ANÁLISE METAGENÔMICA DA MICROBIOTA DO CÓLON DE CAMUNDONGOS SUBMETIDOS A DIETAS NORMO E HIPERLIPÍDICAS

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1 ANÁLISE METAGENÔMICA DA MICROBIOTA DO CÓLON DE CAMUNDONGOS SUBMETIDOS A DIETAS NORMO E HIPERLIPÍDICAS METAGENOMIC ANALYSIS OF THE COLON S MICROBIOTE OF MICE SUBMITTED TO NORMO AND HYPERLIPIDIC DIETS Alexandre Hild Aono (1) Juliane Suzuki Amaral (2) Gabriel Inacio de Morais Honorato de Souza (3) Lila Missae Oyama (4) Ticiana Vasques (5) Elisa Esposito (6) Resumo Devido ao fato de a disbiose estar relacionada à doença humana, diversos estudos de intervenção dietética e estratégias de modulação da microbiota intestinal têm sido conduzidos para corrigir e manipular a composição microbiana, melhorando os resultados do hospedeiro e reduzindo o risco de doença. O objetivo deste estudo foi verificar a eficácia de uma intervenção dietética na obtenção de mudanças benéficas na microbiota intestinal por intermédio da observação da composição e diversidade de bactérias do intestino de camundongos submetidos a dietas normo e hipercalóricas/lipídicas. Com a extração de DNA de amostras de fezes coletadas após 16 semanas de dieta, seguida de sequenciamento utilizando a plataforma Illumina-MiSeq, pudemos identificar micro-organismos indicadores de estado saudável ou doente. A presença de determinados gêneros como Akkermancia, Lactobacillus, Clostridium e Roseburia podem modular o tratamento da obesidade, auxiliando na progressão da terapêutica, aumentando a capacidade de reação do organismo. Palavras-chave: Modulação da Microbiota, Intervenção Dietética, Diversidade Bacteriana, Composição Bacteriana Abstract Due to the fact that dysbiosis is related to human disease, several studies of dietary intervention and strategies of modulation of the intestinal microbiota have been conducted to correct and manipulate the microbial composition, improving the results of the host and reducing the risk of disease. The objective of this study was to verify the efficacy of a dietary intervention in obtaining beneficial changes in the intestinal microbiota by observing the composition and diversity of intestinal bacteria of mice submitted to normal and hypercaloric/lipid diets. With the extraction of DNA from fecal samples collected after 16 weeks of diet followed by sequencing using the Illumina- MiSeq platform, we were able to identify microorganisms related to healthy or diseased status. The presence of certain genera such as Akkermancia, Lactobacillus, Clostridium and Roseburia can modulate the treatment of obesity, aiding in the progression of therapy, increasing the organism's ability to react. Keywords: Microbial Modulation, Dietary Intervention, Bacterial Diversity, Bacterial Composition 1 Graduando em Ciência da Computação pelo Instituto de Ciência e Tecnologia da Universidade Federal de São Paulo, ICT/UNIFESP; 2 Doutoranda em Biotecnologia pelo ICT/UNIFESP; 3 Professor visitante no ICT/UNIFESP; 4 Professor associado no Depto. Fisiologia da Nutrição /UNIFESP; 5 Doutoranda em Biotecnologia pelo ICT/UNIFESP; 6 Professor adjunto no ICT/UNIFESP, eesposito@unifesp.br

2 1. Introdução Múltiplos fatores etiológicos, além da predisposição hereditária, hábitos alimentares errados (consumo excessivo de alimentos gordurosos e processados) e estilo de vida sedentário são associados à obesidade. Recentemente tem se estudado a composição de micro-organismos intestinais de pessoas saudáveis e obesas e os resultados são surpreendentes. As principais alterações na microbiota estão associadas a uma série de distúrbios intestinais, incluindo doença intestinal inflamatória, síndrome do intestino irritável, doença autoimune, diabetes e câncer colo retal (ROSSI et al., 2016). O cólon humano saudável abriga grande diversidade de micro-organismos, podendo a microbiota do intestino sofrer uma diminuição na diversidade bacteriana e composição também, em função da dieta, desencadeando uma redução significativa na abundância de Bacteroidetes com aumento proporcional no Filo Firmicutes (DAVIS-RICHARDSON; TRIPLETT, 2015), o que leva alguns autores a relacionar a obesidade com predominância do filo Firmicutes e o estado saudável com o filo Bacteroidetes (GOYAL et al., 2015). Entretanto, existem representantes do filo Firmicutes com um papel relevante na conversão de acetato em butirato (NEPELSKA et al., 2012), que é um ácido graxo de cadeia curta (AGCC) com a importante função de controlar a obesidade (RIVIÈRE et al., 2016). Diante do exposto, o trabalho teve como objetivo o estudo da composição bacteriana intestinal de camundongos submetidos a dietas normo e hipercalóricas/lipídicas para identificação de bactérias predominantes no estado saudável e na obesidade, possibilitando assim avanços no entendimento da obesidade e de suas implicações na composição microbiana do intestino. 2. Materiais e Métodos Para o estudo foram utilizados camundongos C57BL/6, que são modelos de estudos mais responsivos a diversos propósitos de doenças metabólicas. No total foram utilizados 40 camundongos machos com idade de 21 dias, divididos em grupos experimentais e recebendo as dietas específicas durante 16 semanas. O experimento foi levado a cabo no Biotério da Universidade de Mogi das Cruzes. O DNA metagenômico das amostras fecais, coletadas após uma, oito e dezesseis semanas (final do experimento), foi extraído utilizando o kit de extração de DNA de microbiota fecal Wizard Genomic DNA Purification kit (Promega, USA). O produto de extração foi quantificado pelo Nanodrop, amplificado pela técnica de PCR e a qualidade da amplificação feita por gel de agarose 1% (p/v) corado com Gel Red e fotografado. Para a

3 construção da biblioteca de amplicons, foram utilizados primers das sequências 515f-926r das regiões V3 e V4 do gene 16S rrna. A amplificação por PCR foi realizada em um volume total de 50ul de reação com a enzima polimerase KAPA HiFi HotStart ReadyMix PRC kit (KapaBiosystems ). As reações de amplificação foram realizadas em termociclador Veriti (Applied Bioystems) segundo as condições: desnaturação inicial a 94 C por 3 minutos; 32 ciclos de 94 C por 45 segundos, 56 C por 60 segundos e 72 C por 90 segundos; extensão final de 10 minutos a 72ºC. Por eletroforese em gel, verificou-se que o tamanho do fragmento amplificado foi em torno de 500pb e o produto de PCR foi submetido a uma purificação utilizando beads magnéticas para retirada dos primers e de outros produtos residuais. O sequenciamento do DNA metagenômico foi realizado no Centro de Pesquisa Renê Rachou (Fiocruz BH), utilizando o equipamento de sequenciamento de nova geração (NGS) da Illumina Miseq. Com os dados brutos obtidos, foram realizadas as análises de bioinformática. Para pré-processamento dos dados foi utilizado o software Trimmomatic v0.32 (BOLGER et al., 2014), com filtro de qualidade percorrendo uma janela de 4 bases e um limiar de escala Phred 20 e tamanho mínimo de 50. O programa PEAR v0.9.6 (ZHANG et al., 2013) foi utilizado para unir os pares de sequências de cada read por suas regiões de sobreposição. Para o processamento e análise das sequências foi utilizado o QIIME (CAPORASO et al., 2010), Quantitative Insights Into Microbial Ecology. As sequências foram agrupadas em unidades taxonômicas operacionais (OTUs) com uma identidade mínima de 97% e foram comparadas com o banco de dados Greengenes 13.8 (DESANTIS et al., 2006), sendo os quimeras removidos. Cálculos de diversidade alfa e beta, análises estatísticas e construção de gráficos foram realizados utilizando o software estatístico R (R CORE TEAM, 2000). Para realização das análises estatísticas, empregou-se o teste não paramétrico PERMANOVA em conjunto com testes de Kruskal Wallis. 3. Resultados e Discussão Analisando-se a composição microbiana das fezes de camundongos submetidos a dietas normo e hiperlipídicas, obtivemos como primeira conclusão, por meio da realização da PERMANOVA, com os dados de abundância relativa das bactérias, que a microbiota de camundongos obesos diferia da de camundongos saudáveis (P=0,002), o que era esperado. Considerando-se a análise de abundância relativa, pôde-se observar que a alteração da microbiota em função da dieta foi evidente nas classes Erysiopelotrichi (Filo Firmicutes) e Clostridia (Filo Firmicutes), em que houve uma maior composição nas amostras de animais

4 submetidos a dieta hiperlipídica, enquanto Bacilli (Firmicutis) diminui naqueles submetidos à dieta hiperlipídica. Nesse contexto, podemos afirmar que a dieta é um fator importante que determina a composição da microbiota intestinal. Ela desempenha um papel crítico na colonização, maturação e estabilidade dos micro-organismos. Experimentos tanto em humanos como em modelos animais, demonstram que as mudanças na dieta podem afetar rapidamente a estrutura da microbiota intestinal em um curto período de tempo de aproximadamente 4 dias, após a ingestão de um componente dietético específico (ZHANG; YANG, 2016). Em um estudo realizado por (ZHANG et al., 2010), foi mostrado também que o número de Bacillus bifidus foi reduzido em ratos alimentados com uma dieta rica em gordura. Além disso, pode-se citar um incremento de outras classes de bactérias como Deferribacteres, Deltaproteobactéria, Gammaproteobacteria, Brachyspirae, Coriobacteria, Epsilonproteobacteria e Molicutes no grupo hiperlipídico, enquanto que Verrucomicrobiae e Actinobacteria se sobrepõe no grupo normo. Justamente nestas duas últimas classes encontramos dois gêneros importantes relacionados a estado saudável, Akkermansia e Lactobacillus, respectivamente. A dieta hiperlipídica pode induzir o estresse oxidativo que incrementa a seleção de linhagens de Lactobacillus, resultando em diminuição da resposta inflamatória (SUN et al., 2016), o que é muito positivo e Akkermansia, tem sido diretamente relacionada ao estado saudável. 4. Conclusão A análise metagenômica de amostras de fezes de camundongos submetidos a intervenções dietéticas mostrou diferenças significativas na composição microbiana dos grupos experimentais. A presença de determinados gêneros de bactérias como Akkermancia, Lactobacillus, Clostridium e Roseburia foi relacionada a composição da dieta, diferente entre os grupos, indicando a modulação da microbiota em resposta à obesidade, o que pode auxiliar na progressão da terapêutica e aumentar a capacidade de reação do organismo.

5 Referências BOLGER, A. M. et al. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics, v. 30, n. 15, p , CAPORASO, J. G. et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature methods, v. 7, n. 5, p. 335, DAVIS-RICHARDSON, A. G.; TRIPLETT, E. W. A model for the role of gut bacteria in the development of autoimmunity for type 1 diabetes. Diabetologia, v. 58, n. 7, p , DESANTIS, T. Z. et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rrna gene database and workbench compatible with ARB. Applied and environmental microbiology, v. 72, n. 7, p , GOYAL, M. S. et al. Feeding the brain and nurturing the mind: linking nutrition and the gut microbiota to brain development. Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 112, n. 46, p , NEPELSKA, M. et al. Butyrate produced by commensal bacteria potentiates phorbol esters induced AP-1 response in human intestinal epithelial cells. PloS one, v. 7, n. 12, p. e52869, RIVIÈRE, A. et al. Bifidobacteria and butyrate-producing colon bacteria: importance and strategies for their stimulation in the human gut. Frontiers in microbiology, v. 7, p. 979, ROSSI, O. et al. Faecalibacterium prausnitzii A2-165 has a high capacity to induce IL-10 in human and murine dendritic cells and modulates T cell responses. Scientific reports, v. 6, p , SUN, Jin et al. High-fat-diet induced obesity is associated with decreased antiinflammatory Lactobacillus reuteri sensitive to oxidative stress in mouse Peyer's patches. Nutrition, v. 32, n. 2, p , TEAM, R. Core. R language definition. Vienna, Austria: R foundation for statistical computing, ZHANG, C. et al. Interactions between gut microbiota, host genetics and diet relevant to development of metabolic syndromes in mice. The ISME journal, v. 4, n. 2, p. 232, ZHANG, J. et al. PEAR: a fast and accurate Illumina Paired-End read merger. Bioinformatics, v. 30, n. 5, p , ZHANG, M.; YANG, X.-J. Effects of a high fat diet on intestinal microbiota and gastrointestinal diseases. World journal of gastroenterology, v. 22, n. 40, p. 8905, 2016.