DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DE TALASSEMIA LABORATORIAL DIAGNOSIS OF THALASSEMIA
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- Pedro Henrique Soares Marinho
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1 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DE TALASSEMIA LABORATORIAL DIAGNOSIS OF THALASSEMIA Fernanda Luciélitan Cahoni Maciel 1 Thainara Madureira Rebesco 1 Everson Stábile 2 RESUMO As talassemias são alterações genéticas resultantes da deficiência na síntese de cadeias globínicas, sendo classificadas de acordo com a cadeia polipeptídica atingida. As mais comuns são do tipo alfa e beta. O presente trabalho tem como objetivo abordar os exames mais utilizados no diagnóstico laboratorial das talassemias. Este é realizado, principalmente, através de hemograma, dosagem de ferro e ferritina para triagem. Como métodos confirmatórios os mais utilizados são eletroforese de hemoglobina e estudo molecular através da técnica de PCR. Seu diagnóstico precoce é essencial para o bem estar do paciente, uma vez que a talassemia pode ser confundida com anemia ferropriva, e seus tratamentos são diferentes. Palavras-Chave: Talassemia, Cadeia Globínica, Eletroforese de Hemoglobina. ABSTRACT The thalassemias are genetic alterations resulting from the deficiency in the synthesis of globin chains, being classified according to the polypeptide chain reached. The most common are alpha and beta. The aim of this study is to discuss the most commonly used tests in the laboratory diagnosis of thalassemias. this is realized, mainly, by blood count, iron dosage and ferritin for screening. As confirmatory methods the most used are hemoglobin electrophoresis and molecular study through the PCR technique. Early diagnosis is essential for patient well-being, since thalassemia can be confused with iron deficiency anemia, and its treatments are different. Key words: Thalassemia, Globinic Chain, Hemoglobin Electrophoresis 1 Aluna do 8 semestre de Biomedicina Unitoledo Araçatuba; 2 Biomédico (Centro Universitário Barão de Mauá), Farmacêutico (Faculdades Adamantinenses Integradas), Especialista em Imunologia Aplicada a Análises Clínicas, Especialista em Hematologia Laboratorial e docente do Centro Universitário Toledo.
2 1 INTRODUÇÃO Segundo FABRON JR (2007) As talassemias são um grupo diferenciado de alterações genéticas, que provocam uma redução ou falta da síntese de algum dos tipos de cadeias globínicas que produzem a hemoglobina. São classificadas de acordo com a cadeia polipeptídica afetada, sendo as mais frequentes as talassemias do tipo alfa e as do tipo beta (BRASIL, 2016). As Talassemias tem maior incidência em territórios de grande povoado italiano. (DOMINGOS et al. 2000). Com maior prevalência no território do mediterrâneo, e no extremo oriente (HOFFBRAND; MOSS, 2013). Dentre as manifestações clínicas da doença em questão, podemos dizer que os pacientes com beta talassemia menor são assintomáticos e normalmente são descobertos durante a investigação de uma discreta anemia (SANTOS, 2012). Já no quadro clínico da beta talassemia maior os sintomas são fraqueza, cansaço, palidez, dores nas pernas, podendo ser agravados chegando a produzir alterações cardiológicas, hepatoesplenomegalia e alterações endócrinas (SANTOS, 2012). A beta talassemia intermédia apresenta quadro brando, e neste caso seus portadores não são dependentes de transfusões sanguíneas (SANTOS, 2012). Na alfa talassemia o portador silencioso geralmente é assintomático, sendo que nos portadores de traço alfa talassemia podem apresentar uma discreta anemia, fraqueza, cansaço, dores nas pernas e palidez (TEIXEIRA, 2006). Na doença de Hb H podem apresentar quadros de uma anemia mais branda a anemias mais graves sendo essas necessárias de transfusões sanguíneas. Neste caso, ainda pode haver complicações como esplenomegalia grave, anemia aguda, presença de úlceras nas pernas, cálculos biliares, alterações ósseas, entre outros (TEIXEIRA, 2006). A síndrome da hidropisia fetal é o tipo mais severo de talassemia, ocasiona o óbito do feto ainda na gestação ou em seguida ao nascer (CANÇADO, 2006) 1.1 Tipos de Talassemia Os tipos de talassemias dependem da cadeia polipeptídica atingida, tendo maiores incidências as do tipo alfa e beta (DOMINGOS; SHIMAUTI; SILVA, 2016).
3 1.1.1 Alfa Talassemia Segundo CANÇADO (2006) a talassemia alfa consiste em um agrupamento de doenças hereditárias, de alcance mundial, gerada pela falta de um ou mais genes das cadeias alfa globínicas. HOFFBRAND; MOSS (2013) Acrescentam que há, normalmente, quatro cópias do gene alfa globina, classificando a magnitude da doença de acordo com a quantidade de gene ausente ou inerte Portador Silencioso Caracteriza-se pela inativação de apenas um gene. Este portador não apresenta sintomas clínicos, com pequenas ou nenhuma alteração laboratorial, o que dificulta diagnóstico (SANTOS, 2012) Traço alfa talassemia Um portador de traço alfa talassemia não apresenta, ou apresenta dois genes alfa globínicos inativados. Em geral esses portadores não terão comprometimento na saúde, além de uma discreta anemia (FABRON JR, 2007) Doença da hemoglobina H FABRON JR (2007) descrevem que na hemoglobina H três genes alfa globínicos estão inexistentes ou inativos, há uma diminuição de globina alfa nos glóbulos vermelhos e demasia de cadeias beta, compondo a hemoglobina de quatro cadeias globina beta, e ausente de cadeia globina alfa, o que leva a formação da hemoglobina H, uma hemoglobina atípica. A hemoglobina H apresenta transporte inadequado de oxigênio, o que o torna inadequado para o glóbulo vermelho, além de ocasionar dano na membrana celular, degradando-os depressa. Caracteriza-se por quadro permanente de anemia e necessita de transfusão habitual de sangue Síndrome de hidropisia fetal Síndrome de hidropsia fetal por hemoglobina de Bart é a forma mais agravada da alfa talassemia, pois a não síntese de cadeia alfa é incompatível com a vida, causando a morte do feto ainda no inicio da gestação (TEIXEIRA, 2006).
4 1.1.6 Betatalassemia Segundo SAKAMOTO et al. (2008) A beta, é o tipo de talassemia mais significante, considerando seu grau de morbilidade e mortalidade, isso se deve ao impacto da anemia hemolítica. Esse tipo de talassemia compreende como um conjunto de modificações hereditárias da hemoglobina variável e leva a redução das cadeias beta globínicas (SANTOS et al., 2013) Talassemia beta menor Caracteriza-se por um único gene modificado. Causa um leve grau de anemia microcítica e hipocrômica, fortalecendo a resistência osmótica das hemácias. Não sendo identificável em exames laboratoriais de rotina. No entanto, utilizando técnicas de síntese de cadeias ou de biologia molecular com sondas de ácido desoxirribonucleico (DNA), fica mais fácil a diferenciação desses heterozigotos (DOMINGOS; SHIMAUTI; SILVA, 2016) Talassemia beta intermediaria Segundo FABRON JR (2007) na beta talassemia intermediaria os dois genes não formam ou formam quantidades insuficientes de cadeias de beta globina. Não necessitam de transfusões sanguíneas regulares, porém apresentam alguns sintomas típicos, dentre eles estão anemias, puberdade tardia, úlceras de perna e artrites inflamatórias, além da possibilidade de mais tarde ocorrer sobrecarga de ferro Talassemia beta maior Na beta talassemia maior, ambos os genes não formam ou formam quantidades insuficientes de cadeias beta globínicas. Nesse caso, pela beta globina não ser elemento da hemoglobina F a criança tem condições de nascer, isso por que o oxigênio da mãe é passado para o feto. Porém a substituição da hemoglobina F pela hemoglobina A (hemoglobina do adulto, composta por duas cadeias globínicas alfa e duas cadeias globínicas beta) não é realizado no paciente com beta talassemia maior, pela falta de produção de cadeias globínicas beta, resultando em anemia rigorosa, necessitando normalmente antes do primeiro ano de vida, frequentes transfusões sanguíneas (FABRON JR, 2007).
5 2 OBJETIVOS O presente trabalho tem como objetivo abordar os exames mais utilizados no diagnóstico laboratorial das talassemias. 3 METODOLOGIA Foi realizado uma revisão da literatura, baseado em artigos científicos e revistas disponíveis nos dados virtuais: Scielo, Portal do Ministério da Saúde, MoreiraJR. Além de informações contidas em livros com temas relacionados aos diagnósticos laboratoriais das hemoglobinopatias. 4 DISCUSSÃO De acordo com o estudo realizado, os exames mais utilizados no diagnóstico laboratorial das talassemias são: hemograma completo, avaliação de ferro sérico e ferritina, análise citomorfológica das hemácias e eletroforese de hemoglobina em ph alcalino feitos para triagem, e como testes de confirmação podemos citar a eletroforese de hemoglobina em ph ácido e estudo molecular (DNA) (TEIXEIRA, 2006). Em pacientes portadores de talassemia maior, o hemograma estará representado por uma contagem de eritrócitos diminuída, assim como o hematócrito e a dosagem de hemoglobina, sendo que essa diminuição será mais acentuada que a de eritrócitos. Em relação aos índices hematimétricos, pode ser observado microcitose (VCM diminuído), hipocromia (HCM diminuído), concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM) também diminuído. Um aumento na contagem de reticulócitos e dosagem de ferro sérico também poderão ser identificados (TEIXEIRA, 2006). Em relação a pacientes portadores de talassemia menor, também apresentarão uma contagem de eritrócitos, hematócrito e dosagem de hemoglobina diminuídos. Seus índices hematimétricos indicam uma pequena microcitose, hipocromia e leve diminuição no CHCM. A dosagem de ferro sérico apresenta-se em quantidades normais (TEIXEIRA, 2006). TEIXEIRA (2006) relata que na análise citomorfológica de pacientes portadores de talassemia beta maior, é possível identificar microcitose e hipocromia aumentadas, células em alvo, esquizócitos, podendo apresentar inclusive, policromatofilia, penteados basófilos, corpúsculos de Howell-jolly e a existência de eritroblastos.
6 Na análise citomorfológica de pacientes portadores de beta talassemia menor, é possível observar uma pequena microcitose, hipocromia, anisocitose e poiquilocitose (TEIXEIRA, 2006). Figura 1. Microscopias de esfregaços de sangue corados com May-Grrunwald-Giemsa. Beta talassemia heterozigótica. (GROTTO, 2010) Já na análise da alfa talassemia, a citologia é identificada da seguinte forma: alfa talassemia mínima apresenta morfologia e eritrograma normais, porém com uma discreta microcitose e hipocromia. Alfa talassemia menor apresenta-se muito parecida com a anemia ferropriva de grau discreto. Observa-se também anisocitose com microcitose e hipocromia e células em alvo. Na alfa talassemia intermédia, identificam-se eritrócitos com precipitados de hemoglobina H (SANTOS, 2012).
7 Figura 2. Precipitados de Hb H no interior de eritrócitos de amostra de sangue com talassemia alfa. A esquerda, canto inferior, um reticulócito (RET) para mostrar a sua diferença em relação aos precipitados de Hb H. (NAOUM, 20??) ROBBINS et al.(2000 apud VARGAS e YAMAGUSHI, 2008) descrevem que na talassemia, os eritrócitos apresentam a característica de microcitose e hipocromia, sendo semelhante na anemia por deficiência de ferro. Portanto é de extrema relevância descartar a hipótese de uma anemia ferropriva pelo fato desta se beneficiar com o tratamento com ferro, enquanto na talassemia pode ser agravada (VIANA-BARACIOLI et al., 2001 apud VARGAS; YAMAGUSHI 2008) As hemoglobinas diferem-se uma das outras devido a aspectos "físico-químicas e mobilidades eletroforéticas distintas" (BRASIL, 2016). 4.1 Eletroforese de hemoglobina em ph alcalino (ph 8,6) Habitualmente efetuada em acetato de celulose "separa as hemoglobinas (Hb) normais Hb A, Hb F e Hb A 2 das variantes mais comuns Hb S e Hb C" (BRASIL,2016). NAOUM (1984 apud VARGAS e YAMAGUSHI, 2008) completam que neste método é possível visualizar bandas de Hb H, sugestivo de alfa talassemia.
8 Figura 3. Eletroforese alcalina em acetato de celulose. As amostras 1 e 2 são normais para hemoglobinas (Hb AA) e a de nº 3 pertence a uma pessoa com talassemia alfa (Hb AH). (NAOUM, 20??) 4.2 Eletroforese em ph ácido Em relação aos testes de confirmação, a eletroforese em ph ácido é utilizada para distinguir "alguns tipos de hemoglobina mais lentos que a Hb A", ou seja, Hb S se desassocia da Hb D e a Hb C da Hb E, que deslocam em pontos semelhantes na eletroforese de hemoglobina em ph alcalino. Neste método, as Hb S e Hb C desmembram-se da Hb A. Essa técnica de separação proporciona inclusive, a identificação semiquantitativa de Hb F" (TEIXEIRA, 2006). Em relação à alfa talassemia, o portador silencioso pode ser diagnosticado através da análise de DNA, pois não apresentam alterações clínicas significativas, ocorrendo desta forma também em pacientes com traços da alfa talassemia (ZAGO; FALCÃO; PASQUINI, 2013). Neste caso, as alterações mais graves ocorrem na doença por Hb H (talassemia intermediária) e na hidropsia fetal por Hb de Bart's (talassemia maior). Na doença por Hb H é identificado de 5 a 30% de hemoglobina H e predomínio de hemoglobina A. Na hidropsia fetal somente há a produção de Hb de Bart's e estão ausentes as Hb A e Hb F, este é o estágio mais agravado da alfa talassemia levando a morte do feto (ZAGO; FALCÃO; PASQUINI, 2013).
9 De acordo com os estudos realizados, na beta talassemia maior há o aumento da Hb F entre 20 a 100%, com valores de Hb A2 variáveis, e na beta talassemia menor o aumento se da na Hb A2, podendo apresentar elevação ou não da Hb F (ZAGO; FALCÃO; PASQUINI, 2013). Figura 4. Eletroforese em gek Calm, em ph acido, utilizado para caracterização de HbS. 1.HbAA; 2.HbAS; 3.HbAC; 4.HbSC; 5.HbSS; 6.HbAD; 7.HbS/beta mais talassemia; 8. HbA Lepore. (ZAMARO, 2002) 4.3 Biologia Molecular (PCR) O ultimo estagio é a técnica de biologia molecular, executada através da reação em cadeia da polimerase (PCR). A reação em cadeia da polimerase consiste em "amplificar milhões de vezes um fragmento específico de DNA" (BRASIL, 2016). Este método se caracteriza na replicação de DNA, através de uma ação enzimática "por meio de iniciadores ( primers") com cerca de 20 nucleotídeos de orientação oposta", com seguimentos " complementares as duas extremidades do fragmento" que deseja-se estudar (NAOUM, [20??]). A PCR é executada em três estágios, sendo que o primeiro consiste na separação das fitas de DNA em temperatura de 94 C ; após isso, é realizada a ligação complementar entre os iniciadores e o DNA, em temperatura de 40 C a 60 C, ocasionando a produção de "pequenos fragmentos de fita", formando "duas fitas duplas do DNA idênticas a original" (NAOUM, [20??]). Segundo RAVEL (1995, apud VARGAS e YAMAGUSHI, 2008) esta metodologia é altamente eficaz e identifica a "alteração em nível de cromossomo", sendo que a alteração da beta talassemia ocorre no cromossomo 11 e a da alfa talassemia no cromossomo 16. A pesquisa de DNA é conveniente quando não houver confirmação de doenças na hemoglobina pelos métodos específicos (BRASIL, 2016).
10 De acordo com a revisão bibliográfica realizada, há também outros exames laboratoriais utilizados para diagnóstico das talassemias, porém podendo apresentar interferentes para alguns tipos desta patologia, sendo eles: 4.4 Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC), Método apontado como preferível na quantificação das Hb A2, Hb A e Hb F (BRASIL, 2016). Porém, a HPLC pode não apresentar-se satisfatória devido a interferentes que impossibilitam a veracidade dos resultados obtidos, como por exemplo, em pacientes com beta talassemia menor, que habitualmente apresentam aumento na Hb A2, caso esteja associado a uma anemia por deficiência de ferro, pode ter sua concentração de Hb A2 com valores normais, pois a deficiência de ferro altera a síntese desta fração da hemoglobina fazendo com que sua concentração diminua (NAOUM, [20??]). 4.5 Focalização Isoelétrica RAVEL (1995, apud VARGAS e YAMAGUSHI, 2008) relatam que a Focalização Isoelétrica possibilita separar de forma adequada as mais importantes hemoglobinas anormais. Com esta técnica é possível identificar a presença de Hb S, Hb D, Hb C e Hb E que "podem confundir o diagnóstico de talassemia". Este método é considerado mais complicado e necessita de um tempo maior (BRASIL, 2016). 5 CONCLUSÃO As talassemias são alterações de fator genético, resultante da falta ou redução na síntese de cadeias globínicas que compõem a hemoglobina. Existem alguns tipos de talassemia de acordo com a cadeia globínica atingida, as mais comuns são do tipo Alfa e Beta. Para o diagnóstico laboratorial dessa hemoglobinopatia, geralmente são utilizados como triagem o hemograma com análise citomorfológica das hemácias, dosagem de ferro sérico e ferritina. A partir destes resultados inicia-se a investigação com métodos confirmatórios, por meio da eletroforese de hemoglobina e estudo molecular através da técnica de PCR, sendo estes os métodos mais utilizados e viáveis. Essa patologia engloba uma das doenças da hemoglobina de maior incidência populacional, porém é bastante confundida com anemia ferropriva, e o tratamento destas patologias são diferentes. Portanto o diagnóstico precoce da talassemia é essencial para definir um tratamento correto e consequentemente o bem estar do paciente talassêmico.
11 REFERÊNCIAS BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Atenção à Saúde. Departamento de Atenção Especializada e Temática. Orientações para diagnóstico e tratamento das Talassemias Beta / Ministério da Saúde, Secretaria de Atenção à Saúde, Departamento de Atenção Especializada e Temática. 1. ed., atual. Brasília: Ministério da Saúde, 2016, p Disponível em: < Acesso em: 02 nov CANÇADO, R. D. Talassemias alfa. São José do Rio Preto, MAIO Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia. Disponível em: < Acesso em: 19 abril DOMINGOS, C. R. B; SHIMAUTI, E. L. T; SILVA, D. B. 2016, p. 14. Orientação para o diagnóstico e tratamento das talassemia beta. Brasília, Disponível em: < Acesso em: 19 abril FABRON JR, A. Talassemias. Jun Disponível em: < Acesso em: 07 abril GROTTO, H. Z. W. Diagnóstico laboratorial da deficiência de ferro. Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia, São Paulo, v. 32, n. 2, Disponível em: < Acesso em: 08 dez HOFFBRAND, A. V; MOSS, P. A. H. Fundamentos em hematologia. Porto Alegre: Artmed, p. NAOUM, P. C. Anemias imigrantes, origem das anemias hereditárias no Brasil. Ciência Hoje, v. 3, set./out apud VARGAS, S. P.; YAMAGUSHI, M. U. Diagnóstico laboratorial para talassemias. Revista Saúde e Pesquisa, v. 1, n. 1, p , jan-abr Disponível em: < Acesso em: 07 out NAOUM, P. C. Hemoglobinopatias. Academia de Ciência e Tecnologia de São Jose do Rio Preto. Analise Laboratorial para o diagnóstico das hemoglobinopatias. São Jose do Rio Preto, [20??]. Disponível em: < Acesso em: 13 nov RAVEL, R. Laboratório clínico: aplicações clínicas dos dados laboratoriais. 6. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1995 apud VARGAS, S. P.; YAMAGUSHI, M. U. Diagnóstico laboratorial para talassemias. Revista Saúde e Pesquisa, v. 1, n. 1, p , jan-abr Disponível em: < Acesso em: 07 out
12 ROBBINS, S. L. et al. Doença dos eritrócitos e distúrbios hemorrágicos. In: PATOLOGIA estrutural e funcional. 6. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, p apud VARGAS, S. P.; YAMAGUSHI, M. U. Diagnóstico laboratorial para talassemias. Revista Saúde e Pesquisa, v. 1, n. 1, p , jan-abr Disponível em: < Acesso em: 07 out SAKAMOTO, T. M.; PERUZZO, G. M; IVO, M. L.; BRUM, M. A. R; DOMINGOS, C. R. B; Talassemia ß intermediária em gestante. Revista Brasileira Hematologia e Hemoterapia. Campo grande, v. 30, n. 6, maio Disponível em: < Acesso em: 22 abril SANTOS, P. C. J. L. Hematologia-Métodos e Interpretação: Série Análises Clínicas e Toxicológicas. São Paulo: Roca, p. TEIXEIRA, J. E. C. Diagnóstico Laboratorial em Hematologia. São Paulo: Roca, p. VIANA B. L.: BONINI D. C. R.; PAGLIUSI, R. A. & NAOUM, P. C. Prevenção de hemoglobinopatias a partir do estudo em gestantes. Rev. Bras. Hematol. Hemoter., v. 23, p , 2001 apud VARGAS, S. P.; YAMAGUSHI, M. U. Diagnóstico laboratorial para talassemias. Revista Saúde e Pesquisa, v. 1, n. 1, p , jan-abr Disponível em: < Acesso em: 07 out ZAGO, M. A.; FALCÃO, R. P.; PASQUINI, R. Tratado de Hematologia. Editora: Atheneu, São Paulo, p. ZAMARO, P. J. A.; CANALLI, A. A.; JUNIOR, W. A. da S.; DOMINGOS, C. R. B. Diagnóstico laboratorial de hemoglobinas semelhantes à HbS. Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial, Rio de janeiro, v. 38, n. 4, p. 1-6, jun./abr Disponível em: < Acesso em: 08 dez
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