(22) Data do Depósito: 17/12/2014. (43) Data da Publicação: 19/07/2016

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1 INPI (21) BR A2 (22) Data do Depósito: 17/12/2014 *BR A República Federativa do Brasil Ministério da Indústria, Comércio Exterior e Serviços Instituto Nacional da Propriedade Industrial (43) Data da Publicação: 19/07/2016 (54) Título: PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE XAROPE DE GLICOSE VIA HIDRÓLISE POR EXTRATO AMILOLÍTICO (51) Int. Cl.: C12P 19/02; C12N 9/30 (73) Titular(es): UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JULIO DE MESQUITA FILHO (72) Inventor(es): BRUNA ESCARAMBONI, PEDRO DE OLIVA NETO (74) Procurador(es): FABÍOLA DE MORAES SPIANDORELLO (57) Resumo: PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE XAROPE DE GLICOSE VIA HIDRÓLISE POR EXTRATO AMILOLÍTICO. E descrita a invenção de um processo para produção de amilases via fermentação em estado sólido que utiliza um meio de cultura à base de farelo de trigo complementado com sais de baixo custo e o fungo Rhizopus microsporus var. oligosporus (CCT 3762) e, através do extrato amilolítico produzido, é feita a hidrólise total do amido puro ou na forma de resíduo em etapa única, ou seja, a liquefação e a sacarificação para a hidrólise total e obtenção de xarope de glicose.

2 1/19 PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE XAROPE DE GLICOSE VIA HIDRÓLISE POR EXTRATO AMILOLÍTICO CAMPO DA INVENÇÃO [001] A invenção descreve um processo para produção de amilases via fermentação em estado sólido que utiliza um meio de cultura à base de farelo de trigo complementado com sais de baixo custo e o fungo Rhizopus microsporus var. oligosporus (CCT 3762) e, através do extrato amilolítico produzido, é feita a hidrólise total do amido puro ou na forma de resíduo em etapa única, ou seja, a liquefação e a sacarificação para a hidrólise total e obtenção de xarope de glicose. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [002] A necessidade da substituição de catálise por biocatálise impulsiona o consumo de enzimas em nível internacional. Amilases representam 25% do mercado de enzimas com numerosas aplicações industriais e biotecnológicas (KUMAR, V.; SAHAI, V.; BISARIA, V.S. Production of amylase and chlamydospores by Piriformospora indica, a root endophytic fungus. Biocatalysis and Agricultura/ Biotechnology, v. 1, p , 2012). Pertencem à classe das hidrolases, conforme o Comitê de Nomenclatura da União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (Nomenclature Committee of the lnternational Union of Biochemistry and Molecular Biology - NC-IUBMB), e catalisam a hidrólise do amido e seus derivados, liberando produtos compostos de unidades de glicose. [003] As amilases formam um complexo enzimático compreendendo uma grande variedade de enzimas que atuam sinergicamente para quebrar os polissacarídeos amilose e amilopectina do amido em glicose. Modificações físicas, químicas e enzimáticas do amido permitem a obtenção de carboidratos com propriedades funcionais especiais com inúmeras aplicações. As tecnologias que substituem hidrólises químicas por hidrólises enzimáticas são vantajosas porque as enzimas catalíticas são específicas para a reação. Assim, não há formação de subprodutos

3 2/19 assegurando maior rendimento, bem como produtos de maior qualidade, menor impacto ambiental e menor consumo energético. [004] Os fungos são especialmente valorizados por serem uma excelente fonte de enzimas de interesse industrial. Os pertencentes ao gênero Rhizopus possuem destaque por serem bons produtores de amilases, onde se sabe que o Rhizopus oligosporus é uma espécie fúngica considerada pela FAO (Food and Agriculture Organization) como segura (GRAS - Generally Recognized as Safe), uma vez que diversas espécies deste gênero são tradicionalmente utilizadas na indústria alimentícia, especialmente na fabricação do alimento asiático tempeh. [005] As amilases estão entre as enzimas hidrolíticas mais importantes para a indústria de amido, sendo usada pela primeira vez em 1984, como auxiliar farmacêutico para o tratamento de desordens digestivas (GUPTA, R; GIGRAS, P.; MOHAPATRA, H; GOSWAMI, V. K.; CHAUHAN, 8. Microbial a-amylases: a biotechnological perspective. Process Biochemistry, v.38, p , 2003). Diversos estudos apontam as a amilases e glicoamilases como as enzimas mais importantes e utilizadas no processamento de amido. [006] Um grande mercado para a aplicação das amilases é na produção de hidrolisados de amido para obtenção de glicose e frutose como produto final. O amido é convertido em xaropes com alto teor de frutose (HFCS ou High Fructose Com Syrups). Na panificação, a adição da enzima na massa resulta no aumento da taxa de fermentação e redução da viscosidade, além de melhorar o sabor, coloração e textura do pão. Nas cervejarias, as amilases microbianas auxiliam a amilase do cereal na produção de açúcares fermentescíveis e dextrinas que melhoram o aroma e sabor da bebida, bem como controlam a turbidez devido ao amido. No processamento de sucos de frutas são usadas para evitar a turvação do produto final pela precipitação do amido naturalmente presente na fruta.

4 3/19 [007] Na indústria têxtil, as amilases são utilizadas na eliminação das gomas de proteção que são aplicadas aos fios para conferir maior resistência durante o processo de tecelagem, substituindo os oxidantes, ácidos ou bases, que danificam a celulose do tecido. [008] Na indústria de papel, essas enzimas são empregadas na modificação do amido que é aplicado como cobertura do papel para melhorar a qualidade do produto final, aumentando a resistência e apagabilidade. [009] As amilases também são utilizadas nas indústrias de detergentes, melhorando o desempenho dos detergentes líquidos enzimáticos. [001 O] Além da importância econômica que as amilases representam, o desenvolvimento de novas tecnologias para a utilização eficiente de resíduos tem sido uma preocupação crescente a cada ano, uma vez que a maioria das agroindústrias geram, além do produto final, um grande volume de subprodutos. [0011] A Fermentação em Estado Sólido (FES) representa uma importante alternativa no aproveitamento destes materiais, uma vez que utiliza substratos de baixo custo, como resíduos agrícolas e industriais, garante economia de água e energia, e a biomolécula pode ser obtida de forma mais concentrada, facilitando a sua recuperação. [0012] Enzimas importantes industrialmente têm sido convencionalmente produzidas por fermentação submersa. Enzimas e metabólitos secundários, que são produtos de interesse biotecnológico, foram produzidos pelos micro-organismos, ao longo do processo evolutivo, para o uso em substratos sólidos úmidos. Consequentemente, o cultivo em suspensões aquosas pode prejudicar a eficiência metabólica deles. Dessa maneira, a FES é um método de cultura alternativo que tem ganhado a atenção das pesquisas nos últimos 20 anos, e credibilidade entre muitas corporações industriais (BARRIOS-GONZÁLEZ, J. Solid-state fermentation: Physiology

5 4/19 of solid medium, its molecular basis and applications. Process Biochemistry. v. 47, p , 2012). [0013] Diferentes resíduos agroindustriais podem ser utilizados para a produção de amilases em fermentação em estado sólido, tais como farelo de trigo, farelo de soja, farelo de algodão, bagaço de cana-de-açúcar, palha de arroz, sabugo de milho e resíduos de laranja. Porém, o farelo de trigo possui um teor relativamente elevado de proteínas e carboidratos, bem como uma pequena quantidade de lignina, sendo este o principal diferencial para outras biomassas contendo lignocelulose (APPRICH, S.; TIRPANALAN, 0.; HELL, J.; REISINGER, M.; BÚHMDORFER, S.; SIEBENHANDL-EHN, S.; NOVALIN, S.; KNEIFEL, W. Wheat bran-based biorefinery 2: Valorization of products. LWT - Food Science and Technology, v. 56, p , 2014). [0014] Apesar das amilases já serem produzidas industrialmente por diversos micro-organismos, há grandes variações de preço, sendo as glicoamilases fúngicas as mais caras, e esse é um fator limitante para o seu uso industrial. De acordo com a empresa SIGMA-ALDRICH (Disponível em: < Acesso em 12 de fevereiro de 2014), o valor para aquisição de alfa-amilase de Aspergillus oryzae contendo 30 U/mg é de R$17,88/g. O valor para amiloglicosidase de Aspergillus niger contendo 300 U/ml é de R$454,00/ml e para a mesma enzima, porém de Rhizopus sp contendo 40 U/mg, é de R$1.491,00/g. [0015] A fermentação em estado sólido utilizando diferentes espécies de fungos filamentosos é um procedimento potencial na produção de enzimas devido à capacidade destes organismos produzirem uma ampla gama de enzimas extracelulares. Maiores rendimentos na produção enzimática são geralmente obtidos em fermentações em estado sólido quando comparadas com fermentações submersas, uma vez que meios sólidos se aproximam às condições do habitat natural dos micro-organismos.

6 5/19 [0016] Entre as diferentes classes de enzimas produzidas utilizando fermentação em estado sólido se encontram as amilases. Apesar destas enzimas já serem produzidas industrialmente por diversos microorganismos, há grandes variações de preço, sendo as glicoamilases fúngicas as mais caras, e esse é um fator limitante para o seu uso industrial. [0017] Hashemi et a/. (HASHEMI, M.; RAZAVI, S.H.; SHOJAOSADATI, S.A.; MOUSAVI, S.M.; KHAJEH, K.; SAFARI, M. Development of a SSF process for production of an alpha amylase with potentially interesting properties. Journal of Bioscience and Bioengineering, v. 11 O, p , 201 O) utilizaram farelo de trigo como substrato da fermentação em estado sólido de Bacillus e obtiveram uma atividade a-amilolítica de 197,27 U/g com incubação à 64 oc. [0018] Peixoto-Nogueira et ai. (PEIXOTO-NOGUEIRA, S. C.; SANDRIM, V. C.; GUIMARÃES, L. H. S.; JORGE, J. A.; TERENZI, H. F.; POLIZELI, M. L. T. M. Evidence of thermostable amylolytic activity from Rhizopus microsporus var. rhizopodiformis using wheat bran and corncob as alternative carbon source. Bioprocess and Biosystems Engineering, v. 31, p , 2008.) cultivaram Rhizopus microsporus var. rhizopodiformis à 45 oc por 72 h em FES, tendo farelo de trigo e grãos de milho como substrato, e alcançaram um máximo de 49,3 U totais. [0019] Ghosh e Ray (GHOSH, B.; RAY, R. R. Saccharification of raw native starches by extracellular isoamylase of Rhizopus oryzae. Biotechnology, v. 9, p , 201 O) realizaram a sacarificação de diferentes tipos de amido pela isoamilase de Rhizopus oryzae PRT MTCC Foi obtido um máximo de 43% de sacarificação após 60 minutos de incubação, utilizando 1% de amido de batata (Merck). [0020] Liu e Xu (LIU, X. D.; XU, Y. A novel raw starch digesting a- amylase from a newly isolated Bacil/us sp. YX-1: Purification and characterization. Bioresource Technology, v. 99, p , 2008) testaram a capacidade

7 6/19 de digestão de amido cru por a-amilase a partir de Bacillus sp. YX-1. Os autores constataram que a taxa de degradação de grânulos de milho, trigo e batata preparados com concentração de 1% foram iguais a 57,5%, 53%, 45,1% em 8 horas e de 63,2%, 56,4%, 48,6% em 12 horas, respectivamente. [0021] O documento US descreve um processo de produção de glicoamilase através de leveduras transformadas com um gene de Rhizopus, em fermentação submersa, cuja atividade obtida foi de 0,5 U/ml em 48 horas. A presente invenção propõe o uso da tecnologia de FES, com economia de energia especialmente por não depender de agitação constante, com atividade amilolítica de 60 U/ml no extrato enzimático bruto, o que corresponde a um rendimento de 600 U/g de substrato em 120 horas de cultivo. [0022] O documento W descreve um método de obtenção de amilases a partir de resíduos agroindustriais em FES pelo cultivo de fungos do gênero Aspergil/us obtendo um máximo de 197,6 U/g em 120 horas. [0023] No estudo de Soccol et a/. (SOCCOL, C. R.; ILOKI, 1.; MARIN, B.; RAIMBAUL T, M. Comparative production if alfa amylase, glucoamylase and protein enrichment of raw and cooked cassava by Rhizopus strains in submerged and solid state fermentations. Joumal of Food Science and Technology, 31, p , 1994.) na produção de glicoamilase (108 U/g) foram utilizados os mesmos sais da presente invenção, porém em concentrações mais elevadas (% (m/m): Sulfato de amônio 9,3%, Fosfato de potássio monobásico 4,8% e Ureia 2,3%) e Rhizopus oryzae em fermentação em estado sólido tendo mandioca crua como substrato, alcançando resultados de produção enzimática inferiores àqueles obtidos no processo da presente invenção. [0024] O estado da técnica descreve processos para produção de amilases via fermentação sólida que utilizam duas enzimas de dois micro-organismos diferentes (alfa amilase e glicoamilase ou amiloglucosidase ), em geral de

8 7/19 origem bacteriana, ao passo que o processo para produção de amilases via fermentação sólida, objeto da presente invenção, utiliza enzimas de origem fúngica, ou seja, mais rústica e econômica para produção em escala industrial, atingindo valores de produção de amilase fúngica superiores à 350 U/g de substrato seco, o que demonstra a viabilidade da tecnologia para ser aplicada no desenvolvimento de um bioprocesso econômico com a utilização do farelo de trigo como substrato e do fungo Rhizopus oligosporus, que recebe a denominação GRAS, assegurando sua utilização na alimentação. [0025] Ainda, no que diz respeito ao meio de produção das enzimas amilolíticas, os processos fermentativos com altos custos podem dificultar o potencial de industrialização. Sabe-se que cerca de 30 a 40% do custo de produção das enzimas industriais corresponde ao meio de crescimento (JOO, H-S.; CHANG, C-S. Production of protease from a new alkalophilic Bacillus sp grown on soybean meal: optimization and some properties. Process Biochemistry. v. 40, p , 2005), especialmente quando há necessidade de nutrientes com altos custos e fatores de crescimento, como aqueles utilizados na patente US que emprega glicose como fonte de carbono e uma fonte de nitrogênio à base de levedura, além de uracila, adenina, leucina e histidina, ou a patente US que descreve uma tecnologia para expressão de um gene para alfa-amilase em Bacillus subtilis que utiliza um meio de cultura contendo extrato de levedura, cloreto de cálcio, cloreto de magnésio, sulfato de manganês, cloreto de cobalto, ácido cítrico e maltose, e um antiespumante, característico de uma fermentação submersa, ou ainda a patente US que utiliza maltodextrina como fonte de carbono e extrato de levedura, que tem elevado custo, e ureia como fonte de nitrogênio para a cultura fúngica. [0026] Na presente invenção, o meio de crescimento das enzimas amilolíticas compreende um resíduo agroindustrial - farelo de trigo, com

9 8/19 suplementação mínima de nutrientes, utilizando sais sulfato de amônio, fosfato de potássio monobásico e ureia em proporções específicas, garantindo o baixo custo. [0027] Dessa forma, é objeto da presente invenção um processo para produção de amilases via fermentação em estado sólido que utiliza um meio de cultura à base de farelo de trigo complementado com sais de baixo custo e o fungo Rhizopus microsporus var. o/igosporus (CCT 3762), atingindo valores de produção de amilase fúngica superiores à 350 U/g de substrato seco e, através do extrato amilolítico produzido, é feita a hidrólise total do amido puro ou na forma de resíduo em etapa única, ou seja, a liquefação e a sacarificação para a hidrólise total e obtenção de xarope de glicose. SUMÁRIO [0028] A invenção descreve um processo para produção econômica de amilases via fermentação em estado sólido utilizando condições mínimas de sais (sulfato de amônio, fosfato de potássio monobásico e ureia) associado a farelo de trigo, resíduo abundante no Brasil e de baixo custo, utilizando um fungo eficiente, rústico e seguro para uso alimentar. [0029] A invenção descreve a reação enzimática do extrato enzimático produzido, o qual, em uma única etapa, realiza duas etapas importantes da hidrólise do amido: a liquefação e a produção de glicose como único açúcar obtido. [0030] A invenção descreve um processo para produção de amilases via fermentação em estado sólido que apresenta rendimento de produção enzimática superior àquela encontrada na literatura técnica, bem como execução simplificada, baixo custo e segurança alimentar. [0031] A invenção descreve um processo para produção de amilases via fermentação em estado sólido que provê um extrato enzimático capaz de, numa etapa única de condições operacionais, e usando o mesmo extrato, realizar a liquefação e obtenção de xarope de glicose a partir de resíduos

10 9/19 com potencial uso na produção de biomoléculas por fermentação, cerveja e outros processos fermentativos que empregam substratos amiláceos, clarificação de sucos para retirada de turbidez e compostos precipitáveis, na indústria têxtil e de papel na remoção da goma, produção de biocombustíveis e solventes que empregam substratos amiláceos, indústria farmacêutica, química fina e fabricação de cereais malteados. [0032] A invenção descreve um processo para produção de amilases via fermentação em estado sólido que utiliza concentrações mínimas de sais sulfato de amônio, fosfato de potássio monobásico (fosfato monopotássico) e ureia, com os atrativos de preços economicamente viáveis e disponibilidade, já que são amplamente empregados em outros processos fermentativos. [0033] A invenção descreve um processo para produção de amilases via fermentação em estado sólido e reação enzimática em etapa única para obtenção de xarope de glicose a partir de resíduos que aumenta expressivamente a produção enzimática de 180 U/g para 350 a 600 U/g de substrato, resultando em grande economia na utilização de insumos nutricionais, quando comparados ao estado da técnica, mediante otimização da suplementação do meio de cultivo, umidade do meio e concentração de inóculo através de técnicas estatísticas de planejamento experimental - DCCR, bem como o aperfeiçoamento dos parâmetros tempo e temperatura de cultivo. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0034] A figura 1 apresenta o resultado de cinco ensaios de Fermentação em Estado Sólido (FES) com diferentes concentrações de sais (%, m/m). [0035] A figura 2 apresenta a representação gráfica das superfícies de resposta e curvas de contorno para a atividade enzimática (U/g) em função de X 1 e X 2 (A) e (B), X 1 e X 3 (C) e (D) e X 2 e X 3 (E) e (F), sendo X{ Sulfato de amônio; X 2 : Fosfato de potássio monobásico e X 3 : Ureia.

11 10/19 [0036] A figura 3 apresenta a representação gráfica da hidrólise do amido solúvel (- -), farinha de trigo tipo 11 (-o-), farelo de trigo (-+-) e bagaço de mandioca (-*-) utilizando uma solução contendo 5% de carboidrato e extrato enzimático bruto na proporção de 1,2 U/ml da solução de reação, a 55 oc, com a eficiência da conversão de carboidrato em açúcar redutor expresso em porcentagem. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0037] O processo para produção de amilases via fermentação em estado sólido, objeto da presente invenção, compreende, em uma primeira etapa, na propagação da cultura para obtenção de esporos ( esporangiósporos ). Preferentemente, são utilizados fungos da linhagem Rhizopus microsporus var. oligosporus (CCT 3762). No entanto, podem ser utilizados fungos Rhizopus oryzae, Aspergillus niger e outras espécies de Aspergillus. [0038] O fungo é cultivado preferencialmente no meio de cultivo estático BOA (Batata Oextrose Ágar). [0039] A incubação do fungo é feita de 15 C a 40 C, por 3 a 20 dias, mas preferencialmente de 28 oc a 30 oc, durante 5 a 9 dias. [0040] Após o cultivo do fungo, a obtenção dos esporos é feita a partir da lavagem asséptica da superfície do meio BOA utilizando uma solução 0,01% (v/v) de Tween 80 estéril para remoção dos esporos que serão utilizados em suspensão. [0041] Em uma segunda etapa é preparado o meio de cultivo a ser utilizado na fase de produção da amilase pelo processo de fermentação em estado sólido. [0042] O meio de cultivo compreende entre 5,0 a 70,0% de substrato seco de farelo de trigo, preferencialmente entre 40,0 a 50,0%, entre 10,0 a 50,0% de água, preferentemente destilada e entre O a 50,0% de solução de sais, preferencialmente entre 20,0 a 25,0%. [0043] A solução de sais inclui entre O a 20,0% (m/m) de Sulfato de Amônio, preferencialmente 1,O a 3,0%; entre O a 20,0% de Fosfato de

12 11/19 Potássio monobásico, preferencialmente O a 2,0% e mais preferencialmente de 0,5 a 1,0%; e entre O a 20,0% de uréia, preferencialmente 1,O a 3,0%, dissolvidos em água destilada ou água potável. [0044] Para a inoculação, é adicionado assepticamente ao meio de fermentação entre a esporos por grama de substrato seco de farelo de trigo, mais preferencialmente de a esporos da linhagem de Rhizopus microsporus var. oligosporus (CCT 3762) por grama de substrato seco de farelo de trigo. [0045] A incubação é feita em temperatura entre 15 C e 45 C, mas preferencialmente de 25 C a 35 C, por um período de 72 a 200 horas, preferencialmente 120 horas. [0046] Na etapa de extração enzimática em etapa única, são adicionados entre 5 a 15 ml de água destilada por grama de substrato seco de farelo de trigo, seguida de fragmentação do meio fermentado e agitação entre 100 a 300 rpm, por 10 a 60 minutos, com o extrato enzimático separado por filtração e/ou centrifugação. [0047] Para a reação de hidrólise enzimática do amido e resíduos amiláceos são utilizadas de O, 1 a 1 O unidades enzimáticas por mililitro de solução a ser hidrolisada, preferencialmente 1 a 2 unidades, contendo de 2,0 a 20,0% de carboidratos, preferencialmente 5,0 a 10,0%, em temperatura entre 20 C a 65 C, preferencialmente entre 50 C e 60 C e ph de 3 a 7, preferencialmente ph de 5 a 6. Nesta etapa, os substratos devem estar brutos ou gelatinizados em água ou solução tampão de acordo com o ph definido, ou simplesmente em água ou outro veículo. [0048] Os carboidratos são selecionados dentre farinha de trigo tipo 11, farelo de trigo, trigo, mandioca ou bagaço de mandioca, grãos integrais ou não ou quirera de arroz ou milho, água de maceração de milho, manipueira e outros resíduos amiláceos, tais como resíduos sólidos de fábricas de amidos em geral.

13 12/19 [0049] A reação é iniciada quando é feita a mistura de apenas um destes compostos ou composição de mais de um destes compostos, preferencialmente já gelatinizados, e em condições de concentração de substratos, enzima, ph e temperatura já descritos, na presença ou ausência de agitação suave ou intensa. [0050] A reação de hidrólise do amido é realizada pela incubação do substrato juntamente com o extrato enzimático em temperatura entre 20 C e 65 C, mas preferencialmente de 50 C a 65 C, entre 1 a 120 horas, preferencialmente 5 a 12 horas. [0051] A solução açucarada, contendo predominantemente glicose, é filtrada, podendo ser utilizados filtros comuns e de carvão ativado para remoção de impurezas e cor. A solução rica em glicose, neste caso denominada xarope de glicose, sofre concentração em evaporador até atingir a concentração mínima de 20% (m/v) de glicose, podendo também ser concentrado em outras concentrações conforme a necessidade. [0052] A solução rica em glicose, de forma alternativa, pode ser usada diretamente em bioprocessos fermentativos. [0053] A solução rica em glicose, de forma alternativa, pode ser usada como adoçante, sem a necessidade de concentrá-la em xarope de glicose. [0054] Alternativamente, a solução açucarada pode ser desmineralizada por meio de colunas de troca iônica aniônica e catiônica. TESTES [0055] Foram realizados ensaios de FES com diferentes concentrações de sais, sendo o Ensaio 1 uma solução padrão de sais (9,3% de (NH 4 )2S0 4, 4,8% de KH 2 P0 4 e 2,3% de ureia), Ensaio 2 Ausência de suplementação; Ensaio 3 (5% de (NH 4 )2S0 4, 2,5% de KH 2 P0 4 e 2,5% de uréia), Ensaio 4 (2,5% de (NH 4 )2S0 4, 1,25% de KH 2 P0 4 e 1,25% de ureia) e Ensaio 5 (2,5% de (NH 4 )2S0 4, 1,25% de KH 2 P0 4 e 2,5% de ureia).

14 13/19 [0056] Conforme evidenciado na figura 1, a maior produção de amilase foi de 367 U/g (ensaio 3) para valores intermediários de concentração dos sais (NH 4 )2S0 4, KH 2 P0 4 e ureia. Isto representa um aumento de 100% na atividade enzimática, quando comparado com os testes que utilizaram apenas farelo de trigo (180 U/g) como substrato (ensaio 2) e aqueles que foram suplementados com a máxima concentração sais (181 U/g) da solução padrão (ensaio 1 ). [0057] Os resultados com a solução padrão foram superiores à produção de glicoamilase (1 08 U/g) do estudo de Soccol et a/. (SOCCOL, C. R.; ILOKI, 1.; MARIN, B.; RAIMBAUL T, M. Comparative production if alfa amylase, glucoamylase and protein enrichment of raw and cooked cassava by Rhizopus strains in submerged and solid state fermentations. Journal of Food Science and Technology, 31, p , 1994) utilizando Rhizopus oryzae em fermentação em estado sólido e mandioca crua como substrato. [0058] Os resultados mostraram que a redução da concentração de sais dobrou a produção enzimática, em comparação com a solução padrão, correspondente à máxima concentração de sais testada. Isso indica que as proporções mais elevadas dos componentes testados causaram um possível efeito inibitório, como alteração do equilíbrio osmótico nas células fúngicas, afetando a síntese de amilase por R. oligosporus. [0059] Como os ensaios 3, 4 e 5 foram estatisticamente iguais quanto à atividade, as menores concentração de sais do teste 4 foram selecionadas como os valores máximos dos intervalos utilizados no planejamento experimental e os valores mínimos foram correspondentes à ausência de suplementação. Foi empregado um Delineamento Central Composto Rotacional (DCCR) com seis ensaios nos pontos axiais e três repetições da condição central, apresentado na Tabela 1, com as especificações dos níveis das variáveis apresentados na Tabela 2. [0060] Tabela 1:

15 14/19 Delineamento experimental para o processo de obtenção de amilase, as respostas obtidas e os valores previstos pelo modelo estatístico. Ensaios Variáveis codificadas Atividade (U/g) (NH4)2S04 KH2P04 Uréia Experimental Previsto ,4 244, ,6 264, ,4 244, ,7 264, ,2 339, ,1 319, ,3 339, ,9 319,38 9-1,68 o o 287,9 298, ,68 o o 320,8 298,49 11 o -1,68 o 318,9 294,65 12 o 1,68 o 282,2 294,65 13 o o ' 227,7 225,90 14 o o 1,68 361,6 351,60 15 o o o 323,8 327,42 16 o o o 324,9 327,42 17 o o o 331,5 327,42 [0061] Tabela 2: Especificação dos níveis das variáveis utilizadas no Delineamento Central Composto Rotacional (DCCR). Níveis codificados ' Valores reais das variáveis em estudo(%, m/m) Sulfato de Fosfato de Ureia amônio potássio (X3) (X1) (X2) 0,00 0,00 0,00

16 15/ ,50 0,25 0,25 ' I 0,00 1,25 0,63 0,63 1,00 2,00 1,00 1,00 1,68 2,50 1,25 1,25 [0062] Conforme apresentado na figura 1, a quantidade de amilase sintetizada por R. o/igosporus variou de 227,7 U/g (ensaio 13) a 361,6 U/g (ensaio 14 ). Para o valor mais baixo de atividade enzimática obtida, não houve adição de ureia, e para o valor mais alto, a concentração de ureia foi a maior utilizada no planejamento (1,25%). Ou seja, as respostas de máximo e mínimo de atividade pertencem aos ensaios nos pontos axiais da ureia. [0063] Tabela 3: Coeficientes de regressão para o modelo polinomial utilizando variáveis codificadas. Coeficientes Erro Fatores t (7) p- valor de regressão padrão Média 327,42 7,09 46,18 < 0,0001 x1 (L) 5,15 3,33 1,55 0,1662 x1 (Q) -10,25 3,67-2,79 0,0268 x2 (L) -4,74 3,33-1,42 0,1980 X2(0) -11,61 3, ' 0,0158 x3 (L) 37,41 3,33 11,23 < 0,0001 x3 (Q) -13,70 3, ' 0,0073 x1x2 0,10 4,35 0,02 0,9818 X1X3 1,27 4,35 0,29 0,7795 x2x ' 4, ' 0,0572 [0064] Com a análise dos coeficientes de regressão (apresentados na Tabela 3), é possível observar que os termos relacionados às três variáveis (X1, X2 e X 3 ), bem como a interação entre as variáveis X2 e X3,

17 16/19 apresentaram efeitos estatisticamente significativos, afetando a síntese de amilase. [0065] O modelo com as variáveis codificadas incluindo os parâmetros significativos p< O, 1 O é expresso por: [0066] Atividade (U/g) = 327,42-10,25 X/- 11,61 X/ + 37,41 X 3-13,70 xl- 9,89 X2X3 [0067] Através da análise das superfícies de resposta e curvas de contorno, apresentadas na figura 2, verifica-se que, para a obtenção da máxima produção enzimática, deve-se trabalhar com as fontes de nitrogênio e fósforo, sulfato de amônia e fosfato de potássio em concentrações ao redor de 1,25% e 0,63% (condições do ponto central), respectivamente. No entanto, para valores mais altos de fosfato de potássio, a produção enzimática decresce e para as concentrações mais baixas a atividade aumenta (Figura 2 - E e F). [0068] É verificada ainda uma forte influência da concentração de ureia sobre a resposta, de modo que a maior produção enzimática pode ser observada no ensaio com a concentração de 1,25%, o maior valor testado (Figura 2 - C e E). [0069] Foi verificado que o perfil de hidrólise enzimática foi semelhante para todos os substratos testados, aumentado gradativamente a liberação de açúcares redutores de 30 minutos até 6 horas, tendendo a se estabilizar após este período. Com a hidrólise do amido foi possível obter total conversão em açúcar redutor em 6 h de reação, conforme apresentado na Tabela 5. [0070] Quanto à hidrólise da farinha de trigo tipo 11, farelo de trigo e bagaço de mandioca, a solução foi preparada considerando o teor de carboidratos totais, conforme Tabela 4. [0071] O rendimento de hidrólise para o amido foi de 100% em 6 horas, para a farinha de trigo tipo 11 foi de 63,5% em 6,5 horas, para o bagaço de mandioca foi de 40,5% em 7 horas e para o farelo de trigo foi de 35,5 % em

18 17/19 6 horas, conforme Tabela 5. Tais rendimentos equivalem em eficiências (conforme apresentado na figura 3) de 100%, 82,9%, 63,4% e 60,4 respectivamente para o amido, farinha de trigo tipo 11, farelo de trigo e bagaço de mandioca, considerando-se o teor de amido destes produtos listados na Tabela 4. Verifica-se que o menor fator de conversão de amido em glicose ocorreu em função da pureza do amido. No caso, quanto mais impuro o amido, menor o fator de conversão ou eficiência. Isso ocorre devido à presença de outros componentes, como proteínas, gorduras e fibras na composição destes substratos, dificultando a ação enzimática sobre a porção alvo da amilase que é o amido. Correlacionando a eficiência na conversão do amido em glicose e a porcentagem de fibras, constata-se maior liberação de açúcares redutores quanto menor a proporção de fibras do substrato. [0072] Tabela 4: Composição geral dos substratos utilizados para hidrólise enzimática. Fonte: Amido solúvel (SIGMA-ALDRICH, 2014); Farinha de trigo tipo 11 (MOINHO NACIONAL, 2014); Farelo de trigo (MOINHO NACIONAL, 2014; PRÜCKLER et ai., 2014); Bagaço de mandioca (FREITAS et ai., 2014). Amido Farinha de Farelo de Bagaço de Composto (%) solúvel trigo tipo 11 trigo Mandioca Carboidratos 100,0 76,6 56,0 67,2 Proteínas - 10,3 14,0 2,6 Gorduras totais - 1,O 3,0 1,2 Fibras - 2,6 11,O 20,0 [0073] Ghosh e Ray (201 O) realizaram a sacarificação de diferentes tipos de amido pela isoamilase de Rhizopus oryzae PRT MTCC Foi obtido um máximo de 43% de sacarificação após 60 minutos de incubação, utilizando 1% de amido de batata (Merck). [0074] Liu e Xu (2008) testaram a capacidade de digestão de amido cru por a-amilase a partir de Bacil/us sp. YX-1. Os autores constataram que a taxa

19 18/19 de degradação de grânulos de milho, trigo e batata preparados com concentração de 1% foram iguais a 57,5 %, 53 %, 45,1 % em 8 horas e de 63,2 %, 56,4 %, 48,6 % em 12 horas, respectivamente. [0075] No entanto, estes resultados foram inferiores aos obtidos na presente invenção para amido solúvel e farinha de trigo tipo 11. [0076] A Tabela 5 apresenta a comparação dos rendimentos de hidrólise considerando a liberação de açúcar redutor (AR) pelo teor de carboidratos do substrato ou em massa do substrato utilizada. Verifica-se que há um rendimento menor quanto maior a proporção de outros componentes, como fibras e proteína, naturalmente encontrados nos resíduos. No entanto, de acordo com os resultados apresentados, é possível obter valores expressivos de açúcares redutores (AR), sendo: 1 Kg de AR/Kg de amido, 0,63 Kg de AR/Kg de farinha de trigo tipo 11, 0,41 Kg de AR/Kg de bagaço de mandioca e 0,36 Kg de AR/Kg de farelo de trigo, demonstrando a eficiência do bioprocesso empregado. [0077] Tabela 5: Rendimento da produção de glicose durante a hidrólise dos substratos amiláceos considerando o teor de açúcar redutor liberado pela massa do substrato utilizado. Rendimento (% massa) Tempo (h) Farinha de Bagaço de Amido Farelo de trigo trigo tipo 11 Mandioca 0,5 13,08 10,28 8,31 5, ,18 18,11 11,75 14,16 1,5 30,83 24,53 19,94 17, ,70 28,93 20,81 21,34 2,5 45,98 34,25 22,34 26, ,45 39,04 22,91 29,10 3,5 64,92 41,73 27,82 31,22

20 19/ ,06 46,89 29,02 34,90 4,5 76,71 49,82 28,16 35, ,02 51,22 28,97-5,5 98,87 53,66 28,42 35, ,00 61,10 35,49 38,28 6,5-63,53 34,68 40, ,85 36,44 40,50 [0078] O xarope produzido foi concentrado por evaporação até alcançar 20% de açúcar redutor. Considerando os relatos da literatura, se constata a superioridade da tecnologia desenvolvida no presente trabalho para a produção de amilase e aplicação para a conversão do amido em glicose. Os resultados indicaram que a amilase produzida apresenta potencial para aplicações industriais.

21 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE XAROPE DE GLICOSE VIA HIDRÓLISE POR EXTRATO AMILOlÍTICO caracterizado por compreender as etapas de: a) propagação da cultura para obtenção de esporos (esporangiósporos) utilizando fungos da linhagem Rhizopus microsporus var. oligosporus (CCT 3762), fungos Rhizopus oryzae, Aspergillus niger e outras espécies de Aspergillus; b) preparo do meio de cultivo que inclui entre 5,0 a 70,0% de substrato seco de farelo de trigo, preferencialmente entre 40,0 a 50,0%; entre 10,0 a 50,0% de água, preferentemente destilada e entre O a 50,0% de solução de sais, preferencialmente entre 20,0 a 25,0%; c) inoculação mediante adição ao meio de fermentação entre a esporos por grama de substrato seco de farelo de trigo, mais preferencialmente de a de esporos por grama de substrato seco de farelo de trigo, mantido a temperatura entre 15 C e 45 C, mas preferencialmente de 25 C a 35 C, por um período de 72 a 200 horas, preferencialmente 120 horas; d) extração enzimática em etapa única mediante adição entre 5 a 15 ml de água destilada por grama de substrato seco de farelo de trigo, seguida de fragmentação do meio fermentado e agitação entre 100 a 300 rpm, por 1 O a 60 minutos, com o extrato enzimático separado por filtração e/ou centrifugação; e) reação de hidrólise enzimática do amido e resíduos amiláceos utilizando de O, 1 a 1 O unidades enzimáticas por mililitro de solução a ser hidrolisada, preferencialmente 1 a 2 unidades, contendo de 2,0 a 20,0% de carboidratos, preferencialmente 5,0 a 10,0%, em temperatura entre 20 C a 65 C, preferencialmente entre 50 C e 60 C e ph de 3 a 7, preferencialmente ph de 5 a 6, entre 1 a 120 horas, preferencialmente 5 a 12 horas.

22 2/3 2. PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE XAROPE DE GLICOSE VIA HIDRÓLISE POR EXTRATO AMILOLÍTICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do fungo ser cultivado preferencialmente no meio de cultivo estático BOA (Batata Dextrose Ágar), entre 15 C a 40 C, por 3 a 20 dias, mas preferencialmente de 28 oc a 30 oc, durante 5 a 9 dias. 3. PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE XAROPE DE GLICOSE VIA HIDRÓLISE POR EXTRATO AMILOLÍTICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da solução de sais incluir entre O a 20,0% (m/m) de Sulfato de Amônia, preferencialmente 1,O a 3,0%; entre O a 20,0% de Fosfato de Potássio monobásico, preferencialmente O a 2,0% e mais preferencialmente de 0,5 a 1,0%; e entre O a 20,0% de ureia, preferencialmente 1,O a 3,0%, dissolvidos em água destilada ou água potável. 4. PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE XAROPE DE GLICOSE VIA HIDRÓLISE POR EXTRATO AMILOLÍTICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da etapa de reação de hidrólise enzimática do amido requerer substratos brutos ou gelatinizados em água ou solução tampão de acordo com o ph definido. 5. PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE XAROPE DE GLICOSE VIA HIDRÓLISE POR EXTRATO AMILOLÍTICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato dos carboidratos utilizados na etapa de reação de hidrolise enzimática dos amidos serem selecionados dentre farinha de trigo tipo 11, farelo de trigo, trigo, mandioca ou bagaço de mandioca, grãos integrais ou não ou quirera de arroz ou milho, água de maceração de milho, manipueira e outros resíduos amiláceos. 6. PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE XAROPE DE GLICOSE VIA HIDRÓLISE POR EXTRATO AMILOLÍTICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da solução açucarada contendo

23 3/3 predominantemente glicose ser filtrada, passando por uma etapa de concentração em evaporador. 7. PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE XAROPE DE GLICOSE VIA HIDRÓLISE POR EXTRATO AMILOLÍTICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da solução açucarada ser desmineralizada por meio de colunas de troca iônica aniônica e catiônica.

24 1/3 400 b b b êi - 2. (1l u :;::; l'a E 300 'j:;j c Q) Q) "C (1l "C :;; ~ o Ensaios 4 5 Figura 1

25 2/3 A B c D E Figura 2 F

26 3/3 -~ o - o -c: 80 CJ) 60 E 'O c: CJ) c::: 40 o Tempo (horas) Figura 3

27 1/1 RESUMO PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE XAROPE DE GLICOSE VIA HIDRÓLISE POR EXTRATO AMILOLÍTICO É descrita a invenção de um processo para produção de amilases via fermentação em estado sólido que utiliza um meio de cultura à base de farelo de trigo complementado com sais de baixo custo e o fungo Rhizopus microsporus var. oligosporus (CCT 3762) e, através do extrato amilolítico produzido, é feita a hidrólise total do amido puro ou na forma de resíduo em etapa única, ou seja, a liquefação e a sacarificação para a hidrólise total e obtenção de xarope de glicose.