O grupo ABO só pode ser definido se existir concordância entre os resultados destas duas provas, que devem ser interpretados da seguinte forma:

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1 Sistema ABO A classificação do sistema ABO tem como princípio a pesquisa dos antígenos ABO fixados na membrana da hemácia e anticorpos Anti-ABO presentes no soro do paciente. Esta classificação define o grupo sanguíneo de um indivíduo, e se dá por 2 provas: Prova Direta (ou Beth-Vincent): pesquisa dos antígenos fixados nas hemácias do paciente. Deve ser feita com soros Anti-A, Anti-B e Anti-A,B. Prova Reversa (ou prova de Simonin): pesquisa do anticorpo no soro do paciente. Deve ser feita com hemácias tipadas A e B, com atenção para o fato de que o anticorpo B costuma ser mais fraco (título fraco) que os demais anticorpos. A prova reversa é uma contra-prova fundamental para a conclusão do exame. O grupo ABO só pode ser definido se existir concordância entre os resultados destas duas provas, que devem ser interpretados da seguinte forma: Prova Direta (Antígeno) Prova Reversa (Anticorpo) Sistema ABO Antígeno A Anticorpo b Grupo Sanguíneo A Antígeno B Anticorpo a Grupo Sanguíneo B Antígeno A e B Ausência de Anticorpos a e b Grupo Sanguíneo AB Ausência de Antígenos A e B Anticorpo a e b Grupo Sanguíneo O Os anticorpos do Sistema ABO aparecem espontaneamente após 3-6 meses de idade, com pico de produção no período entre 5-10 anos e diminuição progressiva na velhice. Uma das prováveis explicações para esse aparecimento é a ampla distribuição de estruturas semelhantes a esses antígenos na natureza, principalmente nas bactérias, e por isso esses anticorpos são chamados de ocorrência natural. As bactérias presentes no trato intestinal, na poeira e em alimentos promoveriam uma exposição constante de todos os indivíduos à estas estruturas (semelhantes aos açúcares A e B presentes nas hemácias). Assim, a presença ou ausência dos antígenos A e/ou B na membrana das hemácias (prova direta) e a detecção ou ausência dos anticorpos contra os antígenos que não possuem (prova reversa) está no início e no final da vida do indivíduo. Sua ausência poderá estar relacionada com a patologia apresentada. Os subgrupos do Grupo A apresentam diferenças antigênicas quantitativas e qualitativas, embora sejam formados pelo mesmo açúcar do componente antigênico. Sabe-se que o gene A1 difere do gene A2 por uma deleção de base na região C-terminal, além de uma mutação que determinará uma substituição de aminoácidos (prolina para leucina) na glicosiltransferase resultante. Quando um anticorpo presente não é identificado, deve-se verificar a funcionalidade das hemácias usadas na realização das provas. Lembrando que as hemácias, comerciais ou preparadas pelo laboratório, devem ser fenotipadas para os principais sistemas sangüíneos (ABO, Rh, Kell, Duffy, Kidd, Lewis, P, MNS, Luth e Xg). Quando um anticorpo ausente é identificado, deve-se verificar a lavagem dos tubos e se as hemácias são específicas para o tipo de grupo sanguíneo. Fenotipagem de A: realizada para a determinação dos subgrupos de A. Tem como princípio a interação antígenoanticorpo visualizada pela reação de aglutinação das hemácias em presença de lecitinas ou anti-soros monoclonais com especificidades anti-a1 e anti-h. A reação indicará presença ou ausência de algutinação entre esses anticorpos e os antígenos presentes na membrana da hemácia do paciente. Os resultados esperados para esta prova devem ser interpretados da seguinte forma: Lecitina A1 Lecitina H Resultado Fenotipagem de A Presença de Aglutinação Ausência ou presença de Presença de Anticorpos Anti-A1: Aglutinação (1+ ou 2+) Grupo A1 ou A1B Ausência de Aglutinação Presença de Aglutinação Presença de Anticorpos Anti-A2: Grupo A2 ou A2B Como existem vários subgrupos de A, a ausência de aglutinação no tubo A1 poderá ser interpretada como subgrupo A2 ou outro subgrupo (A3, A4, etc.); Para estes outros subgrupos devem ser utilizadas técnicas mais sofisticadas para a Página 1/6

2 sua caracterização. Para melhor compreensão do resultado desta prova, é recomendada uma literatura mais específica sobre este assunto. Sistema Rhesus Rh (D) A classificação do sistema Rh tem como princípio a pesquisa do antígeno D fixado na membrana da hemácia do paciente. Esta classificação define o fator Rh de um indivíduo, e se dá por: Determinação Rh: determinação do antígeno D do Sistema Rhesus nas hemácias do paciente. Controle Rh: é um reativo controle com ausência de anticorpo Anti-D e de qualquer outro tipo de anticorpo para todos os sistemas eritrocitários. Este reativo controle tem por finalidade detectar erros ou patogenias existentes no paciente que resulte numa reação positiva do controle. (Exemplo: casos de hiperproteinemia). Contudo, diversos laboratórios não fazem uso deste controle em sua rotina ou não valorizam resultados positivos obtidos com o mesmo, arriscando assim a confiabilidade dos seus resultados finais. Para liberar um resultado com o Controle de Rh positivo deve-se fazer um estudo mais aprofundado da imunohematologia do paciente, o que inclui a observação de autoanticorpo frio ou quente (principalmente se a autoprova for positiva), hiperproteinemia, etc. Em caso de dúvidas, deve-se encaminhar a amostra ou o próprio paciente para um serviço especializado. É bom lembrar que não se deve usar albumina bovina à 22% ou à 30%, em substituição à esse reativo controle. O correto é usar o Reativo Controle Rh comercial, não importando se ele é produzido com plasma ou albumina, desde que tenha os mesmos conservantes e estabilizadores do reativo do soro Rh (D) e seja do mesmo fabricante. Pesquisa D fraco e Controle: devem ser feitas quando na classificação do Rh (D) existir ausência de aglutinação (negativa). Sua finalidade é detectar o anticorpo fracamente formado contra o antígeno D fraco, devido a sua transmissão genética. Nesta prova é necessário usar técnicas mais sensíveis (Técnica do Coombs Indireto - TCI) para confirmar sua positividade ou negatividade. A metodologia em Gel não dispensa a realização desta prova. Os fabricantes têm adotado a inclusão desta prova no cartão. Neste caso, o laboratório está realizando a prova no cartão automaticamente. Os resultados destas determinações devem ser interpretados da seguinte forma: Determinação Rh Controle Rh Pesquisa D fraco Controle D fraco Sistema Rhesus Rh(D) Positiva Negativo Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo Positivo Positivo ou Negativo Positivo Positivo ou Negativo Negativo Indeterminado O principal antígeno do Sistema Rh é o D, que pode se manifestar de diversas formas: D positivo: possui o antígeno D completo na sua estrutura, tanto quantitativo como qualitativo; D fraco: é uma variante de D que apresenta reação mais fraca, possuindo alteração no ponto de vista quantitativo; D mosaico: falta um ou mais determinantes do mosaico que constitui o antígeno D. Possui alteração qualitativa; D categoria: falta um ou alguns dos aminoácidos que formam a molécula do antígeno D e poderá ser também imunogênico e se apresentar como D positivo. Possui alterações qualitativas. Atualmente existem kits para caracterizar as categorias de D. Cuidados Adicionais: Se para um D fraco positivo o laboratório encontrar negativo, deve-se: (1) verificar se a potência (título) do Reativo Rh(D) está de acordo; (2) observar se a temperatura do banho-maria está calibrada e constante; (3) fazer a lavagem das hemácias corretamente e dentro da técnica exigida, tendo o cuidado de não perder material durante o procedimento, pois perda de hemácias significa perda de antígeno; (4) verificar se a Antiglobulina Humana (AGH) está dentro das conformidades do seu controle de qualidade; (5) verificar a limpeza da vidraria (existência de resíduos químicos e biológicos); (6) observar presença de umidade na vidraria. Se o resultado permanecer negativo, Página 2/6

3 deve-se usar Hemácias Controle de Coombs, a fim de se detectar prováveis erros técnicos ou do reativo usado, pois com a adição do Controle a reação deverá ser sempre positiva. Pesquisa de Anticorpo Intravascular - AIV (Teste de Antiglobulina Direta [TAD] pela Técnica do Coombs Direto) O Teste de Antiglobulina Humana Direta também conhecida como Teste ou Técnica de Coombs Direto tem como princípio a pesquisa do anticorpo intravascular fixado na membrana da hemácia do paciente com a utilização da Anti- Globulina Humana, conhecida como Soro de Coombs. Este teste se dá por: Determinação da Amostra: Nesta determinação é usada a suspensão de hemácias do paciente a 5% com o soro de Coombs ou o soro da Anti-Globulina Humana (AGH). Determinação do Controle: O controle é feito com o soro de Coombs (AGH) e o reativo de Hemácias Controle de Coombs. Este reativo é composto por hemácias sensibilizadas com anticorpo IgG, devendo dar sempre positivo. Em caso negativo deve-se verificar se o soro de Coombs está funcionando ou se há alguma impureza (sujeira) no tubo do teste. Cuidados: Em caso de dúvida, deve-se levar o tubo à visão microscópica para se certificar de positividade. Os resultados destas determinações devem ser interpretados da seguinte forma: Determinação Amostra Determinação Controle AIV (Coombs Direto) Positivo Positivo Positivo Negativo Positivo Negativo Positivo ou Negativo Negativo Indeterminado (verificar rotina) Pesquisa de Anticorpo Extravascular - AEV (Pesquisa de Anticorpos Irregulares [PAI] pela Técnica do Coombs Indireto) A pesquisa de anticorpos irregulares tem como princípio a triagem de anticorpos eritrocitários desenvolvidos no soro do paciente pela ausência dos respectivos antígenos correlatos do sistema sanguíneo com a utilização da Anti-Globulina Humana ou Soro de Coombs, usando a Técnica de Coombs Indireto, também conhecida como Teste da Anti-Globulina Indireta. Hemácias: O soro do paciente deve ser pesquisado com hemácias de fenótipos conhecidos para os principais sistemas eritrocitários (tipadas ou fenotipadas), formando assim um painel de seleção ou triagem. Normalmente são adotadas duas hemácias, mas o uso de uma terceira pode ocorrer para complementar as duas hemácias normalmente usadas. O importante é que as hemácias usadas contenham os principais antígenos que caracterizam os anticorpos dos principais sistemas eritrocitários (Rh, Kell, Duffy, Kidd, Lewis, P, MNS, Luth e Xg). Com isto, já se obtém um resultado satisfatório. Junto ao Painel de Seleção há um diagrama que deve ser avaliado em cada lote recebido e onde se deve colocar os resultados da Pesquisa. O profissional que vai fazer uso deste diagrama deve ser treinado e receber informações técnicas que possam facilitar o seu manuseio e sua interpretação. Auto-prova: A auto-prova visa avaliar a formação de auto-anticorpos produzidos, sejam eles frio ou quente, pelo próprio paciente (sistema imunológico) ou por um medicamento que está sendo ministrado, funcionando como um complemento e auxiliando no diagnóstico e possível tratamento. Este teste é realizado também pela Técnica do Coombs Indireto, usando o soro e a suspensão de hemácias a 5% do próprio paciente. Cuidados: Deve-se usar nestes testes, ao final da técnica, o Controle de Hemácias de Coombs para prevenir possíveis erros técnicos ou humanos. Em caso de possíveis dúvidas na interpretação fazer visualização microscópica. Página 3/6

4 Exemplo: Um indivíduo em tratamento com L-Dopa (dopamina) reproduz nas hemácias uma simulação de um autoanticorpo, pois a substância medicamentosa envolve as hemácias reproduzindo uma reação similar a de um anticorpo, através de uma auto-aglutinação. A simples retirada do medicamento é suficiente para que não haja mais esta reação. Os resultados destas determinações devem ser interpretados da seguinte forma: Hemácias Negativo para todas as Hemácias testadas. Positivo para alguma das hemácias testadas. AEV (Coombs Indireto) Negativo Positivo Algumas dicas para garantir os resultados de Coombs Indireto e Direto: Hemácia: verificar se as hemácias usadas são tipadas, pois tanto as comerciais quanto as feitas pelo laboratório, podem não estar contemplando todos os antígenos dos principais sistemas sanguíneos; sendo preciso analisar bem a hemácia no momento da compra ou na fenotipagem; este último, no caso de ser preparada pelo laboratório; Caso as hemácias sejam tipadas corretamente, verificar se estão dentro do prazo de validade, pois com o tempo os antígenos ficam fracos; Soro de Coombs: verificar a sua potência, pois pode estar diminuída para a captação do anticorpo. Além disso, poderá estar inespecífico, contendo uma contaminação para outro anticorpo. Isto acarreta um falso positivo, dependendo do anticorpo contaminante. Tubo: Após a lavagem pode ficar com resíduo de detergente ou com água destilada residual, o que interfere na realização da prova. É aconselhável rinsar com salina fisiológica caso permaneça umidade no tubo; Soro fisiológico (Tubo): observar se o soro fisiológico usado na lavagem das hemácias não apresenta contaminação fúngica pois sua presença interfere no teste, acarretando em resultados falso negativos; Gel: Para a metodologia em Gel, fazer o controle dos cartões usando o Controle de Coombs. Este controle, como já foi mencionado, tem um anticorpo irregular fixado em sua hemácia, devendo dar positivo também no cartão; É preciso ter cuidado com as hemácias lavadas em tubo, não somente na boa lavagem das mesmas como na sua secagem, não interferindo no momento da adição do soro de Coombs. Lavagem sem técnica adequada ou resquícios de resíduos de salina podem comprometer a reação final. Identificação de Anticorpos Irregulares (IAI) O IAI tem como princípio a identificação de anticorpos eritrocitários irregulares desenvolvidos pela ausência dos respectivos antígenos correlatos dos sistemas sanguíneos pela utilização de um Painel de Identificação, constituído de várias hemácias fenotipadas e caracterizadas por diagrama com as características de cada anticorpo de importância clínica. Atualmente os kits disponíveis no mercado podem variar a quantidade de hemácias que caracterizam este painel (de 10 a 15 hemácias). Os resultados do IAI devem ser interpretados pela análise do diagrama de antígenos específicos do Painel. A caracterização do anticorpo deverá estar de acordo com a coluna vertical do diagrama referente a cada antígeno dos Sistemas Eritrocitários (coluna horizontal). Os resultados do soro pesquisado deverão ser similares à coluna referente ao anticorpo identificado. Esta igualdade dará o resultado do anticorpo presente no respectivo soro. Não esquecer de considerar as informações físico-químicas específicas do anticorpo a ser identificado, quando levar para a identificação no diagrama. É possível que um mesmo material contenha mais um de anticorpo, como por exemplo, C,D,E. Para estas identificações é importante o treinamento do profissional envolvido para a correta correlação dos antígenos presentes e os anticorpos identificados. Nota 1: É importante que seja verificado o prazo de validade dos painéis de hemácias antes de utilizá-los. Painéis fora do prazo de validade possibilitam a ocorrência de resultados falso-positivos ou falso-negativos. Página 4/6

5 Nota 2: É recomendado que seja feita a inspeção visual das suspensões de hemácias para se observar a presença de hemólise, grumos ou alteração de cor. Qualquer alteração observada torna o painel impróprio para uso. Nota 3: Deve ser feita a verificação do número do lote registrado no rótulo das suspensões de hemácias para se certificar de que corresponde ao mesmo número do lote que está no diagrama do painel. Nota 4: O resultado do Controle de Coombs deverá ser sempre positivo, demonstrando que o Soro de Coombs está eficaz e que a técnica foi realizada corretamente. Nota 5: É importante que o Serviço de Imunohematologia mantenha o Controle de Qualidade destes painéis utilizando soros com anticorpos conhecidos de cada sistema eritrocitário existente no painel, avaliando a sua especificidade, avidez e potência. Fenotipagem dos Sistemas Rh e Kell A fenotipagem dos Sistemas Rh e Kell tem como principio a interação antígeno-anticorpo visualizada pela reação de aglutinação das hemácias estudadas em presença dos Anti-soros específicos. Tem como objetivo a pesquisa de antígenos do sistema Rh e Kell fixados na hemácia pesquisada. O uso da fenotipagem na Hemoterapia é muito importante para a escolha do concentrado de hemácia mais compatível para o paciente quando este apresenta anticorpos de significado clínico importante. A fenotipagem também caracteriza o genótipo Rh mais provável dos concentrados usados na clínica hemoterápica. Abaixo a tabela dos principais fenótipos que caracterizam os genótipos do sistema Rh. Reação com os antígenos das hemácias estudadas Genótipo Determinado D C E c e Wiener Fisher e Race R1R1 CDe/CDe R2R2 cde/cde R0r cde/cde Rz Rz CDE/CDE R1r CDe/cde R2r cde/cde R1 Rz ou R1ry CDe/CDE R2 Rz ou RzrY cde/cde R1 R2 ou Rzr CDe/cDE rr cde/cde r r Cde/cde r r cde/cde r r Cde/Cde r r cde/cde r r Cde/cdE Eluato A técnica do Eluato tem como princípio a liberação do anticorpo por ruptura da membrana da hemácia. A técnica do Eluato é utilizada para a identificação de anticorpos quando o TAD está positivo e não foi possível a sua identificação no espaço extravascular. Também é uma forma mais fácil de conservar anticorpos intravasculares encontrados para possíveis identificações futuras e armazenados em sorotecas. A partir do Eluato é possível fazer a identificação do anticorpo irregular (IAI) usando a técnica de Coombs Indireto, conforme descrito acima. É muito importante na preparação do eluato o controle da solução da última lavagem das hemácias, pois o anticorpo Página 5/6

6 existente pode estar presente nesta lavagem, negativando o resultado. Assim, em casos de eluato negativo recomendase que seja analisada esta última lavagem, também pela técnica de Coombs Indireto. Titulação anti-a, anti-b e anti-d Estes ensaios tem como finalidade encontrar a potência do anticorpo existente em várias diluições determinadas. O título será dado pelo último tubo onde se observe aglutinação. A titulação Anti-D é importante em casos de presença do anticorpo (intra ou extravascular) para que se detecte a sua potência em atividade. Isto também é válido para os outros anticorpos irregulares. A titulação Anti-A e Anti-B é muito usada para avaliação destes anticorpos na circulação sanguínea pelo uso de fatores de coagulação. É recomendado que a titulação de anticorpos seja repetida mais de uma vez na rotina, de forma que o resultado possa ser confirmado e compatível com o obtido anteriormente. Desta forma, evita-se qualquer erro durante a execução da técnica. A titulação periódica de um determinado paciente deve ser feita sempre pareada com a penúltima titulação feita anteriormente deste mesmo paciente. Prova Cruzada A prova cruzada tem como princípio a pesquisa do anticorpo existente no soro do paciente (receptor) em relação a presença ou não do antígeno da hemácia do doador. Esta prova, também chamada de Prova Cruzada Maior, é um dos ensaios que compreende as Provas de Compatibilidade realizadas nos Serviços de Hemoterapia como pré requisito de uma transfusão sanguínea de Concentrados de Hemácias. Deve ser realizada concomitantemente com outras provas, como por exemplo, o PAI, que deve ser acompanhado de uma Auto-Prova (soro do paciente com hemácias do paciente), para que se possa avaliar auto-anticorpos presentes na circulação, ou quando um resultado positivo é obtido para a pesquisa de anticorpo intravascular pela Técnica do Coombs Direto. Para melhor compreensão desta prova, é recomendada uma literatura mais específica da área de Medicina Transfusional. Considerações sobre as metodologias O estudo imunohematológico realizado em técnica de lâmina não é mais aceito atualmente, sendo utilizadas hoje em dia as técnicas em tubo, gel centrifugação e PCR (ainda pouco utilizado no Brasil). A técnica em lâmina, por não reproduzir o mesmo nível de confiabilidade que os demais, não deve ser usada como método conclusivo para liberação de resultados de grupos sanguíneos. Para melhor confiabilidade prática em Imunohematologia o laboratório deve dispor de duas técnicas para liberação dos resultados, podendo ser dois métodos distintos ou dois kits de marcas diferentes. ATENÇÃO: A Portaria 1376 de 19/11/1993 define como obrigatória a realização da prova direta e reversa para Sistema ABO, a Pesquisa do D fraco para o Sistema Rhesus e o uso de hemácias tipadas (com fenótipo conhecido) para a Técnica de Coombs Indireto. Página 6/6