ESTUDO DA AÇÃO HEPATOPROTETORA DO RESVERATROL EM MODELO EXPERIMENTAL DE LESÃO HEPÁTICA POR PARACETAMOL EM RATOS
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- Mônica Moreira Azambuja
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1 ESTUDO DA AÇÃO HEPATOPROTETORA DO RESVERATROL EM MODELO EXPERIMENTAL DE LESÃO HEPÁTICA POR PARACETAMOL EM RATOS Luiza Arco e Flexa Faculdade de Ciências Farmacêuticas Centro de Ciências da Vida luiza.af@puccampinas.edu.br Gustavo Henrique da Silva Obtenção e aplicação de insumos de origem vegetal e animal em alimentos, fitoterápicos e cosméticos Centro de Ciências da Vida gustavohs@puc-campinas.edu.br Resumo: O fígado é o maior e mais pesado órgão interno e possui funções endócrinas e exócrinas, sendo o hepatócito a célula responsável por estas funções, além de converter substâncias nocivas em materiais não-tóxicos que são excretados pela bile. Por esse motivo o fígado é sensível à ação de alguns fármacos, como, por exemplo, o Paracetamol, um analgésico amplamente utilizado, é facilmente metabolizado pelo tecido hepático, porém, em doses elevadas, provoca produção maciça de um metabólito altamente lesivo aos hepatócitos. O resveratrol é um composto de origem vegetal com propriedades antioxidantes que apresenta indicação terapêutica em distúrbios hepáticos. Neste sentido, utilizando o paracetamol como modelo experimental de lesão hepática, o objetivo do presente projeto é avaliar a efetividade do resveratrol como hepatoprotetor em ratos wistar. Para realização do experimento serão utilizados 40 animais, subdivididos em 02 grupos (Controle e Tratado), sendo que os animas do grupo tratado serão submetidos à pré-tratamento de 8 dias com a substância ativa e no 7 dia sofrerão intoxicação c om elevada dose de paracetamol. Após 24 h e 72 h, serão eutanaziados para coleta de amostras de sangue e tecidos. Para avaliação da atividade hepatoprotetora, será realizada a dosagem sérica de enzimas indicativas de lesão hepática (AST, ALT e Fosfatase Alcalina) e análise histológica e morfométrica no tecido hepático. Os resultados mostraram o resveratrol diminuiu a necrose e infiltração inflamatória, a depleção de glicogênio e outros 1,2-glicóis, além de impedir a elevação nos níveis séricos de AST e ALT, podendo concluir que o resveratrol apresentou atividade hepatoprotetora na intoxicação aguda por paracetamol. Palavras-chave: Paracetamol, hepatotoxicidade, resveratrol. Área do Conhecimento: Farmácia 1. INTRODUÇÃO O fígado é o maior e mais pesado órgão interno, sendo também o mais versátil e vascularizado. Assim como o pâncreas, apresenta funções exócrinas e endócrinas, responsável pela produção de bile (secreção exócrina) e pela formação de diversos produtos endócrinos. Os hepatócitos também fazem a desintoxicação do organismo, convertendo substâncias nocivas em materiais não tóxicos, excretados pela bile. O fígado também é responsável pelo metabolismo de lipídeos, carboidratos, proteínas e armazenamento de glicogênio, vitaminas e ferro. [2, 12] A hepatite tóxica é uma lesão causada por inalação, ingestão ou administração parentérica de agentes farmacológicos ou químicos, sendo de grande relevância na prática clínica. Para a lesão celular metabólica dos hepatócitos vários são os mecanismos de agressão e dependendo da extensão do envolvimento mitocondrial e do balanço de fatores ativadores/ inibidores de vias intracelulares de sinalização, o destino da célula poderá ser a necrose ou a apoptose, sendo a primeira situação geradora de mecanismos inflamatórios. A caracterização laboratorial da lesão hepática é bastante ampla e variável, principalmente em relação ao tipo de medicamento. Elevações nos níveis séricos das transaminases (AST e ALT) são sempre observadas, bem como alteração na Fosfatase Alcalina. Histologicamente são observadas desde necrose focal, esteato-hepatite, hepatite crônica e aguda, citopatias mitocôndrias, fibrose, colestase, alterações vasculares e neoplasias. [8, 10, 11,13] O paracetamol é um dos fármacos mais utilizados como analgésico e antipirético, sendo a principal causa de falência hepática, principalmente na superdosagem acidental e intencional, também muito implicado em óbitos nos EUA na década de 90. Na administração de doses tóxicas, as vias tradicionais de metabolização saturam e a via do Citocromo P- 450 assume a biotransformação do paracetamol,
2 ocasionando maior formação de metabólito tóxico e radicais livres, conduzindo a necrose dos hepatócitos. Modelos experimentais que utilizam intoxicação por Paracetamol têm sido amplamente utilizados para avaliar hepatoproteção de drogas e compostos vegetais. [5, 7, 15] O resveratrol (3,5,4 trihidroxiestilbeno) é um polifenol natural encontrado em mais de 70 espécies de plantas, incluindo a videira (Vitis vinifera). Nas últimas décadas, ganhou a atenção de cientistas em todo o mundo devido as suas atividades anti-câncer, antiinflamatórias, hipoglicemiantes e de outros benefícios cardiovasculares. O resveratrol é um neutralizador de radicais livres e um potente antioxidante devido à sua capacidade de promover a atividade de uma variedade de enzimas antioxidantes. A explicação mais provável da sua propriedade antioxidante in vivo está na sua capacidade de aumentar a síntese de óxido nítrico (NO), que por sua vez age como um antioxidante. Recentemente diversos autores constataram a ação hepatoprotetora do resveratrol em diversos modelos experimentais de lesão hepática. [3, 4, 9, 14] 2. OBJETIVOS Avaliar a efetividade do resveratrol como hepatoprotetor em lesão hepática produzida experimentalmente em ratos wistar analisando as alterações histológicas, morfométricas e enzimáticas do fígado. 3. METODOLOGIA Foram utilizados 40 ratos albinos, machos, da linhagem Wistar, não isogênicos com 50 dias de idade fornecidos pelo Biotério do Campus II da PUC Campinas. Em todo o período do experimento os animais não foram submetidos a condições de estresse ou qualquer tipo de sofrimento. Não houve restrição de água ou alimento. Foram observados e cumpridos os "Princípios éticos para uso de animais de laboratório" da Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório. O experimento foi conduzido dividindo-se os animais em dois grupos: tratado e controle. O grupo tratado foi subdivido em subgrupos com 5 animais cada: Subgrupo controle resveratrol 24h e 72h que receberam suspensão de resveratrol por 7 dias na dose 10 mg/kg/dia v.o., sendo eutanasiados 24 e 72 horas, respectivamente, após a ultima administração; Subgrupo controle paracetamol + resveratrol 24h e 72h que receberam suspensão de resveratrol por 7 dias na dose 10 mg/kg/dia v.o. e junto à ultima administração, receberão solução de paracetamol na dose 3g/kg v.o., sendo eutanasiados após 24 e 72 horas, respectivamente. [11, 13] O grupo controle também será subdividido com 5 animais em cada subgrupo: Subgrupo controle negativo 24h e 72h receberam solução salina v.o. durante 7 dias e eutanasiados 24 e 72 horas, respectivamente, após a ultima administração; Subgrupo controle positivo 24h e 72h receberão solução salina v.o. por 7 dias e solução de paracetamol na dose 3g/kg v.o. no ultimo dia, sendo eutanasiados após 24 e 72 horas, respectivamente Coleta Do Material Biológico E Processamento Histológico Passados períodos conforme descrito acima foi feita incisão no ventrículo para realização de coleta de sangue em tubo heparinizado visando dosagem das transaminases hepáticas, fosfatase alcalina e γ- Glutamiltransferase. Houve aprofundamento da a- nestesia até eutanásia do animal e remoção do tecido hepático que foi fragmentado e fixado em solução de formalina 10% tamponada (visando análise histológica) Processamento Histológico Os espécimes de tecido hepático foram submetidos ao processamento histológico padrão em parafina e corados com: Hematoxilina Eosina, Picrosirius Red e Ácido Periódico de Schiff. As lâminas confeccionadas foram examinadas ao microscópio de luz e suas imagens capturadas digitalmente para obtenção dos resultados, avaliando o tipo e a intensidade das lesões hepáticas, observando-se a presença de esteatose, fibrose e necrose Dosagem das Transaminases Hepáticas, Fosfatase Alcalina e γ-glutamiltransferase Partindo do soro, foram quantificadas as enzimas Alanina-Aminotransferase (ALT) e Aspartato- Aminotransferase (AST), Fosfatase Alcalina (FAlc) e γ-glutamiltransferase(γ-gt). A análise foi realizada por método cinético-colorimétrico com leitura em espectrofotômetro UV, conforme especificações contidas nos kits enzimáticos Análise Dos Resultados Na análise histológica do fígado foi realizada com metodologia específica para cada parâmetro: Para a avaliação da necrose os resultados foram expressos vem vcl/cm 2. Para contagem foi utilizado o software TPS Dig 1.30; Para avaliação de fibrose foram analisadas utilizando-se o software AreaMed, mensurando-se a área comprometida por fibrose;
3 Para avaliação da distribuição do glicogênio e outros 1,2-glicóis, realizou-se uma avaliação qualitativa das lâminas coradas em PAS,sendo os resultados expressos por meio de fotomicrografias; A análise estatística das avaliações quantitativas foi realizada no programa Prisma 3.0. A diferença entre os grupos foi comparada por ANOVA seguido do teste de Bonferroni.Os resultados da dosagem das transaminases (AST e ALT), fosfatase alcalina (FAlc) e γ-glutamiltransferase(γ-gt) foram tabulados usando-se o software Microsoft Excel 7.0 e analisados estatisticamente no programa Prisma 3.0. A diferença entre os grupos também foi comparada por ANOVA seguido pelo teste de Bonferroni. 4. RESULTADOS A coloração por Hematoxilina-Eosina permitiu a identificação de estruturas tissulares, células, inclusões e alterações histopatológicas. Após a observação das amostras do Grupo CP foi verificado que não havia incidência de esteatose, mas fibrose e necrose com infiltração de polimorfonucleados. A necrose foi observada predominantemente na região centrolobular, sobretudo, nos animais de 72 h. Esta constatação direcionou para a quantificação dos focos inflamatórios/necróticos nesta região, enquanto que a fibrose foi quantificada em zona 1 e 3 acinar nas lâminas coradas em Pricrosirius Red. Nos animais dos grupos CN e CR o tecido hepático permaneceu preservado, porém nos grupos CP e RP houve inúmeros focos de infiltrado inflamatório, acompanhados ou não de necrose. Nos grupos CP24 e CP72 houve maior predominância deste tipo de lesão, principalmente neste último, tanto em número de regiões centro-lobulares acometidas. Nas lâminas coradas em Picrosirius Red foi verificado que a fibrose estava mais presente nas zonas acinares 1 e 3, e desta forma a quantificação foi realizada nestas regiões. Os grupos CR e RP de ambas as regiões apresentaram área menor de colágeno quando comparadas as dos grupos CP e CN. Realizando-se a observação das secções coradas em PAS, foi verificado que os animais tratados com elevada dose de Paracetamol apresentaram uma grande diminuição das inclusões PAS positivas na região centro-lobular, evidenciada pela diminuição da coloração rósea das células. Verificou-se que nos grupos RP houve a preservações da coloração, obtendo assim 60% de redução de lesão no grupo RP72, indicando então a atividade hepatoprotetora do Resveratrol neste parâmetro. O pré-tratamento com Resveratrol provocou uma diminuição significativa de AST e de ALT em 24h após a administração do paracetamol, protegendo o fígado destes animais. Na Tabela1 observa-se uma diminuição nos níveis séricos de AST e ALT em RP comparando-se à CP. Não houve alterações significativas na fosfatase alcalina e γ-glutamiltransferase, principalmente tendo-se em vista que o grupo CP não sofreu alteração do valor normal destas. Tabela 1: Resultados da dosagem sérica das transaminases, fosfatase alcalina e γ-glutamiltransferase. Valores expressos em U/L ± erro padrão (n=4). ANOVA seguido do teste de Bonferroni, * p<0,001 em relação aos respectivos grupos CP. GRUPOS 24h 72h AST Controle Negativo 89,2 ±7,7 88,6 ±5,3 Controle Resveratrol 89,9 ±5,2 79,9 ±3,3 Resveratrol-Paracetamol 408,7 ±140,4 165,3 ±35,1 Controle Paracetamol 1449,2 ±307,0 179,6 ±34,4 ALT Controle Negativo 39,3 ±2,3 51,9 ±5,5 Controle Resveratrol 42,4 ±2,8 41,7 ±2,5 Resveratrol-Paracetamol 266,5 ±58,5 86,5 ±15,7 Controle Paracetamol 1866,3 ±585,4 194,8 ±56,0 Fosfatase Alcalina Controle Negativo 65,8 ±5,4 83,0 ±19,6 Controle Resveratrol 49,4 ±5,4 46,4 ±3,2 Resveratrol-Paracetamol 73,5 ±4,2 52,6 ±6,7 Controle Paracetamol 83,6 ±9,1 34,6 ±2,8 γ-gt Controle Negativo 5,4 ±1,9 5,4 ±0,4 Controle Resveratrol 6,1 ±0,6 5,4 ±0,7 Resveratrol-Paracetamol 6,7 ±0,5 5,7 ±0,3 Controle Paracetamol 5,6 ±1,0 4,7 ±0,9 5. DISCUSSÃO A análise histológica foi realizada com três principais focos: (a) observação e quantificação de necrose e infiltração inflamatória por meio da coloração Hematoxilina-Eosina, (b) quantificação de fibras colágenas para determinação de fibrose utilizando-se a coloração Picrosirius Red e (c) análise qualitativa de glicogênio e outros 1,2-glicóis por meio da coloração PAS.
4 O primeiro parâmetro mostrou que o Paracetamol, na dose utilizada, provocou necrose e infiltração inflamatória hepática em todos os animais dos grupos 24 h e 72 h, porém neste último as lesões foram mais intensas. O Resveratrol diminuiu significativamente o dano celular no grupo RP72. Tunali-Akbay e colaboradores (2010) verificaram que a administração prévia de Resveratrol, em modelo experimental de lesão hepática induzida por Metotrexato, reduziu as alterações histológicas tais como necrose focal, dilatação e congestão sinusoidal, hiperplasia de células de Kupffer e infiltrado inflamatório no espaço porta e região centro lobular. [14] As secções coradas com Picrosirius Red possibilitaram a realização da quantificação das fibras colágenas na perspectiva de identificação de fibrose. Após análise computacional das imagens verificou-se que não havia diferença significativa entre os grupos, seja na zona 01 ou 03 acinares. Este resultado se justifica devido à baixa intensidade de fibras colágenas observadas e mensuradas no grupo controle positivo, o que corrobora com muitos relatos na literatura científica, que não descrevem presença de fibrose na hepatite tóxica por Paracetamol. [1, 8, 16]. O terceiro parâmetro histológico avaliado mostrou que os animais tratados com elevada dose de Paracetamol apresentaram um aumento das inclusões PAS positivas na região portal e diminuição destas na região centro-lobular quando comparados com o grupo controle negativo. A diminuição de glicogênio hepático pelo Paracetamol foi relatada por Itinose, Sakuno e Bracht (1989) e está relacionada à sua ligação irreversível a um metabólito reativo ou da inibição do metabolismo energético mitocondrial. Apesar de não ter sido realizada uma análise quantitativa, foi possível observar com clareza que o prétratamento com Resveratrol promoveu a distribuição homogênea do glicogênio. [6] Com relação às transaminases hepáticas, o Resveratrol apresentou potencial hepatoprotetor. Os grupos tradados com Resveratrol mostraram resultados significativos em relação às duas enzimas. Gedik e colaboradores (2008) e Tunali-Akbay e colaboradores (2010) em desenho experimental de lesão hepática por isquemia/reperfusão e lesão induzida por Metotrexato, respectivamente, obtiveram resultados semelhantes a estes, redução significativa de AST e ALT pelo uso de Resveratrol. [3, 14] A ausência de elevação de FAlc e γ-gt nos grupo controle positivo, assim como nos demais, está de acordo com os achados histológicos uma vez que não foram observadas alterações em ductos biliares na microscopia de luz, indicando assim que a hepatotoxicidade por Paracetamol seja citolítica e não colestática, conforme Matos e Martins (2005). [8] 6. CONCLUSÃO Com base nos resultados obtidos no presente estudo e de acordo com os objetivos propostos, pode-se concluir que o Resveratrol apresentou ação hepatoprotetora na intoxicação aguda por Paracetamol, evidenciada pela diminuição histológica de necrose e focos inflamatórios, preservação de glicogênio e outros 1,2-glicóis na zona 3 e redução dos níveis séricos de AST e ALT. REFERÊNCIAS [1] Acharya M., Lau-Cam C.A. (2010) Comparison of The Protective Actions Of N-Acetylcysteine, Hypotaurine And Taurine Against Acetaminophen- Induced Hepatotoxicity In The Rat. Journal of Biomedical Science, 17(1):S ,. [2] Gartner, L.P., Hiatt, J.L. (2007) Sistema Digestivo Glândulas Digestivas. In: Tratado De Histologia Em Cores.3ª Ed. Tradução: Thaís Porto Amadeu. Rio De Janeiro: Elsevier. P [3] Gedik, et al. (2008) Resveratrol attenuates oxidative stress and histological alterations induced by liver ischemia/reperfusion in rats. World J Gastroenterol.,14(46): [4] Gusman J, Malonne H, ATASSI G. (2001) A reappraisal of the potential chemopreventive and chemotherapeutic properties of resveratrol. Carcinogenesis, 22: [5] Heubi J, Barbacci M, Zimmerman H. (1998) Therapeutic Misadventures With Acetaminophen: Hepatotoxicity After Multiple Doses In Children. J Pediatr.; 132: [6] Itinose, A. M., Sakuno, M. L. D., Bracht, A. Metabolic effects of acetaminophen. Studies in the isolated perfused rat liver. Cell Biochem. Funct., 7: , [7] Litovitz Tl, et al. (2000) 1999 Annual Report Of The American Association Of Poison Control Centers Toxic Exposure Surveillance System. Am J Emerg Med, 18(5): [8] Matos L.C., Martins B. (2005) Hepatites Tóxicas: Revisão Da Literatura. Medicina Interna, 12(4): [9] Mukherjee S, Dudley JI, Das DK. (2010) Dosedependency of resveratrol in providing health benefits. Dose-Response, 8: [10] Neil K. (2002) Biochemical And Cellular Mechanisms Of Toxic Liver Injury. Sem Liver Dis, 22(2):
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