FACULDADE SUDOESTE PAULISTA Instituição Chaddad de Ensino CURSO DE BIOMEDICINA AMANDA DO NASCIMENTO VIEIRA

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1 FACULDADE SUDOESTE PAULISTA Instituição Chaddad de Ensino CURSO DE BIOMEDICINA AMANDA DO NASCIMENTO VIEIRA DOENÇA HEMOLÍTICA DO RECÉM-NASCIDO RELACIONADO AO SISTEMA RH: UMA REVISÃO DA LITERATURA ITAPETININGA-SP 2017

2 AMANDA DO NASCIMENTO VIEIRA DOENÇA HEMOLÍTICA DO RECÉM-NASCIDO RELACIONADO AO SISTEMA RH: UMA REVISÃO DA LITERATURA Trabalho de conclusão de curso apresentado à Faculdade Sudoeste Paulista de Itapetininga FSP ao curso de graduação em Biomedicina como requisito parcial para a obtenção do título de bacharel em Biomedicina. Orientador: Prof. Dr. Thiago de Souza Candido ITAPETININGA-SP 2017

3 VIEIRA, Amanda do Nascimento Doença Hemolítica do Recém- Nascido Relacionado ao Sistema RH: uma revisão da literatura. Amanda do Nascimento Vieira Itapetininga, 2017, 51p. Monografia FSP Faculdade Sudoeste Paulista Biomedicina: Orientador: Prof. Dr. Thiago de Souza Candido 1. Doença Hemolítica 2. Feto 3. Incompatibilidade Sanguínea 4. Aloimunização 5. Sensibilização

4 AMANDA DO NASCIMENTO VIEIRA Doença Hemolítica Do Recém-Nascido Relacionado Ao Sistema Rh: uma revisão da literatura Trabalho de conclusão de curso apresentado à Faculdade Sudoeste Paulista de Itapetininga FSP ao curso de graduação em Biomedicina como requisito parcial para a obtenção do título de bacharel em Biomedicina. Orientador: Prof. Dr. Thiago de Souza Candido BANCA EXAMINADORA Orientador: Prof. º Dr. Thiago de Souza Candido Prof. ª Ms. Lígia Maria Micai Gomide Prof. º Ms. Heverson Felipe Pranches Carneiro Itapetininga, 07 de Dezembro de 2017.

5 Dedico este trabalho aos meus pais por todo apoio e incentivo.

6 AGRADECIMENTOS Gostaria de agradecer primeiramente a Deus por ter me dado a oportunidade de realizar uma faculdade, por toda força e coragem que me concedeu para continuar e passar por cada obstáculo que surgiram no decorrer destes quatro anos. Agradeço aos meus pais, minhas irmãs e ao meu namorado pela paciência, pelo estímulo, por nunca me deixar abalar e por me encorajar em todos os momentos de dificuldades, bem como pelas inúmeras vezes que me ajudaram. Agradeço aos meus colegas de sala pelo companheirismo e pelos diversos momentos inesquecíveis que passamos nesses quatro anos. Agradeço a minhas amigas Angela e Sarah em particular pela amizade que construímos, pelos diversos momentos que superamos juntas, por toda ajuda e apoio que me deram no decorrer do curso. Agradeço também as minhas colegas de trabalho Tamires e Débora, pelos conselhos e ajudas que me deram no decorrer do último semestre. Agradeço particularmente ao meu orientador, professor Dr. Thiago pelas orientações, pelas contribuições decisivas, por sua amizade e pela grande ajuda que me forneceu no decorrer deste trabalho. Não poderia deixar de agradecer também aos demais professores que mostraram-me o mundo da biomedicina, fornecendo diversos conhecimentos sobre esta incrível área. Obrigada a todos que se fizeram presente e me ajudaram no decorrer desses quatro anos.

7 VIEIRA, AMANDA N. Doença Hemolítica do Recém-Nascido Relacionado ao Sistema Rh: uma revisão da literatura. 51 págs. Monografia Faculdade Sudoeste Paulista, Itapetininga, RESUMO A doença hemolítica do recém-nascido (DHRN) consiste na destruição precoce dos eritrócitos fetais devido a passagem de anticorpos maternos através da barreira placentária. Esta doença leva a casos de hidropisia, kernicterus, anemia fetal e compromete a maturação das hemácias levando ao aumento de eritroblastos, eritrócitos imaturos, na circulação do feto. Isto ocorre devido a incompatibilidade dos grupos sanguíneos do sistema ABO ou do sistema Rh entre a mãe e o feto, sendo o sistema ABO o mais comum porém possui um caráter benigno na maioria dos casos, e o sistema Rh o principal fator que leva a DHRN. Dentre os antígenos do sistema Rh o mais implicado na aloimunização é o antígeno D, pois possui um potencial maior para estimular a produção de anticorpos. Os métodos de prevenção e diagnóstico desta doença podem ser realizados em consultas pré-natal ou após o nascimento do feto, através da pesquisa do histórico gestacional e transfusional, testes de Coombs indireto e direto, tipagem sanguínea dos sistemas ABO e Rh, amniocentese, ultrassonografia, cordoncentese e através da coleta das vilosidades coriônicas. O tratamento da sensibilização materna pode ser feito através da administração de imunoglobulinas anti-d, que irão destruir as células Rh D positivas presentes na circulação materna, prevenindo assim a produção de anticorpos anti D pelas células maternas. Outros possíveis métodos de tratamento são a exanguineotransfusão, processo onde será removido os produtos gerados da hemólise e os anticorpos maternos da circulação fetal, transfusão intrauterina e a fototerapia. Quando a DHRN está relacionada ao sistema Rh, surge a indagação de como o sistema imunológico materno irá afetar a saúde do feto? Muitas mães não sabem o quão importante é a realização da tipagem sanguínea antes de engravidar ou ao descobrir que está grávida, e como isso pode afetar a saúde do feto se houver uma incompatibilidade do sistema Rh. Este, possivelmente, é o principal motivo do alto índice de casos de fetos com a DHRN. Outro fator que pode agravar é a conduta médica, alguns médicos podem não solicitar os devidos exames no início da gestação para detectar a presença de uma sensibilização materna com o objetivo de evitar o quanto antes que o feto seja muito afetado e apresente várias sequelas. O objetivo geral deste trabalho foi demonstrar a relação da DHRN com a incompatibilidade do sistema Rh entre a mãe e o feto, tendo como objetivo específico demostrar como esta incompatibilidade pode gerar uma reação imunológica nas hemácias fetais levando a problemas em sua saúde, bem como as possíveis manifestações clínicas que podem surgir, visando também explicar como pode ser descoberta e tratada. Para compor este trabalho foi utilizado uma pesquisa de natureza básica, com abordagem na problemática qualitativa, com o objetivo de pesquisa exploratória e ponto de vista dos procedimentos técnicos de pesquisas bibliográficas. Com isso pode-se concluir que a forma mais grave da doença está relacionada com sistema Rh, onde o principal antígeno envolvido é o D. Palavras chave: Doença hemolítica. Feto. Incompatibilidade sanguínea. Aloimunização. Sensibilização.

8 VIEIRA, AMANDA N. Hemolytic Disease of the Newborn Related to the Rh System: a review of the literature. 51 pages. Monography - Faculty Southwest Paulista, Itapetininga, ABSTRACT Hemolytic disease of the newborn (DHRN) consists of the early destruction of fetal erythrocytes due to the passage of maternal antibodies through the placental barrier. This disease leads to cases of hydrops, kernicterus, fetal anemia and compromises the maturation of erythrocytes leading to the increase of erythroblasts, immature erythrocytes, in the fetal circulation. This is due to the incompatibility of the blood groups of the ABO system or the Rh system between the mother and the fetus, with the ABO system being the most common but having a benign character in most cases, and the Rh system the main factor leading to DHRN. Among the antigens of the Rh system most implicated in alloimmunization is the D antigen, since it has a greater potential to stimulate the production of antibodies. The methods of prevention and diagnosis of this disease can be performed in prenatal consultations or after the birth of the fetus, through the investigation of the gestational and transfusional history, indirect and direct Coombs tests, ABO and Rh blood typing, amniocentesis, ultrasonography, cordoncentesis and through the collection of chorionic villi. Treatment of maternal sensitization can be done by administering anti-d immunoglobulins, which will destroy the Rh D positive cells present in the maternal circulation, thus preventing the production of anti-d antibodies by maternal cells. Other possible methods of treatment are exchange transfusion, a process in which the products generated from hemolysis and maternal antibodies from the fetal circulation, intrauterine transfusion and phototherapy will be removed. When DHRN is related to the Rh system, does the question arise as to how the maternal immune system will affect the health of the fetus? Many mothers do not know how important blood typing is prior to becoming pregnant or finding out they are pregnant, and how this can affect the health of the fetus if there is an incompatibility of the Rh system. This is possibly the main reason for the high index of fetal cases with DHRN. Another factor that may aggravate medical conduct is that some physicians may not request screening in the early stages of pregnancy to detect the presence of maternal sensitization in order to avoid as early as possible that the fetus is severely affected and has several sequelae. The general objective of this study was to demonstrate the relationship between DHRN and the incompatibility of the Rh system between the mother and fetus, with the specific objective of demonstrating how this incompatibility can generate an immunological reaction in the fetal RBCs leading to problems in their health, as well as possible clinical manifestations that may arise, in order to explain how it can be discovered and treated. To compose this work, a basic research was used, with an approach in the qualitative problem, with the objective of exploratory research and point of view of the technical procedures of bibliographical researches. With this, it can be concluded that the most severe form of the disease is related to Rh system, where the main antigen involved is D. Keywords: Hemolytic disease, fetus, blood incompatibility, alloimmunization, sensitization.

9 LISTA DE TABELAS Tabela 1- Passo a passo da tipagem sanguínea ABO pela prova direta Tabela 2 - Passo a passo da tipagem sanguínea ABO pela prova reversa Tabela 3- Passo a Passo da tipagem sanguínea RhD Tabela 4- Passo a Passo da tipagem sanguínea RhD para determinação de variantes Tabela 5- Passo a passo dos procedimentos necessários para a realização do teste de Coombs Tabela 6 - Passo a passo dos procedimentos necessários para a realização do teste de Coombs Indireto LISTA DE FÍGURAS Figura 1 - Genes e Antígenos do Sistema Rh Figura 2 - Esquema do Desenvolvimento da DHRN Figura 3 - Comparação das proteínas do D fraco e D parcial com D normal Figura 4 - Variantes Proteicos do D fraco e D parcial Figura 5 - Perfil fetal normal Figura 6 - Coluna Vertebral Normal Figura 7 - Simetria normal dos átrios e ventrículos fetais Figura 8 - Ultrassonografia de um feto com hidropisia na região do couro cabeludo Figura 9 - Coleta do líquido amniótico com o auxílio de ultrassom Figura 10 - Coleta do sangue do cordão com o auxílio da ultrassonografia Figura 11 - Coleta das vilosidades coriônicas pela via transcervical Figura 12 Interpretação dos resultados da tipagem sanguínea ABO Figura 13 - Tipagem Sanguínea ABO de indivíduo do grupo A Figura 14 - Tipagem Sanguínea RhD positivo Figura 15- Teste de Coombs Direto Figura 16 - Teste de Coombs Indireto... 40

10 LISTA DE SIGLAS DHRN - Doença Hemolítica do Recém - Nascido SNC - Sistema Nervoso Central TIU - Transfusão Intrauterina EDTA - Ácido Etilenodiaminotetracético NaCl: Cloreto de Sódio PEG: Polietilenoglicol LISTA DE ABREVIATURAS Anti- anticorpo Rh - Rhesus IgM - Imunoglobulina M IgG - Imunoglobulina G IgA - Imunoglobulina A IgD - Imunoglobulina D IgE - Imunoglobulina E kda - Quilodalton mg - Miligramas dl - Decilitro ml - Mililitros g - Gramas Hb - Hemoglobina Rpm - Rotações por minuto µg - Micrograma Rev - Revista Bras - Brasil Ver - Versão Ed - Edição Vol - Volume v - Volume n número Num. - número p. - Páginas f. - folhas

11 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO OBJETIVO Objetivo geral Objetivo específico METODOLOGIA DESENVOLVIMENTO Antígenos Eritrocitários de Superfície Doença hemolítica do recém-nascido (DHRN) Aloimunização Transferência da Imunoglobulina G (IgG) Destruição das Hemácias Fetais Antígeno D Antígenos D fraco Antígenos D parciais Principais Manifestações Clínicas da DHRN Icterícia Kernicterus Anemia Hidropisia Fetal Diagnósticos Laboratoriais da DHRN Conhecimento do histórico gestacional Pesquisa de incompatibilidade sanguínea entre os pais Pesquisa de evidência de aloimunização Ultrassonografia Amniocentese Coleta do sangue fetal do cordão umbilical Coleta de amostras de vilosidades coriônicas Diagnóstico clínico Imunohematológico Teste de Coombs Teste de Coombs Direto Teste de Coombs Indireto Métodos De Tratamento da DHRN... 42

12 4.9.1 Imunoglobulina Anti-D Transfusão Intrauterina Intraperitoneal Intravascular Exanguineotransfusão Fototerapia CONCLUSÃO REFERÊNCIAS... 48

13 11 1 INTRODUÇÃO A doença hemolítica do recém-nascido (DHRN), resulta da passagem de eritrócitos fetais para a circulação materna através da placenta, quando a mãe possui tipagem Rh negativo e o feto Rh positivo (VIEIRA, 2013). Foi descrita primeiramente em 1609, na França, pela parteira Loyse Bourgeois, que relatou o parto de um casal de gêmeos. A primeira nasceu hidrópica, falecendo poucas horas depois, o segundo, aparentemente saudável, apresentou icterícia falecendo alguns dias após seu nascimento (VALENTE, 2009). Desde então, outras manifestações clínicas foram descritas, sendo somente em 1932, demonstrado que a hidropisia, icterícia grave e o kernicterus, um dano severo ao sistema nervoso central (SNC) gerado pelo acúmulo de bilirrubina indireta nos tecidos nervosos, estão relacionados com um mesmo processo acompanhado de anemia hemolítica, eritropoiese extramedular, hepatoesplenomegalia e pela presença de eritroblastos (MACHADO et al., 2006). Devido a presença dos eritrócitos imaturos na circulação fetal, denominados de eritroblastos, posteriormente a DHRN também começou a ser chamada de Eritroblastose Fetal (MACHADO et al., 2006). Em 1939, foi identificada uma mulher que deu à luz a um feto com DHRN que nasceu morto. A mulher foi submetida a uma transfusão sanguínea utilizando o sangue do marido após o parto, tendo como reação uma hemólise severa. Ela possuía tipagem Rh negativo e o marido Rh positivo, seu soro aglutinou com o sangue dele, mas não aglutinava com hemácias Rh negativas. Levine identificou assim que, o sangue da mulher foi sensibilizado pelos antígenos Rh do feto, que foram herdados pelo pai (VALENTE, 2009). O mecanismo imunológico e o antígeno responsável pela isoimunização que levam à DHRN, foram confirmados em 1940 por Weiner, Landsteiner e Levine através da realização de inoculações do sangue de coelhos em hemácias de macacos Rhesus. Os sangues dos coelhos possuíam anticorpos que se ligavam aos antígenos das hemácias do macaco Rhesus agindo contra elas. Foram observados aglutinação em cerca de 85% das hemácias testadas, sendo consideradas do tipo Rh positivo. Os 15% que não apresentaram aglutinação foram chamadas de Rh negativo. Tempos depois, Landsteiner e Levine demostraram assim que as pacientes reportadas em 1939 com casos de reações sanguíneas, possuíam a tipagem Rh negativa tendo em seu sangue o anticorpo anti- Rh capaz de reagir com as hemácias de seus maridos e filhos se possuírem uma tipagem Rh positivo (VALENTE, 2009).

14 12 Esta reação normalmente ocorre na segunda gestação quando o primeiro filho apresentou Rh positivo, porém pode ocorrer na gestação do primeiro filho quando a mãe Rh negativo já entrou em contato com um sangue do tipo Rh positivo durante uma transfusão sanguínea errônea, gerando o estímulo da produção de anticorpos contra o antígeno Rh tornando a mãe sensibilizada (VIEIRA, 2013). Isto se deve ao fato de que, em uma primeira exposição ao antígeno do feto, o sistema imune materno é estimulado a produzir anticorpos do tipo IgM, que não são capazes de atravessar a placenta e atingir os antígenos do feto devido ao seu alto peso molecular (GATTI et al., 2014). Em uma segunda exposição a esse antígeno, o sistema imune materno irá produzir de uma maneira rápida e intensa, anticorpos do tipo IgG que, por possuírem baixo peso molecular, são capazes de atravessar a placenta se ligando aos antígenos eritrocitários do feto, levando à destruição do mesmo gerando uma hemólise (GATTI et al., 2014). Em consequência de um período prolongado desta hemólise, o feto pode vir a desenvolver uma anemia severa ou uma carência de eritrócitos, culminando em uma grande presença de eritroblastos na circulação fetal (VIEIRA, 2013). Nos dias atuais, existem diversos fatores pré-natais importantes para o diagnóstico, controle da imunização materna e para determinar o grau de severidade da DHRN. Alguns dos métodos e técnicas mais importantes são: ter o conhecimento da história gestacional, ultrassonografia detalhada, amniocentese, biópsia das vilosidades coriônicas e a coleta do sangue fetal por meio de cordocentese (VALENTE, 2009). Um dos métodos que podem ser utilizados como uma tentativa de diminuir o risco de uma sensibilização materna é a administração de imunoglobulinas anti-d. Outros métodos como a transfusão intrauterina, exanguineotransfusão e a fototerapia podem ser utilizados para realizar o tratamento da DHRN (MANOLO et al., 2004). Quando a DHRN está relacionada ao sistema Rh, surge a indagação: como o sistema imunológico materno irá afetar a saúde do feto? Isto ocorre devido o contato do sangue materno com o sangue fetal, levando assim a estimulação da produção de anticorpos que irão atingir os antígenos do feto ao atravessar a placenta, podendo gerar uma anemia, hidropisia, icterícia e kernicterus. Atualmente um índice baixo de mulheres em idade fértil tem conhecimento sobre a DHRN e sobre as consequências que esta patologia pode representar para o feto em uma segunda gestação ou pós sensibilização. Por falta de conhecimento,

15 13 poucas mães se atentam ao fato da importância da realização da tipagem sanguínea antes de engravidar ou ao relatar a gravidez. Possivelmente ainda há muitos casos de fetos com a DHRN, pois muitas mães não conhecem os tipos de complicações que se pode ter em casos de incompatibilidades sanguíneas. Outro fator que pode agravar é a conduta médica, alguns médicos podem não solicitar os devidos exames no início da gestação para detectar a presença de uma sensibilização materna com o objetivo de evitar o quanto antes que o feto seja muito afetado e apresente várias sequelas.

16 14 2 OBJETIVO 2.1 Objetivo geral Este trabalho se objetivou em demonstrar a relação da DHRN com a incompatibilidade do sistema RH entre a mãe e o feto, apresentando os principais métodos de tratamento e diagnóstico 2.2 Objetivo específico Teve como objetivo específico demostrar como esta incompatibilidade pode gerar uma reação imunológica nas hemácias fetais gerando problemas em sua saúde, bem como as possíveis manifestações clínicas que podem surgir, visando também explicar como pode ser descoberta e tratada.

17 15 3 METODOLOGIA Para compor este trabalho foi utilizado uma pesquisa de natureza básica, com abordagem na problemática qualitativa, com o objetivo de pesquisa exploratória e ponto de vista dos procedimentos técnicos de pesquisas bibliográficas. Os artigos foram retirados do Google Acadêmico e do Scielo.

18 16 4 DESENVOLVIMENTO 4.1 Antígenos Eritrocitários de Superfície As células do sangue humano possuem muitos antígenos de superfície, estruturas macromoleculares que podem ser de natureza carboidrato, proteína ou glicoproteína (BONIFÀCIO, 2009), sendo que os mais importantes pertencem ao sistema ABO e ao Rhesus (Rh) (PACHECO, 2013). Os antígenos do sistema ABO não estão restritos somente a membrana eritrocitária, mas também podem ser encontrados na saliva e outros líquidos biológicos, exceto no fluido espinhal. Possuem quatro tipos de antígenos: A, B, AB e O, que são expressos desde a 5º semana de vida intrauterina (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014). Estes antígenos são sintetizados na membrana dos eritrócitos devido a adição de carboidratos a uma cadeia glicoproteica (STINGHEN et al., 2016). O sistema Rh consiste em várias proteínas, sendo o antígeno D o mais relevante e o mais implicado nos casos de aloimunização por possuir maior antigenicidade, capacidade de estimular o sistema imune a provocar formação de anticorpos, como reação à presença de substâncias estranhas no organismo (BAIOCHI, 2009). Os antígenos Rh fetais começam a surgir na 6ª semana de vida (GIRALDO, 2009), é o mais complexo dos sistemas eritrocitários e o segundo mais importante na medicina transfusional, depois do sistema ABO, sendo encontrados exclusivamente nas hemácias (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014). São proteínas codificadas por dois genes homólogos o RHD e RHCE, que estão localizados no cromossomo 1 com 10 exóns cada (Figura 1) (BONIFÀCIO, 2009). Estes genes estão muito próximos uns dos outros, porém são orientados em direções opostas (STINGHEN et al., 2016). O RHD irá expressar o antígeno D e o RHCE os antígenos C, c, e, E, que podem possuir várias combinações (BONIFÀCIO, 2009). Tanto o sistema ABO como o Rh são determinados geneticamente, por esta razão o feto pode herdar o tipo sanguíneo da mãe e do pai (PACHECO, 2013). A exposição do antígeno Rh na superfície dos eritrócitos, irá depender da presença da glicoproteína Rh associada, produto do gene RHAG localizado no cromossomo 6 (BONIFÀCIO, 2009). Quando o indivíduo possuí o tipo sanguíneo Rh negativo são expostas a qualquer quantidade de sangue Rh positivo, seu organismo poderá gerar uma reação imunológica, chamada de aloimunização Rh (BAIOCHI, 2009).

19 17 Figura 1 - Genes e Antígenos do Sistema Rh Fonte: STINGHEN et al., 2016, p. 397 Tal exposição pode ocorrer após uma transfusão sanguínea, um contato com seringas contaminadas ou durante uma gestação do feto Rh positivo, em questão da hemorragia feto materna (BAIOCHI, 2009). O fenótipo dos eritrócitos se caracteriza pela presença ou ausência do antígeno D presente na superfície das hemácias. Pode ser identificado mediante técnicas de aglutinação, onde a presença do antígeno D é caracterizada como fenótipo Rh positivo e sua ausência como Rh negativo (SCHMIDT, 2010). 4.2 Doença hemolítica do recém-nascido (DHRN) A doença hemolítica do recém-nascido (DHRN), consiste na redução da vida média dos eritrócitos do feto, devido a ação dos anticorpos eritrocitários maternos, que irão se ligar aos antígenos eritrocitários fetais causando sua destruição, levando a uma anemia fetal (VALDÈS et al., 2000). Isto ocorre devido a incompatibilidade dos grupos sanguíneos entre a mãe e o feto (GATTI et al., 2014). Com relação as diversas formas clínicas que são mediadas pela imunoglobulina IgG, a DHRN é considerada a mais complexa pois envolve a produção de anticorpos em um indivíduo e a destruição celular em outro individuo (GIRALDO, 2009). Algumas situações, como a amniocentese, remoção manual da placenta, cesárias, rompimento da placenta, transfusões sanguíneas com eritrócitos Rh positivos, entre outras situações podem levar à pequenas quantidades de sangue fetal na circulação materna, estimulando a produção de anticorpos (GIRALDO, 2009). O principal tipo de contato do sangue materno com antígenos eritrocitários Rh positivos é devido a gravidez. Esta passagem pode ocorrer em qualquer momento

20 18 da gestação após a 16ª semana, sendo que a quantidade de células e a frequência da exposição tendem a aumentar após o parto quando se tem a maior concentração de eritrócitos fetais em contato com a circulação materna (RAVEL, 1997). Na primeira gravidez a sensibilização é rara, ocorrendo somente em torno de 0,8 % a 1,5 % dos casos, por ser a primeira exposição a antígenos considerados estranhos ao organismo da mãe, tendo apenas o estímulo da produção dos anticorpos, não levando assim, a destruição dos eritrócitos fetais (BAIOCHI, 2009). Nem todas as mães se tornam sensibilizadas durante a gravidez, o risco de sensibilização é em média 10-13%, com a presença de Rh incompatível em mães não sensibilizadas. Entre 5-10% dos primeiros filhos são afetados devido a mãe ter sido exposta aos antígenos Rh positivos antes da gestação, ou devido ao fato da mãe ser muito sensível ao estímulo de um sangue Rh positivo durante uma gravidez normal (RAVEL, 1997). A DHRN causada pela incompatibilidade do feto com os antígenos do sistema ABO materno é mais comum, porém possui um caráter benigno por ser raramente grave, provocando especialmente uma anemia. Já o grupo sanguíneo do sistema Rh é o responsável por 95% dos casos da doença (BAIOCHI, 2009). Se a mãe possuir Rh positivo ou o pai, assim como a mãe, possuir uma tipagem Rh negativo, teoricamente o feto não possui um risco de desenvolver a doença (RAVEL, 1997). O sistema Rh é muito amplo possuindo cerca de cinquenta antígenos já descritos, porém apenas cinco estão envolvidos de forma clinicamente significante na DHRN, sendo eles: D, C, c, E, e (BAIOCHI, 2009). Os anticorpos maternos são transferidos para a circulação do feto através da placenta, sendo a imunoglobulina G (IgG) a única capaz de atravessar a barreira placentária, por possuir baixo peso molecular (Figura 2) (VALDÈS et al., 2000). Ao atravessar a placenta, estes anticorpos irão atingir a circulação fetal levando a destruição de seus eritrócitos (RAVEL, 1997). A partir da 10ª semana da gestação, os anticorpos IgG que passam pela placenta para destruir as hemácias fetais Rh D positivas, irão desencadear um processo de hemólise que irá resultar em uma anemia fetal (BAIOCHI, 2009). O grau desta anemia irá depender da intensidade da hemólise, podendo levar a um aumento da eritropoiese medular, seguida de um recrutamento de sítios extramedulares, como fígado, baço, placenta, rins e suprarrenais, até o momento em que ocorrer uma congestão hepática, obstrução do sistema porta, redução da

21 19 pressão oncótica e se instale uma insuficiência cardíaca e hidropisia fetal (BAIOCHI, 2009). Figura 2 - Esquema do Desenvolvimento da DHRN Fonte: ROBBINS & COTRAN, 2005, p. 508 A doença pode levar a condições severas onde o feto irá apresentar uma anemia intensa, culminando em hidropisia, hiperbilirrubinemia, icterícia, kernicterus ou até mesmo levar ao óbito (VALDÈS et al., 2000). Mesmo após o nascimento, os anticorpos maternos que foram transferidos ao feto continuam causando hemólise, pois os eritrócitos possuem uma meia vida de noventa dias (BAIOCHI, 2009). A reação imunológica inicia-se pelos anticorpos IgM, que são produzidos ao longo das semanas de gestação, não sendo capazes de atravessar a barreira placentária devido ao seu alto peso molecular. Uma resposta secundária pode ocorrer após uma segunda exposição a um determinado antígeno sendo constituído pelo anticorpo IgG, que são capazes de atravessar a placenta (BAIOCHI, 2009). O quadro clínico e a gravidade da doença irão depender do tipo de anticorpo produzido, seu nível no sangue materno e a duração da exposição no feto, determinando o grau de hemólise, a capacidade da eritropoietina e do tratamento aplicado intrauterino (BAIOCHI, 2009). A DHRN possui três estágios: aloimunização

22 20 materna, transferência de imunoglobulina G (IgG) materna ao feto e a destruição das hemácias fetais (VALDÈS et al., 2000). 4.3 Aloimunização A aloimunização consiste na formação de anticorpos após uma exposição a antígenos não próprios considerados estranhos ao organismo. No caso da DHRN, a mãe produz anticorpos contra os antígenos de superfície dos eritrócitos fetais que não estão presentes em seus eritrócitos, o antígeno D (VALDÈS et al., 2000). Nesse caso, o feto irá expressar apenas antígenos de origem paterna, que podem chegar a circulação materna durante a gestação ou no momento do parto levando a produção de imunoglobulinas especificas (BAIOCHI, 2009). As imunoglobulinas são proteínas responsáveis pela resposta imunológica do sistema humoral originadas de células plasmáticas (KALLAUR et al., 2007). Tipos diferentes de imunoglobulinas são secretadas, podendo ser IgG, IgA, IgM, IgD ou IgE (MARTINEZ et al., 1999). A imunoglobulina do tipo IgG é o principal anticorpo produzido durante uma resposta imunológica secundária do sangue (KALLAUR et al., 2007). 4.4 Transferência da Imunoglobulina G (IgG) No momento que os linfócitos B materno identificam os antígenos eritrocitários fetais, uma imediata produção de IgM é estimulada (LAMBERTINO et al., 2014). As imunoglobulinas do tipo IgM possuem uma vida média curta, sendo de em média 5 dias (MARTINEZ et al., 1999). A medida que os níveis de IgM declinam, concomitantemente, os níveis de IgG aumentam (LAMBERTINO et al., 2014). Por possuir um baixo peso molecular de 150 kda (MARTINEZ et. al., 1999), após serem atraídos pelos antígenos eritrocitários do feto, a IgG atravessa a barreira placentária atuando como anticorpos anti-d, levando à destruição dos eritrócitos fetais culminando em um quadro anêmico (LAMBERTINO et al., 2014). 4.5 Destruição das Hemácias Fetais Após a fixação dos anticorpos maternos aos eritrócitos fetais, ocorre dois possíveis mecanismos que são capazes de causar danos (LAMBERTINO et al., 2014). O primeiro é mediado pelo sistema complemento, onde um conjunto de proteínas sintetizadas, principalmente no fígado, são ativadas e irão dar início a uma série de reações, produzindo diferentes tipos de fragmentos proteicos que serão capazes de

23 21 provocar diferentes efeitos biológicos, como por exemplo a destruição das membranas celulares, aumento da atividade fagocitária celular e a introdução de reações inflamatórias. (MARTINEZ et al., 1999). É frequente na presença de anti-a e anti-b, onde ocorrerá um dano marcado de membrana resultando em uma hemólise intravascular com hemoglobinúria e hemoglobinemia, esta membrana é fragmentada e fagocitada no fígado pelo sistema reticuloendotelial (LAMBERTINO et al., 2014). O segundo mecanismo não irá depender do sistema complemento, sendo observado com frequência na presença do anti-d, a destruição é mais sutil e leve, porém também irá levar a uma hemólise ocorrendo principalmente no fígado (LAMBERTINO et al., 2014). Os macrófagos são atraídos por quimiotaxia (processo de migração das células em direção a um gradiente químico) após a união do antígeno com o anticorpo, onde irá se ligar aos glóbulos vermelhos formando rosetas. A membrana celular também é atacada sendo retirado as porções que se selam através do deslocamento, deformando o glóbulo vermelho dando a ele uma maior rigidez. Mesmo que os eritrócitos entrem em processo de fuga do macrófago, ainda levarão danos devido a fragilidade osmótica adquirida (LAMBERTINO et al., 2014). 4.6 Antígeno D Foi descrito em 1939, por Levine e Stetson através de um caso de uma mulher que após dar à luz a uma criança com DHRN, sofreu uma hemorragia, necessitando receber uma transfusão utilizando o sangue incompatível do marido, apresentando em seguida uma reação transfusional grave (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014). O anti-d, anticorpo correspondente ao antígeno D, foi identificado em 1940 por Landsteiner e Wiener, após observarem que o soro do coelho imunizado com hemácias do macaco Rhesus também aglutinava cerca de 80% das hemácias humanas (SCHMIDT, 2010). É um dos cinquenta antígenos do sistema Rh mais importantes do grupo sanguíneo em humanos, altamente polimórfico e imunogênico, sendo que mais de 50% dos casos da DHRN são causados por este antígeno (SCHMIDT, 2010). Por possuírem um extenso polimorfismo, podem se apresentar com uma fraca expressão, sendo este o antígeno D fraco, ou com um antígeno D modificado, o antígeno D parcial (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014). Estes tipos de polimorfismos podem causar dificuldades na classificação do Rh em negativo e positivo, pois

24 22 possuem baixa expressão na superfície das hemácias quando comparados com o antígeno D, apresentando diferentes tipos de proteínas em sua superfície (Figura 3) (BONIFÀCIO, 2009). Seu reconhecimento irá depender do tipo de método e da qualidade do reagente anti-d utilizados (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014). Indivíduos Rh negativos que apresentam o polimorfismo parcial ou enfraquecido podem possuir a formação de anti-d, assim como indivíduos Rh positivos que apresentam o antígeno parcial também podem possui-lo se exposto ao antígeno D (MINISTÈRIO DA SAÚDE, 2014). Figura 3 - Comparação das proteínas do D fraco e D parcial com D normal Fonte: STINGHEN et al., 2016, p Antígenos D fraco São variações quantitativas do antígeno D, possuem expressão enfraquecida que reagem com os anticorpos anti-d (OLIVEIRA, 2013). Esta variação ocorre devido a substituição de aminoácidos na região intracelular ou transmembranária da proteína D, o que leva a diminuição do número de sítios dos antígenos D presentes na membrana eritrocitária (STINGHEN et al., 2016). Nos testes sorológicos eles são detectados somente por meio de tratamento enzimático das hemácias e através da técnica de Coombs Indireto, um teste que consiste na identificação dos anti-d. As hemácias que apresentam o antígeno D fraco devem ser consideradas Rh positivas, pois podem provocar uma aloimunização transfusional ou feto-materna (OLIVEIRA, 2013) Antígenos D parciais Os antígenos D parciais se caracterizam pela ausência de um ou mais epítopos do antígeno D, que são substituídos por epítopos do antígeno CcEE (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014). Esta alteração ocorre devido às modificações moleculares no gene codificador do antígeno D, que leva a substituição dos aminoácidos, principalmente na porção extracelular da proteína D. Devido a

25 23 presença de diferentes aminoácidos, vários epítopos apresentam-se alterados (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014). Indivíduos que necessitam de transfusão sanguínea, ou gestantes que possuem o antígeno D parcial, podem ser sensibilizados se expostos aos antígenos D positivos, pois podem levar a produção de anti-d (STINGHEN et al., 2016). Por esta razão investe-se cada vez mais em obter reagentes capazes de detectar todos os tipos de antígenos D variantes (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014). Estas alterações podem ser qualitativas quando ocorre a perda ou ganho de um epítopo da proteína D ou pode ser quantitativa quando relacionado a redução do número dos sítios do antígeno de membrana eritrocitária (Figura 4) (STINGHEN et al., 2016). Alguns antígenos D parciais possuem baixa densidade antigênica apresentando também uma expressão fraca, outros apresentam uma alta densidade antigênica, semelhantes ao antígeno D normal (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014). Figura 4 - Variantes Proteicos do D fraco e D parcial Fonte: STINGHEN et al., 2016, p Principais Manifestações Clínicas da DHRN A partir da hemólise e do aumento da produção das hemácias fetais para compensar as perdas, surgem algumas manifestações clínicas relacionadas a DHRN (ROUX, 2000). Quanto maior for a reação da hemólise e a compensação das hemácias com o aumento de sua produção, mais grave serão as manifestações clínicas e maiores serão os danos, principalmente no Sistema Nervoso Central (SNC) devido ao grande aumento de bilirrubina no sangue (ROUX, 2000). As principais manifestações clínicas relacionada DHRN consistem em uma anemia e em uma icterícia que se desenvolvem rapidamente, porém ao atingirem seu estado grave outras manifestações podem surgir (RAVEL, 1997).

26 Icterícia A icterícia surge devido a incapacidade do feto em eliminar a bilirrubina (ROUX, 2000). É apresentada como uma coloração amarelada na pele devido a deposição da bilirrubina nesse local, onde é possível encontrar seus níveis elevados no plasma caracterizado assim como hiperbilirrubinemia (RAMOS, 2002). Os níveis de bilirrubina no sangue estão relacionados com a intensidade da coloração amarelada da pele. Quando os níveis de bilirrubina no sangue estão ao redor de 5 a 6 mg/dl a icterícia na pele torna-se visível. A icterícia pode refletir em alguns transtornos na produção ou em alguns passos do metabolismo e da excreção da bilirrubina (RAMOS, 2002). A bilirrubina é um pigmento amarelo, derivada do grupo heme da hemoglobina liberada da quebra das hemácias, onde cada grama que será degradada se transforma em 35 mg (miligramas) de bilirrubina (ROUX, 2000). Este processo ocorre ao final da vida das hemácias, no interior das células do sistema reticuloendotelial (RAMOS, 2002). A icterícia é resultado do aumento da bilirrubina devido a processos hemolíticos, podendo ser agravada pela imaturidade hepática. Após o nascimento, a icterícia surge dentro das primeiras vinte e quatro horas de vida, alcançando seu nível máximo em até três ou quatro dias de vida quando não tratada (ROUX, 2000). É necessário que o paciente seja examinado em um ambiente com uma luz adequada natural, pois em pouca claridade ou com a utilização de uma iluminação artificial, pode ser difícil perceber a coloração amarelada que corresponde a icterícia. Os locais onde a icterícia pode ser mais percebida é na conjuntiva ocular e na pele (RAMOS, 2002). É possível detecta-la quando a concentração sanguínea da bilirrubina ultrapassa 2 a 3 mg/100 ml, sendo que os valores considerados normais são de 0,3 a 1,0 mg/100 ml (RAMOS, 2002). Em situações normais, as bilirrubinas fetais são apuradas pelo fígado materno, por esta razão a maioria dos recémnascidos não apresentam icterícia (ROUX, 2000). Como consequência disto, os recém-nascidos apresentam icterícia após o parto apenas em casos mais graves. Em casos mais leves pode vir a aparecer durante horas ou até 24 horas. Normalmente está acompanhada de anemia quando presente em recém-nascidos, e em alguns casos de eritroblastos circulantes (RAVEL, 1997).

27 Kernicterus A elevada acumulação da bilirrubina no tecido nervoso leva a danos no SNC, caracterizando o kernicterus, também conhecido como encefalopatia bilirrubina, onde ocorre um comprometimento no núcleo da base do encéfalo (RAMOS, 2002). A bilirrubina indireta que circula no plasma ligada à albumina é lipossolúvel, ou seja, solúvel em gordura e insolúvel em água (ROUX, 2000). Quando a capacidade de união da albumina é muito alta, surge a presença de bilirrubina livre no plasma, sendo possível a sua migração aos tecidos se fundindo a eles por difusão, favorecidos pela bicamada lipídica das membranas celulares (ROUX, 2000). Em algumas situações a bilirrubina pode estar fortemente aumentada, o que poderá prejudicar alguns tecidos, principalmente do SNC (RAMOS, 2002). Os tecidos nervosos possuem membranas com uma maior quantidade de lipídeos quando comparadas com os outros tecidos, por esta razão a bilirrubina indireta possui maior afinidade a eles (ROUX, 2000). Em geral, 10% dos recém-nascidos que possuem sinais e sintomas de kernicterus não sobrevivem, pois apresentam retardo mental severo, paralisia cerebral, surdez, estrabismo, alteração na função das mitocôndrias neuronais e, consequentemente, a uma morte neural (ROUX, 2000). Nas últimas quatro décadas a incidência da kernicterus tem variado muito devido aos critérios de diagnóstico bem como os tipos de cuidados ao recém-nascido (RAMOS, 2002) Anemia Anemia é definida como uma redução no número total dos eritrócitos circulantes. Fetos que apresentam a DHRN, podem vir a apresentar uma anemia hemolítica, que resulta da destruição precoce das hemácias devido a uma hemólise extravascular ou intravascular (ROBBINS & COTRAN, 2005). A hemólise extravascular consiste na destruição das hemácias no interior das células presentes no sistema fagócito do baço, sendo que o aumento desta atividade pode causar uma esplenomegalia (ROBBINS & COTRAN, 2005). A hemólise intravascular consiste em uma lesão mecânica, fixação do complemento, infecção por parasitas intracelulares ou por fatores tóxicos exógenos. Com relação a DHRN, a hemólise intravascular é gerada pela fixação do complemento, onde as células são fixadas por anticorpos oriundos de uma transfusão sanguínea incompatível ou através de um contato com sangue incompatível (ROBBINS & COTRAN, 2005).

28 26 Dentre as diversas causas da anemia fetal, a mais comum é a aloiminização das hemácias (CUNNINGHAM et al., 2016). O grau de gravidade da anemia irá depender da capacidade da medula óssea em produzir hemácias para responder a hemólise (ROUX, 2000). O grau da anemia fetal pode ser definido também de acordo com a concentração de hemoglobina, onde o nível menor ou igual a 7 g/dl é considerado um caso grave, níveis de 7 a 10 g/dl são os casos de anemia moderada, e níveis entre 10 e 12 g/dl os casos de anemia leve (TAVEIRA et al., 2004). A maioria dos recém-nascidos apresentam ao nascer uma anemia leve e uma discreta hepatoesplenomegalia (aumento no fígado e no baço), sendo relativamente normal (ROUX, 2000). Alguns recém-nascidos, entre 25% e 30%, apresentam uma anemia moderada e uma eritropoiese insuficiente para que os níveis de hemoglobina fetais sejam adequados mantidos. Na anemia severa, ele pode apresentar uma falência severa nos órgãos, bem como uma hidropisia fetal (ROUX, 2000) Hidropisia Fetal O termo hidropisia refere-se ao grande acúmulo de líquido no corpo (CUNNINGHAM et al., 2016). A hidropisia fetal consiste no acúmulo anormal de líquido no espaço extravascular e nas cavidades corporais do feto, sendo designada como uma redução da pressão oncótica na circulação juntamente com um aumento da pressão dos capilares venosos em razão da insuficiência cardíaca (ROBBINS & COTRAN, 2005). Pequenos grupos de células originadas da estimulação do hormônio eritropoietina, irão se localizar na circulação hepática, gerando uma obstrução portal e umbilical que darão origem a uma hipertensão portal capaz de provocar uma interferência na função dos hepatócitos (ROUX, 2000). Com isso ocorre uma diminuição na produção de albumina levando a uma diminuição da pressão osmótica, dando origem ao desenvolvimento de um edema generalizado, ascite e de um derrame do pericárdio e pleural (anasarca) (ROUX, 2000). A causa mais comum da hidropisia fetal é a anemia hemolítica, devido a incompatibilidade de grupos sanguíneos do sistema Rh entre a mãe e o feto, também conhecida como hidropisia imune (ROBBINS & COTRAN, 2005). Entre 20% e 25% dos fetos que apresentam uma anemia severa desenvolvem hidropisia fetal no útero, de 10% a 12% apresentam antes da 34ª semana de gestação e a outra metade apresenta depois dessa época (ROUX, 2000). Inicialmente era

29 27 diagnosticada após o parto, porém nos dias atuais é possível realizar o diagnóstico através do uso da ultrassonografia (CUNNINGHAM et al., 2016) e da pesquisa de anticorpos eritrocitários no soro materno com o teste de Coombs (FRITSCH, 2012). A hidropisia teve uma grande redução após a utilização da imunoglobulina anti-d e com a imediata transfusão fetal (CUNNINGHAM et al., 2016). 4.8 Diagnósticos Laboratoriais da DHRN É de extrema importância que os exames capazes de detectar a doença sejam realizados rapidamente, para que seja possível impedir o avanço da doença (ROUX et al., 2000). Os procedimentos e exames responsáveis pelo diagnóstico da DHRN são: Conhecimento do histórico gestacional Consiste em saber o histórico de outras gestações, se já passou por partos ou gestações de fetos que apresentaram hidropisia e icterícia, bem como se apresentou abortos no primeiro trimestre da gravidez. Também é importante ter o conhecimento de transfusões anteriores e se a mãe apresentou algum tipo de reação transfusional (ROUX et al., 2000) Pesquisa de incompatibilidade sanguínea entre os pais Consiste na realização da tipagem do ABO e Rh nos pais. Uma complicação com relação ao sistema ABO que pode levar ao feto a desenvolver a DHRN, é quando a mãe possui o antígeno O e o pai o antígeno A ou B. No sistema Rh a condição clássica, e mais frequente, onde o feto apresenta a DHRN é quando a mãe é Rh negativa e o pai Rh positivo (ROUX et al., 2000) Pesquisa de evidência de aloimunização É o principal fator do diagnóstico. Toda gestante que apresenta o antígeno Rh negativo deve realizar o teste de Coombs Indireto (vide adiante), um teste que permite identificar a presença de anticorpos anti-rh e outros, para que seja avaliado se houve algum tipo de contato com um sangue Rh positivo, tornando-a imunizada (ROUX et al., 2000).

30 Ultrassonografia Atualmente é possível realizar o diagnóstico de algumas anomalias fetais utilizando a ultrassonografia devido aos avanços da resolução dos aparelhos. Este exame permite a visualização de qualquer malformação com relação ao crescimento dos órgãos, realizar acompanhamento de algumas regiões fetais ou até mesmo identificar algum atraso no seu desenvolvimento (Figuras 5 e 6) (JUNIOR, 2002). Figura 5 - Perfil fetal normal Fonte: CUNNINGHAM et al., 2016, p. 205 Figura 6 - Coluna Vertebral Normal Fonte: CUNNINGHAM et al., 2016, p. 201

31 29 Não é um método invasivo, permitindo avaliar a função e o tamanho da área cardíaca (Figura 7), tamanho anatômico, área hepática, esplênica e placentária bem como avaliar o volume do líquido amniótico. A técnica pode também indicar a presença de uma hidropisia fetal (Figura 8) (ROUX et al., 2000). Figura 7 - Simetria normal dos átrios e ventrículos fetais Fonte: CUNNINGHAM et al., 2016, p. 209 Figura 8 - Ultrassonografia de um feto com hidropisia na região do couro cabeludo Fonte: CUNNINGHAM et al., 2016, p. 318

32 Amniocentese Consiste na punção do líquido amniótico com o auxílio da ultrassonografia (Figura 9), com o objetivo de identificar o índice de hemólise intrauterina e verificar o estado do feto com relação ao nível do pigmento biliar. Através da espectrofotometria, é possível determinar a concentração da bilirrubina presente no líquido amniótico e a gravidade da anemia fetal (ROUX et al., 2000). Como o líquido amniótico contém bilirrubina indireta na maioria dos casos de hipebilirrubinemia fetal, através de sua análise é possível identificar a DHRN (RAMOS, 2002). Antes de realizar a punção é importante avaliar o feto de uma maneira geral, visualizando suas medidas e movimentos, pois com isso é possível identificar um local ideal para realizar a coleta, bem como, detectar qualquer anomalia prévia antes de se realizar a amniocentese (JUNIOR, 2002). A agulha é posicionada para a região da bolsa com maior quantidade de líquido amniótico, devendo evitar atingir o feto e o cordão umbilical, bem como não atravessar a placenta. Normalmente é realizada entre 15ª e 20ª semana de gestação, porém também pode ser realizada em outras semanas (CUNNINGHAM et al., 2016). Em casos onde a mãe não está sensibilizada, deve ser administrado a imunoglobulina anti-d após o procedimento, para evitar que a mesma se torne sensibilizada após o contato com o sangue fetal (CUNNINGHAM et al., 2016). Figura 9 - Coleta do líquido amniótico com o auxílio de ultrassom Fonte: CUNNINGHAM et al., 2016, p.299

33 Coleta do sangue fetal do cordão umbilical Através da cordocentese é possível retirar uma amostra do sangue fetal presente no cordão umbilical, estabelecendo um diagnóstico com mais segurança pois permite realizar análises hematológicas e bioquímicas do sangue do feto (ROUX et al., 2000). Esta técnica foi desenvolvida por Daffos em 1983, na França, contando hoje com o auxílio da ultrassonografia para localizar a região de implantação do cordão na placenta e acompanhar o processo de punção do sangue (JUNIOR, 2002). Permite o acesso direto a circulação do feto, possibilitando obter dados importantes com relação ao hematócrito, bem como realizar o teste de Coombs Direto (vide adiante) para identificar se há a presença de anticorpos maternos na superfície dos eritrócitos fetais, tipagem sanguínea fetal, verificar os níveis de reticulócitos e realizar análise da bilirrubina total (GIRALDO, 2009). Através do controle direto da ultrassonografia, a agulha é introduzida na veia umbilical e o sangue é aspirado lentamente (Figura 10) (CUNNINGHAM et al., 2016). Por ser um exame mais demorado do que a amniocentese e a coleta das vilosidades coriônicas, pode ser realizado a administração de um anestésico local. Após a punção é necessário verificar os batimentos cárdicos fetais e deve-se examinar o local da punção para verificar se está ocorrendo sangramentos (CUNNINGHAM et al., 2016). Figura 10 - Coleta do sangue do cordão com o auxílio da ultrassonografia. Fonte: CUNNINGHAM et al., 2016, p. 301

34 32 Em algumas situações, pode ser encontrado a presença de sangue materno no sangue puncionado do cordão, sendo necessário utilizar determinados marcadores para detectar a presença de hemoglobinas fetais (Hb fetal) e diferenciar o sangue materno do sangue fetal (ROUX et al., 2000) Coleta de amostras de vilosidades coriônicas A coleta é realizada com o auxílio da ultrassonografia, através da inserção de um cateter na região intrauterina em uma determinada via, podendo ser transabdominal ou transcervical (Figura 11) (JUNIOR, 2002). A amostra pode ser obtida entre a 8ª e 9ª semana de gestação. Quando as vilosidades são rompidas é possível obter eritrócitos fetais para realizar a caracterização dos antígenos (ROUX et al., 2000). Tem sido também proposto como um método capaz de determinar o tipo de Rh fetal (GIRALDO, 2009). A ultrassonografia irá direcionar o cateter para o interior da placenta ainda em formação, aspirando em seguida as vilosidades para dentro da seringa que contém um meio de cultura específico para tecidos (CUNNINGHAM et al., 2016). Por ser considerado um exame invasivo, deve ser indicado apenas para mulheres onde o marido possui a tipagem Rh positivo, pois existe um risco de ela ser imunizada e de ocorrer uma hemorragia feto-materna, ou Figura 11 - Coleta das vilosidades coriônicas pela via transcervical Fonte: CUNNINGHAM et al., 2016, p.300.

35 33 pode ser indicada em casos de outras gestações onde o feto apresentou uma DHRN (ROUX et al., 2000). Em casos onde a mãe não está sensibilizada, deve ser administrado a imunoglobulina anti-d após o procedimento para evitar que a mesma se torne sensibilizada após o contato com o sangue fetal (CUNNINGHAM et al., 2016) Diagnóstico clínico É realizado no recém-nascido, onde será avaliado seu aspecto físico buscando identificar palidez, taquicardia e taquipneia oriundas de uma anemia ou devido a derrames pleurais (ROUX et al., 2000). Avalia também se o recém-nascido apresenta um quadro de hepatoesplenomegalia secundária ou alguma falha cardíaca como consequência de uma hemólise extravascular, hematopoiese extramedular, petequeias, purpuras e icterícia, podendo identificar também danos neurológicos devido ao kernicterus. Outros sintomas incluindo vômito, febre e hipertonia também podem ser identificados (ROUX et al., 2000) Imunohematológico Os exames imunohematológicos fazem a confirmação do tipo sanguíneo e da imunização após o nascimento do feto (ROUX et al., 2000). As provas de confirmação consistem na tipagem dos sistemas ABO e Rh, os exames de confirmação consistem no teste de Coombs, onde o método indireto é realizado afim de determinar os aloanticorpos maternos e sua especificidade e o método direto para identificar os anticorpos eritrocitários (ROUX et al., 2000). A tipagem do ABO é realizada através de uma prova direta, que irá pesquisar os antígenos A e B, ou através de uma prova reversa que irá detectar os anticorpos A, B e O. Nas Tabelas 1 e 2 está demostrado os passos necessários para a realização das respectivas provas. A prova direta consiste no teste dos eritrócitos do paciente com os anticorpos monoclonais específicos, anti-a e anti-b (STINGHEN et al., 2016). Nesta prova os eritrócitos do paciente são colocados em contato com um soro conhecido contendo anti-a e anti-b, com o objetivo de identificar a presença ou a ausência dos antígenos A ou B nos eritrócitos, permitindo definir assim qual a tipagem sanguínea ABO do paciente, se é A, B, AB ou O (Figura 12) (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014).

36 34 Figura 12 Interpretação dos resultados da tipagem sanguínea ABO Fonte: MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014, p. 30 Tabela 1- Passo a passo da tipagem sanguínea ABO pela prova direta Passos Procedimentos 1º Passo Identificar os tubos de ensaio em A e B 2º Passo Pingar uma gota do soro anti-a no tubo A e do soro anti-b no tubo B. 3º Passo Inserir as hemácias do paciente nos tubos 4º Passo Centrifugar os tubos em rpm (rotações por minuto) por 15 segundos 5º Passo Identificar a presença ou ausência de aglutinação Fonte: MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014, p. 29 A prova reversa irá pesquisar os anticorpos anti-a e anti-b presentes no soro ou plasma do paciente, sendo testados com hemácias reagentes fenotipados A e B (Figura 13). Esta prova deve ser realizada sempre que se tem a necessidade de confirmar a tipagem sanguínea dos doadores de sangue que já foram fenotipados (STINGHEN et al., 2016). A prova consiste em colocar o soro do paciente em contato com eritrócitos conhecidos contendo antígenos A e B, permitindo assim identificar a presença ou ausência dos anticorpos produzidos contra esses antígenos (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014). Se o sangue aglutinar a reação é positiva (Figura 13) (STINGHEN et al., 2016).

37 35 Tabela 2 - Passo a passo da tipagem sanguínea ABO pela prova reversa Passo Procedimentos 1º Passo Identificar os tubos em A e B Pingar duas gotas do soro da amostra 2º Passo nos tubos Adicionar no tubo A uma gota das 3º Passo hemácias A e no tubo B uma gota das hemácias B Centrifugar os tubos em rpm por 4º Passo 15 segundos Identificar a presença ou ausência de 5º Passo aglutinação Fonte: MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014, p. 30 Figura 13 - Tipagem Sanguínea ABO de indivíduo do grupo A Fonte: STINGHEN et al., 2016, p.395 A tipagem do sistema Rh utiliza o anti-d como controle do Rh. Este teste possui métodos de procedimento semelhantes ao da tipagem ABO direta (Tabela 3). Se o sangue aglutinar a reação é positiva (Figura 14), quando apresentar aglutinação na tipagem Rh significa que o paciente possui Rh positivo e a ausência da aglutinação significa que o paciente é Rh negativo (STINGHEN et al., 2016).

38 36 Figura 14 - Tipagem Sanguínea RhD positivo Fonte: STINGHEN et al., 2016, p.401 Tabela 3- Passo a Passo da tipagem sanguínea RhD Passos Procedimentos 1º Passo Identificar o tubo como RhD 2º Passo Pingar uma gota do reagente anti-d 3 º Passo Inserir uma gota dos eritrócitos do paciente 4º Passo Homogenizar e centrifugar o tubo a rpm por 15 segundos 5º Passo Identificar a presença ou ausência de aglutinação Fonte: MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014, p. 40 É possível realizar também as provas de determinação das variantes do antígeno D já que os mesmos podem ser considerados Rh positivos. A diferença da realização desta prova com a realização da tipagem sanguínea RhD, consiste na necessidade de incubar o tubo em um banho maria e realizar a lavagem dos eritrócitos com uma solução salina (Tabela 4) (ROUX et al., 2000).