HOLOTYPE HLA 24/11 CONFIGURAÇÃO A1 E CE/A2

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1 HOLOTYPE HLA 24/11 CONFIGURAÇÃO A1 E CE/A2 E CE/A3 E CE/A4 E CE INSTRUÇÕES DE UTILIZAÇÃO VERSÃO Para utilização em diagnóstico in vitro 0086 Prepara ADN para análise de sequenciação no Illumina MiSeq

2 Índice INFORMAÇÕES DO FABRICANTE... 7 LEGENDA DOS SÍMBOLOS... 7 CONTEÚDO DO KIT HOLOTYPE HLA-24/11 CONFIGURAÇÃO A1 E CE/A2 E CE/A3 E CE/A4 E CE... 8 CAIXA DE COMPONENTE INICIADOR... 8 CAIXA DE COMPONENTE DE REAGENTES DE PREPARAÇÃO DE BIBLIOTECA... 9 PLACA ADAPTADORA DE 96 POÇOS... 9 LIVRO DO EXCEL... 9 SOFTWARE OMIXON HLA TWIN EXPEDIÇÃO E ARMAZENAMENTO AVISOS E PRECAUÇÕES LIMITAÇÕES CONHECIDAS DO PRODUTO INFORMAÇÕES DE SEGURANÇA PARÂMETROS DE DESEMPENHO ASSISTÊNCIA TÉCNICA Suporte por telefone: EQUIPAMENTO, REAGENTES E CONSUMÍVEIS RECOMENDAÇÕES TÉCNICAS E SOBRE O EQUIPAMENTO RECOMENDAÇÕES RELATIVAS A REAGENTES ASSOCIADOS Capacidade do kit de reagente MiSeq CONSUMÍVEIS RECOMENDADOS AVISO LEGAL UTILIZAÇÃO PREVISTA NOTA IMPORTANTE ANTES DE COMEÇAR ISOLAMENTO DE ADN GENÓMICO RECOMENDADO PRINCÍPIO DO MÉTODO RESUMO DE PASSOS GLOSSÁRIO/DEFINIÇÕES PASSO 1 PREPARAÇÃO DA MISTURA PRINCIPAL DE AMPLIFICAÇÃO DE HLA LISTA DE REAGENTES PROTOCOLO Mistura principal: HLA-A, B, C, DRB1/DRB3, DRB5, DPA1, DPB1 e DQA Mistura principal: HLA-DRB Mistura principal: HLA-DQB1 Conjunto PASSO 2 AMPLIFICAÇÃO HLA CLASSES I E II LISTA DE REAGENTES PROTOCOLO Mistura principal carregada de Taq polimerase: HLA-A, B, C, DRB1/DRB3, DRB4, DRB5, DPA1, DPB1 e DQA Mistura principal carregada de Taq polimerase: HLA-DQB1 Conjunto Página 2 49

3 Amplificação classe I (HLA-A, B e C) Amplificação classe II (HLA-DRB1/DRB3, DRB4, DRB5, DPA1, DPB1, DQA1 e DQB1) Tamanhos previstos de amplicon PASSO 3 QUANTIFICAÇÃO E NORMALIZAÇÃO DE AMPLICON (UTILIZANDO UM FLUORÓMETRO DE PLACAS) LISTA DE REAGENTES PROTOCOLO Agrupamento de amplicon Purificação PCR de ExoSAP-iT Express PASSO 4 PREPARAÇÃO DA BIBLIOTECA LISTA DE REAGENTES PROTOCOLO Mistura principal de fragmentação Programa de fragmentação Mistura principal de reparação final Programa de reparação final Mistura principal de ligação Programa de ligação Purificação de biblioteca e agrupamento PASSO 5 SELEÇÃO DO TAMANHO DA BIBLIOTECA LISTA DE REAGENTES PROTOCOLO PASSO 6 QUANTIFICAÇÃO DE BIBLIOTECA ATRAVÉS DE UM INSTRUMENTO QPCR LISTA DE REAGENTES PROTOCOLO Mistura de iniciador qpcr Mistura principal qpcr PASSO 7 SEQUENCIAÇÃO NO ILLUMINA MISEQ LISTA DE REAGENTES Capacidade do kit de reagente MiSeq PROTOCOLO PASSO 8 ANÁLISE DE DADOS DE SEQUENCIAÇÃO HLA PROTOCOLO AUTOMATIZADO Instalação e configuração de TI Protocolo por análise PROTOCOLO DE SERVIDOR MANUAL Instalação e configuração de TI Protocolo por análise PROTOCOLO DE AMBIENTE DE TRABALHO MANUAL Instalação e configuração de TI Protocolo por análise VALORES COMPLEMENTARES EXEMPLO DE PLACA PARA PLACA DE AMPLICON, PLACA DE AMPLIFICAÇÃO, PLACA DE DILUIÇÃO, PLACA DE QUANTIFICAÇÃO DE AMPLICON (PARA UM LÓCUS INDIVIDUAL) E PLACA DE REAÇÃO EXEMPLO DE PLACA DE QUANTIFICAÇÃO DE PADRÕES EXEMPLO DE PLACA QPCR DE QUANTIFICAÇÃO DE BIBLIOTECA KAPA Página 3 49

4 ANEXO 1: PIPPIN PREP PROGRAMAR O PIPPIN PREP EXECUTAR O PIPPIN PREP ANEXO 2: QUANTIFICAÇÃO DE AMPLICON UTILIZANDO UM INSTRUMENTO QPCR LISTA DE REAGENTES PROTOCOLO ANEXO 3: QUANTIFICAÇÃO DE BIBLIOTECA, UTILIZANDO UM CORANTE FLUORESCENTE DSADN INTERCALAR LISTA DE REAGENTES PROTOCOLO Página 4 49

5 Histórico do documento Notas e atualizações importantes Versão Data Autor Resumo de alterações Autorizado por Data de emissão V Tünde Vágó Primeira versão Efi Melista 02/05/2018 Página 5 49

6 Isenção de responsabilidade A Omixon envidou todos os esforços para garantir que estas Instruções de utilização (IFU) sejam exatas. A Omixon não se responsabiliza por quaisquer imprecisões ou omissões que possam ter ocorrido. As informações contidas nestas instruções de utilização estão sujeitas a alterações, sem aviso prévio. A Omixon não assume nenhuma responsabilidade por quaisquer imprecisões que possam existir nestas instruções de utilização. A Omixon reserva-se o direito de efetuar melhorias nestas instruções de utilização e/ou aos produtos nelas descritos, a qualquer momento, sem aviso prévio. Caso encontre informações incorretas, inexatas ou incompletas neste manual, agradecemos que nos envie os seus comentários e sugestões para o endereço: support@omixon.com. Página 6 49

7 Informações do fabricante Nome da empresa: Omixon Biocomputing Ltd Endereço para visitantes: Fehérvári út 50-52/6 Cidade: Budapeste Código postal: H-1117 País: Hungria Legenda dos símbolos LOTE/número de carregamento Referência/número de catálogo Consultar as instruções de utilização Contém reagente para número N de teste Fabricante legal. A data associada a este símbolo refere-se à data de fabrico Temperatura de armazenamento recomendada Data de validade Dispositivo médico de diagnóstico in vitro Componente de substituição Contém componente de substituição Página 7 49

8 Conteúdo do kit Holotype HLA-24/11 Configuração A1 e CE/A2 e CE/A3 e CE/A4 e CE Esta secção descreve o conteúdo das várias configurações do produto Holotype HLA 24/11 disponíveis: Tipo de produto REF # Rxns Holotype HLA 24/11 H52 24 Configuração A1 e CE Holotype HLA 24/11 H56 24 Configuração A2 e CE Holotype HLA 24/11 H59 24 Configuração A3 e CE Holotype HLA 24/11 Configuração A4 e CE H53 24 Tenha em atenção que a caixa Componente iniciador e a caixa Componente de reagentes de preparação de biblioteca são idênticas em todas as configurações do produto. O componente da placa adaptadora indexada de 96 poços é diferente no nível de sequência do índice, em cada configuração. Para obter mais informações, consulte abaixo a secção sobre a placa adaptadora indexada de 96 poços. Caixa de componente iniciador A caixa de componente iniciador fornece soluções de iniciador específicas, prontas a utilizar, para amplificação PCR de longo alcance direcionada de genes HLA A, B, C, DPA1, DPB1, DQA1, DQB1, DRB1, DRB3, DRB4 e DRB5. Adicionalmente, também contém dois tipos de aditivos PCR (Intensificador 1 e Intensificador 2). Mistura de iniciador REF # Rxns Vol/tubo # Tubos Código de cor HLA-A P µl 1 Amarelo HLA-B P µl 1 Vermelho HLA-C P µl 1 Cor de laranja HLA-DRB1/DRB3 P µl 1 Verde HLA-DRB4 P µl 1 Branco HLA-DRB5 P µl 1 Cor-de-rosa HLA-DPA1 P µl 1 Preto HLA-DPB1 P µl 1 Roxo HLA-DQA1 P µl 1 Castanho HLA-DQB1 (Conjunto 3) P µl 1 Azul Intensificador 1 E µl 1 Transparente Intensificador 2 E µl 1 Transparente Página 8 49

9 Caixa de componente de reagentes de preparação de biblioteca A caixa de componente de preparação de biblioteca fornece reagentes para a preparação da biblioteca (fragmentação, extremidade romba e adenilato das extremidades dos amplicons, ligando-lhes sequências adaptadoras indexadas) dos amplicons HLA. Reagente REF # Rxns Vol/tubo # Tubos Código de cor Enzima de fragmentação (A) R µl 1 Amarelo Tampão de fragmentação (B) R µl 1 Vermelho Enzima de reparação de R µl 1 Verde extremidade (C) Tampão de reparação de R µl 1 Cor de laranja extremidade (D) Enzima de ligação (E) R µl 1 Azul Tampão de ligação (F) R µl 2 Preto Placa adaptadora de 96 poços O componente de placa adaptadora indexada de 96 poços contém adaptadores NGS indexados (oligonucleótidos de ADN de cadeia dupla) em solução de 5 µl, prontos a utilizar, para gerar bibliotecas de NGS individuais. A placa adaptadora indexada de 96 poços contém um tipo suficiente de adaptadores indexados para geração de 24 bibliotecas NGS individuais e para identificação de amostras a jusante. Tipo de produto Reagente associado REF # Rxns Vol/poço # Placas Holotype HLA 24/11 Placa adaptadora A1 (i1-24) N µl 1 Configuração A1 e CE (REF:H52) Holotype HLA 24/11 Placa adaptadora A2 (i25-48) N µl 1 Configuração A2 e CE (REF:H56) Holotype HLA 24/11 Placa adaptadora A3 (i49-72) N µl 1 Configuração A3 e CE (REF:H59) Holotype HLA 24/11 Configuração A4 e CE (REF:H53) Placa adaptadora A4 (i73-96) N µl 1 Livro do Excel É fornecido um livro do Excel para apoio do protocolo Holotype HLA 24/11 com cálculos, esquemas de placas, manutenção de registos, geração de ficha de amostras MiSeq e muito mais. Caso não possua uma cópia, contacte support@omixon.com. Página 9 49

10 Software Omixon HLA Twin Contacte para obtenção de créditos Omixon HLA Twin associados à sua compra do kit Holotype HLA 24/11. Nota importante: Utilizar os três componentes do kit Omixon Holotype HLA 24/11 e o software Omixon HLA Twin no mesmo fluxo de trabalho para constituir um fluxo de trabalho para utilização em diagnóstico in vitro. Consulte a secção de Avisos e precauções para limitações de utilização do produto. Os componentes de substituição encontram-se disponíveis mediante pedido específico do utilizador. Tenha em atenção que a Omixon substitui caixas de componentes e não frascos individuais. Contactar sales@omixon.com para obter mais informações. Expedição e armazenamento Enviado em pacotes de gelo seco na caixa de transporte de poliestireno extrudido e deve ser armazenado a -20 C após chegar ao destino. Valide o seu controlo de temperatura e processo de monitorização dos seus congeladores, procedendo regularmente à manutenção necessária. Os kits não abertos mantêm-se estáveis até à data de validade do kit (indicada na etiqueta do kit), se armazenados a -20 C. Após a abertura do produto, recomenda-se um máximo de quatro (4) ciclos de congelamento/ descongelamento, para garantir a estabilidade do produto. Os kits abertos mantêm-se estáveis até 3 meses, quando armazenados a -20 C. Avisos e precauções Limitações de utilização do produto Para obter o melhor desempenho, utilize o fluxo de trabalho do kit Holotype HLA 24/11 e o software Omixon HLA Twin para a tipificação HLA por NGS com os materiais, reagentes e equipamentos recomendados na secção Equipamentos e reagentes. A utilização de materiais diferentes dos especificados na secção Equipamentos e reagentes deve ser confirmada e validada pelo utilizador. Não reconstituir nem diluir os reagentes em volumes diferentes dos descritos nestas instruções de utilização. Não utilizar um volume dos reagentes inferior ao especificado nestas instruções de utilização. Estas ações podem provocar erros de desempenho. A Omixon não pode fornecer suporte técnico para nenhuns problemas resultantes do não cumprimento dos passos do protocolo descritos nestas instruções de utilização. Não utilizar o produto em caso de danos detetáveis nos componentes (frascos quebrados, placa, tampas soltas, etc.). Página 10 49

11 Limitações conhecidas do produto Consultar o documento Product Known Limitations Guide (Guia de limitações conhecidas do produto), relativamente a ambiguidades conhecidas e limitações de software conhecidas do produto Holotype HLA. O Guia é distribuído com as instruções de utilização, mas também pode ser encontrado no Web site da Omixon em MyHolotype/Support and Services/HLA Twin Instructions for Use, ou pode ser solicitado mediante pedido para support@omixon.com. Informações de segurança Antes de começar, leia as secções Informações de segurança e Notas importantes relativas a todos os reagentes ou kits especificados na secção Equipamento, reagentes e consumíveis. Ao trabalhar com produtos químicos, usar sempre bata de laboratório adequada, luvas descartáveis e óculos de proteção. Para obter mais informações, consulte as Fichas de dados de segurança (FDS) adequadas, disponíveis no fornecedor do produto respetivo. Pode encontrar-se uma descrição geral dos componentes químicos dos reagentes do produto nas FDS do kit Holotype HLA 24/11, estando disponíveis mediante pedido. Eliminar os componentes do produto como lixo médico geral. Parâmetros de desempenho Parâmetros de desempenho principais, determinados em conformidade com a validação do produto. HLA-A HLA-B HLA-DRB1 HLA-C HLA-DPB1 HLA-DQA1 HLA-DQB1 Sensibilidade 99,054% 99,171% 98,335% 96,310% 98,818% 98,927% 95,724% Especificidade 99,966% 99,982% 99,956% 99,863% 99,946% 99,881% 99,775% Precisão 99,054% 99,171% 98,335% 96,310% 98,818% 98,927% 95,724% Exatidão 99,935% 99,965% 99,915% 99,736% 99,897% 99,785% 99,572% Reprodutibilidade 100,00% 100,00% 99,28% 100,00% 99,28% 100,00% 99,28% Repetibilidade 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% Assistência técnica Para obter assistência geral relativa a este protocolo, contactar support@omixon.com Suporte por telefone: Estados Unidos +1 (617) Europa Resto do mundo +1 (617) Página 11 49

12 Equipamento, reagentes e consumíveis Recomendações técnicas e sobre o equipamento Termociclador com formato de 96 poços Fluorómetro de placas (ou qualquer instrumento capaz de deteção de fluorescência em formato de placa de 96 poços, para utilização com o sistema QuantiFluor dsadn da Promega) Pippin Prep (n.º cat. PIP0001) ou Blue Pippin (n.º cat. BLU0001) da SAGE Science Instrumento qpcr com formato de placa de 96 ou 384 poços Fluorómetro Qubit (n.º cat. Q33216, Thermo Fisher Scientific) (opcional) Illumina MiSeq (n.º cat. SY ) Computador de 64 bits, no mínimo, 4 core e com 16 GB de RAM Armazenamento de dados a longo prazo (aproximadamente 2 TB de dados por MiSeq por ano) Recomendações relativas a reagentes associados Kits LongRange PCR da Qiagen (n.º cat , ou ) Cada amostra necessita de 4,4 µl de Taq polimerase N.º cat Kit LongRange PCR (20) contém 8 µl de Taq polimerase N.º cat Kit LongRange PCR (100) contém 40 µl de Taq polimerase N.º cat Kit LongRange PCR (250) contém 100 µl de Taq polimerase ExoSAP-IT da Affymetrix (n.º cat , ML, X-1ML ou ML) Cada amostra composta necessita de 4 µl de enzima ExoSAP-IT N.º cat contém 200 µl de enzima ExoSAP-IT Express N.º cat ML contém 1 ml de enzima ExoSAP-IT Express N.º cat X-1ML contém 4 ml de enzima ExoSAP-IT Express N.º cat ML contém 10 ml de enzima ExoSAP-IT Express Kit de quantificação de biblioteca Illumina/Universal da KAPA Biosystems (n.º cat. KK4824) Kit de exame Qubit dsadn BR (n.º cat. Q32850 ou Q32853) (opcional) N.º cat. Q32850 contém 100 exames N.º cat. Q32853 contém 500 exames Sistema QuantiFluor dsadn da Promega (n. cat. E2670) Grânulos Agencourt AMPure XP da Beckman Coulter (n.º cat. A63880, A63881 ou A63882) Cada execução do Holotype HLA necessita de um máximo de 900 µl de grânulos AMpure XP N.º cat. A63880 contém 5 ml de grânulos AMPure XP N.º cat. A63881 contém 60 ml de grânulos AMPure XP N.º cat. A63882 contém 450 ml de grânulos AMPure XP Cassete de gel, 1,5% de agarose, sem corantes com padrão interno (marcador K/R2), para o Pippin Prep/Blue Pippin (n.º cat. CDF1510 para Pippin Prep e BDF1510 para Blue Pippin) Etanol de grau molecular (álcool anidro) Água de grau molecular (sem DNase nem RNase) Hidróxido de sódio 1 tampão TE (ph 8,0) Kit de reagente MiSeq da Illumina Página 12 49

13 Capacidade do kit de reagente MiSeq Kit de reagente Illumina MiSeq Ciclo 500 Std (MS ) Ciclo 300 Std (MS ) Micro ciclo 300 (MS ) Nano ciclo 500 (MS ) Nano ciclo 300 (MS ) Período de tempo Horas Amostras 24/11 ~39 24 ~24 24 ~19 20 ~28 8 ~17 4 Consumíveis recomendados Tubos de microcentrifugação 1,5 ml Tubos de microcentrifugação 1,5 ml de baixa ligação Tubos de microcentrifugação 2,0 ml de baixa ligação (recomendado Eppendorf DNA LoBind n.º cat ) Tubos de parede fina de 0,5 ml para instrumento Qubit (recomendado tubos de exame Qubit n.º cat. Q32856) Pipetas de volume ajustável (capacidade de 1, µl) Pipetas de volume ajustável de 8 canais (capacidade de 1,0 100 µl) Placas de 96 poços compatíveis com o termociclador Placas óticas de 96 poços compatíveis com o fluorómetro de placas Placas de 96 poços compatíveis com o instrumento qpcr Vedantes de placa para utilização geral Vedantes de placas compatíveis com os termocicladores (testados para PCR de longo alcance) Vedantes de placas óticas compatíveis com o instrumento qpcr (opcional) Suporte magnético compatível com tubos de microcentrifugação de 2 ml Suporte refrigerador de 96 poços (2 peças) Tubos cónicos de 50 ml Reservatórios de 50 ml Página 13 49

14 Aviso Legal As instruções de utilização do Holotype HLA 24/11 e todos os conteúdos são propriedade da Omixon Biocomputing Limited ( Omixon ), e destinam-se exclusivamente à utilização contratual pelo respetivo cliente, relativamente ao(s) produto(s) descrito(s) e para nenhum outro fim. Este documento e o respetivo conteúdo não devem ser utilizados nem distribuídos para qualquer outra finalidade e/ou comunicados, divulgados ou reproduzidos de qualquer forma, sem consentimento prévio por escrito da Omixon. A Omixon não concede nenhuma licença sob os seus direitos de patentes, marcas comerciais, direitos de autor ou direitos comuns, nem direitos semelhantes de quaisquer terceiros através deste documento. O Omixon HLA Twin ( software ) é licenciado para o cliente sob os termos e condições do EULA do Omixon HLA Twin ( Caso não concorde com os respetivos termos e condições, a Omixon não licencia o Software para si, não devendo o utilizador usar nem instalar o Software. As instruções incluídas neste documento devem ser rigorosa e explicitamente seguidas por pessoal qualificado e devidamente formado, a fim de assegurar a utilização correta e segura do(s) produto(s) aqui descrito(s). Antes de utilizar tais produtos, todo o conteúdo deste documento deve ser lido e compreendido integralmente. A FALHA NA LEITURA COMPLETA E NO SEGUIMENTO EXPLÍCITO DE TODAS AS INSTRUÇÕES INCLUÍDAS NESTE DOCUMENTO PODE RESULTAR EM DANOS PARA O(S) PRODUTO(S), FERIMENTOS PARA PESSOAS, INCLUINDO PARA OS UTILIZADORES OU TERCEIROS, BEM COMO DANOS A PROPRIEDADES DE TERCEIROS. A OMIXON NÃO ASSUME QUALQUER RESPONSABILIDADE DECORRENTE DE UTILIZAÇÃO INADEQUADA DO(S) PRODUTO(S) DESCRITO(S) (INCLUINDO PEÇAS OU SOFTWARE) OU QUALQUER UTILIZAÇÃO DESTE(S) PRODUTO(S) FORA DO ÂMBITO DAS LICENÇAS OU PERMISSÕES EXPRESSAS POR ESCRITO CONCEDIDAS PELA OMIXON, ASSOCIADAS À AQUISIÇÃO DESTE(S) PRODUTO(S) PELO CLIENTE. PARA UTILIZAÇÃO EM DIAGNÓSTICO IN VITRO 2017 Omixon Biocomputing Ltd. Todos os direitos reservados. Utilização prevista O produto Holotype HLA 24/11 Configuração A1 e CE /A2 e CE /A3 e CE/ A4 e CE (designado por Holotype HLA ) é uma combinação de reagentes de exame de diagnóstico in vitro com software de análise de dados (Omixon HLA Twin ), concebido para a identificação e definição de antígenos leucocitários humanos (HLA) de classe I e II, destinando-se a utilização na tipificação HLA, através da utilização da plataforma dados de sequenciação de nova geração Illumina MiSeq. O Holotype HLA disponibiliza informação de histocompatibilidade humana de loci HLA Classe I (A, B e C) e Classe II (DPA1, DPB1, DQA1, DQB1, DRB1, DRB3, DRB4 e DRB5), através de ADN genómico humano. Página 14 49

15 O software Omixon HLA Twin incluído no produto Holotype HLA está concebido para interpretar e fazer corresponder dados de sequenciação gerados no sistema Illumina MiSeq, resultando em tipificação HLA de nível de alelo de passagem única, de alta precisão, com taxa de ambiguidade muito baixa no nível de campo 2. O produto Holotype HLA está concebido para utilização em diagnóstico in vitro por pessoal profissional de cuidados de saúde como, por exemplo, laboratórios técnicos e médicos, que tenham tido formação em tipificação HLA em laboratórios de diagnóstico com acreditação EFI ou ASHI ou laboratórios com competência para trabalhar em conformidade com as especificações EFI ou ASHI. Nota importante antes de começar Isolamento de ADN genómico recomendado O ADN genómico humano deve ser preparado em kits de preparação de ADN comercialmente disponíveis e bem testados, para garantir a consistência da preparação. Independentemente da abordagem, é necessária a determinação exata de concentração e pureza para um desempenho robusto do exame. O ADN deve estar isento de contaminantes que possam afetar passos posteriores de amplificação, preparação da biblioteca e sequenciação (por exemplo, álcool, sais, detergentes, formaldeído e heparina). O sangue não deve ser colhido em tubos heparinizados, não devendo ser utilizadas amostras de sangue de pacientes submetidos a terapia com heparina, nem amostras lipémicas ou hemolisadas. O ADN genómico preparado pode ser utilizado de imediato se preparado em água sem nuclease, ou armazenado durante períodos longos a -20 C ou menos. Recomendamos a utilização de água para preparação de gadn, pois o EDTA no tampão TE pode inibir reações de PCR de longo alcance. Deve ser evitado o descongelamento repetido de congelados, para reduzir a degradação. É altamente recomendada uma concentração de ng/µl de ADN para fornecer ng de entrada de ADN genómico por amplificação PCR. É extremamente recomendável utilizar um método de quantificação baseado em fluorescência para determinar a concentração de gadn. A relação de absorvência de 260 nm/280 nm e 260 nm/230 nm valores de 1,7 2 é altamente recomendada. Para a amplificação de HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1/DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1 e HLA-DQB1, é necessário 1,0-1,5 µg de gadn para cada amostra. Princípio do método Durante muitos anos, a comunidade HLA tem trabalhado para a obtenção de um método que identificará com precisão o extenso polimorfismo dos genes HLA e dos respetivos produtos génicos. O advento do PCR, combinado com outras tecnologias (sequenciação Sanger, SSOP, SSP, Página 15 49

16 Luminex), forneceu uma fórmula para melhorar significativamente a deteção de polimorfismos HLA, porém com várias limitações que continuam a inibir nossa capacidade de caracterizar os genes HLA, de forma abrangente. As tecnologias desenvolvidas ao longo dos últimos anos, cumulativamente designadas por dados de sequenciação de nova geração (NGS, Next Generation Sequencing), proporcionaram novas oportunidades que permitem a completa caracterização dos genes HLA de maneira haplóide. A NGS possui duas características distintas: 1) sequenciação clonal de fragmentos de ADN e 2) capacidade de produção tremendamente alta. A NGS proporciona a capacidade de fasear polimorfismos, eliminando assim todas as ambiguidades, e fornece tipificação HLA no nível de campo de três a quatro, sem testes reflexivos, introduzindo assim uma solução potencialmente completa para o problema de tipificação HLA. O protocolo aqui descrito tira partido desta tecnologia e combina a amplificação por PCR de longo alcance dos genes HLA com a sequenciação na plataforma Illumina MiSeq. Mais especificamente, os genes HLA A, B, C, DPA1, DQA1 e DQB1 são amplificados em todo o seu comprimento de codificação, incluindo elementos das regiões 5 e 3 não convertidas, enquanto DRB1, DRB3 e DRB4 são amplificados do intrão 1 ao intrão 4 e DRB5 e DPB1 são amplificados a partir do intrão 1 para a região 3 não convertida. Os amplicons são então processados através de uma série de passos que: 1. Fragmentam os amplicons para um tamanho adequado para sequenciação na plataforma Illumina, 2. Fazem uso de extremidades planas e com adenilato na extremidades dos amplicons fragmentados 3. Sequências adaptadoras de ligação que são utilizadas em todo o processo no MiSeq para captar, amplificar e sequenciar o ADN. Os adaptadores também incluem um índice que é uma sequência curta, exclusiva para cada adaptador, que identifica as origens da biblioteca (amostra/lócus). Depois de agrupar as bibliotecas indexadas, selecionar o tamanho e quantificação, a amostra é carregada no MiSeq para sequenciação. O processo completo demora 3 a 5 dias, dependendo da seleção da célula de fluxo na plataforma Illumina. O resumo dos passos do protocolo é apresentado na figura abaixo: Página 16 49

17 Resumo de passos PREPARAÇÃO DE GADN PREPARAÇÃO DE MISTURA PRINCIPAL HLA CLASSE I E CLASSE II AMPLIFICAÇÃO PERÍODO DE PRÁTICA: 0 H 45, DURAÇÃO TOTAL: 0 H 45 PERÍODO DE PRÁTICA: 0 H 50, DURAÇÃO TOTAL: 6 H 50 QUANTIFICAÇÃO E NORMALIZAÇÃO DE AMPLICON PREPARAÇÃO DE BIBLIOTECA PERÍODO DE PRÁTICA: 0 H 40, DURAÇÃO TOTAL: 0 H 40 PERÍODO DE PRÁTICA: 0 H 55, DURAÇÃO TOTAL: 3 H SELEÇÃO DE TAMANHO DE BIBLIOTECA QUANTIFICAÇÃO DA BIBLIOTECA PERÍODO DE PRÁTICA: 0 H 15, DURAÇÃO TOTAL: 1 H PERÍODO DE PRÁTICA: 0 H 15, DURAÇÃO TOTAL: 1 H 15 SEQUENCIAÇÃO ATIVADA MISEQ ILLUMINA ANÁLISE DE HLA DADOS DE SEQUENCIAÇÃO PERÍODO DE PRÁTICA: 0 H 20, DURAÇÃO TOTAL: 23 H PERÍODO DE PRÁTICA: 0 H 0, DURAÇÃO TOTAL: 6 H Página 17 49

18 Glossário/Definições Placa amplicon nome alternativo para placa de amplificação Placa de quantificação de amplicon placa de 96 poços compatível com o fluorómetro de placas, no qual os amplicons diluídos são quantificados Placa de amplificação placa de 96 poços PCR utilizada para amplificar os loci HLA Biblioteca final biblioteca que inclui todas as bibliotecas de amostras prontas para serem sequenciadas numa execução única de MiSeq Placa de reação placa onde são realizadas as reações sequenciais que fragmentam, terminam a reparação e ligam os adaptadores indexados às bibliotecas de amostras Placa de reagente placa utilizada para alíquotas de vários reagentes, utilizados para preparação das bibliotecas Biblioteca de amostras uma biblioteca preparada para combinar (agrupar) todos os loci HLA para uma determinada amostra Placa de amplicons agrupados placa que inclui uma biblioteca de amostras (todos os loci combinados) por poço Placa de quantificação de padrões placa de 96 poços compatível com o fluorómetro de placas, no qual os padrões de ADN são colocados para permitir a quantificação de amplicon Página 18 49

19 Passo 1 Preparação da mistura principal de amplificação de HLA Duração: ~45 minutos O objetivo deste passo é preparar as misturas principais específicas de lócus para amplificar individualmente cada lócus HLA determinado. Os loci amplificados por este protocolo são HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1/DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1 e HLA-DQB1, Nota: As misturas principais preparadas neste passo incluem todos os reagentes necessários para amplificação, exceto a Taq polimerase. Lista de reagentes Item Armazenamento Fornecido por Mistura de iniciador HLA-A -20 C Omixon Mistura de iniciador HLA-B -20 C Omixon Mistura de iniciador HLA-C -20 C Omixon Mistura de iniciador HLA-DRB1/DRB3-20 C Omixon Mistura de iniciador HLA-DRB4-20 C Omixon Mistura de iniciador HLA-DRB5-20 C Omixon Mistura de iniciador HLA-DPA1-20 C Omixon Mistura de iniciador HLA-DPB1-20 C Omixon Mistura de iniciador HLA-DQA1-20 C Omixon Mistura de iniciador HLA-DQB1 conjunto 3-20 C Omixon Intensificador 1-20 C Omixon Intensificador 2-20 C Omixon Tampão LongRange PCR (10 ) -20 C Qiagen dntps (10 mm cada) -20 C Qiagen Grau molecular H 2 O -20 C Qiagen Protocolo 1.1 Remover todas as misturas de iniciadores, Intensificador 1 e 2, os dntp e o tampão PCR de longo alcance (10 ) do armazenamento e descongelar à temperatura ambiente. 1.2 Preparar o intensificador combinado: adicionar 132 µl de Intensificador 2 no tubo do Intensificador 1. Mudar o nome da etiqueta do tubo do Intensificador 1 para Intensificador combinado. Guardar o intensificador 2 para ser utilizado na reação PCR DRB4 de longo alcance. Página 19 49

20 1.3 Preparar uma mistura principal para cada mistura de iniciador, de acordo com as tabelas abaixo: Mistura principal: HLA-A, B, C, DRB1/DRB3, DRB5, DPA1, DPB1 e DQA1 Reagente Volume/amostra/lócus Volume/24 amostras/lócus Mistura de iniciador 2 µl 51 µl Tampão LongRange PCR (10 ) 2,5 µl 63,8 µl Mistura dntp (10 mm cada) 1,25 µl 31,9 µl Grau molecular H 2 O 13,85 µl 353,2 µl Volume total 19,6 µl 499,9 µl Mistura principal: HLA-DRB4 Reagente Volume/amostra/lócus Volume/24 amostras/lócus Mistura de iniciador 2 µl 51 µl Tampão LongRange PCR (10 ) 2,5 µl 63,8 µl Mistura dntp (10 mm cada) 1,25 µl 31,9 µl Intensificador 2 0,6 μl 15,3 μl Grau molecular H 2 O 13,25 μl 337,9 μl Volume total 19,6 µl 499,9 µl Mistura principal: HLA-DQB1 Conjunto 3 Reagente Volume/amostra/lócus Volume/24 amostras/lócus Mistura de iniciador 2 µl 51 µl Tampão LongRange PCR (10 ) 2,5 µl 63,8 µl Mistura dntp (10 mm cada) 1,25 µl 31,9 µl Intensificador combinado 5,6 µl 142,8 µl Grau molecular H 2 O 7,85 µl 200,2 µl Volume total 19,2 µl 489,7 µl 1.4 Agitar e centrifugar cada mistura principal durante 1 segundo. Colocar as misturas principais em gelo. 1.5 Diluir todo o gadn numa concentração de ng/µl (o volume mínimo é 55 µl). Nota: O Holotype HLA inclui reagentes suficientes para 24 reações mais volume adicional para perda de pipetagem e falha na amplificação. Página 20 49

21 Passo 2 Amplificação HLA Classes I e II Duração: ~6 horas 50 minutos O objetivo do passo 2 é amplificar os loci HLA. As amplificações HLA classe I e classe II foram otimizadas, utilizando dois conjuntos separados de condições PCR. Após as reações PCR estarem concluídas, a amplificação é confirmada por eletroforese em gel de agarose (opcional). Lista de reagentes Sugestão breve A eletroforese em gel de agarose, embora recomendada, não é necessária para concluir com êxito o protocolo Holotype HLA. Quando os amplicons são quantificados (Passo 3), qualquer concentração acima de 50 ng/µl é considerada uma amplificação bem-sucedida. A eletroforese em gel de agarose é um passo de controlo de qualidade importante, não devendo ser ignorada sem experiência suficiente com o protocolo Holotype HLA completo. Item Armazenamento Fornecido por Mistura principal HLA-A -20 C Passo 1 Mistura principal HLA-B -20 C Passo 1 Mistura principal HLA-C -20 C Passo 1 Mistura principal HLA-DRB1/DRB3-20 C Passo 1 Mistura principal HLA-DRB4-20 C Passo 1 Mistura principal HLA-DRB5-20 C Passo 1 Mistura principal HLA-DPA1-20 C Passo 1 Mistura principal HLA-DPB1-20 C Passo 1 Mistura principal HLA-DQA1-20 C Passo 1 Mistura principal HLA-DQB1 Conjunto 3-20 C Passo 1 Taq polimerase -20 C Qiagen gadn 4 C Utilizador Grau molecular H 2 O 20 C Utilizador Protocolo 2.1 Remover a Taq polimerase do armazenamento, centrifugá-la e adicioná-la a cada mistura principal, de acordo com as tabelas abaixo, enxaguando as pontas das pipetas exaustivamente na pipetagem: Página 21 49

22 Mistura principal carregada de Taq polimerase: HLA-A, B, C, DRB1/DRB3, DRB4, DRB5, DPA1, DPB1 e DQA1 Reagente Volume/amostra/lócus Volume/24 amostras/lócus Mistura principal do passo 1 19,6 µl 499,9 µl Taq polimerase 0,4 µl 10,2 µl Total 20 µl 510,1 µl Mistura principal carregada de Taq polimerase: HLA-DQB1 Conjunto 3 Reagente Volume/amostra/lócus Volume/24 amostras/lócus Mistura principal do passo 1 19,2 µl 489,7 µl Taq polimerase 0,8 µl 20,4 µl Total 20 µl 510,1 µl 2.2 Agitar e centrifugar brevemente todas as misturas principais carregadas com Taq polimerase. Alíquota de 20 µl de cada mistura principal carregada com Taq polimerase em poços separados de placas de 96 poços PCR. Nota: As amplificações de classe I e classe II foram otimizadas utilizando duas condições PCR diferentes, por isso as misturas principais classe I e classe II não devem estar na mesma placa. 2.3 Adicionar 5 µl de cada gadn diluído no poço adequado das placas preparadas no passo anterior. Misturar por pipetagem. Vedá-los com vedação térmica e inspecionar visualmente cada poço. Centrifugar todas as placas de amplificação numa centrifugadora. 2.4 Colocar as placas de amplificação nos termocicladores e executar os programas para amplificação classe I e classe II, de acordo com as tabelas abaixo: Amplificação classe I (HLA-A, B e C) Número de ciclos Temperatura Período de tempo 1 95 C 3 minutos 95 C 15 segundos C 30 segundos 68 C 5 minutos 1 68 C 10 minutos 1 4 C Página 22 49

23 Amplificação classe II (HLA-DRB1/DRB3, DRB4, DRB5, DPA1, DPB1, DQA1 e DQB1) Número de ciclos Temperatura Período de tempo 1 95 C 3 minutos 93 C 15 segundos C 30 segundos 68 C 9 minutos 1 68 C 10 minutos 1 4 C Nota: O êxito da amplificação pode ser verificado através da aplicação de 2 µl de cada amplicon em gel de agarose a 2% padrão a 250 V, durante 30 minutos. (Opcional) Tamanhos previstos de amplicon Lócus HLA Tamanhos previstos de amplicon (kb) HLA-A, B e C ~3 HLA-DRB1/DRB3 ~4,3 HLA-DRB4 ~4,2 HLA-DRB5 ~5 HLA-DPA1 ~5,5 HLA-DPB1 ~6,6 HLA-DQA1 ~5,5 HLA-DQB1 (Conjunto 3) ~6,5 Ponto de paragem segura. Os amplicons podem ser armazenados a 4 C de um dia para o outro ou a -20 C durante períodos maiores. Página 23 49

24 Passo 3 Quantificação e normalização de amplicon (utilizando um fluorómetro de placas) Duração: ~40 minutos A quantificação e a normalização de amplicon são recomendadas para garantir uma entrada exata no passo de preparação da biblioteca (opcional). A concentração de amplicon é medida através do sistema QuantiFluor dsadn, que inclui um corante fluorescente de ligação ao ADN e padrão ADN para quantificação sensível de pequenas porções de ADN de cadeia dupla (dsadn). Consultar o Anexo 2 para obter instruções sobre como fazer a quantificação de amplicon utilizando uma máquina qpcr. Lista de reagentes Sugestão breve A quantificação de amplicon, embora recomendada, não é necessária para concluir com êxito o protocolo Holotype HLA. A normalização de amplicon não necessita de medição exata da concentração de amplicon. Em alternativa, pode ser utilizada uma estimativa da concentração de amplicon, com base na experiência ou na eletroforese em gel de agarose. A quantificação de amplicon não deve ser ignorada sem experiência suficiente com o protocolo Holotype HLA completo. Item Armazenamento Fornecido por Placa de amplificação classe I 4 C Passo 2 Placa de amplificação classe II 4 C Passo 2 Padrão Lambda ADN (100 ng/µl) 4 C Promega Corante QuantiFluor dsadn (200 ) 4 C Promega 20 tampão TE (ph 7,5) 4 C Promega Grau molecular H 2 O 20 C a 25 C Utilizador ExoSAP-iT Express -20 C Affymetrix Página 24 49

25 Protocolo 3.1 Preparar padrões ADN por diluição em série do padrão Lambda ADN (100 ng/µl), fornecido no kit QuantiFluor, de acordo com a tabela de diluição abaixo: Etiqueta no tubo Entrada de ADN Volume ADN (µl) Volume 1x TE (µl) Conc. Final (ng/µl) Padrão 1 Lambda ADN 7,5 µl 492,5 µl 1,5 ng/µl Padrão 2 Padrão µl 250 µl 0,75 ng/µl Padrão 3 Padrão µl 250 µl 0,38 ng/µl Padrão 4 Padrão µl 250 µl 0,19 ng/µl Padrão 5 Padrão µl 250 µl 0,09 ng/µl Padrão 6 Padrão µl 250 µl 0,05 ng/µl Vazio Vazio 0 µl 250 µl 0 ng/µl 3.2 Preparar as placas de quantificação de amplicon (consultar valores complementares). Alíquota de 99 µl 1x tampão TE nos poços de uma placa ótica de 96 poços para o número total de amplicons a serem quantificados. 3.3 Adicionar 1 µl de amplicons dos poços correspondentes nas placas de amplicon para os poços individuais nas placas de quantificação de amplicon. Misturar por pipetagem. 3.4 Preparar 1 solução de trabalho de corante QuantiFluor, utilizando a seguinte fórmula: 0,5 µl corante QuantiFluor (200X) + 99,5 µl 1 tampão TE. Preparar 1 solução de trabalho de corante QuantiFluor suficiente, de forma a que cada amostra (do total de amostras nas placas de amplicon) e padrão (14 no total) recebam uma alíquota de 100 µl. 3.5 Preparar uma placa de quantificação de padrões e placas de quantificação de amplicon. Alíquota de 100 µl de 1 solução de trabalho de corante QuantiFluor para poços da placa ótica de 96 poços, que será a placa de quantificação de padrões, e para as placas de quantificação de amplicon do passo Utilizando os padrões preparados acima, adicionar 100 µl de cada padrão, em duplicado, nos poços individuais na placa de quantificação de padrões (14 poços no total). Misturar por pipetagem. 3.7 Agitar bem para misturar e centrifugar. 3.8 Executar a placa de quantificação de padrões no fluorómetro de placas e, em seguida, as placas de quantificação de amplicon. 3.9 Calcular a concentração de ADN nas placas de quantificação de amplicon, utilizando os dados RFU gerados pelo fluorómetro de placas. Para obter ajuda para os cálculos, consultar a tabela de diluição no livro fornecido. Página 25 49

26 3.10 Diluir o ADN nas placas de amplicon com grau molecular H 2 O, para que a concentração final de ADN seja aproximadamente de 67 ng/µl. Se a concentração de ADN for igual ou superior a 150 ng/µl: adicionar 25 µl de H 2 O Se a concentração de ADN se situar entre ng/µl: adicionar 10 µl de H 2 O Se a concentração de ADN for inferior a 100 ng/µl: não adicionar H 2 O Agrupamento de amplicon 3.11 Agrupar todos os loci de cada amostra numa única placa de amplicons agrupados. Combinar os volumes indicados para cada lócus, conforme indicado na tabela a seguir, para obter um volume final de 35 µl: Lócus HLA A B C DRB1/DRB3 DRB4 DRB5 DPA1 DPB1 DQA1 DQB1 Conjunto 3 Volume agrupado 3,5 μl 3,5 μl 3,5 μl 3,5 μl 3,5 μl 3,5 μl 3,5 μl 3,5 μl 3,5 μl 3,5 μl 3.12 Adicionar 4 µl de ExoSAP-iT Express em cada biblioteca de amostra. Enxaguar as pontes das pipetas, para pipetagem. Vedar a placa com vedante térmico e centrifugar Colocar a placa de amplicons agrupados num termociclador e executar o seguinte programa: Purificação PCR de ExoSAP-iT Express Número de ciclos Temperatura Período de tempo 1 37 C 4 minutos 1 80 C 1 minuto 1 4 C Ponto de paragem segura. Os amplicons podem ser armazenados a 4 C de um dia para o outro ou a -20 C durante períodos maiores. Página 26 49

27 Passo 4 Preparação da biblioteca Duração: ~3 horas Durante este passo, os amplicons agrupados são preparados para sequenciação no Illumina MiSeq. Os amplicons são fragmentados enzimaticamente, as extremidades são reparadas e adeniladas e os adaptadores indexados são ligados às extremidades. As bibliotecas são então agrupadas, seguindo-se um único passo de limpeza e concentração, realizado utilizando grânulos AMPure XP. Lista de reagentes Nota: A Omixon recomenda volumes superiores ao necessário para 24 amostras, porque muitas das enzimas e tampões são viscosos, resultando em perda excessiva por pipetagem. Item Armazenamento Fornecido por Placa de amplicons agrupados 4 C Passo 3 Enzima de fragmentação (A) -20 C Omixon Tampão de fragmentação (B) -20 C Omixon Enzima de reparação de extremidade (C) -20 C Omixon Tampão de reparação de extremidade (D) -20 C Omixon Enzima de ligação (E) -20 C Omixon Tampão de ligação (F) -20 C Omixon Placa adaptadora -20 C Omixon Grânulos AMPure XP 4 C Beckman Coulter 80% etanol (preparado no momento) 20 C a 25 C Utilizador Grau molecular H 2 O 20 C a 25 C Utilizador Protocolo 4.1 Ligar o termociclador. Verificar se a tampa aquecida está a aquecer. Nota: Antes da utilização, certifique-se de que agita exaustivamente a enzima de fragmentação (A). 4.2 Preparar a mistura principal de fragmentação de acordo com a tabela abaixo: Página 27 49

28 Mistura principal de fragmentação Reagente Volume por biblioteca (µl) Volumes recomendados para 24 bibliotecas (µl) Código de cor Enzima de fragmentação (A) 2 µl 55,2 µl Amarelo Tampão de fragmentação (B) 2 µl 55,2 µl Vermelho Volume total 4 µl 110,4 µl 4.3 Preparar uma placa de reagente: colocar uma nova placa PCR de 96 poços num suporte de refrigeração PCR, bem como alíquota e quantidade igual da mistura principal de fragmentação em cada poço de uma única coluna. Nota: A reação de fragmentação foi concebida para fornecer ADN de tamanho ideal para sequenciação no Illumina MiSeq. É importante manter os reagentes frios até começar a reação no termociclador, para evitar fragmentação excessiva. Recomendase a utilização de pipetas multicanais, para minimizar as probabilidades de fragmentação excessiva. 4.4 Centrifugar a placa de amplicons agrupados durante 10 segundos e colocá-la em gelo ou num bloco frio. 4.5 Preparar uma placa de reação: colocar uma placa de 96 poços PCR num bloco frio PCR. 4.6 Adicionar 4 µl de mistura principal de fragmentação da placa de reagente nos poços da placa de reação, correspondentes às amostras na placa de amplicons agrupados. Recomenda-se a utilização de pipetas multicanais. 4.7 Transferir 16 µl de cada amplicon da placa de amplicons agrupados para o poço correspondente na placa de reação, utilizando uma pipeta multicanal. Misturar por pipetagem. 4.8 Cobrir a placa de reação com o vedante térmico e centrifugar durante 10 segundos. 4.9 Deixar incubar a placa de reação num termociclador com o seguinte programa: Programa de fragmentação Número de ciclos Temperatura Período de tempo 1 37 C 10 minutos 1 70 C 15 minutos 1 4 C Ponto de paragem segura. As biblioteca podem ser armazenadas a 4 C de um dia para o outro ou a -20 C durante períodos maiores Preparar a mistura principal de reparação final de acordo com a tabela abaixo: Página 28 49

29 Mistura principal de reparação final Reagente Volume por biblioteca (µl) Volumes recomendados para 24 bibliotecas (µl) Código de cor Grau molecular H 2 O 1,25 µl 34,8 µl Enzima de reparação de 1,25 µl 34,8 µl Verde extremidade (C) Tampão de reparação 2,5 µl 69,6 µl Cor de laranja de extremidade (D) Volume total 5 µl 139,2 µl 4.11 Colocar alíquota numa quantidade igual de mistura principal de reparação final numa coluna única não utilizada da placa de reagente Centrifugar a placa de reação (que contém as amostras fragmentadas) durante 10 segundos. Adicionar 5 µl de mistura principal de reparação fina da placa de reagente em cada poço da placa de reação. Recomenda-se a utilização de pipetas multicanais. Misturar por pipetagem Cobrir a placa de reação com o vedante térmico e centrifugar durante 10 segundos Deixar incubar a placa de reação num termociclador com o seguinte programa: Programa de reparação final Número de ciclos Temperatura Período de tempo 1 20 C 30 minutos 1 70 C 5 minutos 1 4 C Ponto de paragem segura. As biblioteca podem ser armazenadas a 4 C de um dia para o outro ou a -20 C durante períodos maiores Remover a placa de adaptadores indexados do armazenamento e descongelar à temperatura ambiente, após o início do programa de reparação final no termociclador. Quando a placa adaptadora estiver à temperatura ambiente, centrifugá-la durante 3 minutos a 3000 rpm Puxar com cuidado a vedação da placa adaptadora. Não agitar a placa adaptadora depois de a vedação ter sido removida, para evitar contaminação cruzada Transferir todo o volume de cada poço da placa de reação (25 µl) para o poço correspondente na placa adaptadora. Página 29 49

30 Nota: Caso NÃO seja utilizada a totalidade da placa adaptadora, é possível utilizar apenas o número necessário de adaptadores. Cortar a vedação da placa entre os poços a serem utilizados e os poços a serem mantidos. Puxar com cuidado a vedação da placa adaptadora, mantendo a vedação sobre os poços a conservar. a. Transferir 25 μl de cada amostra de extremidade reparada da placa de reação para um poço na placa adaptadora, misturando bem com uma pipeta. b. Transferir a totalidade de cada amostra da placa adaptadora para o poço original da placa de reação. c. Voltar a vedar a placa adaptadora e voltar a colocá-la a -20 C. Utilizar a placa de reação em vez da placa adaptadora para os passos restantes indicados no manual Preparar a mistura principal de ligação. Preparar mistura principal de ligação suficiente para cada amostra. Mistura principal de ligação Reagente Volume (µl) Volumes recomendados para 24 bibliotecas (µl) Código de cor Enzima de ligação (E) 2,5 µl 63,2 µl Azul Tampão de ligação (F) 30 µl 757,5 µl Preto Volume total 32,5 820,7 µl 4.19 Colocar alíquota da mistura principal de ligação numa coluna não utilizada da placa de reagente. Recomenda-se a utilização de pipetas multicanais Adicionar 32,5 µl de mistura principal de ligação em cada poço da placa de reação. Recomenda-se a utilização de pipetas multicanais. Misturar por pipetagem Cobrir a placa de reação com o vedante térmico e centrifugar durante 10 segundos Incubar a placa de reação no termociclador com o seguinte programa: Programa de ligação Número de ciclos Temperatura Período de tempo 1 25 C 10 minutos 1 70 C 10 minutos 1 4 C Ponto de paragem segura. As biblioteca podem ser armazenadas a 4 C de um dia para o outro ou a -20 C durante períodos maiores. Página 30 49

31 Purificação de biblioteca e agrupamento 4.23 Permitir que os grânulos AMPure XP atinjam a temperatura ambiente. Garantir que são homogéneos (sem grumos nem péletes). Preparar no momento, com 5 ml de 80% de etanol (4 ml EtOH + 1 ml H 2 O) Criar a biblioteca, combinando uma alíquota de cada amplicon agrupado, agora uma biblioteca específica de amostra, num tubo de microcentrifugação único de 2,0 ml de baixa ligação. I. Para 16 ou mais amostras calcular a quantidade de cada biblioteca de amostra a agrupar conjuntamente como uma biblioteca única com volume total de 900 µl. Dividir 900 µl pelo número de bibliotecas de amostra. Este é o volume de alíquota a extrair de cada biblioteca de amostra e a pipetar na biblioteca. II. Para menos de 16 amostras Transferir 60 µl de cada biblioteca de amostra para uma biblioteca Adicionar 900 µl de grânulos AMPure XP ao tubo da biblioteca, mas não tocar na biblioteca com a ponta da pipeta. Misturar exaustivamente por agitação e centrifugar brevemente. Não permitir que os grânulos se separem. Incubar a biblioteca durante 10 minutos, à temperatura ambiente. Nota: Caso haja menos de 900 µl de biblioteca no agrupamento final, adicionar uma quantidade equivalente de grânulos AMPure XP. Deve existir uma proporção 1:1 de agrupamento final e de grânulos AMPure XP Colocar o tubo da biblioteca num suporte magnético e incubar durante 10 minutos Mantendo o tubo no suporte magnético, remover cuidadosamente e eliminar o sobrenadante do tubo da biblioteca, sem tocar nos grânulos Mantendo o tubo no suporte magnético, adicionar ~1,5 2 ml de 80% de etanol, preparado no momento, ao tubo da biblioteca. O volume de etanol adicionado deve ser suficiente para cobrir os grânulos. Nota: Aplicar o etanol no lado do tubo sem grânulos Incubar o tubo da biblioteca a temperatura ambiente durante 30 segundos; em seguida, remover cuidadosamente e eliminar o sobrenadante Repetir os passos 4.28 e Centrifugar brevemente o tubo de biblioteca e colocá-lo novamente no suporte magnético, com a tampa aberta. Remover o etanol residual com uma pipeta. Não tocar nos grânulos. Página 31 49

32 Nota: Deve certificar-se de que a pélete de grânulos não contém etanol residual. Isto pode exigir a rotação do tubo no suporte magnético, para remover o etanol sem perturbar a pélete de grânulos Permite que os grânulos sequem ao ar durante 5-8 minutos no suporte magnético até que a pélete de grânulos fique seca Remover o tubo de biblioteca do suporte magnético e eluir a biblioteca com 31 µl de água de grau molecular. Não permitir que a pipeta toque nos grânulos, pois ficarão agarrados nela Agitar a biblioteca para que os grânulos fiquem de novo completamente em suspensão. Centrifugar brevemente, caso fiquem alguns pingos nas paredes laterais. Garantir que os grânulos permanecem em suspensão Incubar a biblioteca à temperatura ambiente durante 2 minutos Colocar a biblioteca no suporte magnético durante 2 minutos Colher a biblioteca: mantendo o tubo da biblioteca final no suporte magnético, recolher 31 µl do sobrenadante num novo tubo de microcentrifugação de baixa ligação de 1,5 ml. Ponto de paragem segura. As bibliotecas podem ser armazenadas a -20 C durante períodos prolongados. Página 32 49

33 Passo 5 Seleção do tamanho da biblioteca Duração: ~1 hora O passo 5 adota a biblioteca do passo 4 e realiza a seleção do tamanho, utilizando o método Pippin Prep. O Pippin Prep pode selecionar automaticamente um intervalo de tamanhos de fragmentos de ADN, eluindo-os numa câmara de colheita. Nota: Pode ser utilizado o Blue Pippin, em alternativa ao Pippin Prep. Consultar o Anexo 1 para obter instruções de utilização do Pippin Prep. Lista de reagentes Item Armazenamento Fornecido por Cassete de 1,5% de gel de agarose, sem corante 20 C a 25 C Sage Science Solução carregada de Pippin/mistura de 4 C Sage Science marcador (com etiqueta K) Biblioteca agrupada 4 C Passo 4 Nota: O marcador K é utilizado com o Pippin Prep. O Blue Pippin utiliza o marcador R2. Protocolo 5.1 Colocar a solução carregada do marcador K à temperatura ambiente. 5.2 Combinar 31 µl do agrupamento com 10 µl de solução carregada do marcador K. 5.3 Misturar por agitação e centrifugação. 5.4 Configurar o Pippin Prep para recolher fragmentos de ADN entre 650 e 1300 bps. Carregar a amostra de 40 µl na porta de amostra e executar. O tempo de execução é de minutos. 5.5 Recolher todo o conteúdo (aproximadamente 40 µl) da porta de eluição do Pippin Prep e transferi-lo para um novo tubo de microcentrifugação de baixa ligação de 1,5 ml. Esta é a biblioteca selecionada por tamanho. Ponto de paragem segura. As bibliotecas podem ser armazenadas a -20 C durante períodos prolongados. Página 33 49

34 Passo 6 Quantificação de biblioteca através de um instrumento qpcr Duração: ~1 hora 15 minutos É necessário quantificar a biblioteca selecionada por tamanho para utilizar otimamente a saída do sequenciador Illumina MiSeq. A concentração da biblioteca selecionada por tamanho pode ser medida com exatidão pelo qpcr. Como opção, pode utilizar o kit Qubit dsadn BR e uma máquina Qubit para a medição da concentração da biblioteca. Consultar o Anexo 3, relativamente a este protocolo. Lista de reagentes Item Armazenamento Fornecido por 10 pré-mistura de iniciador Illumina -20 C KAPA Biosystems 2 mistura principal KAPA SYBR FAST qpcr -20 C KAPA Biosystems Std 1 (20,00 pm) -20 C KAPA Biosystems Std 2 (2,00 pm) -20 C KAPA Biosystems Std 3 (0,20 pm) -20 C KAPA Biosystems Std 4 (0,02 pm) -20 C KAPA Biosystems Padrões ADN Illumina -20 C KAPA Biosystems Grau molecular H 2 O 20 C a 25 C Utilizador 1 tampão TE (ph 8,0) 20 C a 25 C Utilizador Biblioteca selecionada por tamanho 4 C Passo 5 Protocolo 1 Preparar a mistura de iniciador qpcr utilizando 10x pré-mistura de iniciador Illumina e 2 mistura principal KAPA SYBR FAST qpcr: Nota: Os reagentes do kit KAPA SYBR FAST qpcr (mistura principal qpcr, prémistura de iniciador e soluções ROX) são combinados durante a primeira utilização do kit. Esta solução combinada mantém-se estável durante, pelo menos, 30 ciclos de congelamento/descongelamento. Seguir a documentação KAPA para determinar se o ROX é recomendado para o respetivo instrumento qpcr. Mistura de iniciador qpcr Reagente Volume (ml) 10 pré-mistura de iniciador Illumina 1 ml 2 mistura principal KAPA SYBR FAST qpcr 5 ml Volume total 6 ml Página 34 49

35 2 Preparar a mistura principal qpcr. Mistura principal qpcr Reagente Volume (µl) Mistura de iniciador qpcr 228 µl Grau molecular H 2 O 76 µl Volume total 304 µl 3 Preparar uma diluição em série da biblioteca selecionada pelo tamanho. a. Preparar uma diluição 1:1000, adicionando 1 µl da biblioteca selecionada pelo tamanho a 999 µl de 1 tampão TE (ph 8,0), enxaguando exaustivamente a ponta da pipeta. Agitar e centrifugar. b. Preparar uma diluição 1:2000, adicionando 100 µl da diluição 1:1000 a 100 µl 1 tampão TE (ph 8,0). Agitar e centrifugar. 4 Preparar uma placa de quantificação qpcr numa placa PCR nova, compatível com o respetivo sistema qpcr. 5 Colocar alíquota de 16 µl da mistura principal qpcr em triplicado para padrões 1-4, a diluição 1:1000 e a diluição 1:2000 (consultar valores complementares). 6 Colocar alíquota de 4 µl de padrões 1-4, a diluição 1:1000 e a diluição 1:2000 nos poços correspondentes. 7 Vedar a placa de quantificação qpcr e centrifugá-la durante 10 segundos. Nota: Evitar a criação de bolhas nos poços da placa de quantificação qpcr. Centrifugar conforme necessário para eliminar as bolhas. 8 Definir os triplicados 1:1000 e 1:2000 como amostras-alvo e definir o padrões (pontos: 4, concentração inicial: 20 pm, diluição: 1:10). Executar o seguinte programa na máquina qpcr para determinar a concentração de ADN da biblioteca selecionada por tamanho: Número de ciclos Temperatura Período de tempo 1 95 C 5 minutos 25 (sem curva de fusão) 95 C 30 segundos 60 C 90 segundos (aquisição de dados) 9 Para converter o resultado de qpcr de concentração pm para nm, introduzir os resultados de Quantidade média das duas réplicas de biblioteca no separador do livro Omixon designado por Library Quantitation (Quantificação de biblioteca). 10 Utilizando os volumes do livro, diluir 10 µl da biblioteca selecionada por tamanho para uma concentração de 2 nm com H 2 O esterilizada, num novo tubo de microcentrifugação de baixa ligação de 1,5 ml. Armazenar a parte restante da biblioteca selecionada por tamanho a -20 C. Página 35 49

36 Ponto de paragem segura. As bibliotecas podem ser armazenadas a -20 C durante períodos prolongados. No caso de armazenamento de longa duração, é extremamente recomendável uma nova quantificação da biblioteca antes de a processar no MiSeq. Página 36 49

37 Passo 7 Sequenciação no Illumina MiSeq Duração: ~24 horas O Illumina MiSeq é um instrumento NGS automatizado, que pode sequenciar a biblioteca selecionada por tamanho preparada nos passos anteriores. A desmultiplexação das amostras indexadas é efetuada automaticamente após a conclusão da execução de sequenciação. Sugestão breve Pode utilizar um pico PhiX de 1% como controlo adicional para monitorizar a reação de sequenciação. Consultar a documentação Illumina para obter informações adicionais sobre o controlo PhiX. Lista de reagentes Item Armazenamento Fornecido por Cartucho de reagente -20 C Illumina HT1-20 C Illumina PR2 4 C Illumina Célula de fluxo MiSeq 4 C Illumina Biblioteca a 2nM 4 C Passo 6 NaOH 1 N ou 2 N 20 C a 25 C Utilizador Grau molecular H 2 O 20 C a 25 C Utilizador Capacidade do kit de reagente MiSeq Kit de reagente Illumina MiSeq Ciclo 500 Std (MS ) Ciclo 300 Std (MS ) Micro ciclo 300 (MS ) Nano ciclo 500 (MS ) Nano ciclo 300 (MS ) Período de tempo Horas Amostras 24/11 ~39 24 ~24 24 ~19 20 ~28 8 ~17 4 Protocolo 7.1 Preparar o MiSeq em conformidade com os protocolos Illumina padrão. Página 37 49

38 7.2 Preparar uma biblioteca desnaturada 1 nm: Combinar 10 μl de 0,2 N de NaOH recémpreparado e 10 µl da diluição de 2 nm da biblioteca selecionada por tamanho num novo tubo de microcentrifugação de baixa ligação de 1,5 ml. Agitar e centrifugar. Incubar esta biblioteca desnaturada de 1 nm à temperatura ambiente, durante 5 minutos. 7.3 Preparar uma biblioteca desnaturada de 20 pm: Adicionar 980 µl de HT1 refrigerado aos 20 µl da biblioteca desnaturada de 1 nm. Agitar e centrifugar. 7.4 Preparar uma biblioteca desnaturada de 9 pm: Adicionar 550 µl de HT1 refrigerado e 450 µl da biblioteca desnaturada de 20 nm num novo tubo de microcentrifugação de baixa ligação de 1,5 ml. Agitar e centrifugar. 7.5 Transferir 600 µl da biblioteca desnaturada de 9 pm para o reservatório de amostras carregadas do cartucho de reagente MiSeq. Sugestão breve É aconselhável utilizar o livro fornecido para criar a ficha de amostras que é necessária para o Miseq. Página 38 49

39 Passo 8 Análise de dados de sequenciação HLA O Illumina MiSeq processa a biblioteca agrupada de 9 pm, gerando dados de sequenciação como ficheiros fastq. Consultar o manual do HLA Twin para obter auxílio para a instalação correta do HLA Twin, bem como para obter informações sobre a interpretação da análise de genotipificação dos respetivos dados de sequenciação. Para implementar o protocolo automatizado e relativamente a questões sobre a instalação ou à análise de dados, contactar support@omixon.com. Protocolo automatizado Instalação e configuração de TI 1. Instalar o HLA Twin Server no servidor. Instalar o HLA Twin Client num computador cliente podem ser ligados vários HLA Twin Clients ao servidor. Para obter instruções de instalação personalizadas para automatização, contactar o suporte técnico da Omixon (support@omixon.com). Protocolo por análise 1. Iniciar o HLA Twin Client e iniciar sessão. 2. Os dados já estão processados ou estão a ser processados. Rever os resultados, utilizando o sistema de semáforo no HLA Twin. 3. Exportar os resultados de genotipificação e/ou as sequências de consenso, conforme necessário. Protocolo de servidor manual Instalação e configuração de TI Instalar o HLA Twin Server no servidor. Instalar o HLA Twin Client num computador cliente. Protocolo por análise Iniciar o HLA Twin Client e iniciar sessão. Selecionar os dados MiSeq em formato fastq ou fastq.gz e iniciar a execução de tipificação Holotype HLA. Após ter concluído a tipificação Holotype HLA, rever os resultados, utilizando o sistema de semáforo no HLA Twin. Exportar os resultados de genotipificação e/ou as sequências de consenso, conforme necessário. Página 39 49

40 Protocolo de ambiente de trabalho manual Instalação e configuração de TI Instalar o ambiente de trabalho HLA Twin. Protocolo por análise 6 Iniciar o HLA Twin e iniciar sessão. 7 Selecionar os dados MiSeq em formato fastq ou fastq.gz e iniciar a execução de tipificação Holotype HLA. 8 Após ter concluído a tipificação Holotype HLA, rever os resultados, utilizando o sistema de semáforo no HLA Twin. 9 Exportar os resultados de genotipificação e/ou as sequências de consenso, conforme necessário. Página 40 49

41 Valores complementares Exemplo de placa para placa de amplicon, placa de amplificação, placa de diluição, placa de quantificação de amplicon (para um lócus individual) e placa de reação Exemplo de placa de quantificação de padrões Página 41 49

42 Exemplo de placa qpcr de quantificação de biblioteca KAPA Página 42 49

43 Anexo 1: Pippin Prep Programar o Pippin Prep 1. Clicar no separador Editor de protocolos e clicar no botão New (Novo). 2. Clicar no ícone da pasta junto do campo Cassete e selecionar 1.5%DF Marker K para o Pippin Prep ou 1.5%DF Marker R2 para o Blue Pippin. 3. Na faixa que está a programar: a. Realçar o campo Range (Intervalo). b. Definir a Ref Lane (Faixa de referência) para corresponder ao número de faixa em que estiver a trabalhar. c. Definir o campo Start* (Iniciar) para 650. d. Definir o campo End* (Terminar) para No campo Faixa de referência, selecionar a faixa em que está a trabalhar. 5. Clicar no botão Save As (Guardar como) e atribuir um nome ao programa. Executar o Pippin Prep 1. Ativar o Pippin Prep, premindo o botão de ligar/desligar na parte posterior do dispositivo. 2. Inspecionar visualmente o Pippin Prep. Deve certificar-se de que os 5 LED se encontram ligados e de que o interior do dispositivo está limpo e seco. 3. Clicar no logótipo Sage Science, na parte inferior direita do ecrã. Isto permitir ao utilizador introduzir uma palavra-passe. A palavra-passe predefinida de fábrica é pips. 4. Clicar no separador Configuração de fábrica e certificar-se de que o valor base-para-limite está definido para 0, Colocar o acessório de calibragem no interior do Pippin Prep, certificando-se de que a faixa escura está voltada para baixo e sobre as luzes LED. 6. No separador Principal, clicar no botão Calibration (Calibragem). 7. Na janela Calibragem, deve certificar-se de que o campo Target I ph ma está definido para 0,80 (0,60 para Blue Pippin) e, em seguida, premir o botão Calibrate (Calibrar). 8. Aceder ao separador Protocolos. Clicar no botão Load (Carregar) e selecionar o programa para Holotype HLA e a faixa específica que vai utilizar. Certifique-se de que: a. Está ligada a faixa correta b. O indicador de seleção de espetro amplo está ativado c. A faixa de referência é a mesma faixa que vai ser executada. 9. Aceder ao separador Principal. Certifique-se de que: a. O programa que carregou é o que está selecionado. Página 43 49

44 b. Está selecionada a faixa de referência adequada e que se trata também da faixa em que a amostra vai ser executada. 10. Inspecionar a cassete. Antes de retirar a fita de vedação dos poços, verificar se há bolhas por trás da porta de eluição. Se houver bolhas por trás da porta de eluição, bater suavemente e fazer deslizar a cassete na mão para desfazer as bolhas. 11. Colocar a cassete, com a fita ainda colocada sobre os poços, dentro do Pippin Prep. 12. Retirar cuidadosamente a fita, certificando-se de remover a fita a partir do lado limpo da cassete (faixa 5) para o lado usado da cassete (faixa 1). Ter cuidado para não fazer salpicar líquido quando a fita for removida, para evitar contaminação. 13. Remover todo o volume do tampão da porta de eluição, da faixa que vai utilizar, e adicionar 40 µl de tampão de eletroforese recém-preparado nessa porta de eluição. 14. Adicionar uma tira fina de fita nas portas de eluição. 15. Os reservatórios com menos de 3/4 de enchimento devem ser reabastecidos com tampão de eletroforese. Não encher os poços excessivamente! A borda do tampão deve alcançar o apenas plástico, não ultrapassando, para evitar arrastamento quando a tampa deslizar. Aplicar o tampão a partir dos poços limpos (faixa 5) para os poços os usados (faixa 1). 16. Certificar-se de que cada um dos poços de carregamento (poços com agarose) esteja cheio com tampão de eletroforese. O tampão deve encontrar-se mesmo sobre a agarose, parecendo completamente plano. 17. Fechar o Pippin Prep lentamente, tendo em atenção que nenhum tampão esteja a tocar na tampa enquanto estiver a fechar o dispositivo. 18. Realizar o teste de continuidade. Quando os sensores secam ligeiramente, é comum que o teste de continuidade falhe uma vez. Se o teste de continuidade falhar, executá-lo mais uma vez. Quando o teste de continuidade terminar, abrir o Pippin lentamente. Certificarse de que nenhum fluido está a ser puxado através da cassete, pela tampa do Pippin Prep. 19. Agitar brevemente a solução carregada do marcador K e centrifugar. Adicionar 10 µl da solução carregada do marcador K à respetiva biblioteca de ~30 µl. 20. Agitar brevemente a biblioteca e centrifugar. 21. Remover 40 µl do tampão do poço da amostra que será utilizado. 22. Adicionar ~40 µl da biblioteca carregada com marcador K para o poço da amostra que será utilizado. 23. Marcar a faixa que está a ser utilizada com as iniciais do técnico e a data. 24. Fechar o Pippin Prep e clicar no botão Start (Iniciar). Certificar-se de que foi ativada a faixa correta. A amostra deve ser processada durante 45 minutos. 25. Após a conclusão do processamento, abrir cuidadosamente o Pippin Prep. Ter em atenção se a tampa arrasta qualquer líquido através da cassete. Página 44 49

45 26. Remover a fita sobre as portas de eluição, tendo cuidado para não fazer salpicar nenhum líquido. 27. Transferir todo o volume da porta de eluição para um novo tubo de 1,5 ml de baixa ligação. 28. Cobrir todos os poços abertos com dois pedaços de fita de vedação da placa. Lembre-se de deixar uma aba no lado limpo. Isto facilitará a remoção da fita do lado limpo para o usado. 29. Colocar a cassete vedada no saco respetivo e guardá-la. 30. Pegar na cassete de lavagem e enchê-la com água MiliQ. Fechar suavemente a tampa do Pippin Prep, tendo em atenção se é derramado algum líquido através da cassete de lavagem. 32. Deixar o Pippin Prep fechado durante alguns segundos. 33. Abrir o Pippin Prep, tendo em atenção se é derramado algum líquido através da cassete de lavagem. 34. Remover a cassete de água, esvaziá-la e deixá-la secar. 35. Limpar toda a água do Pippin Prep e fechá-lo suavemente. 36. Selecionar o botão Shut Down (Encerrar) no menu Pippin Prep. Página 45 49

46 Anexo 2: Quantificação de amplicon utilizando um instrumento qpcr Duração: 40 minutos Lista de reagentes Item Armazenamento Fornecido por 20 tampão TE (ph 7,5) 4 C Promega Padrão Lambda ADN (100 ng/µl) 4 C Promega 200 corante QuantiFluor dsadn 4 C Promega H 2 O esterilizada 20 C a 25 C Utilizador Placa(s) de amplificação classe I 4 C Passo 2 Placa(s) de amplificação classe II 4 C Passo 2 Protocolo 2. Criar uma diluição em série, utilizando tubos de microcentrifugação de 1,5 ml e o padrão QuantiFluor Lambda ADN (100 ng/µl). Seguir a tabela de diluição abaixo: Etiqueta no tubo Entrada de ADN Volume ADN (µl) Volume 1x TE (µl) Conc. Final (ng/µl) Padrão 1 Lambda ADN 7,5 µl 492,5 µl 1,5 ng/µl Padrão 2 Padrão µl 250 µl 0,75 ng/µl Padrão 3 Padrão µl 250 µl 0,38 ng/µl Padrão 4 Padrão µl 250 µl 0,19 ng/µl Padrão 5 Padrão µl 250 µl 0,09 ng/µl Padrão 6 Padrão µl 250 µl 0,05 ng/µl Padrão 7, vazio Vazio 0 µl 250 µl 0 ng/µl 3. Preparar as placas de quantificação de amplicon (consultar valores complementares). Alíquota de 49,5 µl 1x tampão TE nos poços de uma placa de 96 poços limpa para o número total de amplicons a serem quantificados. 4. Adicionar 0,5 µl de amplicons dos poços correspondentes nas placas de amplicon para os poços individuais nas placas de quantificação de amplicon. Misturar por pipetagem. 5. Preparar 1 solução de trabalho de corante QuantiFluor, utilizando a seguinte fórmula: 0,25 µl corante QuantiFluor (200X) + 49,75 µl 1 tampão TE. Preparar 1 solução de trabalho de corante QuantiFluor suficiente, de forma a que cada amostra (do total de amostras nas placas de amplicon) e padrão (14 no total) recebam uma alíquota de 50 µl. Página 46 49

47 6. Preparar uma placa de quantificação de padrões e placas de quantificação de amplicon. Alíquota de 50 µl de 1 solução de trabalho de corante QuantiFluor para poços da placa ótica de 96 poços, utilizando o formato da placa de quantificação de padrões e as placas de quantificação de amplicon (consultar valores complementares). 7. Utilizando os padrões preparados acima, adicionar 50 µl de cada padrão, em duplicado, nos poços individuais na placa de quantificação de padrões (14 poços no total). 8. Agitar para misturar bem e centrifugar. 9. Colocar cada placa de quantificação na máquina qpcr, uma de cada vez, e executar o seguinte programa: Número de ciclos Temperatura Período de tempo 1 25 C 10 segundos 25 C 15 segundos 2 25 C 30 segundos (aquisição de dados) 10. Calcular a concentração de ADN nas placas de quantificação de amplicon, utilizando os dados RFU brutos gerados pelo instrumento qpcr. 11. Diluir o ADN nas placas de amplicon com H 2 O esterilizada, para que a concentração final de ADN seja aproximadamente de 67 ng/µl. Se a concentração de ADN for igual ou superior a 150 ng/µl: adicionar 25 µl de H 2 O Se a concentração de ADN se situar entre ng/µl: adicionar 10 µl de H 2 O Se a concentração de ADN for inferior a 100 ng/µl: adicionar 0 µl de H 2 O Página 47 49

48 Anexo 3: Quantificação de biblioteca, utilizando um corante fluorescente dsadn intercalar Duração: ~15 minutos A concentração da biblioteca selecionada por tamanho pode ser medida com exatidão através de um corante fluorescente de dsadn intercalar como, por exemplo, SYBR verde ou equivalente. Os kits e instrumentos comercialmente disponíveis para este fim incluem, por exemplo, o leitor Qubit da Thermo Fisher (utiliza o kit de exame Qubit Broad-Range dsadn), o leitor Quantus da Promega (utiliza o corante fluorescente Quantifluor dsadn), entre outros. Aqui, o método Qubit é descrito como o instrumento mais utilizado. Caso seja utilizado outro instrumento e kit, siga as instruções padrão do fabricante. Lista de reagentes Nota: Este método fluorométrico dsadn é uma forma rápida, porém exata, de determinar a concentração da biblioteca final selecionada pelo tamanho. Permite medir a totalidade de dsadn presente na biblioteca. Item Armazenamento Fornecido por Kit de exame Qubit dsadn BR temperatura ambiente Thermo Fisher Padrões Qubit dsadn BR 4 C Thermo Fisher Biblioteca selecionada por tamanho 4 C Passo 5 Protocolo 6.1 Colocar os padrões Qubit Standards à temperatura ambiente. Preparar tubos de ensaio Qubit (500 µl, de parede fina) para a sua biblioteca em duplicado e os dois padrões. Agitar e centrifugar os padrões e a biblioteca. 6.2 Adicionar 995 µl de tampão e 5 µl de corante num tubo de centrifugação de 1,5 ml. Agitar e centrifugar. 6.3 Transferir 190 µl da mistura de reagentes para os tubos Qubit, para os dois padrões. Transferir 198 µl da mistura de reagentes para os dois tubos Qubit, para os duplicados da biblioteca. 6.4 Adicionar 10 µl do padrão 1 ao tubo Qubit correspondente e agitar durante 2 segundos. Repetir o processo para o padrão Adicionar 2 µl da biblioteca aos dois tubos Qubit correspondentes e agitar durante 2 segundos. 6.6 Incubar os tubos Qubit à temperatura ambiente durante 2 minutos. 6.7 Ligar a máquina Qubit e escolher o protocolo BR. Página 48 49