UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE QUÍMICA Programa em Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Bioquímica)

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1 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE QUÍMICA Programa em Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Bioquímica) ADRIANO SARTORI Toxicidade de Aminoacetona a Células Produtoras de Insulina São Paulo Data do Depósito na CPG 20/01/2010

2 ADRIANO SARTORI Toxicidade de Aminoacetona a Células Produtoras de Insulina Tese apresentada ao Instituto de Química da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências (Bioquímica). Orientador: Prof. Dr. Etelvino José Henriques Bechara São Paulo 2010

3 Adriano Sartori Toxicidade de Aminoacetona a Células Produtoras de Insulina Aprovado em: Dissertação apresentada ao Instituto de Química da Universidade de São Paulo para obtenção do Título de Doutor em Ciências (Bioquímica). Banca Examinadora Prof. Dr. Instituição: Assinatura: Prof. Dr. Instituição: Assinatura: Prof. Dr. Instituição: Assinatura: Prof. Dr. Instituição: Assinatura: Prof. Dr. Instituição: Assinatura:

4 Dedico esta tese aos meus pais Walter Sartori e Yvonne Bronzeri Sartori e ao meu irmão Fábio Sartori. Pelo apoio incondicional, pois sem eles nada disto seria possível.

5 Agradecimentos Agradeço ao meu orientador Dr. Etelvino Bechara pelo apoio, companheirismo, paciência e discussões científicas. À Dra. Mari Cleide Sogayar por disponibilizar as culturas de células RINm5f bem como seu laboratório para a realização de muitos experimentos, além de apoio e amizade. À Dra. Alícia Kowaltowski e à Dra. Ana Maria da Costa Ferreira, por me aceitarem como aluno de iniciação científica em seus laboratórios, despertando meu interesse para a área acadêmica. Ao meu amigo Dr. Humberto Miguel Garay-Malpartida e em especial a Maria Fernanda Forni, uma pessoa fantástica, competente e ótima cientista. Muitos dos resultados apresentados nesta tese são frutos do trabalho de ambos. Aos meus amigos desde o tempo de graduação e que acabaram por me acompanhar também na pós-graduação: Danilo Bilches Medinas, Graciele Almeida de Oliveira, Lívia Fujita Barbosa, Luciana Mantzouranis e Lizandra B. R. Castro. À Vanessa Cardoso, colega de laboratório, a qual admiro por sua perseverança, dedicação e amizade. Ao Dr. Fernando Dutra por ensinar a síntese da aminoacetona e por ajudar no início do Doutorado. Ao Dr. Pio Colepicolo Neto e ao Dr. Renato Lahos, pelos experimentos para a determinação de GSH. Aos técnicos da Central Analítica: Wilton, Adriana e Márcio.

6 Ao Dr. Robert Ivan Schumacher pela amizade, discussões, incentivo e ensino da citometria de fluxo. À minha namorada Sara Chacon, pelo apoio e paciência com meus horários alternativos, meus fins de semana experimentais e minhas idas aos congressos. Ao grupo da Dra. Mari Cleide Sogayar, por sua receptividade e amizade durante todos estes anos. A todo pessoal do laboratório que proporcionou um ótimo ambiente de trabalho e que foram importantes para o desenvolvimento da tese através de discussões e idéias: Dóris Araújo, Adriana Wendel, Dr. Cassius Stevani, Camila Marinho Mano, Rita Tokikawa, Chrislaine Soares, Júlio Massari Filho, Douglas Ganini, Anderson Garbuglio, Luiz Fernando Mendes, Olívia Domingues e Dr. Nílson Assunção. Aos meus amigos da Pós-Graduação: Graziella Ronsein, Fernanda Manso Prado, Fernanda Cerqueira, Lauren Camargo e Júlio Rozenfeld. À FAPESP, CAPES, CNPq e INCT Redoxoma pelo apoio financeiro.

7 Um cientista em seu laboratório não é um mero técnico: é também uma criança que confronta os fenômenos naturais que o impressionam como faziam os contos de fada. (Marie Curie) Nunca ande pelo caminho traçado, pois ele conduz apenas onde os outros já foram. (Alexander Graham Bell)

8 Resumo (Sartori, A.) Toxicidade de Aminoacetona a Células Produtoras de Insulina p. Tese de Doutorado Programa de Pós Graduação em Ciências (Bioquímica). Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo. Danos induzidos por hiperglicemia em tecidos no diabetes são caracterizados por quatro mecanismos conectados: aumento do fluxo metabólico através da via do poliol, ativação da proteína quinase C (PKC), aumento da atividade da via das hexosaminas e aumento da produção intracelular dos precursores dos produtos finais de glicação avançada (AGEs). Entre eles, os derivados de metilglioxal, um potente agente de modificação de proteínas e DNA, têm sido associados a complicações microvasculares no diabetes: nefropatia, retinopatia e neuropatia. O metilglioxal é produzido a partir das trioses fosfato, acetona e aminoacetona, um catabólito de treonina e glicina, gerado na matriz mitocondrial. A aminoacetona sofre oxidação enzimática, catalisada por aminoxidase sensível a semicarbazida (SSAO), ou química, catalisada por íons de cobre e ferro, produzindo metilglioxal, H 2 O 2 e NH + 4. Sabendo que metilglioxal e H 2 O 2 são capazes de induzir apoptose e/ou necrose em células produtoras de insulina (RINm5f) propomos uma possível atividade pró-oxidante da aminoacetona sobre células beta do pâncreas. O tratamento destas linhagens com aminoacetona/cu(ii) aumentou a morte celular, fluxo de Ca 2+ intracelular, produção de NO, fragmentação do DNA, depleção dos níveis de glutationa reduzida (GSH), expressão gênica da proteína apoptótica Bax, enzimas antioxidantes - glutationa

9 peroxidase (GPx), glutationa redutase (GRd), catalase e isoformas de superóxido dismutases (CuZnSOD e MnSOD) - e óxido nítrico sintase induzida (inos). Embora as concentrações normais e patológicas da aminoacetona, provavelmente seja muito menores que as usadas nos experimentos, sugerimos que, em tecidos de diabéticos, um acúmulo da aminoacetona em longo prazo pode conduzir a danos oxidativos e eventualmente morte das células beta do pâncreas. Palavras chaves: aminoacetona, metilglioxal, peróxido de hidrogênio, estresse oxidativo, diabetes, células RINm5f.

10 Abstract (Sartori, A.) Cytotoxity of aminoacetone on insulin-producing cells p. PhD Thesis Graduate Program in Biochemistry. Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo. Tissue damages induced by hyperglycemia in diabetics are characterized by four linked mechanisms: increased flux through the polyol pathway, protein kinase C (PKC) activation, increased hexosamine pathway activity and intracellular production of advanced glycation end product (AGE) precursors. The production of AGEs by modifying proteins and DNA agent, such as methylglyoxal, has been implicated in microvascular complications in diabetes: nephropathy, retinopathy and neuropathy. Methylglyoxal is putatively produced in vivo from trioses phosphate, acetone and aminoacetone, a catabolite of threonine and glycine synthesized in the mitochondrial matrix. Aminoacetone has been reported to undergo semicarbazide sensitive amine oxidase- catalyzed and copper- and iron-catalyzed oxidations by molecular oxygen to methylglyoxal, NH + 4 ion and H 2 O 2. Considering that methylglyoxal and H 2 O 2 have been found to promote apoptosis/necrosis to insulin-producing cells (RINm5f), we propose a possible pro-oxidant role of aminoacetone in pancreatic beta-cells. Treatment of RINm5f cells with aminoacetone plus Cu(II) ion promotes an increase of non-viable cells, influx of Ca 2+ ions, NO production, DNA fragmentation, depletion of reduced glutathione (GSH) levels, and increased mrna expression of pro-apoptotic protein (Bax), antioxidant enzymes - glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GRd), MnSOD,

11 CuZnSOD and catalase - and inducible nitric oxide synthase (inos). Although both normal and pathological concentrations of aminoacetone are probably much lower than those used here, it is tempting to propose that excess aminoacetone in diabetic patients, at long term, may drive oxidative damage and eventually death of pancreatic beta-cells. Keywords: aminoacetone, methylglyoxal, hydrogen peroxide, oxidative sress, diabetes, RINm5f cells.

12 Lista de Abreviaturas 1 H-RMN - Ressonância Magnética Nuclear de Prótons AA Aminoacetona AGEs - Produtos Finais de Glicação Avançada ALA - Ácido 5-aminolevulínico AVC Acidente Vascular Cerebral CCT Complexo de Clivagem da Treonina Cit P 450 Citocromo P 450 CuZnSOD Cobre-Zinco Superóxido Dismutase DAF-FM Diacetato de 4,5-diaminofluoresceína DAG Diacilglicerol DHAP Dihidroxiacetona fosfato DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium DMSO Dimetilsulfóxido DTPA - Ácido dietilenotriaminopentaacético ERNs - Espécies Reativas de Nitrogênio EROs - Espécies Reativas de Oxigênio GAPDH - Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase GFAT - Glutamina:frutose-6-fosfato amidotransferase GPx Glutationa peroxidase GRd Glutationa redutase GSH Glutationa reduzida GSSG Glutationa oxidada HL60 Células Leucêmicas Promielocitícas Humanas HRP - Peroxidase de raiz forte inos - Óxido Nítico Sintase Induzida IP Iodeto de propídeo MG Metilglioxal MnSOD Manganês Superóxido Dismutase MTT - Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio NAC - N-Acetilcisteína NEM - N-etilmaleímida

13 NIH 3T3 Linhagem Celular de Fibroblastos Embrionários de Rato PARP - Poli(ADP) Ribose Polimerase PBS Tampão fosfato-salino PKC Proteína Quinase C RINm5f - Linhagem clone de células beta pancreáticas RPMI meio Roswell Park Memorial Institute RT-PCR PCR Quantitativo em Tempo Real SFB Soro Fetal Bovino SSAO Aminoxidase sensível a semicarbazida t-butooh - terc-butil hidroperóxido TMS Tetrametilsilano TOPA - 6-hidróxidopa: 2,4,5-trihidróxifenilalanina TPI Triose Fosfato Isomerase UDP-GLc-Nac - UDP-N-acetil glucosamina

14 Índice 1 INTRODUÇÃO Diabetes: epidemiologia, classificação e bioquímica α-aminocetonas, α-oxoaldeídos e aminoxidases OBJETIVOS MATERIAIS E MÉTODOS Materiais Métodos Preparação de aminoacetona Caracterização química da acetoamidoacetona e aminoacetona Consumo de O2 por aminoacetona no meio de cultura RPMi Testes de viabilidade celular a Medidas de viabilidade celular pós-adição da aminoacetona b Testes com metilglioxal c Testes com peróxido de hidrogênio c.1 Determinação de peróxido de hidrogênio (método de Cotton e Dunford) d - Efeito do soro fetal bovino na viabilidade celular e Testes com fibroblastos Fragmentação de DNA celular Medidas de fluxo de cálcio intracelular por citometria de fluxo Expressão gênica de proteínas antioxidantes (catalase, CuZnSOD, MnSOD, GRd e GPx), Pró- (Bax) e anti- (Bcl-2) apoptóticas e inos Medidas da atividade da SOD total (CuZnSOD + MnSOD), catalase, GRd e GPx Quantificação de GSH Medidas da produção de NO por citometria de fluxo Análise estatística dos dados RESULTADOS E DISCUSSÃO Otimização da síntese da aminoacetona Cinética de consumo de oxigênio por aminoacetona presente no meio de cultura RPMi 1640, na ausência e presença de soro fetal bovino Ação citotóxica de metilglioxal às células RINm5f Ação citotóxica de H2O2 às células RINm5f Ação citotóxica da aminoacetona às células RINm5f em cultura...57

15 4.6 Efeito protetor de soro fetal bovino adicionado as culturas de RINm5f Efeitos da adição de Fe(II), Fe(III) e Cu(II) a culturas de RINm5f tratadas com aminoacetona Testes com antioxidantes em culturas de células RINm5f tratadas com aminoacetona na ausência de soro fetal bovino Ensaio comparativo da ação citotóxica da aminoacetona em culturas de células beta (RINm5f) e fibroblastos (NIH-3T3) Medidas da expressão gênica de enzimas antioxidantes (catalase, CuZnSOD, MnSOD, GRd e GPx) de culturas de células RINm5f tratadas com aminoacetona Medidas da atividade da catalase, SOD (CuZnSOD + MnSOD), GRd e GPx de culturas de células RINm5f tratadas com aminoacetona a Catalase b Superóxido Dismutase (CuZnSOD + MnSOD) c Glutationa Redutase d Glutationa Peroxidase Quantificação de GSH em culturas de células RINm5f tratadas com aminoacetona Medidas da produção de NO por citometria de fluxo de culturas de células RINm5f tratadas com aminoacetona Medidas da expressão gênica da inos em culturas de células RINm5f tratadas com aminoacetona Expressão gênica de proteínas pró- (Bax) e anti- (Bcl-2) apoptóticas em culturas de células RINm5f tratadas com aminoacetona Fragmentação do DNA de culturas de células RINm5f induzida pelo tratamento com aminoacetona Medidas do fluxo intracelular de cálcio de culturas de células RINm5f tratadas com aminoacetona CONCLUSÕES REFERÊNCIAS ANEXO A ANEXO B SÚMULA CURRICULAR

16 15 1 INTRODUÇÃO 1.1 Diabetes: epidemiologia, classificação e bioquímica A história do diabetes mellitus remonta a aproximadamente anos, desde sua descoberta, descrição e pesquisas sobre causas e tratamentos (Sanders, 2002). O número de casos da doença em todo mundo atingiu cerca de 171 milhões de pessoas em 2000 e pode chegar a mais de 350 milhões em 2030 (Wild et al., 2004). Apenas nos Estados Unidos, estima-se que os casos da doença atingiram cerca de 20 milhões de pessoas em 2007, o que custou ao país aproximadamente 120 bilhões de dólares em campanhas publicitárias, pesquisas e tratamentos (International Diabetes Federation, 2010). O Ministério da Saúde do Brasil constatou, em 2009, que 5,2% da população adulta (acima dos 18 anos) é diabética. O estilo de vida sedentário aliado a uma má alimentação é um grande passo para a aquisição do diabetes tipo 2 (Narayan e Williamson, 2010), sendo os países em desenvolvimento os mais afetados pela doença, devido à adoção do estilo de vida cada vez mais parecido com o americano (Tuchman, 2009). Por ser predominante, o diabetes tipo 2, é a forma que concentra maior número de estudos sobre seu desenvolvimento e tratamento (Israili, 2009). No que concerne ao diabetes tipo 1, uma doença autoimune, a hiperglicemia é o resultado da destruição das células produtoras de insulina (Hawa et al., 2009; Skyler, 2007). Por isso, ainda não há uma forma eficaz de tratamento da doença (Cernea et al., 2009), apesar de o transplante de ilhotas ser considerado uma das alternativas de tratamento (Corrêa-Giannella e Raposo do Amaral,

17 ). O primeiro transplante de ilhotas no Brasil foi realizado com a colaboração da Profa. Dra. Mari Sogayar do IQ-USP (Eliaschewitz et al., 2004). Outra proposta para um tratamento eficaz da doença poderá resultar do estudo de células-tronco (Couri e Voltarelli, 2009). Todas as formas de diabetes são caracterizadas por hiperglicemia crônica e o desenvolvimento de patologias na retina, nervos periféricos e glomérulos renais (Brownlee, 2001). O diabetes também é associado com o aceleramento da aterosclerose macrovascular, a qual afeta as artérias que suprem o coração, cérebro e membros inferiores. Como resultado, pacientes com diabetes têm alto risco de sofrer infarto no miocárdio, amputações de membros inferiores e acidente vascular cerebral (AVC) (Brownlee, 2001; Wei et al., 1998). Danos que ocasionam disfunção mitocondrial são atualmente associados ao desenvolvimento do diabetes tipo 2 (Friederich et al., 2009; Schiff et al., 2009). Esses danos são precedidos por estresse oxidativo (Munusamy e MacMillan-Crow, 2009; Houstis et al., 2006) e sugerem a MnSOD como um dos prováveis alvos de estudo para elucidar/tratar a doença (Nishikawa e Araki, 2007; Bertera et al., 2003). Durante muitos anos, a relação entre hiperglicemia e desenvolvimento de patologias microvasculares e macrovasculares não era totalmente entendida, porém, hoje há quatro hipóteses sobre como a hiperglicemia pode causar as complicações no diabetes. São elas: (1) aumento do fluxo na via de formação do sorbitol, a partir da ativação da enzima aldose redutase (Lorenzi, 2007); (2) formação dos produtos finais de glicação avançada (AGEs), a partir da decomposição dos produtos de Amadori a 3- deoxiglucasona (Monnier et al., 2008), autoxidação da glicose a glioxal (Grillo e Colombatto, 2008) e aumento na formação de metilglioxal (Kalapos, 2008); (3) ativação

18 17 das isoformas da proteína quinase C (PKC), a partir do aumento da concentração de diacilglicerol (DAG) (Das Evcimen e King, 2007); e (4) aumento do fluxo através da via das hexosaminas, com formação de UDP-N-acetil glucosamina (UDP-GLc-Nac), a partir da frutose 6-fosfato, a qual acarreta O-glicosilação de resíduos de treonina e serina em fatores de transcrição, resultando em mudanças patológicas na expressão gênica (Hu et al., 2009). Em fins de 2009, o PubMed registrou aproximadamente referências sobre o verbete Diabetes, porém, até pouco tempo atrás, não havia relatos que interligassem as quatro hipóteses bioquímicas de danos causados pela hiperglicemia. Primeiro, porque faltava um elemento comum e, segundo, porque todas as tentativas de tratamento pontual de cada uma das hipóteses haviam falhado (Brownlee, 2005). Porém, em 2000, o grupo do pesquisador Michael Brownlee (Albert Einstein College of Medicine, New York) apresentou dados que suportam a hipótese de que a hiperglicemia eleva a produção do O 2 - na mitocôndria, ativando o ciclo das hexosaminas (Du et al., 2000) e que a normalização da produção do O 2 - a partir da mitocôndria inibe a ativação das isoformas da PKC bem como a formação de AGEs e sorbitol (Nishikawa et al., 2000). Estes resultados corroboraram resultados anteriores de outros grupos de pesquisa que ligavam a hiperglicemia ao desenvolvimento de um quadro de estresse oxidativo no diabetes (Ceriello et al., 1993; Wolf et al., 1991). Em um estado hiperglicêmico, há elevado influxo celular de glicose. Esse excesso de glicose é oxidado, gerando elevadas concentrações de coenzimas reduzidas, sobrecarregando a cadeia de transporte de elétrons da mitocôndria, o que deve comprometer o transporte de elétrons através do complexo III. Espera-se,

19 18 conseqüentemente, aumento do vazamento de elétrons ao nível da coenzima Q e, a partir daí, redução unieletrônica da molécula de oxigênio ao O 2 - (Korshunov et al., 1997). Estes dados permitiram conectar a ocorrência de elevadas concentrações do O 2 - com as quatro hipóteses. Du e colab. (2000) reportaram que o aumento da produção de O 2 - acarreta diminuição da atividade da gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH), enzima da via glicolítica. Sabe-se que esta enzima pode ser inativada por H 2 O 2 e O 2 - através da oxidação de grupos sulfidrilas presentes em seu sitio ativo (Brodie e Reed, 1987). Como esta inativação é reversível, este evento não se encaixaria bem no modelo proposto para hiperglicemia/estresse oxidativo. Garcia Soriano e colab. (2001) demonstraram que a hiperglicemia, através da elevada geração de espécies reativas de nitrogênio (ERNs) e oxigênio (EROs), ativa a poli(adp) ribose polimerase (PARP), uma enzima reparadora de DNA. Considerando que: (i) uma vez ativada, a PARP cliva o NAD + em ácido nicotínico e ADP-ribose, cujo polímero é capaz de se ligar a proteínas contidas no núcleo, inativando-as (Love et al., 1999; de Murcia et al., 1997) e (ii) há translocação bidirecional da enzima GAPDH para o núcleo (Schmidtz et al., 2003; Sawa et al., 1997), foi proposto por Brownlee (2005) que a ativação da PARP pela elevada concentração de espécies reativas, com conseqüente ligação dos polímeros de ADP-ribose à GAPDH, seria o ponto de cruzamento entre as quatro hipóteses (Esquema 1).

20 19 Esquema 1: Conexões metabólicas entre hiperglicemia e estresse oxidativo em diabetes. A superprodução de O 2 - e a inibição da gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase ativam as quatro principais vias de danos causados pela hiperglicemia (Modificado de Brownlee, 2005). Neste contexto, é importante mencionar que, Du e colab. (2003) haviam demonstrado que ratos nocautes para a PARP, quando submetidos à hiperglicemia (30 mm de glicose), não apresentavam a enzima GAPDH com os polímeros de ADP-ribose. Porém, os animais não nocauteados para PARP, em estado de hiperglicemia, tinham um aumento da ADP-ribosilação da enzima. Dessa maneira, a princípio, fica claro que a GAPDH constitui um ponto crucial no circuito metabólico do diabetes e pode ser um fator chave para a elucidação de novas drogas e terapias contra o diabetes.

21 α-aminocetonas, α-oxoaldeídos e aminoxidases Um aumento na produção de EROs e ERNs no organismo acarreta danos oxidativos a lipídeos, proteínas, carboidratos e DNA, promovendo o aparecimento de compostos carbonílicos reativos que muitas vezes instalam um estado patológico (Ellis, 2007). Doenças como o diabetes estão agora sendo associadas a um acúmulo destes compostos carbonílicos reativos, caracterizando-se um estado metabólico freqüentemente denominado de estresse carbonílico (Duran-Jimenez et al., 2009; Turk, 2009; Ceriello e Motz, 2004). Metilglioxal (Yao e Brownlee, 2009; Duran-Jimenez, 2009), 4-hidroxi-2-nonenal (produto da peroxidação lipídica) (LoPachin et al., 2009), 3- deoxiglucasona (Nakayama et al., 2008) e a aminoacetona (Sartori et al.; 2008, Dhar et al.; 2008) são exemplos de catabolitos associados ao estresse carbonílico no diabetes. α-aminocetonas (ex., aminoacetona e ácido 5-aminolevulínico) e α- hidroxicetonas (ex., dihidroxiacetona fosfato), na forma dienólica, comportam-se como polifenóis (ex., 6-hidroxidopamina e divicina), ao doar um elétron ao oxigênio molecular gerando O 2 -, principalmente se o meio for ligeiramente alcalino (> ph 7,4) e contiver íons fosfato, que atua como catalisador da enolização (Bechara et al., 2006). Além de espécies reativas de oxigênio, a oxidação aeróbica de α-aminocetonas produz α- oxoaldeídos, reconhecidos há muitas décadas como moléculas capazes de reagir com DNA e resíduos sulfidrila de cisteína e amino de arginina e lisina (Takahashi, 1977; Sartorelli et al., 1965; Schubert, 1935, 1936).

22 21 O estudo de α-aminocetonas pelo grupo do Prof. Etelvino Bechara começou com o ácido 5-aminolevúlinico, ALA, (Hermes-Lima et al., 1992; Monteiro et al., 1989), precursor da síntese do grupo heme. Acúmulo de ALA no sangue e tecidos (principalmente cérebro e fígado) foi constatado em pacientes de porfíria aguda intermitente hereditária e intoxicação por chumbo, uma porfíria adquirida (Costa et al., 1997; Demasi et al., 1996; Bechara, 1996; Hindmarsh, 1993; Conley e Chisholm, 1979). Os produtos de oxidação do ALA são H 2 O 2, NH + 4 e o ácido 4,5-dioxovalérico, este último um catabolito potencialmente genotóxico, pois foi capaz de promover in vitro a formação de adutos cíclicos em resíduos de guanina e adenina (Douki et al.; 1998a). Demonstrou-se in vitro e in vivo que a oxidação do ALA gera radicais hidroxila (Timmins et al., 1999; Douki et al., 1998b) e produz danos a mitocôndrias isoladas de fígado de rato (Vercesi et al., 1994) e de ratos tratados intraperitonialmente com ALA (Pereira et al.; 1992). Similarmente ao ALA, duas outras α-aminocetonas a aminoacetona, um catabolito de treonina e glicina inicialmente investigada por Dutra e colab. (2001) e estudada nesta tese no que toca às suas propridades tóxicas a céulas beta e a 1,4- diamino-2-butanona (DAB), um análogo da putrescina responsável por inibir a proliferação de Trypanosoma cruzi (Vannier-Santos et al., 2008), também se revelaram como fontes de EROs e α-oxoaldeídos em meio aerado. Todas elas aminoacetona, ALA e DAB - possuem um amino grupo vicinal à carbonila. Esta característica estrutural torna esta molécula passível de enolização catalisada por fosfato, com subseqüente oxidação pelo oxigênio na presença de Fe(II) ou Cu(II), produzindo um α-oxoaldeído

23 22 (metilglioxal, no caso de aminoacetona), H 2 O 2, O 2 - e NH4 + (Bechara et al., 2006) (Esquema 2). Esquema 2: Mecanismo de oxidação aeróbica não enzimática de α-aminoacetonas (Reproduzido de Bechara e colab. 2006). Metabolitos de natureza α-hidroxicarbonílica, como aldoses, aldiminas e dihidroxiacetona (DHAP), também são passíveis de enolização a enedióis, cujo potencial de redução também é negativo o suficiente para transferir elétron para o oxigênio formando O 2 - e radical enoila como demonstrado por Mashino e Fridovich, (1987) para a DHAP. Neste caso, o produto final é o hidroxipiruvaldeído, também altamente reativo frente a nucleófilos como resíduos de cisteina e lisina de proteinas. Segundo Mátyus e colab. (2004) e outros autores, aminoacetona também pode sofrer oxidação enzimática catalisada por uma aminoxidase sensível a semicarbazida (SSAO), promovida por um cofator redox da classe das quinonas, denominado TOPA (6-hidróxidopa: 2,4,5-trihidróxifenilalanina), e por isso é inibida via adição de Michael

24 23 por moléculas que possuem um grupo nucleofílico, como derivados de hidrazina e de propargilamina. As SSAOs são capazes de catalisar a oxidação aeróbica de aminas primárias, endógenas ou xenobióticas, gerando seus aldeídos correspondentes, H 2 O 2 e + NH 4 (Obata, 2006) (Equação 1). Dessa maneira, Xiao e Yu, (2009) explicam a participação de SSAOs no desenvolvimento do diabetes. SSAO RCH 2 NH 2 + O 2 + H 2 O RCHO + NH 3 + H 2 O 2 Equação 1 - Desaminação oxidativa de aminas primárias por SSAO. As SSAOs distinguem-se das monoamina oxidases, pelo fato de estas não serem inibidas por semicarbazida. A denominação SSAO não é totalmente correta, pois outras amino oxidases também são inibidas por semicarbazida, incluindo diamino oxidases, também classificadas como lisil oxidases (Smith-Mungo e Kagan, 1998), as quais se diferem por utilizarem uma lisinatirosilquinona, ao invés do TOPA, como cofator (Wang et al., 1997). Na maioria dos mamíferos, as SSAOs existem sob duas isoformas - ligada a tecidos ou solúveis (plasma) - hipoteticamene relacionadas com o diabetes (Obata, 2006). Há variações na atividade da SSAO em plasma e tecidos de mamíferos (Boomsma et al., 2000). Elevadas atividades de SSAO são associadas a células cardiovasculares do músculo liso, tecido adiposo, pulmão e cartilagem (Hernandez et al., 2006). São ausentes em nervos e células gliais do cérebro, mas presentes nos microvasos cerebrais (Castillo, 1997). Vale ressaltar que alguns estudos não conseguiram demonstrar atividade de SSAO na região endócrina do pâncreas de humanos (Ramonet et al., 2003; Andrés et al., 2001) e outros demonstraram que hà

25 24 uma atividade de SSAO em pâncreas e ilhotas de ratos (Abella et al., 2003; Hayes e Clarke, 1990). Recentes estudos revelaram a participação de SSAO em desordens relacionadas ao déficit de atenção (Roessner et al., 2006), a estados de falha renal crônica (Nemcsik et al., 2007), à ativação de receptores GLUT-4 em conjunto com MAO, com concomitante captação de glicose (McDonald et al., 2007; Abella et al., 2003), a doenças neurodegenerativas como o mal de Alzheimer (Jiang et al., 2008; Unzeta et al., 2007), ao aumento do tecido branco adiposo de ratos (Carpéné et al., 2008), e, destacadamente, a danos vasculares (Gokturk et al., 2007). Diante desse quadro, torna-se difícil definir uma função metabólica para as SSAOs, principalmente porque os produtos gerados pelas reações catalisadas por + estas enzimas EROs, metilglioxal e NH 4 (Esquema 3) são potencialmente mais tóxicos que os próprios substratos (O Sullivan et al., 2004). Esquema 3 Oxidação química e enzimática da aminoacetona (AA), gerando metilglioxal (MG), H 2 O 2 e NH 4 + (Sartori et al., 2008).

26 25 Há ainda uma terceira via de oxidação da aminoacetona segundo Hiraku e colab. (1999), os quais afirmam que, em altas concentrações (não citadas no artigo), duas moléculas de aminoacetona se condensam resultando na formação da 2,5- dimetilpirazina. Segundo os mesmos autores, tanto a via de formação da 2,5- dimetilpirazina quanto a do metilglioxal, só acontecem na presença de Cu(II) e ambas têm H 2 O 2 e O 2 - como produto final e intermediário (Esquema 4). A elevada formação de AGEs e possivelmente de aminoacetona e metilglioxal estão relacionadas a um aumento nas concentrações de glicose (Kalapos, 2008). Em especial, o estudo do papel do metilglioxal em diabetes tem despertado o interesse de muitos pesquisadores, pois se trata de um potente agente modificador de proteínas e DNA (Synold et al., 2008; Frischmann et al., 2005), possivelmente associado à neuropatia, nefropatia, retinopatia e arteriosclerose típicas de diabetes (Kalapos, 2008; Ahmed e Thornalley, 2007). A concentração plasmática de metilglioxal em sujeitos normais está em torno de 500 nm, podendo ser elevada de 5 a 6 vezes em pacientes de diabetes tipo 1 e de 2 a 3 vezes em pacientes de diabetes tipo 2 (Thornalley, 1996). A variabilidade nas concentrações detectadas de metilglioxal em plasma de pacientes diabéticos deve estar relacionada à alta reatividade da molécula e aos diferentes métodos utilizados para analisar metilglioxal em amostras biológicas (Dhar et al., 2009). Estudos com linhagens de células produtoras de insulina derivadas de células beta (NIT-1 e RINm5f), desafiadas com metilglioxal ou H 2 O 2 (Nakamura et al., 2006; Sheader et al., 2001), mostraram que ambos os metabólitos induzem apoptose a estas linhagens. O processo de morte celular promovido por estas moléculas pode estar ligado a danos a mitocôndrias, a DNA e ao aumento intracelular da concentração de

27 26 íons cálcio e de íons de metais de transição (Fe(II) e Cu(I)), como sugerido por estudos com células beta e linhagens delas derivadas (Lee et al., 2009; Synold et al., 2008; Hamelin et al., 2007; Hamada et al., 2005; Wittmann et al., 2001). Outros estudos também apontam para um papel sinalizador do H 2 O 2 na produção de insulina por células beta (Pi et al., 2007), o que poderia estar associado à baixa atividade antioxidante detectada nestas células (Lenzen, 2008). Além da oxidação da aminoacetona via catabolismo da treonina, o metilglioxal é gerado também endogenamente a partir das trioses fosfatos (via glicolítica) e acetona (oxidada pelo citocromo P 450 ) (Esquema 5), sendo que a via de detoxificação do metilglioxal utiliza o sistema das glioxalases (Kalapos, 1999a). Esta via, dependente de GSH, foi estudada pelo Prêmio Nobel Szent-Györgyi (1967), quando postulou que o metilglioxal (retina) atua como agente bloqueador da proliferação celular, em que a glioxalase II (promina) agiria como um desbloqueador através da retirada do metilglioxal do sistema, tendo como produto final o ácido D-lático (Kalapos, 1999a; Kalapos, 1994). Assim, durante um estado de privação nutricional, como no diabetes, onde a razão acetil-coa/coash aumenta, a enzima produziria principalmente aminoacetona (House et al., 2001) (Esquema 6). Outros estudos demonstraram que a atividade da enzima treonina desidrogenase, responsável pela oxidação de treonina a glicina e acetil-coa (Guerranti et al., 2001) são altas no fígado e pâncreas de porcos (Le Floc h et al., 1997) e que em ratos esta via corresponde a 87% do catabolismo da treonina (Bird e Nunn, 1983). Mais recentemente Wang e colab. (2009) mostraram que células-tronco embrionárias de camundongo possuem elevados níveis de mrna, proteína e atividade da enzima treonina desidrogenase. Em humanos, o catabolismo da treonina através da treonina

28 27 desidrogenase ainda é controverso. Zhao e colab. (1986) e Darling e colab. (2000) mostraram que, em humanos, a treonina desidrogenase responde por apenas 7-11% do catabolismo da treonina e que a rota principal de oxidação da treonina é a catalisada por L-serina/treonina desidratase, enquanto, resultados de Northern blotting de homogenatos de pâncreas humano mostraram que há expressão gênica para o mrna da 2-amino 3-cetobutirato coenzima A ligase, a segunda enzima na conversão de treonina em glicina e acetil CoA (Edgar e Polak, 2000). Os próprios autores, porém, sugerem que mais estudos sejam realizados a fim de se estabelecer com segurança qual rota de oxidação da treonina é a principal em humanos e, não sendo via treonina desidrogenase, o porquê da diferença em outros animais. Deve-se ressaltar, contudo, que estudos in vitro revelaram que a aminoacetona é um pró-oxidante poderoso promotor de danos oxidativos em biomoléculas e organelas celulares: (i) na presença de Cu(II), promove danos ao DNA de células leucêmicas promielocitícas humanas (HL60) (Hiraku et al., 1999); (ii) consome oxigênio na presença de ferritina, induzindo a liberação de ferro, além de causar perda da atividade ferroxidásica da apoproteína, bem como de sua capacidade de captação de Fe(III) (Dutra et al., 2003); (iii) induz permeabilização mitocondrial através da abertura de poros sensíveis a ciclosporina-a e dependentes de cálcio, acarretando inchamento mitocondrial (Dutra e Bechara, 2004); e (iv) induz agregação de proteína, liberação de cobre e diminuição da atividade ferroxidásica da ceruloplasmina (Dutra et al., 2005), uma proteína estocadora de cobre, cuja concentração em diabéticos é bastante elevada (Daimon et al., 1998).

29 28 Esquema 4: Mecanismos prospostos por Hiraku e colab. (1999) para explicar danos em DNA promovidos por aminoacetona. (A) Via de formação de metilglioxal e H 2 O 2 através da oxidação química da aminoacetona. (B) Via de formação da 2,5 dimetilpirazina e H 2 O 2 através da condensação de duas moléculas de aminoacetona (Modificado de Hiraku e colab. (1999)).

30 29 Esquema 5 - Rotas metabólicas de formação do metilglioxal (Sartori et al., 2008) Esquema 6 Metabolismo da Treonina (Reproduzido da Tese de Doutorado do Dr. Fernando Dutra 2003). Diante do exposto acima e considerando o papel de EROs e ERNs no envelhecimento e morte celular é pertinente questionar se aminoacetona, como agente

31 30 agregador de proteínas, em virtude de seus grupos funcionais amínico e carbonílico, ou se seus produtos de oxidação por oxigênio (radicais de oxigênio, H 2 O 2 ), poderia contribuir com metilglioxal na indução de morte de células pancreáticas produtoras de insulina.

32 31 2 OBJETIVOS Objetivo central: Demonstrar que a aminoacetona, um catabólito de treonina e glicina putativamente acumulado em diabetes, contribui para danos a biomoléculas e estruturas celulares e eventualmente morte de células beta, através da produção exacerbada de espécies reativas de oxigênio e metilglioxal durante sua oxidação aeróbica não enzimática, respondendo assim, pelo menos parcialmente, pelas manifestações clínicas desta devastadora doença. Justificativas: Embora SSAO seja uma amino oxidase amplamente distribuída no organismo, localizada na membrana plasmática e no plasma (Obata, 2006), ela não é específica para aminoacetona. Seu substrato mais reativo é a benzilamina, um xenobiótico (Mátyus et al., 2004; O Sullivan et al., 2004). Ekblom (1998) relatou que as concentrações de aminoacetona no plasma de pacientes com diabetes são elevadas, entretanto as concentrações fisiológicas deste metabólito permanecem desconhecidas. Sabe-se que a aminoacetona é um metabólito mitocondrial (Guerranti et al., 2001) e trabalhos anteriores de Bechara e colaboradores revelaram que a oxidação química da aminoacetona, catalisada por metal, é propagada por O 2 - e produz metilglioxal (Dutra et al., 2001), e que tais espécies promovem danos oxidativos a mitocôndrias isoladas de fígado de rato (Dutra e Bechara, 2004), ferritina e mioglobina (Dutra et al., 2003; Dutra et al., 2001) e ceruloplasmina (Dutra et al., 2005). Propôs-se que, uma vez produzida na matriz mitocondrial de células beta, a aminoacetona migre até o

33 32 citoplasma onde ocorrem sua oxidação e danos oxidativos às células. Segundo Zheng e colab. (2008), Turk e colab. (2006) e Wrede e colab. (2006), as concentrações de metilglioxal, íons Fe(II) e íons Cu(II) estão aumentadas no diabetes mellitus, e, segundo Lenzen (2008), células beta possuem proteção antioxidante muito baixa comparada às demais células do organismo. Estes achados reforçam a hipótese de que aminoacetona pode atuar como uma toxina endógena em diabetes. Abordagens experimentais: Linhagens de células produtoras de insulina (RINm5f) (Gazdar et al., 1980) foram desafiadas com aminoacetona, com o intuito de se verificar a viabilidade celular frente aos intermediários reativos (EROs) e produto principal (metilglioxal) oriundos da oxidação de aminoacetona. Através do método clássico do brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT), que monitora a viabilidade celular, constatamos a toxicidade da aminoacetona às células produtoras de insulina. Adicionando-se antioxidantes (SOD, catalase, N-acetilcisteína (NAC), batocuproína) ou íons de Fe(II) e Cu(II) como catalisadores ao meio de cultura, buscamos confirmar a participação de EROs nos danos causados pela aminoacetona às células. Medidas de expressão gênica (Bax, Bcl-2, inos, CuZnSOD, MnSOD, catalase, GPx, GRd), níveis de Ca 2+ intracelular, produção de NO, atividade das enzimas antioxidantes, fragmentação de DNA e medidas de níveis de GSH foram realizadas para esclarecer os mecanismos moleculares que conduziam as células à morte quando desafiadas por aminoacetona.

34 33 3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Materiais Todos os reagentes foram adquiridos da Sigma-Aldrich ou Merck. Piridina, anidrido acético, etanol e éter dietílico utilizados na síntese da aminoacetona foram purificados conforme descrito por Armarego e Perrin (1998). Todos os tampões utilizados nos experimentos foram previamente tratados com CHELEX. Linhagens de células produtoras de insulina (RINm5f) e, para comparação, de fibroblastos (NIH 3T3), bem como todo material utilizado para as culturas destas células foram fornecidos pela Prof a Mari Cleide Sogayar (IQUSP). Isto inclui o brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) e os meios Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) e Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) contendo 2,0 mg/ml (11.1 mm) e 1,0 mg/ml (5,55 mm) de glicose respectivamente, 100 unidades/ml de penicilina e 100 unidades/ml de estreptomicina acrescidos ou não com 10% de soro fetal bovino, (Kumazawa et al., 2007; Akiba et al., 2004), tripsina/edta e dimetilsulfóxido (DMSO), utilizados para as análises de viabilidade celular no leitor de microplacas ELISA e congelamento de estoque de células, além do espaço para a manipulação das culturas.

35 Métodos Preparação de aminoacetona Aminoacetona foi preparada como descrito por Hepworth (1976), onde uma mistura de glicina (1,0 mol), piridina (6,0 mol) e anidrido acético (12,0 mol) foi aquecida até o refluxo do solvente e deixada sob agitação por 6 h. Decorrido este tempo, os excessos de piridina, anidrido acético e ácido acético foram rotoevaporados à pressão reduzida, porém sem aquecimento. O resíduo, um óleo escuro, foi destilado à pressão reduzida (~0,5 mmhg). O produto, acetoamidoacetona, tem aparência oleosa e cor amarelada. A acetoamidoacetona assim obtida foi dissolvida em 350 ml de HCl 6 M. A mistura foi aquecida até a ebulição por 6 h, sob atmosfera de N 2. A solução resultante foi concentrada em rotoevaporador, sem que a temperatura do banho chegasse a 60ºC, até que toda a água, HCl e ácido acético (formado na reação) fossem eliminados. O produto obtido é um óleo castanho que foi dissolvido em etanol superseco e, após adição de éter anidro, submetido à recristalização do produto (relação etanol:éter 2:8). Por ser muito higroscópica, a aminoacetona resultante foi filtrada em atmosbag, sob atmosfera de N 2, mantida em dessecador sobre pentóxido de fósforo por várias horas, pesada em vários frascos de penicilina, selados sob nitrogênio e armazenados em congelador (-20ºC) Caracterização química da acetoamidoacetona e aminoacetona A aminoacetona foi caracterizada por análise elementar na Central Analítica do IQ-USP

36 35 utilizando o aparelho: Elementar Analyzer CHN modelo 2400 da Perkin Elmer, que permite a determinação de porcentagens de carbono, nitrogênio e hidrogênio, com erro absoluto entre 0,3 e 0,5. A caracterização química da acetoamidoacetona e da aminoacetona foi realizada por 1 H RMN (Ressonância Magnética Nuclear de Prótons) no aparelho modelo Brucker AC 200 MHz (Central Analítica IQ-USP) em solução de CDCl 3 e D 2 O, respectivamente Consumo de O 2 por aminoacetona no meio de cultura RPMi-1640 Os experimentos para a caracterização de consumo de O 2 pela aminoacetona (1,0 10 mm), com ou sem Cu(II) e Fe(II)(EDTA) 100 µm no meio de cultura RPMi-1640, na ausência ou presença de soro fetal bovino 10%, foram realizados em um oxígrafo da Hansatech Instruments, o qual contém, um eletrodo de Clark, seletivo de oxigênio molecular, durante 30 a 60 min a 37 C Testes de viabilidade celular - O método utilizado para a verificação da viabilidade celular baseia-se no MTT, (Mosmann, 1983), um substrato de desidrogenases de mitocondriais de células viáveis, as quais catalisam a redução do MTT à sua formazana, um sal colorido e insolúvel em água. Anterior ao tratamento com as drogas, as placas (10 4 células/poço) com 200 µl de meio de cultura em cada poço, foram mantidas durante 48 h em estufa a 37 C, em atmosfera úmida contendo 5% de CO 2, com o intuito de que, no momento de adição da droga, as células estivessem em fase exponencial de crescimento.

37 36 Após o período de tratamento, o meio de cultura contendo a droga foi substituído por meio de cultura (na ausência ou presença de soro) contendo MTT (0,5 mg/ml). Após 4 h de tratamento com o MTT, o meio de cultura foi retirado e adicionou-se DMSO a fim de solubilizar a formazana. Os valores de viabilidade celular foram medidos através de um leitor de microplacas ELISA da Molecular Devices modelo spectramax M2 e, a 570 nm e normalizados em relação ao controle. Os testes tiveram período de exposição às drogas de 24 h. Este procedimento foi utilizado para todos os testes de viabilidade celular a Medidas de viabilidade celular pós-adição da aminoacetona - Aminoacetona foi adicionada às células em meios de cultura, na ausência ou presença de soro fetal bovino, em concentrações variando de 2,0 μm a 10 mm, na presença ou ausência de Cu(II) (aq) (5,0-100 µm) e soluções estoque na razão 1:1,2 de Fe(II)(EDTA) ( µm), Fe(II)(citrato) e Fe(III)EDTA (300 µm). Para verificar se os produtos de oxidação da aminoacetona eram os agentes promotores da morte celular foram utilizados catalase (5,0 μm), SOD (50 U/mL) e NAC (5,0 mm) como antioxidantes em experimentos contendo apenas aminoacetona (5,0 mm) ou aminoacetona (1,0 mm) na presença de Cu(II) 100 μm. Também se utilizou o quelante batocuproína (0,10 mm), que apresenta coloração alaranjada quando coordenada a Cu(I), com o intuito de se verificar um ciclo redox Cu(II)-Cu(I) no sistema, como postulado anteriormente por Hiraku e colab. (1999). Os testes foram realizados na ausência de soro.

38 b Testes com metilglioxal Metilglioxal (0,50 10 mm) foi adicionado ao meio de cultura (com soro), com o objetivo de comprovar e comparar os efeitos citotóxicos do metilglioxal às células produtoras de insulina, como descrito previamente por Sheader e colab. (2001) e por Cook e colab. (1998). Uma solução estoque de metilglioxal foi preparada em água e a concentração foi calculada de sua absorção a 286 nm (ε = 32x10 3 mol -1 L cm -1 ) depois de sua derivatização com cloridato de semicarbazida (Rodrigues et al., 2006) c Testes com peróxido de hidrogênio Peróxido de hidrogênio, (5,0 200 µm), quantificado pelo método de Cotton e Dunford, (1973), foi adicionado ao meio de cultura, com o objetivo de comprovar e comparar os efeitos citotóxicos de H 2 O 2 às células produtoras de insulina, como descrito por Tiedge e colab. (1997, 1999) c.1 Determinação de peróxido de hidrogênio (método de Cotton e Dunford) Em uma cubeta, contendo 3,0 ml de uma solução 0,05 M de KI, em tampão acetato (ph = 3,8, 10 mm) adicionou-se 10 μl de solução estoque de H 2 O 2 diluída de 10 a 1000 vezes em água. Em seguida, adicionou-se 10-8 M HRP (peroxidase de raiz forte) na mesma cubeta e mediu-se a absorbância do íon I 3 - em 353 nm (ε = 2.55x10 4 M -1 cm -1 ) para calcular-se a concentração de H 2 O 2. Antes de realizar os experimentos, a

39 38 concentração do H 2 O 2 foi verificada lendo-se a absorbância de uma solução de H 2 O 2 em água a 240 nm (ε = 40 M -1 cm -1 ) (Beers e Sizer, 1952) d - Efeito do soro fetal bovino na viabilidade celular O soro, comumente usado em culturas de células (no caso, 10 4 células/poço, placa de 96 poços), pode apresentar efeito protetor em sistemas dependentes de EROs ou ERNs, atribuível a componentes antioxidantes do soro que se comportam como alvos mais susceptíveis ao ataque da espécies reativas do que as células. Assim foi comparada a viabilidade de linhagens submetidas ao tratamento com aminoacetona em meios de cultura na presença ou ausência de soro. Como o MTT constitui um método que também permite comparar a população de células sob diferentes tratamentos, realizou-se experimento de proliferação celular nas mesmas condições utilizadas para o teste de viabilidade e Testes com fibroblastos Fibroblastos, (NHI 3T3) em meio DMEM, foram desafiados com aminoacetona (0,10 10 mm), com o objetivo de verificar se culturas diferentes de células oriundas do tecido pancreático são de fato mais resistentes ao estresse oxidativo, conforme indicado na literatura (Grankvist et al., 1981; Tiedge et al., 1997). Os experimentos com fibroblastos foram realizados em meio de cultura suplementado com 10% de soro.

40 Fragmentação de DNA celular - Células RINm5f (10 5 células/poço, placas de 12 poços) foram tratadas com 1,0 mm de aminoacetona na ausência ou presença de 100 µm de Cu(II) e sem soro durante 24 h. Após este período, o meio foi retirado e as células lavadas 2 vezes com PBS e tripsinizadas. As células foram centrifugadas durante 3 min a 1000 g, o meio com tripsina retirado, sendo então lisadas em tampão hipotônico, ph 7,4, contendo: 50 μl/ml de iodeto de propídeo (IP) (Invitrogen), 0,1% m/v de citrato de sódio e 0,1% m/v de Triton X-100. A fragmentação do DNA celular foi medida de acordo com Formichi e colab. (2006) Medidas de fluxo de cálcio intracelular por citometria de fluxo Células RINm5f (10 5 células/poço, placas de 12 poços) foram expostas a aminoacetona (0,50-1,0 mm) na presença ou ausência de Cu(II) (100 µm) e na ausência de soro, durante 4 h. Foi utilizada a sonda Fluo-4 AM (acetoximetil) (λ ex = 488 nm λ em = 520 nm), K d (Ca 2+ ) = 325 nm (Gee et al., 2000). Após 4 h, o meio foi retirado, e as células lavadas 2 vezes com PBS, tripsinizadas, centrifugadas e ressuspendidas em 1,0 ml de meio fresco (sem soro). Antes das medidas no citômetro, os meios contendo as células foram mantidos por 45 min no escuro em atmosfera úmida contendo 5% de CO 2 a 37ºC na presença de 100 nm de Fluo-4 AM (solução estoque 1,0 mm em DMSO). Fluo-4 AM é permeável à membrana plasmática sendo hidrolisado por esterases presentes no citoplasma. A forma livre do reagente se torna fluorescente quando ligada aos íons de cálcio. O equipamento utilizado foi o citômetro de fluxo (Beckman Coulter, modelo cytomics FC 500 MPL) da Central Analítica do IQ-USP.

41 Expressão gênica de proteínas antioxidantes (catalase, CuZnSOD, MnSOD, GRd e GPx), Pró- (Bax) e anti- (Bcl-2) apoptóticas e inos. Enzimas antioxidantes - Células RINm5f (10 5 células/poço, placas de 12 poços) foram tratadas com 0,50-1,0 mm de aminoacetona na ausência ou presença de 50 µm de Cu(II), por 2 h, sem soro. Decorrido este tempo, o meio foi retirado, as células lavadas 2 vezes com PBS e meio fresco contendo 10% de soro foi adicionado por mais 22 h. O meio foi então retirado, as células lavadas 2 vezes com PBS e tripsinizadas. A Tabela 1 apresenta os primers gene-específicos utilizados no PCR para as enzimas antioxidantes. A menor concentração de Cu(II) utilizada (50 µm) e o tempo reduzido de exposição 2 h em relação aos outros tratamentos foram escolhidos com o intuito de promover apenas um efeito indutor, pré-condicionante da expressão das enzimas antioxidantes, sem que houvesse queda de viabilidade celular significativa. Tabela 1: Primers Gene-Específicos utilizados no PCR para Enzimas Antioxidantes Gene Senso Seqüências Antisenso Catalase ATTGCCGTCCGATTCTCC CCAGTTACCATCTTCAGTGTAG GPx GTTCGGACATCAGGAGAATGG GGGTTCGATGTCGATGGTGC MnSOD GACCTGCCTTACGACTATG TACTTCTCCTCGGTGACG CuZnSOD CCAGCGGATGAAGAGAGG CCAATCACACCACAAGCC GRd CGGAAGTCAACGGGAAGAAG CCACCCGTGGCGATCA

42 41 Bax e Bcl-2 - Células RINm5f (10 5 células/poço, placas de 12 poços) foram tratadas com aminoacetona (1,0 mm) na presença de Cu(II) 100 µm durante 24 h, porém na ausência de soro. Depois, o meio foi retirado e as células lavadas 2 vezes com PBS e tripsinizadas. A Tabela 2 apresenta os primers gene-específicos utilizados no PCR para Bax e Bcl-2. Tabela 2: Primers Gene-Específicos utilizados no PCR para Proteínas Pro- e Anti-Apoptóticas Gene Seqüências Senso Antisenso Bax CAAGAAGCTGAGCGAGTGTC GAAGTTGCCGTCTGCAAACA Bcl-2 CTGGGATGCCTTTGTGGAA CAGCCAGGAGAAATCAAACAGA inos - Para a leitura da expressão da NO sintase, foi elaborada uma curva com células RINm5f cultivadas em placas de 6 poços (2,5x10 5 células/poço), com tempos de tratamento de 10 min e 1, 2 e 24 h. As culturas, ficaram expostas a aminoacetona 1,0 mm na ausência ou presença de Cu(II) 50 µm por no máximo de 2 h em meio RPMi sem soro. Quanto ao tratamento de 24 horas, o tempo de incubação em meio sem soro na presença de aminoacetona e Cu(II) foi de 2 h acrescido por mais 22 h em meio suplementado com 10% de soro. Para este último tratamento (24 h) as culturas foram lavadas 2 vezes com PBS antes da adição do meio suplementado com 10% de soro. A Tabela 3 apresenta os primers gene-específicos utilizados no PCR para a inos.

43 42 Tabela 3: Primers Gene-Específicos utilizados no PCR para inos Gene Seqüências Senso inos GCTGAAGATTTGGAAAAGGTGT Antisenso ACAGAGGGCCACAATGTGAT Para todos os experimentos, as células tiveram o RNA total extraído usando Trizol (Invitrogen, Carisoroad, CA). A qualidade do RNA foi verificada através da razão obtida dos espectros UV-Vis dos RNAs a 280/260 e 230/260 nm. O cdna foi sintetizado a partir de 2,0 µg do RNA total utilizando o kit SuperScript III Reverse Transcriptase, (Invitrogen), com uma mistura randômica de primers OligodT. Desse modo foi possível à análise da expressão gênica das proteínas citadas acima através de PCR quantitativo em tempo real (RT PCR) utilizando o Sybr Green Master Mix (Applied Biosystems), com o detector de seqüências ABI PRISM 5700 (Perkin-Elmer/Applied Biosystems). Os primers gene-específicos utilizados no PCR, são apresentados nas Tabelas 1, 2 e 3. Foi usado um protocolo em dois passos, com uma temperatura desnaturante a 95 o C e uma temperatura de anelamento-extensão de 60 C. Os níveis de expressão relativa dos genes foram calculados através da fórmula: 2 (ΔCt ΔΔCt) (McKay et al., 2006) Medidas da atividade da SOD total (CuZnSOD + MnSOD), catalase, GRd e GPx Células RINm5f (2,5x10 5 células/poço, placas de 6 poços) foram tratadas com 1,0 mm de aminoacetona na ausência ou presença de 50 µm de Cu(II), por 2 h sem soro. Decorrido este tempo, o meio foi retirado, as células lavadas 2 vezes com PBS e meio fresco suplementado com 10% de soro foi adicionado por mais 22 h. Após este

44 43 tempo, o meio foi retirado e as células lavadas 2 vezes com PBS e tripsinizadas. O procedimento para a extração das proteínas foi o seguinte: Após a tripsinização, as células foram centrifugadas por 5 min a 1000 rpm em meio de cultura sem soro. O pellet foi ressuspendido em tampão fosfato 50 mm (ph = 7,8), contendo inibidor de protease (Sigma-Aldrich), diluído 1000 vezes, os tubos foram colocados no gelo e as células sofreram sonicação em equipamento Sonics vibra cell, com amplitude de 20%, em intervalos de 15 s, contabilizando um minuto no total. Os homogenatos foram centrifugados por 40 min a g e o sobrenadante aliquotado em amostras de 200 ul e estocado a -20 C até a análise. As analises para todas as enzimas antioxidantes foram realizadas em espectrofotômetro da marca Varian modelo Cary 50 Bio. O inibidor de proteases é um coquetel de drogas que garante a inibição de serina-, cisteína- e metalo-proteases. O coquetel é formado por: fluoreto de 4-(2-amino etil) benzenosulfonila (AEBSF), (2S,3S)-3-(N-{(S)-1-[N-(4-guanidino butil)carbamoil]3- metil-butil}carbamoil)oxirano-2-ácido carboxílico (E-64), bestatina, leupeptina, aprotinina e EDTA. Superóxido Dismutase - A atividade total da SOD foi medida pelo monitoramento da redução do ferricitocromo c na presença de xantina/xantina oxidase como fonte de superóxido, segundo McCord e Fridovich (1969). O meio reacional foi preparado com 25 ml de tampão fosfato 50 mm, ph 7,8, contendo 0,10 mm de ácido dietileno triamino pentaacético (DTPA), 10 ml de solução 10 mm de NaOH, 0,76 mg de xantina e 6,2 mg de ferricitocromo c. Preparou-se, à parte, uma solução 0,50 U/mL de xantina oxidase (25 U/mL). Como esta enzima degrada

45 44 muito facilmente, é necessário, primeiramente, verificar a sua atividade. Para tanto, adicionam-se volumes diferentes da solução descrita de xantina oxidase a 700 µl de meio de reação e monitora-se a variação da absorbância em 550 nm, a 25ºC, por 3 min. O volume de xantina oxidase que se deve utilizar no ensaio é aquele que fornece uma reta de coeficiente angular em torno de 0,025 min -1. O volume final foi sempre de 1,0 ml. O ensaio de SOD é efetuado adicionando-se a uma cubeta, contendo 700 µl de meio reacional e 50 µl de amostra, o volume de xantina oxidase encontrado no teste anterior. O volume final foi sempre 1,0 ml. Monitorou-se a absorbância em 550 nm, a 25ºC, por 3 min. A atividade de SOD foi obtida através da determinação das inclinações das retas com e sem amostra. Calculou-se a inibição percentual através da relação 100 (1-k inb /k) e, finalmente, determinou-se a atividade de SOD através do valor em 50% de inibição, multiplicando-se pelo fator de diluição do homogenato. Uma unidade de SOD é definida como a quantidade necessária para inibir a redução do ferricitocromo c em 50 % (Flohé e Otting, 1984). Catalase - A atividade de catalase foi avaliada pelo monitoramento do consumo de H 2 O 2 a 240 nm, durante 1 min a 25 C. O meio reacional constitui-se de tampão fosfato 100 mm, ph 7,4, com DTPA 0,50 mm. Utilizou-se ε = 40 M -1 cm -1 para calcular a concentração de H 2 O 2 (Aebi, 1984; Beers e Sizer, 1952). Glutationa Redutase - A atividade da GRd foi realizada em tampão fosfato 0,10 M, ph 7,6 com DTPA 0,50 mm. Primeiro, durante 10 min a 30 C, preparou-se o meio de

46 45 reação, que contém glutationa oxidada (GSSG) 1,0 mm e NADPH 0,10 mm em tampão fosfato 0,10 M, ph 7,6. O meio de reação (900 µl) foi então pipetado em uma cubeta de quartzo juntamente com 100 µl de lisado de células. O consumo do NADPH na redução da GSSG a GSH, catalisada pela GRd, foi medido a 340 nm a 30 C (Carlberg e Mannervik, 1975). Glutationa Peroxidase - A atividade de glutationa peroxidase (GPx) foi medida em tampão fosfato 0,10 M, ph 7,0, contendo DTPA 1,0 mm. Durante 10 min e a 37 C, incubou-se a mistura de reação: 500 µl de tampão fosfato 0,10 M, ph 7,0, 100 µl de lisado de células, GRd 0,24 U/mL e GSH 1,0 mm. Depois, adicionou-se NADPH 0,15 mm preparado em solução de NaHCO 3 0,10% m/v ao meio de reação. Esta mistura foi transferida para uma cubeta de quartzo e durante 2,5 min verificou-se se havia decaimento do NADPH a 340 nm e a 37 C. Permanecendo estável, adicionava-se então o oxidante terc-butil hidroperóxido (t-butooh) 1,2 mm. A atividade da GPx é calculada do consumo de NADPH medido a 340 nm, gasto na redução da GSSG catalisada pela GRd, gerando mais GSH para a reação da GPx. Os cálculos para a obtenção da atividade da enzima foram os utilizados por Flohé e Günzler (1984). Em todos os experimentos de medida de atividade enzimática (SOD, catalase, GRd e GPx), a concentração total de proteína nos lisados foi medida pelo método de Bradford, utilizando um espectrofotômetro Varian, modelo Cary 50 Bio. A concentração de proteína total em cada experimento variou de 1,0 a 5,0 µg/ml.

47 Quantificação de GSH Os procedimentos de cultivo e tratamento das culturas de células RINm5f com aminoacetona, na presença ou ausência de Cu(II), e a homogenização dos meios contendo as células tripsinazadas são similares aos descritos no item de Materiais e Métodos. Utilizou-se tampão fosfato 200 mm, ph 7,4, para a homogeneização e : N-etilmaleimida (NEM) (100 mm) como derivatizante adicionado ao tampão contendo as células para evitar perda de GSH por oxidação. A determinação de GSH foi realizada em HPLC/MS do tipo híbrido triplo quádruplo/íon-trap linear, marca Applied Biosystems modelo 3200 QTrap. A separação cromatográfica foi realizada em uma coluna com preenchimento de C-18 (Luna, 250 x 4,6 mm, 5 μm) da marca Phenomenex, com fase móvel A: metanol/água (65:35), 5,0 mm de acetato de amônio e 0,10% de ácido fórmico e fase móvel B: água com 5,0 mm de acetato de amônio e 0,10 % de ácido fórmico. O fluxo usado foi de 0,90 ml/min, com gradiente de solventes de: 100% de B por 30 s, de 30 s a 2 min 0% de B, condição que foi mantida até 5 min, voltando para a condição inicial após 5 min. A corrida cromatográfica teve duração total de 12 min. A análise por espectrometria de massas foi feita utilizando o método multiple reaction monitoring (MRM) em que após a ionização da amostra na fonte de ionização, filtram-se no primeiro quadrupolo do equipamento apenas os íons de massa/carga correspondentes aos analitos de interesse. No caso, usando para glutationa reduzida as transições: 433,1/355,2 (glutationa reduzida + N-etilmaleimida + H + ). Portanto, apenas este íon passa do primeiro quadrupolo para o segundo, onde será fragmentado, e os fragmentos gerados serão filtrados no terceiro quadrupolo para que apenas os fragmentos específicos do analito cheguem ao detector que gera o sinal no equipamento. Esta metodologia, ainda

48 47 não publicada, foi desenvolvida no laboratório do Prof. Dr. Pio Colepicolo (IQ-USP), onde foram feitas as análises. Foi realizada uma curva padrão com GSH autêntica prétratada com NEM previamente a medida das amostras. Os valores encontrados em ng/ml de GSH foram normalizados pela divisão da concentração de proteína mg/ml encontrada em cada tratamento. O método de Bradford foi o utilizado para a obtenção da concentração de proteína Medidas da produção de NO por citometria de fluxo Células RINm5f foram tratadas em meio sem soro com aminoacetona 1,0 mm na ausência ou presença de Cu(II) 50 µm por 2 h (2,5x10 5 células/poço, placas de 6 poços). Após esse período, o procedimento com as células percorreu dois caminhos distintos: a primeira metade dos tratamentos teve o meio retirado e a produção de NO foi medida após 2 h de tratamento; já para a segunda metade das culturas, o meio foi retirado e adicionou-se meio suplementado com 10% de soro por mais 22 h, e após esse período as leituras da produção de NO foram realizadas. Para ambos os experimentos, o tratamento das células anterior às leituras foi o mesmo: as células foram lavadas 2 vezes com PBS, tripsinizadas, centrifugadas e ressuspendidas em 1,0 ml de meio fresco (sem soro). Antes das medidas no citômetro, (Beckman Coulter, modelo cytomics FC 500 MPL) da Central Analítica do IQ-USP, os meios contendo as células foram mantidos por 45 min no escuro em atmosfera úmida contendo 5% de CO 2 a 37ºC na presença de 100 nm de diacetato de 4,5-diaminofluoresceína (DAF-FM) (λ ex = 485 nm λ em = 538 nm) (solução estoque 1,0 mm em DMSO) (Nakatsubo et al., 1998). A membrana plasmática é permeável a DAF-FM o qual é desacetilado por esterases intracelulares à 4,5-diamino

49 48 fluoresceína (DAF-2). Entretanto, DAF-2, é não fluorescente até reagir com o NO na presença de O 2, formando a molécula fluorescente triazolo-fluoresceína Análise estatística dos dados - Todos os gráficos foram obtidos através do programa Origin, versões 6.1 e 8.0, e Graph Pad Prism, versão 4.02, sendo a análise estatística realizada pelo Student s test-t (para a comparação de 2 grupos) com o programa Microsoft Excel e pelo Bonferroni test através do programa Graph Pad Prism (para a análise de três ou mais grupos). Probabilidade de p < 0,05 foi utilizada como critério de significância estatística. Cada valor de n amostras representa a média de pelo menos uma triplicata obtida de determinações independentes.

50 49 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 Otimização da síntese da aminoacetona A preparação e caracterização química da aminoacetona, apesar de publicadas no rigoroso Organic Synthesis (Hepworth, 1976), apresentaram dificuldades provavelmente em virtude de sua fácil oxidação pelo O 2, e por isso não é comercializada. Daí a necessidade de se re-estudar sua síntese. Aminoacetona foi preparada a partir de anidrido acético e glicina, através de duas etapas, segundo as indicações de Hepworth (1976) (Esquema 7). O primeiro passo da síntese é a preparação de acetoamidoacetona na sua forma N-acetilada (Figura 1). Este composto foi identificado por 1 H RMN na Central Analítica do IQUSP como a acetoamidoacetona N-acetilada. Esquema 7: Rota de síntese da aminoacetona.

51 50 Figura 1: Fórmula da acetoamidoacetona. 1 H RMN, CDCl 3 /TMS; δ(ppm): 2,24 (3H, s, H 1 ); 2,36 (6H, s, H 3 ); 4,55 (2H, s, H 2 ). O rendimento de preparação foi de 62%, um pouco abaixo ao relatado na literatura (70 a 78%) (Hepworth, 1976). A reação seguinte visa obter o cloridrato de aminoacetona, através da hidrólise ácida da acetoamidoacetona. Esta reação foi realizada em atmosfera de N 2 em vidraria limpa de íons metálicos contaminantes, pois foi previamente lavada com água MilliQ e tratada com Chelex. O cloridrato de aminoacetona foi obtido com rendimento de 34%, considerado satisfatório. O produto foi caracterizado por 1 H RMN e análise elementar. Figura 2: Aminoacetona (o pka de aminoacetona foi determinado por Dutra et al., 2001). 1 H RMN, D 2 O; δ (ppm): 2,08 (3H, s, H 1 ); 3,88 (4H, s, H 2 )

52 51 Devido à facilidade de a aminoacetona ser oxidada pelo O 2 atmosférico, os resultados obtidos da análise elementar (Tabela 4), estão próximos ao erro absoluto tolerável: 0,3 a 0,5 de diferença entre os valores calculados e os obtidos. Tabela 4: Resultados da primeira análise elementar da aminoacetona. Átomo Valor Calculado (%) Valor Obtido (%) Carbono (C) 32,88 32,46 Hidrogênio (H) 7,30 6,73 Nitrogênio (N) 12,78 12,05 A diferença entre o valor calculado e o obtido pode ser devida à alta oxidação da aminoacetona, a qual foi manipulada por alguns segundos na presença do O 2 atmosférico. Com a intenção de verificar o efeito da rápida oxidação da aminoacetona frente ao O 2 atmosférico, foi realizada uma segunda análise elementar nos 5 min após a primeira. O resultado é apresentado na Tabela 5:

53 52 Tabela 5: Segunda Análise Elementar da aminoacetona. Átomo Valor Calculado (%) Valor Obtido (%) Carbono (C) 32,88 32,06 Hidrogênio (H) 7,30 6,69 Nitrogênio (N) 12,78 11,85 Estes dados evidenciam a facilidade com que a aminoacetona se decompõe sob O 2 atmosférico no intervalo de minutos (processo de pesar e inserir o composto no aparelho para análise). O espectro de 1 H RMN e a análise elementar atestam pureza satisfatória da amostra de aminoacetona. 4.2 Consumo de oxigênio por aminoacetona presente no meio de cultura RPMi 1640, na ausência e presença de soro fetal bovino Foi acompanhado o consumo de oxigênio por aminoacetona dissolvida no meio de cultura, na presença ou ausência de soro, monitorado pelo eletrodo de Clark (Figura 3):

54 53 Figura 3: Consumo de O 2 por aminoacetona (AA) no meio de cultura RPMi 1640, suplementado com soro 10%, a 37 C. Este resultado é representativo de ao menos 3 experimentos independentes. Dessa maneira, pôde-se constatar que ocorre a oxidação da aminoacetona pelo oxigênio dissolvido em meio de cultura RPMi 1640 suplementado com soro 10%. O resultado é similar aos obtidos por Dutra e colab. (2001) em tampão fosfato 100 mm, ph 7,4, o que permite supor que no meio de cultura há também a produção de espécies reativas de oxigênio e que a aminoacetona poderia ser tóxica às células RINm5f. 4.3 Ação citotóxica de metilglioxal às células RINm5f Como já mencionado na Introdução, o metilglioxal é um agente gerador de produtos de glicação avançada (AGEs) (Gawlowski et al., 2007; Ramasamy et al., 2006), que têm sua concentração elevada no plasma em estados clínicos como o do diabetes

55 54 mellitus (Cantero et al., 2007). Apesar da importância patológica de AGEs, a literatura envolvendo metilglioxal e células produtoras de insulina é ainda incipiente (MacDonald et al., 2006; Sheader et al., 2001; Cook et al., 1998). Sabe-se, porém, que o metilglioxal é tóxico a estas células, causando diminuição da produção de insulina (MacDonald et al., 2006) e promoção de danos químicos à própria estrutura da insulina (Jia et al., 2006). De posse destas informações, buscamos comprovar o efeito citotóxico do metilglioxal às culturas de células RINm5f (Figura 4). Figura 4: Efeito citotóxico do metilglioxal (MG) às células RINm5f produtoras de insulina. Concentrações de metilglioxal indicadas no histograma. Todos os valores representam a média de ao menos 3 experimentos independentes. Cada experimento foi realizado pelo menos em quadruplicata. * p < 0,05 Este resultado corrobora os relatados na literatura, onde o metilglioxal começa a ter um efeito significativo a partir de 1,0 mm (MacDonald et al., 2006; Sheader et al., 2001). Trabalhos anteriores demonstraram que a partir de 5,0 mm da aminoacetona, apenas 200 μm de metilglioxal são formados (limitação pelo oxigênio dissolvido, em torno de 200 µm) (Dutra et al., 2001), de modo que os efeitos de concentração da

56 55 aminoacetona sobre as células produtoras de insulina podem estar subestimados. De qualquer modo, fica claro que o metilglioxal é um agente citotóxico a linhagem RINm5f, e como o metilglioxal é um produto da oxidação da aminoacetona, este resultado apóia nossa hipótese de que aminoacetona possa exercer uma ação citotóxicas às células produtoras de insulina. 4.4 Ação citotóxica de H 2 O 2 às células RINm5f Como H 2 O 2 tem baixa atividade redox na ausência de íons de metal de transição, praticamente nenhuma oxidação ocorre quando DNA, lipídeos e proteínas simples são incubados com H 2 O 2 durante várias horas. Peróxido de hidrogênio pode atravessar a membrana celular rapidamente e, uma vez dentro da célula, pode reagir com íons de ferro e cobre e gerar, através da reação de Fenton, espécies deletérias como o radical hidroxila (OH ) (Halliwell e Gutteridge, 2007). Como H 2 O 2 é um dos produtos da oxidação química da aminoacetona, vale considerar que H 2 O 2 possa estar relacionado a uma provável ação citotóxica da aminoacetona às células RINm5f. Esta hipótese é sustentada por trabalhos de Tiedge e colab. (1999, 1997) que relataram ação citotóxica de H 2 O 2 as células RINm5f. Reproduzimos estes resultados com culturas de RINm5f submetidas ao tratamento com H 2 O 2 na faixa de 5,0 a 200 μm (Figura 5).

57 56 O resultado apresentado na Figura 5 demonstra que, de fato, H 2 O 2 é citotóxico às células produtoras de insulina, provavelmente por poder atravessar a membrana plasmática e, no meio intracelular, em contato com íons de metais de transição, especialmente íons de ferro e cobre promover reações nocivas às células. Desse modo, nossa hipótese de mecanismo radicalar para a ação citotóxica da aminoacetona sobre as células em estudo é sustentada pelos resultados até então, bem como os dados de literatura que apontam o H 2 O 2 como um agente capaz de promover danos e apoptose as culturas de células beta (Lee et al., 2009; Roma et al., 2009). Como a aminoacetona é continuamente gerada na mitocôndria, através do catabolismo da treonina e de acetilcoa mais glicina, é tentador propor que, em pacientes com diabetes, a aminoacetona possa contribuir para a perda de função e morte de células beta do pâncreas. Figura 5: Efeito citotóxico de H 2 O 2 sobre células RINm5f produtoras de insulina. Concentrações de H 2 O 2 indicadas no histograma. Todos os valores representam a média de ao menos 3 experimentos independentes. Cada experimento representa ao menos uma quadruplicata. * p < 0,05.

58 Ação citotóxica da aminoacetona às células RINm5f em cultura Desafiando as linhagens RINm5f com uma larga faixa de concentração da aminoacetona (2,0 μm 10 mm), durante 24 h de tratamento, determinou-se que uma faixa ótima de trabalho seria entre 1,0 5,0 mm de aminoacetona. Uma porcentagem significante (p < 0,05) de queda da viabilidade celular foi encontrada para aminoacetona em concentração de 5,0 mm: 20 ± 6% (n = 3), enquanto, concentrações abaixo de 3,0 mm não causaram dano significativo às células. Ressaltamos novamente que a velocidade de oxidação de aminoacetona é limitada pela concentração de oxigênio dissolvido, em torno de 200 µm. Figura 6: Efeito citotóxico da aminoacetona (AA) sobre células RINm5f produtoras de insulina. Concentrações da aminoacetona indicadas no histograma. Todos os valores representam a média de ao menos 3 experimentos independentes. Cada experimento representa ao menos uma quadruplicata. * p < 0,05.

59 58 Analisando os resultados obtidos na faixa de 1,0 a 5,0 mm (figura 6) foi calculado o valor de EC 50 durante 24 h de tratamento: 3,92 ± 0,13 mm (n = 3). Este valor é provavelmente exageradamente alto para as condições fisiológicas. Porém, considerando-se que a produção de aminoacetona ocorre na matriz mitocondrial, é provável que em estados de diabetes, onde elevada degradação de proteínas e lesões a mitocôndrias é relatada (Wiederkehr e Wollheim, 2006; Kang e Hamasaki, 2005), a concentração de aminoacetona no interior das células seja maior que os níveis circulantes. Embora a produção mitocondrial diária de aminoacetona possa ser na faixa nano ou micromolar nas células beta, ela deve ser mais elevada em diabéticos, a julgar das altas concentrações detectadas de metilglioxal e, ao longo do tempo, poderia conduzir a efeitos citotóxicos crônicos, cumulativos, próximos aos encontrados neste trabalho. 4.6 Efeito protetor de soro fetal bovino adicionado as culturas de RINm5f Com resultado da seção anterior fica a pergunta: Antioxidantes presentes no soro colaboraram para um efeito protetor às culturas contra a ação oxidante da aminoacetona? Para isso bastaria apenas um teste de viabilidade celular de células tratadas com aminoacetona na presença e ausência de soro, porém, surge uma segunda pergunta: Células RINm5f conseguem sobreviver em meio sem soro por longos períodos, por exemplo, 24 h? Mizuno e colab. (1998) mostraram que células da linhagem RINm5f mantêm alta viabilidade celular até 24 h de tratamento. Já Chow e

60 59 colab. (2008) demonstraram que os efeitos citotóxicos de protoporfirinas em gliobastomas foram inibidos pela adição de soro e albumina ao meio de cultura, mesmo resultado alcançado por Kiaer e Thams (2009) que demonstraram que a adição de albumina inibe os efeitos citotóxicos do H 2 O 2 e de uma mistura de citocinas (IL-1beta, IFN-gama e TNF-alfa) em culturas de células beta (INS-1E). Diante desse quadro, experimentos de viabilidade celular e proliferação celular foram realizados em meio sem soro e, por comparação, com soro (Figuras 7A e 7B): Figura 7: (A) Viabilidade celular de células RINm5f na presença e ausência de soro. (B) Proliferação Celular de células RINm5f na presença e ausência de soro. Todos os valores representam a média de ao menos 4 experimentos independentes. Cada experimento representa ao menos uma quadruplicata. * p < 0,05 em relação às células tratadas em meio com 10% de soro.

61 60 As figuras 7A e 7B mostram que a viabilidade celular praticamente não se altera ao longo de 24 h na ausência de soro, em relação às células que estão em meio com 10% de soro. Na ausência de soro, há aumento na proliferação celular, mais lento se comparado às células em meio com 10% de soro. Afinal, o soro é rico em fatores de crescimento, necessários para uma proliferação celular mais acelerada. Esses resultados mostram que, de fato, é possível realizar experimentos na ausência de soro num período de 24 h e, desse modo, obter resultados mais condizentes com a situação real de ação deletéria da aminoacetona às células RINm5f. Atestando a possibilidade de realização de experimentos sem soro, fez-se o teste de viabilidade celular adicionando-se aminoacetona 2,5 mm e aminoacetona 1,0 mm na presença e ausência de Cu(II) 100 µm (Figuras 8A e 8B). Nota-se que o soro exerce um efeito protetor, já que células tratadas com AA 2,5 mm em meio com soro não apresentaram queda da viabilidade celular, ao contrário das células tratadas nas mesmas condições, na ausência de soro, que apresentaram uma queda de aproximadamente 60% em sua viabilidade. O mesmo resultado foi obtido quando células tratadas com aminoacetona 1,0 mm na presença de Cu(II) 100 µm, em meio suplementado com soro, apresentavam queda de viabilidade de aproximadamente 20%. Na ausência de soro, apresentaram queda de viabilidade superior a 80%. Torna-se necessário verificar se de fato aminoacetona e aminoacetona/cu(ii) são oxidadas mais rapidamente na ausência de soro ou, se no meio de cultura suplementado com soro, o efeito protetor é devido ao fato de os produtos de oxidação da aminoacetona reagirem primeiramente com as biomoléculas do soro, conferindo

62 61 assim efeito protetor ao soro. A Figura 9 apresenta a o consumo de oxigênio da aminoacetona em meio de cultura RPMi na ausência e presença de soro. Figura 8: Efeito protetor do soro fetal bovino (SFB) em células tratadas com aminoacetona (AA) na presença ou ausência de Cu(II). (A) Culturas de células RINm5f tratadas com aminoacetona na presença e ausência de soro. (B) Culturas de células RINm5f tratadas com aminoacetona com ou sem de íons de Cu(II) na presença ou ausência de soro. As concentrações dos reagentes são apresentadas nos histogramas. Todos os valores representam a média de ao menos 3 experimentos independentes. Cada experimento representa ao menos uma quadruplicata. * p < 0,05 em relação às células-controle. A Figura 9 revela que a velocidade de oxidação da aminoacetona no meio de cultura suplementado com soro é menor em comparação ao meio sem soro. Trabalhos na literatura apontam para o soro utilizado em meios de cultura como fator protetor as culturas contra EROs, por possuírem elevada concentração de albumina. Esta proteína se mostrou eficiente na inibição dos efeitos do H 2 O 2 e citocinas a células beta e de EROs a células tubulares renais e macrófagos (Kiaer e Thams, 2009; Iglesias et al., 1999) e Wagner e colab. (2007) demonstraram que o soro possui atividade

63 62 peroxidásica. Estes resultados alertam para a necessidade de se considerar o efeito protetor de soro em ensaios sobre a toxicidade de drogas produtoras de EROs ou ERNs a células em cultura. É bem provável que o soro contenha proteínas antioxidantes e que alguns constituintes do soro sejam alvos mais susceptíveis à ação deletéria de pró-oxidantes adicionados exogenamente do que as próprias células. Figura 9: Consumo de O 2 por aminoacetona (AA) no meio de cultura RPMi 1640 na presença ou ausência de soro 10%. As concentrações utilizadas são apresentadas nas figuras. O experimento foi realizado a 37 C durante 30 min. O resultado apresentado é uma amostra de ao menos 3 experimentos independentes. 4.7 Efeitos da adição de Fe(II), Fe(III) e Cu(II) a culturas de RINm5f tratadas com aminoacetona Dentre os metais de transição, ferro e cobre desempenham um papel central na geração de EROs, pois o ciclo redox de seus íons promove a reação de Fenton com produção do radical OH. Sabe-se que há sobrecarga destes metais livres, ativos, no

64 63 organismo, associáveis com as manifestações patológicas do diabetes (Zheng et al., 2008; Swanimathan et al., 2007). A utilização de íons de Fe(II) e Fe(III) como catalisadores dos experimentos realizados exige o emprego de quelantes, uma vez que íons férricos ou ferrosos se precipitam na forma de hidróxido em ph fisiológico, enquanto Cu(II), plenamente solúvel, foi adicionado na forma livre. Primeiramente foram realizados experimentos de oximetria para verificar a eficiência catalítica destes íons na oxidação da aminoacetona no meio de cultura suplementado ou não com soro. O resultado é apresentado na Figura 10: Como previsto, o consumo de O 2 na oxidação da aminoacetona na presença de íons de Cu(II) em meio suplementado com 10% de soro foi menor (Figura 10), reforçando o resultado obtido de índice de viabilidade celular para culturas tratadas com aminoacetona/cu(ii) que foi menor em meio de cultura suplementado com soro (Figura 8B). Curiosamente a adição de íons de Fe(II) e Fe(III) quelados a EDTA e citrato (dados não apresentados) a meios de cultura contendo aminoacetona não alterou a viabilidade celular das culturas das células RINm5f. Estes íons não se apresentaram como catalisadores (pelo menos nos testes de viabilidade), contrariando, apesar de serem condições totalmente diferentes, os resultados de estudos in vitro do consumo de oxigênio por aminoacetona realizados por Dutra e colab. (2001) e os expostos na figura 10. Não compreendemos ainda a ineficácia aparente dos íons de ferro para catalisar a oxidação da aminoacetona nos experimentos de viabilidade celular. Neste sentido, é importante notar que Kicic e colab. (2001) demonstraram que a membrana plasmática não é totalmente permeável a complexos de íons de Fe(II) e Fe(III) com EDTA.

65 64 Figura 10: Consumo de O 2 por aminoacetona (AA) na presença ou ausência de íons de Fe(II) e Cu(II). (A) Consumo de O 2 por aminoacetona em meio de cultura RPMi 1640 suplementado com 10% de soro. (B) Consumo de O 2 por aminoacetona em meio de cultura RPMi 1640 sem soro. As concentrações utilizadas estão indicadas na figura. O experimento foi realizado a 37 C durante 30 min. O resultado apresentado é uma amostra de ao menos 3 experimentos independentes. A alternativa foi explorar a eficácia de Cu(II) como promotor coadjuvante de morte celular. Sua adição ao meio de cultura aumentou o poder pró-oxidante da aminoacetona contra as culturas de células RINm5f. Estabelecido que no meio de cultura apenas Cu(II) catalisa a oxidação da aminoacetona, foram realizados novamente experimentos, desta vez na ausência de soro, estabelecendo uma relação dose-dependência entre aminoacetona e Cu(II) (Figura 11A e 11B). As concentrações de aminoacetona e Cu(II) que levam a queda de viabilidade celular foram menores do que as empregadas em meios suplementados com soro: aminoacetona 0,10-1,0 mm e Cu(II) 100 µm (Figura 11A) ou aminoacetona 1,0 mm e Cu(II) 5,0-100 µm (Figura 11B). Ainda na Figura 11, é apresentado um controle do íons de Cu(II) quando adicionados as culturas de células RINm5f na ausência da aminoacetona (figura 11C). Como a atividade pró-oxidante do sistema

66 65 aminoacetona/cu(ii) é dependente de concentração, pode-se propor que, no diabetes, uma continua exposição das células produtoras de insulina e até mesmo das Ilhotas de Langerhans a baixas concentrações da aminoacetona e Cu(II) possa causar efeito similar ao apresentado in vitro, prejudicando as funções destas células. O mecanismo mais provável da oxidação da aminoacetona catalisada por Cu(II) é o proposto por Hiraku e colab. (1999), diferentemente do mecanismo proposto para a oxidação da aminoacetona por íons de Fe(II) (Dutra et al., 2001). Neste caso, íons de Cu(II) podem gerar ânion radical superóxido ao reagir com a aminoacetona e o oxigênio molecular e, dessa maneira, propagar a formação de radical enoil e H 2 O 2 (Esquema 4). Na presença de Cu(II), a aminoacetona seria primeiramente oxidada pelo Cu(II), gerando o radical enoila e Cu(I). O oxigênio pode ser reduzido ao ânion radical superóxido por Cu(I) ou via dois elétrons, um oriundo do Cu(I) e outro do radical enoila, gerando H 2 O 2. No primeiro caso, o ânion radical superóxido formado propagará a oxidação da aminoacetona até seus produtos finais, enquanto no segundo, o H 2 O 2 formado provavelmente realizará a reação de Fenton com os íons de Cu(I) presentes na reação, gerando um oxidante muito forte: o radical hidroxila.

67 66 Figura 11: Efeito da concentração da aminoacetona (AA) na presença de Cu(II). (A) Células RINm5f tratadas com aminoacetona 0,10-1,0 mm na presença ou ausência de Cu(II) 100 µm. (B) Células RINm5f tratadas com aminoacetona 1,0 mm na presença ou ausência de Cu(II) 5,0-100 µm (C) Controles de células RINm5f tratadas somente com íons de Cu(II) 5,0-100 µm. Todos os valores representam a média de ao menos 3 experimentos independentes. Cada experimento representa ao menos uma quadruplicata. * p < 0,05 em relação às células controle e # p < 0,05 em relação às células tratadas apenas com aminoacetona.

68 Testes com antioxidantes em culturas de células RINm5f tratadas com aminoacetona na ausência de soro fetal bovino Íons de Cu(II) e Fe(III) podem oxidar O 2 - a O2, gerando desta maneira íons Cu(I) e Fe(II) que, juntamente com o H 2 O 2, irão amplificar a reação de Fenton. Por isso, espera-se que a adição de SOD e catalase iniba a morte celular induzida por aminoacetona. Já a N-acetilcisteína (NAC) é muito utilizada em diversos experimentos como antioxidante, pois pode se difundir através da membrana celular e seqüestrar várias espécies oxidantes como: HOCl, ONOOH, RO 2, OH e H2 O 2 (Halliwell e Gutteridge, 2007). NAC é reconhecidamente um inibidor da oxidação de tióis, além de ser um precursor do antioxidante endógeno glutationa (GSH) (Cotgreave, 1997). De posse destas informações, células RINm5f foram incubadas com aminoacetona 5,0 mm na presença de SOD (50 U/mL), catalase (5,0 μm) e NAC (5,0 mm) e também incubadas com aminoacetona 1,0 mm na ausência ou presença de Cu(II) 100 μm, e dos antioxidantes já citados, além do quelante de íons de Cu(I) batocuproína (Laggner et al., 2006), com o objetivo de verificar a intermediação de EROs na viabilidade celular (Figura 12): Como apresentado nas figuras 12A e 12B, catalase foi o antioxidante mais eficiente, pois em ambos os casos, células tratadas apenas com aminoacetona 5,0 mm ou tratadas com aminoacetona 1,0 mm na presença de Cu(II) 100 µm, houve total proteção, enquanto que SOD e NAC promoveram proteção significativa apenas em células tratadas somente com aminoacetona.

69 68 Nossos resultados estão de acordo com os apresentados na literatura, onde a oxidação química ou enzimática da aminoacetona produz espécies reativas, as quais levam a danos oxidativos em proteínas, mitocôndrias, DNA e lipídios (Dutra et al., 2005; Dutra e Bechara, 2004; Dutra et al., 2003; Hiraku et al., 1999). Quando se usou o sistema aminoacetona/cu(ii), a catalase eliminou o H 2 O 2 gerado, impedindo dessa maneira a reação de Fenton com Cu(I). Batocuproína, um quelante para íons Cu(I) (Laggner et al., 2006), mostrou-se eficaz, inibindo a ação deletéria da aminoacetona ao, provavelmente, impedir que íons Cu(I) reagissem com H 2 O 2, gerando radicais hidroxila. Este experimento mostra que a formação de íons Cu(I) no sistema é primordial para a exacerbação do efeito pró-oxidante da aminoacetona sobre as culturas de células produtoras de insulina. Interessante notar que o efeito específico da batocuproína pode ser apreciado visualmente, pois quando Cu(I) é quelado pela batocuproína o meio reacional fica alaranjado. Ao final do experimento de 24 h, os meios de cultura onde se encontravam batocuproína, aminoacetona e Cu(II) tornaram-se alaranjados. Quanto à ineficácia da SOD, pode-se pensar que houve alta produção de radical hidroxila, o qual pode inativar a atividade da SOD (Sato et al., 1992). Quanto à NAC, a molécula tem sido apontada como um promissor agente anticarcinogênico e antigenotóxico (Jayalakshmi et al., 2005; Agarwal et al., 2004), em virtude de sua alta capacidade de seqüestrar radicais hidroxila (Morley et al., 2003). Na presença de Cu(II), porém, a NAC agiu como um pró-oxidante. Outros trabalhos, como Oikawa e colab. (1999) e Su e colab. (2006) também observaram um efeito pró-oxidante de NAC na presença de íons de metais de transição. Assim como o proposto para a reação entre íons de Cu(II) e cisteína (Munday et al., 2003; Kachur et al., 1998), propõe-se que a

70 69 NAC na presença de metais de transição, principalmente Cu(II), possa gerar O 2 -, H2 O 2, OH e radical tiila. NAC reage com Cu(II) através de um mecanismo parecido com o do ascorbato, onde Cu(II) receberia um elétron da molécula de NAC, sendo reciclado a seu estado reduzido Cu(I), e o radical tiila de NAC formaria dímeros dissulfeto. Conseqüentemente o íon Cu(I) poderia gerar radicais hidroxila através da reação de Fenton com o H 2 O 2 (Esquema 8). Há controvérsias quanto a este mecanismo, pois Kachur e colab. (1998) demonstraram que a reação entre NAC e Cu(II) é iniciada por pelo complexo de Cu(II) com o ânion mercapteto da NAC (Esquema 9), tendo como produtos finais H 2 O 2 e ácido sulfônico da NAC (representado por RSO 3 H no Esquema 9). Essa proposta acontece em duas fases distintas relativas ao consumo de oxigênio molecular e produção de radical hidroxila: na primeira a velocidade de consumo de oxigênio é constante e a produção de radical hidroxila é baixa, enquanto na segunda fase há uma diminuição na velocidade de consumo de oxigênio, porém gerando maior concentração de radical hidroxila. Essa proposta foi verificada e aceita mais tarde (Munday et al., 2003). Em qualquer caso, entretanto, há produção de íons de Cu(I), O 2 -, H 2 O 2 e OH. Estes resultados reforçam nossa proposta de que, na condição diabética, onde a descarga de ferro e cobre livres é elevada (Zheng et al., 2008), a produção da aminoacetona é elevada, com concomitante aumento da atividade de SSAO (Boomsma et al., 2005), e a mobilização de aminoácidos gerando maior concentração de metilglioxal também é exacerbada (Thornalley, 1996), a combinação da aminoacetona com íons de metal de transição pode conduzir a um efeito citotóxico de aminoacetona

71 70 às células produtoras de insulina. Novamente enfatizamos que as concentrações de reagentes utilizadas nestes experimentos estão certamente muito acima das fisiológicas, porém deve-se levar em conta que a reação é limitada pela concentração local de oxigênio molecular e conseqüentemente do fluxo de radicais hidroxilas que lesam as células devido à competição com outras moléculas redutoras presentes no meio de cultura, como glicose, vitaminas, albumina e globulinas. Figura 12: Viabilidade de células RINm5f em cultura, tratadas com aminoacetona (AA) na ausência ou presença de Cu(II). (A) Culturas de células tratadas com aminoacetona 5,0 mm na ausência ou presença de antioxidantes. Concentrações indicadas no histograma. (B) Culturas de células tratadas com aminoacetona (1,0 mm), Cu(II) (100 µm) e com o sistema aminoacetona/cu(ii), na presença ou ausência de antioxidantes. Concentrações são indicadas no histograma. Todos os valores representam a média de ao menos 3 experimentos independentes. Cada experimento representa ao menos uma quadruplicata. * p < 0,05 em relação às células controle e # p < 0,05 em relação às células tratadas com o sistema aminoacetona/cu(ii).

72 71 Esquema 8: Mecanismo proposto para o efeito pró-oxidante de NAC na presença de íons de metal de transição. Adaptado de Oikawa e colab. (1999). Esquema 9: Mecanismo proposto para a catálise de Cu(II) na oxidação de NAC. 1 fase (linhas sólidas), 2 fase (linhas tracejadas). (Reproduzido de Kachuer et al., 1998). As porcentagens de 40 e 60% correspondem ao total de oxigênio consumido em cada fase.