Efeito do veneno de Bothrops moojeni no fígado de ratos Wistar: marcadores enzimáticos da função do fígado e o uso de fitoterápico.

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1 1 Efeito do veneno de Bothrops moojeni no fígado de ratos Wistar: marcadores enzimáticos da função do fígado e o uso de fitoterápico. Adrielly Pereira da Silva 1,2 ; Maria Helena Fermiano 2 ; Rosemary Matias Coelho 3 ; Baldomero Antonio Kato da Siva ² ; Doroty Mesquita Dourado ²; 1 Bolsista PIBIC /CNPq dykah_aps@hotmail.com 2 Laboratório de Toxinologia e Plantas Medicinais - Universidade Anhanguera Uniderp; 3 Laboratório de Produtos Naturais - Universidade Anhanguera Uniderp Resumo As peçonhas de serpentes são misturas complexas que podem desencadear severas desordens metabólicas, sendo tóxicas ao sistema neurológico, renal, hepático e também ocasionando edema e eritema no local. O fígado cumpre a tarefa de manter a homeostase metabólica corporal. A elevação sérica das enzimas ALT, AST e FA é um indicativo de dano hepático, mas essa alteração enzimática não interfere no funcionamento normal do fígado. Este trabalho tem como finalidade a busca de tratamentos alternativos e eficazes de fácil aplicabilidade e baixo custo a população em acidentes ofídicos. Foram utilizados 48 ratos Wistar machos com aproximadamente 250g, divididos em 4 grupos: G1 (Solução Salina); G2 (veneno de Bothrops moojeni); G3 (Veneno+ planta Sebastiana hispida via gavage) e G4 (Veneno+Planta S.hispida via intraperitoneal), Os animais foram eutanasiados nos períodos de 3 horas, 3 dias e 7 dias após a injeção dos tratamentos, sendo sacrificados 4 indivíduos por tempo. Após os períodos de experimentos os animais serão eutanasiados com dose de Xilazina (5mg/kg) e Ketamina (30 mg/kg). Os danos causados pela injeção de veneno bruto de B. moojeni serão avaliados através de análises histológicas do tecido hepático, o sangue será coletado para avaliação enzimática em função do tempo pós-envenenamento e em função do tratamento com o extrato da planta Sebastiana hispida (Euphorbiaceae). O uso do extrato aquoso de S. hispida se mostrou benéfico para acidentes Botrópicos. Palavras chaves: fígado; alterações hepáticas; acidente botrópico; enzimas. INTRODUÇÃO Os acidentes causados por serpentes peçonhentas constituem importante problema na Saúde Pública em regiões tropicais o mundo. A incidência e o numero de mortes por picada de serpente, no mundo todo, são desconhecidos seja por falta de registro ou por metodologia deficiente na captação de dados (LIZANO et.al., 2003). A peçonha botrópica pode desencadear severas desordens metabólicas devido às atividades proteolítica, coagulante, hemorrágica, necrosante e reação inflamatória (CHIPAUX, 1991). O fígado como órgão responsável por metabolizar todos os compostos xenobióticos do organismo pode ser afetado acentuadamente quando o indivíduo é picado por serpente peçonhenta, provocando assim uma desordem metabólica considerável. Uma forma de avaliar o dano hepático é através de testes de função hepática, as enzimas que identificam dano hepático são: Alanina-aminotrasferase (ALT), Aspartato-aminotrasferase (AST) e a Fosfatase Alcalina (FA) pode indicar processo de colestase (SCHAFFNER, SCHAFFNER, 1969). O uso de plantas medicinais está atribuído à cultura popular, sendo fonte primária de estudos com plantas e suas características, as quais podem vir a ser benéficas ao ser humano tornando-se princípio ativo de fármacos. A planta Sebastiana hispida é uma planta pioneira encontrada em várias regiões do Pantanal (POTT; POTT, 1994). A S. hispida apresenta metabólicos secundários, que são de muita importância para estudos fitoterápicos (HONDA, 1990). Essa espécie vegetal períodos mais secos há um aumento em sua abundância e também é um espécime invasor das sub-regiões do pantanal da Nhecôlandia

2 2 (TOMAS, 2010). Este trabalho tem por objetivo buscar métodos alternativos eficazes de tratamento para acidentes ofídicos de baixo custo e fácil acesso. MATERIAL E MÉTODOS Neste trabalho foram utilizados 48 ratos (Rattus albinus novergicus) adultos, machos da linhagem Wistar, pesando aproximadamente 200 a 250 g e provenientes do biotério da Universidade Anhanguera-Uniderp. Os animais foram alimentados com ração Nuvital e água ad libitum em condições ambientais apropriadas. A planta Sebastiana hispida (Euphorbiaceae) foi coletada no Pantanal do Rio Negro, MS e o veneno bruto foi extraído de serpentes Bothrops moojeni mantidas no Laboratório de Zoologia 1. Grupo G1: injetado com solução salina estéril 0,9 % (0,1 ml/100g de peso corporal) 2. Grupo G2 (40 g/ml) (0,4 mg/kg): injetado com solução de veneno bruto; 3. Grupo G3: injetado com veneno bruto e tratado de imediato com o extrato aquoso das folhas de Sebastiana híspida, diariamente via gavage (1ml). 4. Grupo G4: injetado com veneno bruto e tratado de imediato com o extrato aquoso das folhas de Sebastiana híspida, diariamente via intraperitoneal (1ml). O tempo para a eutanásia dos animais do grupo controle (SS) foram o mesmo dos demais grupos, ou seja, 3h, 3 e 7 dias. A via de inoculação do veneno foi intramuscular (i.m.), enquanto que da solução salina foi via gavage e do extrato aquoso da planta foi inoculado por duas vias: via gavage e via intraperitoneal. Foi feita a analgesia pré-emptiva em todos os grupos de animais que foram injetados com veneno para minimizar o desconforto causado pela toxina botrópica no período imediato da aplicação. Caso observasse desconforto do animal a dose seria ser repetida até 72horas após o inicio do experimento. Para analgesia foi usado butorfanol (opióide) (torbugesic ) na dosagem 0,01mg/100g/animal via oral. Na eutanásia foram anestesiados em dose excessiva com a associação dos anestésicos Xilazina (5mg/kg) e Ketamina (30 mg/kg). O fígado foi retirado, pesado e medido e imerso em solução de paraformoldeido 4% a base de tampão fosfato de sódio 0,2M ph 7,4 por 24 horas, processados, incluídos em parafina, cortados em micrótomo com 5 m de espessura, foram corados através Hematoxilina e Eosina, Reação do Reativo de Schiff e Tricômico de Mason, para leitura das lâminas através de microscopia usando o programa Imagelab As medidas das variáveis foram expressas em média ± desvio padrão. Os dados foram expostos de modo a se comparar as alterações enzimáticas. Para comparação entre os grupos foi utilizada a Análise de Variância (ANOVA) com post hoc test de Tukey. Consideraram-se como significantes as comparações com p 0,05. RESULTADOS E DISCUSSÃO Na avaliação enzimática observou-se elevação sérica das enzimas hepáticas comparando-se o grupo solução salina com os grupos tratados com veneno e extrato de S. hispida. Na analise entre os grupos a enzima AST permanece alterada em todos os momentos do experimento, demonstrando uma queda significativa quando comparado ao grupo Vb x ExTSh v.g. Na analise histológica o grupo controle não apresentou nenhuma alteração durante o experimento. Observou-se boa preservação da arquitetura celular do órgão, com núcleos ovóides aparentes e cordões celulares de hepatócitos definidos em direção a veia centrolobular. Ausência de degeneração e necrose. Ductos biliares e veias hepáticas bem definidas e preservadas. Os indivíduos analisados do grupo Veneno apresentaram alterações como: degeneração do citoplasma, desestruturação da arquitetura do fígado, deposição proteinácea e inflamação focal.

3 3 Os grupos tratados com extrato aquoso de S.hispida via intraperitoneal no período de 3h, apresentou muitas células com degeneração citoplasmática, algumas células em cariólise e arquitetura do fígado pouco alterada e aos 7 dias de experimento o órgão apresentava muitos pontos de necrose. No grupo tratado via gavage no período de 3h o arranjo estrutural do fígado estava bem preservado com poucas células em cariólise e aos 3 dias havia pontos de necrose e no período de 7 dias o arranjo do órgão já estava próximo a normalidade. InF * InF * A B C D Figura1: cariólise de hepatócitos (setas) e inflamação focal (InF) no grupo tratado com extrato aquoso via intra peritoneal (A); inflamação focal (InF), hepatócito com núcleo aumentado(seta) e alguns pontos de necrose (*), no grupo tratado com extrato via gavage (B); muitos hepatócitos com degeneração citoplasmática (setas) no grupo veneno(c); células. do fígado preservadas no grupo controle(d). HE/400x Os venenos de serpentes da família Viparidae possuem potente ação inflamatória, desencadeada rapidamente após o envenenamento (GUTIERREZ; LOMONTE, 2003) e as alterações histopatológicas produzidas pelo veneno botrópico são conseqüências de sua ação pró-inflamatória, proteolítica, hemorrágica e coagulante (BENVENUTI, 2003). O efeito sistêmico do veneno permite que a sua toxicidade chegue ao fígado, provocando danos estruturais como rompimento de hepatócitos, necrose e comprometimento das funções do órgão. A elevação de ALT ocorre na presença de alterações hepáticas intensas (ANDRIOLO, 2005) e AST possui, além da fração citoplasmática, frações em mitocôndrias, elevando-se em geral após a ALT, em resposta a agressões mais intensas (KONDO, 2003). A liberação dessas enzimas se dá quando um tecido é lesado, sendo a ALT específica para lesões hepáticas. CONCLUSÃO A avaliação enzimática mostrou resultados positivos para o uso do extrato via gavage apresentando um decréscimo nos níveis de AST e histologicamente os grupos tratados com extrato aquoso de S. hispida mostraram melhora no tecido lesado pelo veneno. AGRADECIMENTO As instituições de fomento PIBIC/CNPq, a PROPP e a Universidade Anhanguera - Uniderp. REFERÊNCIAS: Andriolo, A. Guia de medicina ambulatorial e hospitalar da UNIFESP-EPM: medicina laboratorial. São Paulo: Manole, Benvenuti, L.A.; Anatomia Patológica nos Accidentes por Animais Peçonhentos. In: Cardoso, J.L.C.; França, F.O.S.; Wen, F.H.; Málaque, C.M.S.; Junior,V.H. (Org.). Animais Peçonhentos no Brasil: Biologia, clínica e terapêutica dos acidentes. São Paulo: Savier, p , 2003.

4 4 CHIPAUX, J. P.; WILLIANS, V. AND WHITE, J. Review article: Snake venom variatiability: Methods of study and interpretation. Toxicon,v. 29, p , Gutiérrez, J.M.; Lomonte, B. Efectos locales en el envenenamiento ofídico en América latina. In: Cardoso, J.L.C.; França, F.O.S.; Wen, F.H. Animais Peçonhentos no Brasil: biologia, clínica e terapêutica dos acidentes. São Paulo: Savier, HONDA, N. K.; GARCEZ, W. S.; GARCEZ, F. R.; CONCEIÇÃO, C. A. Estudo químico de plantas de Mato Grosso do Sul I: triagem fitoquímica. Revista Científica e Cultural UFMS, v. 5, p , 1990 Kondo Y, Kobayashi K, Kobayashi T, Shiina M, Ueno Y, Satoh T, et al. Distribution of the HLA class I allele in chronic hepatitis C and its association with serum ALT level in chronic hepatitis C. Tohoku Journal Experimental Medicine. v.201, p , LIZANO, S. DOMONT, G. PERALES, J. Natural phospholipase A2 myotoxin inhibitor proteins from snakes, mammals and plants. Toxicon, v.42, n. 8, p , POTT, A.; POTT, V. J. Plantas do Pantanal. Corumbá: EMBRAPA Pantanal, SCHAFFNER, J.A. SCHAFFNER, F. Avaliação das condições do fígado. In HENRY, R.J. Bioquímica clinica. Barcelona. Ed. Jims, p TOMAS, M. A.; TOMAS, W. M.; RODRIGUES, F.H.G. Importância da Sebastiania hispida para o Veado-Campeiro, Ozotoceros bezoarticus, em períodos de seca no Pantanal. In: 5º Simpósio sobre recursos nataruais e sócio econômicos do Pantanal. Corumbá, 2010.

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