª Produto final Formulação ª , ª , ª III

99 Lote Produto Designação 1 Vital Frutos Vermelhos Morango à peça Nº do bidão Formulação - Ingrediente Nº da carga de formulação Teores totais Leveduras Bolores Bolores termorresistentes Esporos de bactérias aeróbias Esporos de bactérias acidófilas Início Meio Fim I M F I M F I M F I M F I M F 4ª , ª ª , ª , ª ª , ª , ª , ª , ª , ª , ª , ª , ª , ª ª ª ª , ª , ª , ª , ª , IV

100 Lote Produto Designação 1 2 Framboesa à peça Vital Frutos Vermelhos Vital Frutos Vermelhos Ingrediente Produto final Nº do bidão Formulação - Nº da carga de formulação Teores totais Leveduras Bolores Bolores termorresistentes Esporos de bactérias aeróbias Esporos de bactérias acidófilas Início Meio Fim I M F I M F I M F I M F I M F 1 1ª , ª , ª , ª , ª , ª , ª , ª ª , ª ª ª ª ª ª ª ª V

101 Lote Produto Designação 2 Vital Frutos Vermelhos Morango à peça Framboesa à peça Nº do bidão Formulação - Ingrediente Ingrediente Nº da carga de formulação Teores totais Leveduras Bolores Bolores termorresistentes Esporos de bactérias aeróbias Esporos de bactérias acidófilas Início Meio Fim I M F I M F I M F I M F I M F 8ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª , ª , ª ª , ª ª ª ª ª ª ª ª VI

102 Lote Produto Designação Nº do bidão Nº da carga de formulação Teores totais Leveduras Bolores Bolores termorresistentes Esporos de bactérias aeróbias Esporos de bactérias acidófilas Início Meio Fim I M F I M F I M F I M F I M F 1 15ª Framboesa à peça Ingrediente 1 16ª ª ª Vital Frutos Vermelhos Produto final ª ª ª ª , Vital Frutos Vermelhos Formulação - 6ª ª ª ª ª ª Morango à peça Ingrediente 1 2ª , ª VII

103 Lote Produto Designação 3 1 Morango à peça Framboesa à peça Um Bongo Morango Ingrediente Ingrediente Produto final Nº do bidão Nº da carga de formulação Teores totais Leveduras Bolores Bolores termorresistentes Esporos de bactérias aeróbias Esporos de bactérias acidófilas Início Meio Fim I M F I M F I M F I M F I M F 1 4ª ª , ª , ª , ª , ª ª , ª ª ª ª , ª ª ª , ª ª , ª ª , VIII

104 Lote Produto Designação 1 1 Morango à peça Fruit-mix Pera Rocha Pera Rocha Ingrediente Ingrediente Produto final Nº do bidão Formulação - Nº da carga de formulação Teores totais Leveduras Bolores Bolores termorresistentes Esporos de bactérias aeróbias Esporos de bactérias acidófilas Início Meio Fim I M F I M F I M F I M F I M F 1 1ª , ª , ª ª ª - > ª - > ª - > ª ª - > ª ª ª ª ª , ª - > ª ª ª IX

105 Lote Produto Designação 1 2 Pera Rocha Polpa pera Pera Rocha Pera Rocha Nº do bidão Formulação - Ingrediente Produto final Formulação - Nº da carga de formulação Teores totais Leveduras Bolores Bolores termorresistentes Esporos de bactérias aeróbias Esporos de bactérias acidófilas Início Meio Fim I M F I M F I M F I M F I M F 15ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª X

106 Lote Produto Designação 2 1 Pera Rocha Polpa pera 100% Laranja Nº do bidão Formulação - Ingrediente Nº da carga de formulação Produto final - - Teores totais Leveduras Bolores Bolores termorresistentes Esporos de bactérias aeróbias Esporos de bactérias acidófilas Início Meio Fim I M F I M F I M F I M F I M F 6ª ª ª ª , ª ª , ª ª , ª ª , ª ª ª ª ª ª ª ª XI

107 Lote Produto Designação % Laranja Concentrado laranja 100% Laranja Formulação Ingrediente Produto final Nº do bidão Nº da carga de formulação Teores totais Leveduras Bolores Bolores termorresistentes Esporos de bactérias aeróbias Esporos de bactérias acidófilas Início Meio Fim I M F I M F I M F I M F I M F - 1ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª , ª ª ª XII

108 Lote Produto Designação % Laranja Concentra do laranja 100% Maçã 100% Maçã Nº do bidão Formulação - Ingrediente Nº da carga de formulação Produto final - - Formulação - Teores totais Leveduras Bolores Bolores termorresistentes Esporos de bactérias aeróbias Esporos de bactérias acidófilas Início Meio Fim I M F I M F I M F I M F I M F 2ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª , ª XIII

109 Lote Produto Designação 1 Nº do bidão 100% Maçã Formulação - Clarificado maçã Ingrediente 1 Nº da carga de formulação Iníci o Teores totais Leveduras Bolores Bolores termorresistentes Esporos de bactérias aeróbias Esporos de bactérias acidófilas Meio Fim I M F I M F I M F I M F I M F 3ª , ª ª ª ª XIV

110 Lote Produto Designação % Maçã 100% Maçã 100% Maçã Clarificado maçã 100% Maçã Ingrediente Produto final Nº do bidão 1 Formulação - Ingrediente Produto final Nº da carga de formulação Teores totais Leveduras Bolores Bolores termorresistentes Esporos de bactérias aeróbias Esporos de bactérias acidófilas Início Meio Fim I M F I M F I M F I M F I M F ª ª , ª ª ª ª ª ª ª ª , XV

111 Lote Produto Designação 3 100% Maçã 100% Maçã Clarificado maçã Produto final Nº do bidão Formulação - Ingrediente Nº da carga de formulação - - Teores totais Leveduras Bolores Bolores termorresistentes Esporos de bactérias aeróbias Esporos de bactérias acidófilas Início Meio Fim I M F I M F I M F I M F I M F 1ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª ª XVI

112 Anexo 2. Modelação da resistência térmica de alguns dos microrganismos identificados XVII

113 XVIII

114 XIX