TÍTULO: EFEITO ANTIMICROBIANO DOS FLAVONÓIDES DO PÓLEN APÍCOLA

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1 16 TÍTULO: EFEITO ANTIMICROBIANO DOS FLAVONÓIDES DO PÓLEN APÍCOLA CATEGORIA: CONCLUÍDO ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE SUBÁREA: NUTRIÇÃO INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE CATÓLICA DE SANTOS AUTOR(ES): DAYANE DA SILVA TEIXEIRA ORIENTADOR(ES): ELIZABETE LOURENÇO DA COSTA

2 RESUMO Atualmente, o mercado está bastante favorável ao consumo de produtos naturais, complementares à dieta ou com efeitos terapêuticos, em virtude da preocupação da população com sua saúde, reflexo do aumento da expectativa de vida que, por outro lado, corrobora com o surgimento de doenças crônicas não transmissíveis. Dentro deste contexto, os produtos naturais como o pólen apícola ocupam um lugar de destaque. O pólen apícola consiste em um aglomerado de grãos microscópicos, é rico em proteínas e compostos fenólicos. Estes componentes normalmente apresentam ação antioxidante amplamente demonstrada em estudos in vitro. Deste modo, o objetivo deste trabalho é pesquisar o efeito funcional do extrato de flavonoides derivados do pólen apícola, visando demonstrar seu efeito antimicrobiano in vivo, por meio da curva de crescimento medida por densidade óptica, utilizando as cepas de Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Escherichia coli (ATCC 25922) e Salmonella sp. (ATCC 29890) cedidas pelo Instituto Adolfo Lutz (Unidade Santos). O meio de cultivo utilizado foi o caldo BHI, (Infusão de Cérebro e Coração), previamente esterilizados em autoclave, depois foi adicionado o extrato do pólen, sendo que a leitura deste caldo em espectrofotômetro foi realizada de 1 em 1 hora, até 6 horas e após 24 horas do início do teste. O S. aureus começou a mostrar crescimento apenas após 6 horas, indicando um efeito inibitório do pólen sobre esta bactéria, um efeito similar foi observado para a bactéria P. aeruginosa. Já nas entrobactérias: E. coli e Salmonella sp. não foi observado resultados positivos quanto ao efeito antimicrobiano do pólen apícola. INTRODUÇÃO O Pólen é um aglomerado de grãos microscópicos que consistem nas células reprodutivas masculinas das plantas. É coletado pelas abelhas melíferas e misturado a secreções salivares. A partir daí ele passa a ser denominado de pólen apícola, sendo em seguida transportado para a colmeia, onde servirá de fonte proteica para alimentação das larvas até o terceiro dia de vida e faz parte da composição da geleia real (BARRETO et al., 2005). De acordo com a Instrução Normativa n. 3 de 19 de Janeiro de 2001, do Ministério da Agricultura e do Abastecimento (BRASIL, 2001), que estabelece o Regulamento Técnico para Fixação de Identidade e Qualidade dos produtos

3 apícolas, o pólen apícola é definido como um produto resultante da aglutinação do pólen das flores, efetuada pelas abelhas operárias, mediante néctar e suas substâncias salivares. Este é recolhido no ingresso da colmeia e submetido ao processo de desidratação, seguindo os procedimentos adequados de tratamento, com temperatura inferior a 45 C e teor de umidade final inferior a 4%, para o pólen desidratado. Um aspecto que chama atenção para este produto é que apenas a abelha rainha se alimenta dele, podendo atingir até seis anos de vida, enquanto as operárias vivem apenas por algumas semanas (CAMPOS; CUNHA; MARKHAM, 1997). Por ser um produto rico em nutrientes essenciais, tais como aminoácidos, vitaminas e minerais é empregado na alimentação humana para suplementação dietética há muitos anos. O pólen apícola apresenta sua composição química bastante variável, sendo que o principal fator consiste na espécie botânica. No entanto, outros condicionantes podem ser a idade e a condição nutricional da planta, além das condições ambientais durante seu desenvolvimento. Em uma revisão, Arruda (2009) mostra que em sete trabalhos que estudaram a composição do pólen brasileiro, apenas o teor de cinzas mostrou homogeneidade entre os dados. Além de seu valor nutricional, há indícios de ação terapêutica para a saúde. Algumas de suas indicações compreendem a atividade anticarcinogênica (WU; LOU, 2007), atividade antioxidante, antibacteriana (CARPES et al., 2007) e estimulante para o metabolismo ósseo (YAMAGUCHI et al., 2006). Esses efeitos podem ser atribuídos aos compostos fenólicos presentes no pólen apícola, como demonstrado por Leja et al. (2007), que verificaram que elevados níveis de fenólicos são frequentemente correlacionados com uma elevada atividade antioxidante em pólen. O efeito funcional do pólen apícola tende a variar dependendo de condições climáticas ou da espécie visitada pela abelha, com o objetivo de investigar a atividade funcional deste produto este estudo propõe a avaliação de seu efeito antimicrobiano utilizando microrganismos da microbiota entérica e da pele.

4 OBJETIVOS Pesquisar o efeito antimicrobiano dos flavonóides derivados do pólen apícola por meio da curva de crescimento microbiano e fazer a caracterização da composição centesimal do pólen apícola. METODOLOGIA E DESENVOLVIMENTO Extração e caracterização dos flavonóides O pólen apícola obtido de apicultores do Vale do Ribeira foi submetido a caracterização da composição centesimal, sendo o teor de umidade, cinzas e proteínas determinado de acordo com os procedimentos descritos pela AOAC (1997). O teor de lipídeos foi determinado pelo método de Bligh e Dyer (1959), e os carboidratos por diferença. Para realizar a extração dos extratos hidrossolúveis, uma porção de 50g foi triturada em solução de metanol: água (80:20; v/v) e mantida em maceração por 24 horas em refrigerador. O metanol foi removido em evaporador rotatório. Após vários procedimentos para obtenção de volume adequado o extrato concentrado foi congelado até o momento das análises. Os flavonóides dos extratos foram quantificados como equivalente de ácido gálico utilizando o reativo de Folin, por leitura espectrofotométrica a 760nm (VERZA et al., 2007). Ensaio de atividade antimicrobiana Para a avaliação antimicrobiana foram utilizadas quatro cepas de bactérias, Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Escherichia coli (ATCC 25922) e Salmonella sp. (ATCC 29890) cedidas pelo Instituto Adolfo Lutz (Unidade Santos). O meio de cultivo utilizado foi o caldo BHI, (Infusão de Cérebro e Coração), previamente esterilizados em autoclave a 121ºC por 15 minutos, em um volume de 4 ml por tubo. Após a autoclavagem foi adicionado 50 µl do extrato de pólen. Para o início do ensaio um volume de 10 µl da cultura de 24 horas da bactéria foi utilizado, sendo que a leitura deste caldo em espectrofotômetro ( = 600nm) foi realizada de 1 em 1 hora, até 6 horas e após 24 horas do início do teste.

5 O procedimento descrito acima foi realizado para cada microrganismo separadamente e a incubação foi feita em estufa com agitação a 37ºC (PACKER; LUZ, 2007). RESULTADOS O extrato obtido foi armazenado em freezer até o momento das análises, apresentando um aspecto amarelo, com aroma intenso de mel de abelhas. O grão de pólen após determinações químicas demonstrou a composição apresentada na tabela abaixo, com um significativo teor de proteína, o que o torna desejável como fonte deste nutriente. Quanto à umidade faz-se necessário um cuidado mais intensificado com o armazenamento para evitar a proliferação de bolores e leveduras, já que não se encontra na categoria de pólen desidratado. Tabela 1 - Composição Centesimal do pólen apícola e teor de compostos fenólicos Umidade (%) 17,47±0,48 Cinzas (%) 2,34±0,33 Proteína (%) 19,23±0,12 Lipídeo (%) 6,28±0,24 Carboidratos totais (%) 54,68 Fenólicos totais (mg/100g) 843,01 A Figura 1 apresenta o perfil de sensibilidade ao extrato do pólen pelas bactérias estudadas:

6 ABS (600nm) Figura 1 Curva de crescimento microbiano após adição do extrato de pólen apícola 2,5 2 1,5 1 0, Tempo (h) S. aureus Salmonella Pseudomonas E. coli A Figura 1 mostra que a bactéria S. aureus apresentou uma longa fase de adaptação, correspondendo à fase da curva de crescimento microbiano onde há pouca divisão celular, pelo fato dos microrganismos estarem se adaptando ao meio. Só após 6 horas de incubação em meio líquido que este microrganismo começou a mostrar crescimento, indicando um efeito inibitório do pólen sobre esta bactéria, em comparação com as demais. Um efeito similar foi observado para a bactéria P. aeruginosa. Já nas entrobactérias: E. coli e Salmonella sp. não foi observado resultados positivos quanto ao efeito antimicrobiano do pólen apícola. Foi observado que as bactérias saíram mais rápido da fase lag (fase de latência), ou seja, se adaptaram rapidamente ao meio, atingindo a fase de crescimento exponencial, fase em que o microrganismo entra em divisão celular acelerada, ao atingir o limiar de consumo de nutrientes do meio para essas duas bactérias foi possível observar mais uma vez a mudança de fase, a fase estacionária, em que a velocidade de crescimento diminui, com a apresentação de uma reta paralela ao eixo "X". Nas condições estudas a E. coli entrou na fase exponencial 2 horas após a incubação, e após 4 horas entrou na fase estacionária. A Salmonella sp. entrou na fase exponencial em 3 horas após a incubação e diminui seu crescimento após 5 horas de incubação. As duas bactérias apresentam um perfil típico de uma curva de crescimento microbiano, com multiplicação acelerada (TRABULSI, 2008).

7 O S. aureus é um microrganismo que produz enterotoxinas, podendo causar intoxicação alimentar quando consumimos alimentos contaminados por esta bactéria e pode ser encontrada na pele (microbiota das mãos) e nas vias aéreas superiores. A bactéria Pseudomonas também pode ser encontrada na pele, algumas são patógenas oportunistas do ser humano, pois produzem substâncias tóxicas. Foi de extrema importância observar o efeito antimicrobiano positivo às cepas de S. aureus e P. aeruginosa, já que são bactérias veiculadas pelo manipulador dos alimentos, dessa forma utilizando o extrato do pólen apícola nos alimentos poderia evitar a contaminação por esses microrganismos, já que apenas após algumas horas é possível observar o crescimento das mesmas. Não foi observado um efeito positivo do pólen apícola nas cepas de E. coli e Salmonella, outros estudos são necessário com a utilização de uma concentração mais elevada do extrato do pólen. O risco da presença desses microrganismos, integrantes da família Enterobacteriaea, consiste no significado da presença da E. coli que pertencente ao grupo dos coliformes fecais, além da possibilidade da presença de cepas toxigênicas. Quanto ao gênero Salmonella, este abriga espécies que causam a febre tifóide, febres entéricas ou enterocolites em homens e animais (FRANCO; LANDGRAF, 2002). CONSIDERAÇÕES FINAIS O extrato do pólen apícola apresentou efeito antimicrobiano, mas não se mostrou eficiente para todas as bactérias estudadas, podendo ser uma alternativa para evitar a proliferação dos microrganismos S. aureus e P. aeruginosa, que contaminam frequentemente os alimentos, veiculados por manipuladores, visto que fazem parte da microbiota da pele, e vias aéreas superiores no caso do S. aureus. Portanto, o grão de pólen pode também ser utilizado como alimento e consistir em uma forma de proteção ao organismo. FONTES CONSULTADAS AOAC. Official methods of analysis. In 14th Associations of Analytical Chemists, Washington, D.C, USA, ARRUDA, Vanilda Aparecida Soares de. Estabilidade de Vitaminas do Complexo B em Pólen Apícola f. Dissertação (Ciência dos Alimentos) Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2009.

8 BARRETO, L.M.R.C.; FUNARI, S.R.C.; ORSI, R.O. Composição e qualidade do pólen apícola proveniente de sete estados brasileiros e do Distrito Federal. Boletim da Indústria Animal, v.62, p , BLIGH, E.G.; DYER, W.J. A rapid method of total lipid extration and purification. Canadian Journal of Biochemistry Physiology, 37: , BRASIL. Ministério da Agricultura. Instrução Normativa N 3, de 19 de janeiro de 2001, Aprova os Regulamentos Técnicos de Identidade e Qualidade de Apitoxina, Cera de Abelha, Geléia Real Liofilizada, Pólen Apícola, Própolis e Extrato de Própolis. CAMPOS, M. G.; CUNHA, A.; MARKHAN, K. R. Bee-Pollen: Composition, properties and applications. In: Bee Products. Springer Science Business Media: New York, CARPES, S. T., BEGNINI, R.; ALENCAR, S. M.; MASSON, M. L. Study of preparations of bee pollen extracts, antioxidant and antibacterial activity. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 31, n. 6, p , FRANCO, B. D. G. M.; LANDGRAF, M. Microbiologia dos Alimentos. Editora Atheneu. São Paulo, LEJA, M.; MARECZEK, A.; WYZGOLIK, G.; KLEPACZ-BANIAK, J.; CZEKONSKA, K. Antioxidative properties of bee pollen in selected plant species. Food Chemistry, v. 100, p , PACKER, J. F.; LUZ, M. M. S. Método para avaliação e pesquisa da atividade antimicrobiana de produtos de origem natural. Brazilian Journal of Pharmacognosy, v. 17, n. 1, p , TRABULSI, L.R. et al. Microbiologia. 8ª ed. Rio de Janeiro: Atheneu, VERZA, S.G.; KREINECKER, M. T.; REIS, V; HENRIQUES, A.T; ORTEGA, G.G. Avaliação das variáveis analíticas do método de Folin-Ciocalteu para determinação do teor de taninos totais utilizando como modelo o extrato aquoso de folhas de Psidium guajava L. Química Nova, v. 30, n.4, p , WU, Y. D.; LOU, Y. J. Brassinolide, a plant sterol from pollen of Brassica napus L. induces apoptosis in human prostate cancer PC-3 cells. Pharmazie v. 62, n. 5, p , 2007.

9 YAMAGUCHI, M.; HAMAMOTO, R.; UCHIYAMA, S.;, ISHIYAMA, K.; HASHIMOTO, K. Anabolic Effects of bee pollen Cistus ladaniferus extract on bone components in the femoral-diaphyseal and -metaphyseal tissues of rats in vitro and in vivo. Journal of Health Science, v.52, n.1, p , 2006.