Figura.21 - Pontos de Coleta das águas potáveis nas cidades do Rio de Janeiro e Niterói
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- João Guilherme Carrilho Viveiros
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1 7 Experimental Em decorrência da importância dos ftalatos como interferentes endócrinos foram analisadas águas potáveis coletadas domesticamente, de forma a avaliar a qualidade das águas, quanto ao teor de ftalatos, as quais são disponibilizadas para o consumo humano. Também foi estudada uma amostra de água mineral comercial industrializada e outra coletada na sua fonte, com finalidade comparativa. Para a amostragem das águas potáveis, escolheram-se as cidades do Rio de Janeiro e Niterói por, em conjunto, formarem o segundo centro industrial do país. Definiu-se como água potável aquela que chega à população através da rede de abastecimento da cidade, antes de passar por qualquer recurso de depuração (filtração, ozonização,etc...). Assim, a escolha das áreas para a coleta das amostras nos bairros do Rio de Janeiro e Niterói se deu em função da densidade demográfica, sendo escolhidos apenas bairros residenciais. Desta forma, tentou-se avaliar a exposição diária da população carioca e niteroiense. Os bairros cujas águas foram amostradas, encontram-se na figura 21.
2 7 - Experimental 78 Figura.21 - Pontos de Coleta das águas potáveis nas cidades do Rio de Janeiro e Niterói
3 7 - Experimental 79 A parte experimental referente ao ecossistema da Baía de Guanabara consistiu em coletar amostras de águas, sedimentos e mexilhões Perna perna, acondicioná-las apropriadamente segundo o tipo de amostra, para evitar perdas e/ou contaminações, concentrar os extratos e analisar os ftalatos qualitativa e quantitativamente por cromatografia em fase gasosa, utilizando detecção for captura de elétrons. No caso de identificações duvidosas ou problemáticas, utilizaram-se as técnicas de cromatografia gasosa e espectrometria de massas associadas. Para nenhuma das amostras do ecossistema da Baía (água, sedimento e mexilhões) existe material de referência para comparar os resultados, portanto utilizou-se os padrões auxiliares de extração ( surrogate ) DPIP (di fenil iso ftalato) e DPP (di fenil ftalato) para avaliar as extrações de cada amostra. Os ftalatos escolhidos para o estudo foram os 16 indicados como de interesse para avaliação de águas potáveis pela EPA: DMP, DEP, DIBP, DBP, DMPP, DMEP, DAP, DEEP, HEHP, DHP, BBP, DBEP, DEHP, DCHP, DNOP E DNP. Não se avaliaram os monoésteres, nem o anidrido ftálico (principais produtos formados pelas rotas de degradação), por terem outras fontes de emissão para o ecossistema da Baía, o que inviabilizaria a correlação direta com a degradação dos compostos em estudo. A escolha dos pontos de amostragem foi realizada com o objetivo de melhor representar as características das diferentes subáreas dentro da baía, proximidade das principais fontes de ftalatos para a Baía de Guanabara indústrias de plásticos, etc e dos recursos disponíveis para a realização do estudo. O posicionamento dos pontos foi feito por triangulação a partir das referências visíveis (para águas e mexilhões) e por localização com GPS (no caso dos sedimentos), e foram designados da seguinte forma: 6 (seis) pontos para coleta de águas superficiais (A1-A6), 4 (quatro) pontos para coleta de amostras de sedimentos (S1-S4) e 4 (quatro) pontos para coleta de amostras de mexilhões (M1-M4).
4 7 - Experimental 80 Tendo em vista estes condicionantes, as seguintes estações de coleta, são descritas a seguir e podem ser localizadas na figura 22: Santos Dumont (A1 e M1): na entrada do canal de acesso à Marina da Glória e o Aeroporto Santos Dumont. Baía de Botafogo (S1): na entrada da Baía de Botafogo, em frente ao monumento a Estácio de Sá Ponte Rio-Niterói, próximo ao Rio (A2 e M2): 2 maior pilar da Ponte Rio-Niterói no sentido Rio-Niterói (mais próximo ao Porto do Rio de Janeiro). Rio Meriti (A3 e S2): área navegável mais próxima ao ponto de deságue do Rio Meriti, por trás da Ilha do Governador. Fundo da Baía (A4 e S3): área de proteção ambiental, situada no fundo da baía. São Gonçalo (S4): área interna da baía, próxima ao município de São Gonçalo. Ponte Rio-Niterói, próximo a Niterói (A5 e M3): 2 maior pilar da Ponte Rio- Niterói no sentido Niterói-Rio (mais próximo ao canal central de circulação da baía e à base naval de Mocanguê). Praia de Boa Viagem (A6 e M4): Ilha de Boa Viagem, em Niterói, na face voltada para a entrada da baía. Como consequência dos resultados das análises de ftalatos encontrados para os mexilhões, realizou-se um estudo de biomonitoramento ativo destes espécimes, em dois pontos da Baía de Guanabara, descritos abaixo e localizados na figura 22: Ilha d Água (B1): ilha particular, pertencente a PETROBRÁS, situada na parte área interna da baía, próxima ao canal central da baía e de outros locais onde foram encontrados mexilhões, sujeita a constantes impactos ambientais. Itaipu (B2): área de controle, situada em uma região abrigada próxima à Fortaleza de Santa Cruz.
5 7 - Experimental 81 Figura.22 Localização das estações de amostragem na Baía de Guanabara
6 7 - Experimental Amostragem e Tratamento das Amostras Amostras de Águas A armazenagem é um ponto muito importante para se assegurar que os ftalatos não degradaram durante o processo de tratamento e extração das amostras. Segundo Jara (2000), BBP, DBP e DEHP prontamente extraídos de amostras de água são estáveis quando acondicionados por mais de 9 meses a 4 o C, porém em amostras de água armazenadas a 4 o C por mais de 30 dias antes da extração, para os mesmos compostos, obtêm-se baixa recuperação e com pequena degradação A) Águas potáveis A coleta das amostras de água potável para análise de ftalatos dissolvidos e dispersos foi realizada na primeira semana de janeiro/2001. Para a obtenção das amostras foi utilizada garrafa de vidro com capacidade de 1 L, previamente descontaminada, sendo recolhida a água da torneira após 1 min. de fluxo contínuo. As amostras foram armazenadas sob refrigeração por um período máximo de 12 hrs, sendo em seguida extraídas B) Águas superficiais da Baía de Guanabara A coleta de água para análise de ftalatos foi realizada nos dias 15/dezembro/2000 e 13/agosto/2001, durante as marés vazante, de forma a se verificar a maior influência dos poluentes do interior da baía. Para a obtenção das amostras foi utilizado um amostrador de teflon, com capacidade de 1L de água. A profundidade escolhida para a coleta foi de 1,0 m abaixo da superfície. O coletor era descido fechado e, por meio de um sistema de cordas, era aberto à profundidade escolhida, sendo içado ao barco novamente fechado. Foram obtidos mais 10 ml de água de cada estação para a análise do teor de material em suspensão, sendo este volume excedente acondicionado em garrafas de polietileno.
7 7 - Experimental Amostras de Sedimentos Para este tipo de amostra, como se desejava verificar a contaminação ao longo dos anos, foram coletados 4 testemunhos por ponto de coleta. Os testemunhos foram coletados, no dia 13 de agosto de 2001 utilizando um amostrador acionado por gravidade, onde são acoplados tubos de aço-inox de 100 cm de comprimento e 5 cm de diâmetro interno. O amostrador penetra no sedimento por gravidade, com o auxílio de um peso de 20 kg. Ao serem trazidos para o barco, os testemunhos são identificados e fechados em ambas as pontas com rolhas de borracha revestidas com papel alumínio, para evitar contaminação. Os testemunhos são transportados dentro destes tubos, sendo mantidos na posição vertical, para o laboratório, na posição vertical, de modo que não haja perturbação dos sedimentos e envoltos em papel alumínio de modo a limitar a atividade biológica e a fotoxidação. Tabela 16 Localização e Profundidade das Estações de Coleta de Sedimentos na Baía de Guanabara Ponto de Coleta Latitude Longitude Profundidade (m) Santos Dumont 22 o S 43 o W 5,0 Rio Meriti 22 o S 43 o W 5,0 Fundo da Baía 22 o S 43 o W 7,0 São Gonçalo 22 o S 43 o W 4,5 No laboratório, cada testemunho obtido, foi fatiado de 3 em 3 cm, procedimento padrão para posterior datação das amostras. Só a parte central de cada fatia (que não teve contato com o aço-inox) foi aproveitada para a análise dos ftalatos, de forma a certificarse que não havia contaminação da amostra pelo tubo. O restante da amostra foi destinado à datação dos sedimentos. O material assim obtido foi secado em liofilizador e armazenado em frascos de vidro previamente limpos, para análise posterior dos ftalatos.
8 7 - Experimental Amostras de Mexilhões Perna perna Para este tipo de amostra, utilizou-se a ajuda de pescadores da Colônia de Pescadores de Jurujuba, que, por conhecerem bem a região, sabem exatamente os locais onde há ocorrência de mexilhões nas especificações necessárias para este estudo. Os mexilhões foram coletados manualmente, sendo recolhidos apenas os indivíduos adultos (aproximadamente com 4 a 6 cm de comprimento). Em seguida, foi retirada toda a flora e fauna presente, com o auxílio de uma faca de aço inoxidável. Finalmente, foram acondicionados em embalagens de alumínio previamente descontaminadas e armazenados em recipientes térmicos contendo gelo, até a chegada ao laboratório, onde foram finalmente guardados no congelador a 0 C. Para cada estação, selecionaram-se dois grupos de 10 indivíduos, com tamanhos semelhantes, variando de 4 a 6 cm (figura 23). Cada um destes grupos compôs as subamostras das estações estudadas. As subamostras devem ser compostas de mexilhões com tamanhos de concha semelhantes para que o teor de tecido e, consequentemente, de lipídios, seja aproximadamente o mesmo. Figura.23 Medição dos Mexilhões triados para o estudo
9 7 - Experimental 85 O tecido dos mexilhões foi separado das valvas e o bisso retirado. Em seguida, as amostras de tecidos congelados foram conduzidas a um liofilizador, onde permaneceram por 24 horas. As amostras foram liofilizadas a frio por que esta técnica permite a drenagem completa da água sem perdas dos compostos mais voláteis. O material liofilizado foi então triturado e homogeneizado em gral de porcelana previamente descontaminado, acondicionado em pequenos frascos de vidro com tampa, e congelado a temperaturas inferiores a -10 C. Figura.24 Abertura dos Mexilhões triados para retirada dos tecidos A) Mexilhões coletados de 1997 a 2000 As amostras de mexilhões Perna perna, foram coletadas nos mesmos pontos, nas estações chuvosa e seca, por quatro anos consecutivos (97 a 00), de forma a obter-se um comportamento em relação ao tempo. As datas de coleta foram: 1997: 19/ago e 23/dez; 1998: 24/ago e 14/dez; 1999: 30/ago e 18/dez e 2000: 13/set e 15/dez.
10 7 - Experimental B) Mexilhões do Biomonitoramento O biomonitoramento ativo foi realizado com animais presos em gaiolas, em uma área contaminada cronicamente (Ilha d Água) e em uma área de controle (Itaipu), em colaboração com os experimentos da tese de doutorado de Lima (2001). O início do transplante ocorreu em 15/outubro/99 e durante os três meses subsequentes foram coletadas amostras mensais (15/outubro/99, 22/novembro/99 e 07/janeiro/00) de mexilhões nas redes para monitorar a bioacumulação de xenobióticos (hidrocarbonetos poliaromáticos no estudo de Lima, 2001 e ftalatos neste estudo). O fluxograma do biomonitoramento ativo é apresentado na figura 25. Figura.25 Fluxograma do Transplante (Lima, 2001) Os mexilhões transplantados foram fixados em 3 gaiolas de redes de nylon, presas por cordas a um cabo de madeira e suspensas por uma bóia. A estrutura foi fixada no fundo do mar por garatéias de ferro.
11 7 - Experimental 87 Figura.26 Foto das gaiolas utilizadas no monitoramento (Lima, 2001) Em Itaipu (área de controle) foram coletados 300 mexilhões dos costões, sendo 50 animais separados para os testes do tempo inicial e 250 transplantados para as gaiolas (cerca de 80 mexilhões por gaiola com comprimento de concha 4,5-6,0 cm) colocadas na Ilha d Agua. Figura.27 Foto da estrutura do transplante na Ilha d Água (Lima, 2001)
12 7 - Experimental 88 Do mesmo modo, foram transferidos animais provenientes da Ponte Rio-Niterói (área contaminada) para Itaipu (área de controle). As gaiolas eram periodicamente verificadas (a cada 15 dias), por 3 motivos: 1. fazer uma manutenção preventiva do sistema de fixação ao sedimento; 2. para retirada de vegetação acumulada nas redes das gaiolas. O excesso de vegetação poderia causar a morte dos organismos por asfixia. 3. verificar se nenhuma gaiola foi retirada por peixes de maior porte ou pelos catadores de mexilhão atuantes na região. Apesar de todo este cuidado, uma gaiola de cada estação foi perdida pelas grandes correntes em novembro nos locais escolhidos para o biomonitoramento. Como a literatura cita 3 meses como tempo ideal para este tipo de estudo (Lima, 2001), optou-se por não coletar em dezembro (2 meses) e encerrar o experimento em janeiro (3 meses). Em todas as coletas de amostras de organismos dos transplantes foram registrados ph, a salinidade e temperatura (in situ) e realizada a determinação de ftalatos, medidos no laboratório segundo método descrito para os mexilhões coletados de 1997 a 2000.
13 7 - Experimental Descontaminação do Material Utilizado Como os ftalatos encontram-se largamente disseminados no ambiente dos laboratórios, pois quase a totalidade dos plásticos os contém, a descontaminação das amostras durante os trabalhos e análises é de importância crucial. O procedimento de limpeza de todo o material em contato com as amostras foi sempre feito imediatamente antes do uso, de forma a evitar contaminação durante armazenamento, o que pode ocorrer mesmo quando o material é embalado em papel alumínio previamente descontaminado. Este procedimento, bem como os demais relacionados à metodologia de determinação de ftalatos, foi baseado em extensa literatura de referência (Giam, C.S. 1975; Ehrhardt, M. 1980; IOC, 1984; Sporstøel, S. 1985; OSHA 104, 1994; Furtmann, K. 1994; EPA 606, 1995). A descontaminação consistiu em sucessivas lavagens com detergente, água destilada livre de compostos orgânicos, acetona p.a., etanol p.a. e hexano normal grau cromatográfico, seguida por secagem em mufla a 450 C por 2-4 horas, e, finalmente, selagem e armazenamento em ambiente limpo, de forma a evitar contaminação por poeira e outras substâncias orgânicas. A água Milli-Q utilizada durante o procedimento analítico foi purificada em funil de separação com hexano normal de grau cromatográfico para a retirada de qualquer traço de compostos orgânicos presentes. Todos os solventes, adsorventes e outros compostos usados no procedimento analítico foram testados para valores de branco em ftalatos, sendo os resultados reportados no capítulo de resultados.
14 7 - Experimental Determinação dos Ftalatos Extracão das Amostras: As condições de extração utilizadas foram baseadas nas de trabalhos semelhantes. Como descrito por Giam (1975) e outros (Thurén, A. 1986; Zurmühl, T 1990; Chee, K.K. 1996a) a presença de hidrocarbonetos clorados e PCBs em amostras marinhas, interfere na análise cromatográfica dos ftalatos, portanto devem ser eliminados durante a extração (redução da contaminação de fundo). Tal dado foi observado nas amostras de sedimentos e mexilhões, onde os picos com identificação duvidosa, quando verificados via espectrometria de massas demonstraram ser parafinas ou organoclorados A) Amostras de Águas: A técnica tradicionalmente utilizada para a extração de ftalatos em amostras líquidas é a extração líquido-líquido. Esta técnica, além de consumir grandes quantidades de solventes orgânicos, requer procedimentos com muitas etapas de limpeza para remover os compostos co-extraídos antes da análise cromatográfica, o que poderia causar contaminação das amostras. Para evitar contaminação das amostras por ftalatos, a técnica de extração deve ter o menor número de etapas possível. Uma alternativa eficiente e rápida para estes problemas é a técnica de extração em fase sólida (EFS), empregando discos especificamente condicionados para reter os ftalatos (ALLTECH, 1997; EMPORE, 1992). Neste estudo, utilizou-se discos de C 18 (3M Empore High Performance Extraction Disks). O método de extração empregado foi o EPA 8061A para determinação de ftalatos em amostras ambientais, no qual o disco de C 18 é condicionado com 5 ml de metanol. Passa-se 1L de amostra pelo disco, a seguir 5 ml de acetonitrila usada para lavar o frasco e, finalmente, 2 porções sucessivas de 5 ml de diclorometano para extrair os ftalatos retidos no disco. Os extratos são combinados, evaporados à secura e rediluídos até 1,0 ml em acetona.
15 7 - Experimental 91 Com a finalidade de verificar a eficácia da extração e calcular as concentrações de ftalatos das análises foram empregados padrões puros recomendados pelo método. Para a eficiência da extração, utilizaram-se padrões internos do tipo 2: acrescentou-se à amostra antes da extração 0,5 ml da mistura dos padrões difenil ftalato (DPP, Accustandard, concentração=56 µg.ml -1 ) e difenil isoftalato (DPIP, Accustandard, concentração=69 µg.ml -1 ), respectivamente. Para avaliar os teores de ftalatos adicionaram-se 5 µl do padrão interno tipo 1 benzoato de benzila (Accustandard, concentração=5,0 mg.ml -1 ) ao extrato final em acetona B) Amostras de Sedimentos e de Mexilhões O método de extração empregado foi o de Giam para determinação de ftalatos em amostras de biota marinha. A amostra (0,5g) + 1µL de padrão auxiliar difenil ftalato (DPP, Accustandard, concentração=56µg.ml -1 ) foi extraída com 5mL de acetonitrila em homogenizador de alta velocidade (Ultra-Turrax T25 Basic, IKA Labortechnik, Wilmington, NC, USA), à velocidade 4 (19000 rpm) por 2 min. Repetiu-se este procedimento com duas novas porções de acetonitrila e os extratos combinados foram passados por discos de C 18 de forma a extrair os ftalatos e simultaneamente eliminar interferentes Análise por Cromatografia em Fase Gasosa Neste estudo utilizou-se o detector de captura de elétrons (ECD) devido aos baixíssimos níveis de detecção requeridos para as análises das águas potáveis (Giam, 1975). Este detector consiste em um eletrodo coletor em cujo centro se encontra uma fonte de 63 Ni. Esta produz constantemente elétrons que migram para o anodo, produzindo corrente. O efluente da coluna passa através do eletrodo e reduz a corrente de forma proporcional à quantidade das substâncias presentes que forem capazes de capturar elétrons. Este tipo de detector é extremamente sensível para tais compostos de grande afinidade eletrônica (sensibilidade reportada de até g.l -1 ). Sua grande desvantagem é
16 7 - Experimental 92 a resposta quantitativa diferente para cada componente de uma mesma função química, demandando curvas de calibração individuais nas faixas de trabalho. A identificação dos ftalatos foi realizada com base nos tempos de retenção dos picos dos componentes das amostras, comparando-os aos tempos de retenção dos padrões. Para confirmação e eliminação de dúvidas na identificação de picos desconhecidos, foi usada a técnica de cromatografia associada à espectrometria de massa (GC-MS) avaliando uma amostra de cada tipo (água potável, água superficial da baía, sedimento e mexilhão). Estas análises foram realizadas no laboratório ambiental da PUC, no equipamento CG/MS ThermoFinnigan modelo Polaris Q, com cromatógrafo Trace 2000, nas seguintes condições: m/z= 149 (característico de ftalatos) temperatura da fonte de íons e interface: 250 C e 300 C respectivamente corrente de emissão e energia do feixe de elétrons: 250V e 70eV aquisição: Full Scan 50 a 450 daltons, 0,45 segundos por scan coluna cromatográfica : J & W DB5-MS 30m x 0,25mm x 0,25µm gás de arraste: He em vazão de 1,2mL.min -1 temperatura de injeção: 265 C volume injetado: 1,6µL em sistema splitless (sem divisão de fluxo) programa de temperatura da coluna : 100 C isotérmica durante 0,6min, programada a 5 C.min -1 até 220 C, então programada a 3 C.min -1 até 275 C, permanecendo isotérmica durante 10min. A análise quantitativa foi realizada através de curvas de calibração das áreas dos padrões de ftalatos divididos pela área do padrão interno versus a concentração dos padrões de ftalatos divididos pela concentração do padrão interno. Variou-se a concentração do padrão de ftalatos em duas faixas (1, 10, 50, 100 ng.l -1 e 100, 500, 1000 ng.l -1 ), mantendo-se a concentração do padrão interno em 10 ng.l -1 ; assim, obteve-se para cada ftalato uma curva de área versus concentração, com as respectivas regressões. Cada ponto da curva é a média de cinco replicatas. As curvas de calibração quantitativas encontram-se no Apêndice I e II.
17 7 - Experimental 93 O cálculo das recuperações das extrações foram obtidos diretamente através das curvas de calibração dos padrões difenil ftalato (DPP) e difenil isoftalato (DPIP) versus o padrão interno tipo A) Aguas potáveis As análises foram realizadas no Laboratório da FEEMA, em cromatógrafo HP5890, equipado com detector de captura de elétrons com fonte de Ni 63, e uma coluna capilar de sílica fundida DB-5 (J&W) de 30 m x 0,25mm x 0,25µm. As condições de operação foram: temperaturas do injetor e do detector: 250 C e 300 C respectivamente programa de temperatura da coluna: 190 C isotérmica por 40 min., programada a 20 C.min -1 até 210 C, aí permanecendo por 12 min. volume de amostra injetado: 1 µl em sistema splitless (sem divisão de fluxo) gás carreador: N 2 à vazão de 4 ml.min -1. gás complementar: N 2 à vazão de 26 ml.min B) Amostras do ecossistema da Baía de Guanabara As análises foram realizadas no Laboratório do INT, em cromatógrafo Shimadzu GC 17A, equipado com detector de captura de elétrons com fonte de Ni 63, amostrador automático Autosampler AOC-17 e uma coluna capilar de sílica fundida DB-5 (HP) de 30 m x 0,25mm x 0,25µm. As condições de operação foram: temperaturas do injetor e detector: 250 C e 300 C respectivamente programa de temperatura da coluna: 100 C isotérmica por 0,5 min., programada a 5 C.min -1 até 220 C, então programada a 3 C.min -1 até 275 C aí permanecendo por 5min. volume de amostra injetado: 1 µl em sistema splitless (sem divisão de fluxo) gás carreador: N 2 à vazão de 2 ml.min -1. gás complementar: N 2 à vazão de 48 ml.min -1.
8 Resultados e Discussão
8 Resultados e Discussão O sistema de extração foi testado após sua descontaminação (branco) e nenhum pico foi detectado (seis replicatas). Logo, o limite detecção não pode ser determinado como sendo a
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