ANÁLISE DOS CONSTITUINTES DA PELE HUMANA SOB EFEITOS DE FORMULAÇÕES COSMÉTICAS POR ESPECTROSCOPIA RAMAN

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Terezinha Custódio Stachinski
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Universidade do Vale do Paraíba Laboratório de Espectroscopia Vibracional Biomédica ANÁLISE DOS CONSTITUINTES DA PELE HUMANA SOB EFEITOS DE FORMULAÇÕES COSMÉTICAS POR

1 Universidade do Vale do Paraíba Laboratório de Espectroscopia Vibracional Biomédica ANÁLISE DOS CONSTITUINTES DA PELE HUMANA SOB EFEITOS DE FORMULAÇÕES COSMÉTICAS POR ESPECTROSCOPIA RAMAN Maira Gaspar Tosato Rani de S. Alves, Leandro Raniero, Priscila F. C. Menezes*, Carlos Eduardo de O. Praes*, Odivania Kruger*, Airton Abrahão Martin.

2 Sumário 1. Introdução 2. Objetivos 3. Revisão Bibliográfica 4. Materiais e Métodos 5. Resultados e Discussões 6. Conclusões 7. Projetos Futuros

3 Introdução Pele: importante função de proteção, sensorial e estética De 1980 a 2000, o grupo de idosos aumentou 107% contra 14% de 0 a 14 anos. Envelhecimento cutâneo fatores extrínsecos e intrínsecos

4 Introdução Uso de cosméticos retardar envelhecimento extrínseco e prevenir intrínseco Crescimento setor mundial de cosméticos - 5,4% a.a entre 2004 e 2008 Indústria brasileira crescimento de 10,6% nos últimos 13 anos 3% PIB, 2,9% indústria geral - 2º mercado consumidor de cosméticos

5 Introdução Teorias do envelhecimento ROS, encurtamento de telômeros, envelhecimento mitocondrial e fotodanos. Métodos invasivos ex vivo biópsia- alterações do tecido Técnicas biofísicas in vivo escamometria- dificuldades de análises Métodos não invasivos - Corneometer, Tewameter, Phmeter perfil geral da pele ; OCT, fluorescência especificidade molecular limitada Espectroscopia Raman informações bioquímicas do tecido

6 Objetivos 1. Identificar os componentes bioquímicos da pele de mulheres entre 60 e 65 anos através da análise dos modos vibracionais dos espectros Raman adquiridos in vivo. 2. Identificar as regiões espectrais onde ocorreram as principais alterações comparando com os diferentes tratamentos dos grupos de voluntárias. 3. Analisar as alterações das estruturas protéicas, lipídicas e quantidade de água presentes na pele envelhecida na ausência e sob efeitos de formulações cosméticas utilizando dois tipos de técnicas de espectroscopia Raman in vivo sendo elas: dispersiva e com transformada de Fourier

7 Materiais e Métodos Comitê de ética nº H48/CEP/ voluntárias selecionadas (60 to 75 anos) 3 grupos: controle (CTR), placebo (RT2) e ativo (AF2) Estabilização 20ºC, 50% umidade durante 10 min. Região orbicular limpa com algodão embebido em 1,5 ml de álcool etílico 70% Classificação da pele por fototipo: Fitzpatrick Grupo Tipo I Tipo II Tipo III Tipo IV Tipo V Tipo VI CTR RT AF

8 Materiais e Métodos FT-Raman Espectrômetro RFS 100 (Bruker Optics, USA)- laser Nd:YAG com λ = 1064 nm Parâmetros: 2 pontos, 190 mw, 18 minutos, 4 cm -1

9 Materiais e Métodos Raman Dispersivo Espectrometro SpectraPro- 2500i (Pi-Acton) e detector CCD (Spec10, Princeton); laser λ = 785 nm, fibra óptica EMVISION LLC Parâmetros: 3 pontos, 78 mw, 70 segundos

Pré processamento Análise de Componentes Principais (PCA) Classificação de tecidos com distintas características bioquímicas Padrões nos dados semelhanças e diferenças Análise Discriminante

10 Pré processamento Análise de Componentes Principais (PCA) Classificação de tecidos com distintas características bioquímicas Padrões nos dados semelhanças e diferenças Análise Discriminante Linear Contribuição das variáveis na separação dos grupos Localização de indivíduos dentro dos grupos conhecidos Cálculo de 1º derivada Pequenas variações aumento da sensibilidade de análise

11 Resultados e Discussões 7 Intensidade (u.a.) Deslocamento Raman (cm -1 ) Impressão Digital Número da Posição do pico Estrutura Atribuição banda (cm -1 ) νc-c α hélicecolágeno (prolina e hidroxiprolina) νcc (Anel Fenilalanina aromático) s C-C=O trans(acyl) Lipídeos (ácidos graxos) νc-c Tirosina νc=o, νc-n α hélice-amida III νc=o, angular Amida III CNH δ(ch 3 ) a Lipídeos e proteínas / 1544 NH, νc-c Triptofano, DNA, melanina νc=o α hélice - Amida I νc=o Triglicérides/ sebo (éster)

12 FT-Raman 1080 cm -1 lipídeos (trans) e 1121 cm -1 lipídeos (gauche) AF2- Lipídeos gauche Lipídeos trans- Produto homeostase lipídica RT cm -1 lipídeos gauche CTR- Deslocamento para lipídeos gauche AF2_T0 AF2_T30 AF2_T60 RT2_ T0 RT2_ T30 RT2_ T cm -1 Intensity (a.u.) 0,00 Inte nsity (a.u.) 0.00 (a) (b) Raman shift (cm -1 ) Ram an S hif t (cm -1 ) 0.01 CTRT0 CTRT30 CTRT60 Intensity (a.u.) (c) Figura 1: Deslocamento espectral da derivada primeira de 1075 a 1155 cm -1 (1080 cm -1 conformação trans de lipídeos e 1121 cm -1 - conformação gauche de lipídeos). (a) grupo AF2, (b) grupo RT2 e (c) grupo CTR Ra man shift (cm -1 )

13 FT-Raman 1295 cm -1 a ácidos graxos (COOH) e 1303 cm -1 a amida III AF2- Desaparecimento de dublete em T60- RT2- Deslocamento de 1296 cm -1 (ácidos graxos). CTR- Deslocamento em 1295 cm -1, T30 e T60 Intensity (a.u.) 0,02 0,00-0, Raman Shift (cm -1 ) * AF2_T0 AF2_T30 AF2_T60 Intensity (u.a.) Raman Shift (cm -1 ) RT2_T0 RT2_T30 RT2_T60 o uso do produto desacelerou o processo de oxidação lipídica CT R_ T0 CT R_ T30 CT R_ T60 Intensity (a.u.) Figura 2: Deslocamento espectral da derivada primeira de 1280 a 1325 cm -1 (1295 cm -1 correspondem aos ácidos graxos δ (CH 2 ) e 1303 cm -1 a amida III). (a) grupo AF2, (b) grupo RT2 e (c) grupo CTR Ra man Sh ift (cm -1 )

14 FT-Raman Intensidade (u.a.) 1,0 0,8 0,6 0,4 AF260 CTR60 RT260 Radicais livres oxidação de DNA, lipídeos e proteínas. Peroxidação de ácidos graxos radical lipidico livre CTR e RT2 Ativos antivelhecimento- AF2 0,2 0, Melanina- fotoenvelhecimento Deslocamento Raman (cm -1 ) Grupos CTR e RT2- fragmentação e oxidação do DNA ombro GRUPO / T0 T30 T60 PERÍODO AF2 3,36 4,20 3,92 RT2 3,41 5,26 5,37 CTR 4,81 4,44 6,83

15 FT-Raman Resultados da Análise Discriminante Linear (%) Grupo T0 T30 T60 AF2 52,9 47,1 11,8 Grupos RT2 e AF2 sutis variações espectrais RT2 50,0 21,4 64,3 CTR 81,8 81,8 90,9 Área relativa entre os picos 1445 cm -1 (lipídeos) e 1654 cm -1 (amida I) Umidade relativa 24,3%

16 FT-Raman- alta frequência 2 Pele Água Intensidade (u.a.) Intensidade (u.a.) Raman Shift (cm -1 ) Deslocamento Raman (cm -1 )

17 FT-Raman- alta frequência AF2_0 AF2_30 AF2_60 AF2(60)-AF2(0) AF2(30)-AF2(0) Intensidade (u.a.) Intensidade (u.a.) AF2(0) AF2(30) - AF2(0) AF2(60) - AF2(0) Deslocamento Raman (cm -1 ) Deslocamento Raman (cm -1 ) Diferença entre T30 e T60- influência da umidade relativa do ar- perda de água Cálculo da área: 3100 a 3490 cm -1

18 FT-Raman RT2_0 RT2_30 RT2_60 RT2(60)-RT2(0) RT2(30)-RT2(0) Intensidade (u.a.) Intensidade (a.u.) RT2(0) RT2(30)-RT2(0) RT2(60)-RT2(0) Deslocamento Raman (cm -1 ) Deslocamento Raman (cm -1 )

19 FT-Raman CTR_0 CTR_30 CTR_60 CTR(60)-CTR(0) CTR(30)-CTR(0) Intensidade (u.a.) Intensidade (u.a.) CTR_0 CTR(30)-CTR(0) CTR(60)-CTR(0) Deslocamento Raman (cm -1 ) Deslocamento Raman (cm -1 )

20 FT-Raman Intensidade relativa 3220 cm -1 e 2936 cm -1 Hidratação (u.a.) 0,04 0,02 0,00 CTR AF2 RT Umidade relativa do ar** (%) Tempo (dias) **Estação meteorológica da UNIVAP (Urbanova)

21 Raman Dispersivo Intensidade (u.a.) 0,02 0,00 T0 T30 T60 Cálculo da 1º derivada Amida III de prolina na molécula de protocolágeno Alteração do colágeno- ação das MMP -0, Deslocamento Raman (cm -1 ) 1 T0 T30 T60 Amida I - cadeia de colágeno tripla hélice grande número de ligações de hidrogênio = alteração da geometria molecular e formação de ponte de hidrogênio. Intensidade (u.a.) 0,02 2 0,00-0, Deslocamento Raman (cm -1 )

22 Conclusões A espectroscopia Raman foi sensível para identificar as alterações bioquímicas ocorridas na pele com e sem o uso de cosméticos. As mudanças ocorridas na região de DNA e melanina mostraram a ação dos radicais livres e possíveis alterações no fotopigmentação da pele mostrando o benefício de produtos com ativos antienvelhecimento. Pode-se comprovar as influências climáticas sobre a barreira de proteção da pele gerando perda de água e possíveis alterações funcionais da pele.

23 Agradecimentos

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