R I O D E J A N E I R O

Transcrição

1 U N I V E R S I D A D E F E D E R A L D O R I O D E J A N E I R O I N S T I T U T O D E B I O F Í S I C A C A R L O S C H A G A S F I L H O P R O G R A M A D E B I O L O G I A C E L U L A R E P A R A S I T O L O G I A A L L A N C É Z A R D E A Z E V E D O M A R T I N S S Í N T E S E D E F O S F A T I D I L C O L I N A E M C R I T H I D I A D E A N E I : a i n f l u ê n c i a d o e n d o s s i m b i o n t e R I O D E J A N E I R O

2 Livros Grátis Milhares de livros grátis para download.

3 i i A L L A N C É Z A R D E A Z E V E D O M A R T I N S S Í N T E S E D E F O S F A T I D I L C O L I N A E M C R I T H I D I A D E A N E I : a i n f l u ê n c i a d o e n d o s s i m b i o n t e D i s s e r t a ç ã o d e M e s t r a d o a p r e s e n t a d a a o P r o g r a m a d e B i o l o g i a C e l u l a r e P a r a s i t o l o g i a d e P ó s - G r a d u a ç ã o e m C i ê n c i a s B i o l ó g i c a s ( B i o f í s i c a ), I n s t i t u t o d e B i o f í s i c a C a r l o s C h a g a s F i l h o, U n i v e r s i d a d e F e d e r a l d o R i o d e J a n e i r o, c o m o r e q u i s i t o p a r c i a l p a r a o b t e n ç ã o d o t í t u l o d e M e s t r e C i ê n c i a s B i o l ó g i c a s ( B i o f í s i c a ) O r i e n t a d o r e s : P r o f. D r ª M a r i a C r i s t i n a M a c h a d o M o t t a e P r o f. D r M a r c e l o E i n i c k e r L a m a s R I O D E J A N E I R O

4 i i i A L L A N C É Z A R D E A Z E V E D O M A R T I N S S Í N T E S E D E F O S F A T I D I L C O L I N A E M C R I T H I D I A D E A N E I : a i n f l u ê n c i a d o e n d o s s i m b i o n t e D i s s e r t a ç ã o d e M e s t r a d o a p r e s e n t a d a a o P r o g r a m a d e B i o l o g i a C e l u l a r e P a r a s i t o l o g i a d e P ó s - G r a d u a ç ã o e m C i ê n c i a s B i o l ó g i c a s ( B i o f í s i c a ), I n s t i t u t o d e B i o f í s i c a C a r l o s C h a g a s F i l h o, U n i v e r s i d a d e F e d e r a l d o R i o d e J a n e i r o, c o m o r e q u i s i t o p a r c i a l p a r a o b t e n ç ã o d o t í t u l o d e M e s t r e C i ê n c i a s B i o l ó g i c a s ( B i o f í s i c a ) A p r o v a d a e m d e d e. P R O F ª D R ª M A R I A C R I S T I N A M A C H A D O M O T T A, I B C C F P R O F D R M A R C E L O E I N I C K E R L A M A S, I B C C F D R ª C L A U D I A D A V I L A L E V Y, I O C P R O F D R E D N I L D O D E A L C Â N T A R A M A C H A D O, I B C C F P R O F ª D R ª G E Ó R G I A C O R R E A A T E L L A, I B C C F P R O F D R N O R T O N H E I S E, I B C C F

5 i v À L u c i a n a, p o r t u d o q u e a p r e n d i.

6 v À D r a. C r i s t i n a M o t t a, p e l a c o n f i a n ç a.

7 v i A o A n t ô n i o, D a y s e e A n d r é m i n h a f a m í l i a.

8 v i i Ag r a d e c i m e n t o s E m p r i m e i r o l u g a r, a g r a d e ç o a D e u s p e l a o p o r t u n i d a d e d e d e s e n v o l v e r u m e s t u d o e c o n s e g u i r c h e g a r a t é a q u i. À p r o f e s s o r a D r. ª M a r i a C r i s t i n a M a c h a d o M o t t a q u e m e i n s e r i u n a c o m u n i d a d e c i e n t í f i c a, s e j a a t r a v é s d o p r o j e t o q u e m e i n c u m b i u, s e j a p e l o e s t í m u l o e m d e s e n v o l v e r o p e n s a r c i e n t í f i c o ; e p e l a c o n f i a n ç a q u e t e v e e m m i n h a p e s s o a. A o p r o f e s s o r D r. M a r c e l o E i n i c k e r L a m a s, q u e c o l a b o r o u d e m a n e i r a e s s e n c i a l n e s s e p r o j e t o a o a u x i l i a r n a r e s o l u ç ã o d e e n s a i o s q u e n ã o p o d e r i a m s e r r e a l i z a d o s n o m e u l a b o r a t ó r i o ; e p e l a p e s s o a m u i t o d i v e r t i d a q u e é. À I a m a r a p e l o g r a n d e a u x í l i o n o d e s e n v o l v i m e n t o d o s e x p e r i m e n t o s e n a o r g a n i z a ç ã o d a s h i p ó t e s e s a s e r e m e s t u d a d a s. A o P a u l o p e l a g r a n d e a j u d a e a p o i o d u r a n t e o p e r í o d o d e e s t á g i o. A o s c o n p a n h e i r o s d e l a b u t a d i á r i a, A l i n e, D a n i e l l e, T h i a g o, C a r o l, F e l i p e e J a q u e l i n e p o r c o n t r i b u i r s e j a c o m a t r o c a d e e x p e r i ê n c i a s, s e j a p a s s a n d o s u a e x p e r i ê n c i a, m o s t r a n d o a m e l h o r m a n e i r a d e r e a l i z a r a l g u n s e n s a i o s d e p r o c e s s a m e n t o d e a m o s t r a s. A o B o s c o e à N e t e p e l o a u x í l i o t a n t o n a l i m p e z a d e m a t e r i a l e h i g i e n e d o a m b i e n t e d e t r a b a l h o q u a n t o n o s m o m e n t o s d e d e s c o n t r a ç ã o.

9 v i i i À F U N D A Ç Ã O D E A M P A R O À P E S Q U I S A D O E S T A D O D O R I O D E J A N E I R O ( F A P E R J ) e à C O O R D E N A Ç Ã O D E A P E R F E I Ç O A M E N T O D E P E S S O A L D E N Í V E L S U P E R I O R ( C A P E S ), p e l o p a t r o c í n i o c o m o ó r g ã o s f o m e n t a d o r e s d e b o l s a d e p ó s - g r a d u a ç ã o. A o L A B O R A T Ó R I O D E U L T R A E S T R U R A C E L U L A R H E R T H A M E Y E R, p o r p e r m i t i r o d e s e n v o l v i m e n t o d e s t a p e s q u i s a e m s e u e s p a ç o f í s i c o. A o L A B O R A T Ó R I O D E F Í S I C O Q U Í M I C A B I O L Ó G I C A A Í D A H A S S O N - V O L O C H, p o r p e r m i t i r o d e s e n v o l v i m e n t o d e e n s a i o s c o m p l e m e n t a r e s a e s t a p e s q u i s a e m s e u e s p a ç o f í s i c o. A o g r u p o d e c o l a b o r a ç ã o d o D r. K r i e g e r n o I N S T I T U T O D E B I O L O G I A M O L E C U L A R D O P A R A N Á ( I B M P ), c o m o q u a l d e c i f r a m o s a l g u n s e n i g m a s n o g e n o m a d o s i m b i o n t e. A o D r. A n t ô n i o G a l i n a F i l h o d o I N S T I T U T O D E B I O Q U Í M I C A M É D I C A ( I B q M ) d a U F R J, p e l a c o l a b o r a ç ã o n o e s t u d o d o c o n s u m o d e O 2.

10 i x S u m á r i o L i s t a d e f i g u r a s L i s t a d e t a b e l a s L i s t a d e a b r e v i a t u r a s R e s u m o A b s t r a c t x i x i i i x i v x v x v i i 1 I n t r o d u ç ã o A f a m í l i a T r y p a n o s o m a t i d a e E n d o s s i m b i o s e e m t r i p a n o s o m a t í d e o s O e n v o l t ó r i o b a c t e r i a n o M e t a b o l i s m o d e f o s f a t i d i l c o l i n a V i a d e K e n n e d y V i a d e G r e e n b e r g V i a d a P C s i n t a s e O b j e t i v o s O b j e t i v o G e r a l O b j e t i v o s e s p e c í f i c o s M a t e r i a l e m é t o d o s C u l t i v o F r a c i o n a m e n t o c e l u l a r O b t e n ç ã o d a s f r a ç õ e s d e e n d o s s i m b i o n t e e m i t o c ô n d r i a M i c r o s c o p i a E l e t r ô n i c a d e T r a n s m i s s ã o I n c o r p o r a ç ã o d e t r a ç a d o r e s r a d i o a t i v o s 2 5

11 x 3. 5 E x t r a ç ã o d e l i p í d e o s C r o m a t o g r a f i a e m c a m a d a f i n a P e s q u i s a g e n ô m i c a C o n s u m o d e O R e s u l t a d o s S í n t e s e d e f o s f o l i p í d e o s n a s c e p a s n o r m a l e c u r a d a d e C. d e a n e i U l t r a e s t r u t u r a d e C. d e a n e i e d a s f r a ç õ e s d e s i m b i o n t e e d e m i t o c ô n d r i a Q u a n t i f i c a ç ã o d e f o s f o l i p í d e o s d a s f r a ç õ e s d e e n d o s s i m b i o n t e e d e m i t o c ô n d r i a o b t i d a s d e C. d e a n e i c r e s c i d a e m m e i o c o n t e n d o 3 2 P i C a p a c i d a d e d e s í n t e s e d e f o s f o l i p í d e o s e m e n d o s s i m b i o n t e s e m i t o c ô n d r i a s i s o l a d o s d e C. d e a n e i e i n c u b a d o s c o m 3 2 P i I n c o r p o r a ç ã o d e [ 3 H ] - c o l i n a p e l o e n d o s s i m b i o n t e i s o l a d o d e C. d e a n e i B u s c a d e e n z i m a s d a s v i a s d e s í n t e s e d e P C n o g e n o m a d o s i m b i o n t e d e C. d e a n e i D i f e r e n ç a s n o c o n s u m o d e O 2 p e l a s c e p a s n o r m a l e c u r a d a d e C. d e a n e i e p e l a s f r a ç õ e s d e s i m b i o n t e e m i t o c ô n d r i a D i s c u s s ã o C o n c l u s õ e s R e f e r ê n c i a s B i b l i o g r á f i c a s 5 9

12 x i L i s ta d e f i g uras F i g u r a 1 C r i t h i d i a d e a n e i 2 F i g u r a 2 U l t r a e s t r u t u r a d e C r i t h i d i a d e s o u z a i 7 F i g u r a 3 E n v o l t ó r i o c e l u l a r d e b a c t é r i a s G r a m - n e g a t i v a s 9 F i g u r a 4 E n v o l t ó r i o d o e n d o s s i m b i o n t e d e t r i p a n o s o m a t í d e o s. 1 1 F i g u r a 5 V i a d e K e n n e d y e V i a d e G r e e n b e r g 1 5 F i g u r a 6 V i a d a P C S i n t a s e ( P C S ) 1 8 F i g u r a 7 I n c o r p o r a ç ã o d e 3 2 P i e m f o s f o l i p í d e o s p e l a s c e p a s s e l v a g e m e a p o s i m b i ó t i c a d e C. d e a n e i. 3 3 F i g u r a 8 U l t r a e s t r u t u r a d e C r i t h i d i a d e a n e i 3 4 F i g u r a 9 U l t r a e s t r u t u r a d a s f r a ç õ e s d e s i m b i o n t e e m i t o c ô n d r i a 3 5 F i g u r a 1 0 Q u a n t i f i c a ç ã o f o s f o l i p í d i c a d e s i m b i o n t e s e m i t o c ô n d r i a s d e C. d e a n e i 3 7 F i g u r a 1 1 S í n t e s e d e f o s f o l i p í d e o s p e l a s f r a ç õ e s d e s i m b i o n t e e m i t o c ô n d r i a. 3 9 F i g u r a 1 2 Q u a n t i f i c a ç ã o f o s f o l i p í d i c a d a f r a ç ã o d e s i m b i o n t e i s o l a d a 4 0 F i g u r a 1 3 I n c o r p o r a ç ã o d e [ 3 H ] - c o l i n a p e l a f r a ç ã o s d e s i m b i o n t e 4 2 F i g u r a 1 4 C o n s u m o d e O 2 p e l a c e p a a p o s i m b i ó t i c a e s e l v a g e m d e C r i t h i d i a d e a n e i 4 5

13 x i i F i g u r a 1 5 C o n s u m o d e O 2 p e l a s f r a ç õ e s d e s i m b i o n t e e m i t o c ô n d r i a a p ó s i s o l a m e n t o d a C r i t h i d i a d e a n e i. 4 6

14 x i i i L i s ta d e ta b e l a s T a b e l a 1 - E z i m a s d a s v i a s d e s í n t e s e d e P C ( V i a d e K e n n e d y, V i a d e G r e e n b e r g e V i a d a P C S i n t a s e ) T a b e l a 2 - G e n e s s i m i l a r e s a f o s f o l i p a s e D d o g ê n e r o B o r d e t e l l a e n c o n t r a d o s n o g e n o m a d o s i m b i o n t e

15 x i v L i s ta d e a b re vi a t u r a s C, K = C i n e t o p l a s t o E = E n d o s s i m b i o n t e E P = e s t r u t u r a p a r a - f l a g e l a r F = f l a g e l o G = g l i c o s s o m o s M = M i t o c ô n d r i a M S = m i c r o t ú b u l o s s u b - p e l i c u l a r e s P A = Á c i d o F o s f a t í d i c o P C = F o s f a t i d i l c o l i n a P C S = F o s f a t i d i l c o l i n a s i n t a s e P E = F o s f a t i d i l e t a n o l a m i n a P I = F o s f a t i d i l i n o s i t o l

16 x v R e s u m o A Z E V E D O - M A R T I N S, A. C. S í n t e s e d e f o s f a t i d i l c o l i n a e m C r i t h i d i a d e a n e i : a i n f l u ê n c i a d a b a c t e r i a s i m b i ó t i c a. R i o d e J a n e i r o, D i s s e r t a ç ã o ( M e s t r a d o e m C i ê n c i a s B i o l ó g i c a s B i o f í s i c a ) I n s t i t u t o d e B i o f í s i c a C a r l o s C h a g a s F i l h o, U n i v e r s i d a d e F e d e r a l d o R i o d e J a n e i r o, R i o d e J a n e i r o, A l g u n s t r i p a n o s o m a t í d e o s a b r i g a m u m a b a c t é r i a s i m b i ó t i c a e m s e u c i t o p l a s m a, c o m a q u a l m a n t é m u m a r e l a ç ã o m u t u a l í s t i c a, c o n s t i t u i n d o u m e x c e l e n t e m o d e l o p a r a o e s t u d o d a o r i g e m d a s o r g a n e l a s e d a e v o l u ç ã o c e l u l a r. E s t e t r a b a l h o m o s t r a q u e a C r i t h i d i a d e a n e i q u e h o s p e d a o s i m b i o n t e i n c o r p o r a d u a s v e z e s m a i s 3 2 P i e m f o s f o l i p í d e o s, a p ó s c r e s c i m e n t o e m m e i o d e c u l t u r a, q u a n d o c o m p a r a d a a c e p a a p o s i m b i ó t i c a. O p r i n c i p a l f o s f o l i p í d e o s i n t e t i z a d o p o r a m b a s a s c e p a s é f o s f a t i d i l c o l i n a ( P C ), s e g u i d a d e f o s f a t i d i l e t a n o l a m i n a ( P E ) e f o s f a t i d i l i n o s i t o l ( P I ). O f r a c i o n a m e n t o c e l u l a r i n d i c o u q u e 3 2 P i - P C é o f o s f o l i p í d e o m a j o r i t á r i o n a s f r a ç õ e s d e s i m b i o n t e e m i t o c ô n d r i a. O s i m b i o n t e i s o l a d o é c a p a z d e s i n t e t i z a r f o s f o l i p í d e o s i n d e p e n d e n t e d o t r i p a n o s o m a t í d e o h o s p e d e i r o. E n t r e t a n t o, a s b a c t é r i a s i s o l a d a s s i n t e t i z a m g r a n d e q u a n t i d a d e d e P E, m a i s q u e P C, i n d i c a n d o q u e a a s s o c i a ç ã o c o m o p r o t o z o á r i o h o s p e d e i r o é e s s e n c i a l p a r a a p r o d u ç ã o d e P C d o s i m b i o n t e. O e n d o s s i m b i o n t e i s o l a d o f o i i n c u b a d o c o m [ 3 H ] - c o l i n a p a r a v e r i f i c a r s e a b a c t é r i a p o d e r i a i n c o r p o r a r o t r a ç a d o r d o m e i o e s i n t e t i z a r P C - m a r c a d o, m a s n e n h u m a i n c o r p o r a ç ã o f o i o b s e r v a d a. A l é m d i s s o, o s g e n e s q u e c o d i f i c a m a s e n z i m a s e n v o l v i d a s n a b i o s s í n t e s e d e P C n ã o f o r a m e n c o n t r a d o s n o g e n o m a d o e n d o s s i m b i o n t e. C o n t u d o, e s t a b u s c a s r e v e l a r a m u m g e n e c o d i f i c a n t e d e u m a p u t a t i v a f o s f o l i p a s e D, i n d i c a n d o q u e a t r o c a e n t r e o s g r u p o s d e c a b e ç a s p o l a r e s p o d e e x p l i c a r a s í n t e s e d e P C e m p a r t e. A r e s p e i t o d o c o n s u m o d e O 2 p e l a f r a ç ã o m i t o c o n d r i a l, t a x a s m a i s e l e v a d a s s ã o o b s e r v a d a s q u a n d o c o m p a r a d a s à f r a ç ã o d e s i m b i o n t e, s u g e r i n d o q u e, e m b o r a m e t a b o l i c a m e n t e a t i v a a p ó s o f r a c i o n a m e n t o c e l u l a r, a m i t o c ô n d r i a é i n c a p a z d e s i n t e t i z a r f o s f o l i p í d e o s. O c o n s u m o d e O 2 p e l o p r o t o z o á r i o q u e c o n t é m o e n d o s s i m b i o n t e é m a i s e l e v a d o q u a n d o c o m p a r a d o a o a p o s i m b i ó t i c o, r e f o r ç a n d o a i d é i a d e q u e a b a c t é r i a s i m b i ó t i c a a c e l e r a o m e t a b o l i s m o d o h o s p e d e i r o. O s d a d o s o b t i d o s p o r m i c r o s c o p i a e l e t r ô n i c a d e t r a n s m i s s ã o r e v e l a r a m u m a p r o x i m i d a d e e n t r e e n d o s s i m b i o n t e, n ú c l e o e r e t í c u l o e n d o p l a s m á t i c o. J u n t o s, e s s e s r e s u l t a d o s s u g e r e m q u e a b a c t é r i a s i m b i ó t i c a p o d e o b t e r p a r t e d e s u a P C, o u m e s m o p r e c u r s o r e s d e P C, d o t r i p a n o s o m a t í d e o h o s p e d e i r o.

17 P a l a v r a s - c h a v e : C r i t h i d i a d e a n e i ; e n d o s s i m b i o s e ; b a c t é r i a s i m b i ó t i c a ; f o s f o l i p í d e o s ; b i o s s í n t e s e d e f o s f a t i d i l c o l i n a. x v i

18 x v i i Ab s t r a c t A Z E V E D O - M A R T I N S, A. C. S í n t e s e d e f o s f a t i d i l c o l i n a e m C r i t h i d i a d e a n e i : a i n f l u ê n c i a d a b a c t e r i a s i m b i ó t i c a. R i o d e J a n e i r o, D i s s e r t a ç ã o ( M e s t r a d o e m C i ê n c i a s B i o l ó g i c a s B i o f í s i c a ) I n s t i t u t o d e B i o f í s i c a C a r l o s C h a g a s F i l h o, U n i v e r s i d a d e F e d e r a l d o R i o d e J a n e i r o, R i o d e J a n e i r o, S o m e t r y p a n o s o m a t i d s h a r b o r a s y m b i o t i c b a c t e r i u m, w h i c h m a i n t a i n s a m u t u a l i s t i c r e l a t i o n s h i p w i t h t h e h o s t, c o n s t i t u t i n g a n e x c e l l e n t m o d e l t o s t u d y o r g a n e l l e o r i g i n a n d c e l l u l a r e v o l u t i o n. T h i s w o r k s h o w s t h a t s y m b i o n t - b e a r i n g C. d e a n e i i n c o r p o r a t e s m o r e t h a n t w o f o l d 3 2 P i i n t o p h o s p h o l i p i d s, a f t e r g r o w t h i n c u l t u r e m e d i u m, a s c o m p a r e d t o t h e a p o s y m b i o t i c s t r a i n. T h e m a j o r p h o s p h o l i p i d s y n t h e s i z e d b y b o t h s t r a i n s w a s p h o s p h a t i d i l c h o l i n e ( P C ), f o l l o w e d b y p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e ( P E ) a n d p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l ( P I ). C e l l u l a r f r a c t i o n a t i o n 3 i n d i c a t e d t h a t 2 P i - P C i s t h e m a j o r p h o s p h o l i p i d, b o t h i n t h e s y m b i o n t a n d i n t h e m i t o c h o n d r i o n f r a c t i o n s. I s o l a t e d s y m b i o n t s w e r e c a p a b l e o f s y n t h e s i z i n g p h o s p h o l i p i d s i n d e p e n d e n t l y f r o m t h e h o s t t r y p a n o s o m a t i d. H o w e v e r, t h e i s o l a t e d b a c t e r i a s y n t h e s i z e d m o s t l y P E, r a t h e r t h a n P C, i n d i c a t i n g t h a t t h e a s s o c i a t i o n w i t h t h e h o s t p r o t o z o a n i s e s s e n t i a l f o r t h e s y m b i o n t P C p r o d u c t i o n. I s o l a t e d e n d o s y m b i o n t s w e r e i n c u b a t e d w i t h [ 3 H ] - c h o l i n e i n o r d e r t o v e r i f y i f t h e b a c t e r i u m c o u l d u p t a k e t h e t r a c e r f r o m t h e m e d i u m t o s y n t h e s i z e r a d i o l a b e l e d - P C, b u t n o i n c o r p o r a t i o n w a s o b s e r v e d. F u r t h e r m o r e, g e n e s t h a t c o d i f y e n z y m e s i n v o l v e d i n P C b i o s y n t h e s i s w e r e n o t f o u n d i n t h e e n d o s y m b i o n t g e n o m e. H o w e v e r, t h i s s e a r c h r e v e a l e d a p u t a t i v e g e n e e n c o n d i n g a p h o s p h o l i p a s e D, i n d i c a t i n g t h a t t h e c h a n g e b e t w e e n p o l a r h e a d g r o u p s c o u l d e x p l a i n i n p a r t t h e P C p r o d u c t i o n. R e g a r d i n g O 2 c o n s u m p t i o n b y m i t o c h o n d r i a l f r a c t i o n, h i g h e r r a t e s w e r e o b s e r v e d w h e n c o m p a r e d t o t h e s y m b i o n t f r a c t i o n, s u g g e s t i n g t h a t a l t h o u g h m e t a b o l i c a l l y a c t i v e a f t e r c e l l f r a c t i o n i n g, m i t o c h o n d r i o n i s u n a b l e t o s y n t h e s i z e p h o s p h o l i p i d s. T h e c o n s u m p t i o n o f O 2 b y s y m b i o n t - c o n t a i n i n g p r o t o z o a w a s h i g h e r w h e n c o m p a r e d w i t h t h e a p o s y m b i o t i c c e l l s, r e i n f o r c i n g t h e i d e a t h a t t h e s y m b i o t i c b a c t e r i u m a c c e l e r a t e s t h e h o s t m e t a b o l i s m. D a t a o b t a i n e d b y t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y r e v e a l e d a c l o s e a s s o c i a t i o n b e t w e e n t h e e n d o s y m b i o n t, t h e n u c l e u s a n d t h e e n d o p l a s m a t i c r e t i c u l u m. T a k e n t o g e t h e r, t h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e s y m b i o t i c b a c t e r i u m m a y o b t a i n p a r t o f i t s P C, o r e v e n P C p r e c u r s o r s, f r o m t h e h o s t t r y p a n o s o m a t i d. K e y w o r d s : C r i t h i d i a d e a n e i ; e n d o s y m b i o s e s ; s y m b i o t i c b a c t e r i a ; p h o s p h o l i p i d s ; p h o s p h a t i d i l c h o l i n e b i o s y n t h e s i s.

19 1 1 I n t r o d u ç ã o 1. 1 A f a m í l i a T r y p a n o s o m a t i d a e D e n t r e a s e s p é c i e s p a r a s i t á r i a s, o s p r o t o z o á r i o s d a f a m í l i a T r y p a n o s o m a t i d a e d e s p e r t a m g r a n d e i n t e r e s s e d e e s t u d o p o r c a u s a r e m d o e n ç a s a o h o m e m, c o m o a s l e i s h m a n i o s e s, c a u s a d a s p o r v á r i a s e s p é c i e s d o g ê n e r o L e i s h m a n i a, a D o e n ç a d e C h a g a s, c a u s a d a p e l o T r y p a n o s o m a c r u z i, e a D o e n ç a d o s o n o, c a u s a d a p e l o T r y p a n o s o m a b r u c e i ( W H O, ). O s t r i p a n o s o m a t í d e o s p e r t e n c e m à O r d e m K i n e t o p l a s t i d a, p o s s u i n d o c a r a c t e r í s t i c a s u l t r a e s t r u t u r a i s t í p i c a s ( F I G U R A 1 ), c o m o : f l a g e l o ú n i c o c o n t e n d o u m a c o m p l e x a e s t r u t u r a p a r a f l a g e l a r ; m i t o c ô n d r i a ú n i c a e r a m i f i c a d a q u e c o n t é m u m a r e g i ã o m a i s a l a r g a d a e c o m a c ú m u l o d e D N A ( d e n o m i n a d a d e c i n e t o p l a s t o ), g l i c o s s o m o s ( t i p o d e p e r o x i s o m o q u e c o n t é m e n z i m a s d a v i a g l i c o l í t i c a ) e m i c r o t ú b u l o s s u b p e l i c u l a r e s a s s o c i a d o s à m e m b r a n a p l a s m á t i c a ( D e S O U Z A, ). C o m t a n t o s o r g a n i s m o s d e i m p o r t â n c i a m é d i c a, n e s t a f a m í l i a t a m b é m s ã o e n c o n t r a d a s e s p é c i e s n ã o p a t o g ê n i c a s a o s e r h u m a n o, q u e p a r a s i t a m s o m e n t e u m h o s p e d e i r o i n v e r t e b r a d o, g e r a l m e n t e i n s e t o s. T a i s e s p é c i e s q u e p a r a s i t a m a p e n a s u m h o s p e d e i r o s ã o d e n o m i n a d a s m o n o x ê n i c a s e p e r t e n c e m a d i f e r e n t e s g ê n e r o s ( M c G H E E & C O S G R O V E, ; B A R O N e t a l., ). E n t r e o s t r i p a n o s o m a t í d e o s m o n o x ê n i c o s, e x i s t e u m p e q u e n o n ú m e r o d e e s p é c i e s q u e a p r e s e n t a m u m a b a c t é r i a s i m b i ó t i c a e m

20 2 E M S N M E P C G F F i g u r a 1 C r i t h i d i a d e a n e i. D e s e n h o e s q u e m á t i c o d o t r i p a n o s o m a t í d e o C. d e a n e i, p o r M á r c i a S h i m a d a. N o t a r a p r e s e n ç a d o e n d o s s i m b i o n t e ( E ) p r ó x i m o a o n ú c l e o ( N ) e o c i n e t o p l a s t o ( C ) n a e x t r e m i d a d e a n t e r i o r d o p r o t o z o á r i o. E P = e s t r u t u r a p a r a - f l a g e l a r ; F = f l a g e l o ; G = g l i c o s s o m o ; M = m i t o c ô n d r i a ; M S = m i c r o t ú b u l o s s u b - p e l i c u l a r e s.

21 3 s e u c i t o p l a s m a, s ã o e l a s : C r i t h i d i a d e a n e i ; C r i t h i d i a d e s o u z a i ; C r i t h i d i a o n c o p e l t i ; B l a s t o c r i t h i d i a c u l i c i s ; e H e r p e t o m o n a s r o i t m a n i. ( r e v i s t o p o r D E S O U Z A e M O T T A, ) E n d o s s i m b i o s e e m t r i p a n o s o m a t í d e o s O s e n d o s s i m b i o n t e s p r e s e n t e s n a s d i f e r e n t e s e s p é c i e s d e t r i p a n o s o m a t í d e o s g u a r d a m g r a n d e i d e n t i d a d e e n t r e s i e c o m b a c t é r i a s d o g ê n e r o B o r d e t e l l a, l e v a n t a n d o a h i p ó t e s e d e q u e u m ú n i c o e v e n t o e v o l u t i v o o r i g i n o u a e n d o s s i m b i o s e n e s t a f a m í l i a d e p r o t o z o á r i o s ( D U e t a l., a e b ). O p r o j e t o g e n o m a d o e n d o s s i m b i o n t e d e C. d e a n e i e s t á e m f a s e f i n a l, s e n d o q u e o s r e s u l t a d o s d o s e q ü e n c i a m e n t o r e v e l a m m a i o r h o m o l o g i a e n t r e e s t e p r o c a r i o t o e a b a c t é r i a B o r d e t e l l a p a r a p e r t u s s i s, u m a G r a m - n e g a t i v a, p e r t e n c e n t e à s u b d i v i s ã o β d a s P r o t e o b a c t é r i a s ( P R O B S T e t a l., ). A e n d o s s i m b i o s e e m t r i p a n o s o m a t í d e o s a p r e s e n t a u m c a r á t e r m u t u a l í s t i c o, s e n d o q u e i n t e n s a s t r o c a s m e t a b ó l i c a s o c o r r e m e n t r e a b a c t é r i a s i m b i ó t i c a e o p r o t o z o á r i o h o s p e d e i r o. O e n d o s s i m b i o n t e f e c h a d i v e r s o s c i c l o s m e t a b ó l i c o s c o m o p r o t o z o á r i o, q u e a p r e s e n t a b a i x a s e x i g ê n c i a s n u t r i c i o n a i s ( r e v i s t o p o r D e S O U Z A & M O T T A, ). A c a r a c t e r í s t i c a m a r c a n t e d o m u t u a l i s m o r e s i d e n o f a t o d o h o s p e d e i r o e d o s i m b i o n t e s e r e m i n c a p a z e s d e s o b r e v i v e r n a n a t u r e z a q u a n d o s e p a r a d o s, o q u e é o b s e r v a d o e m C. d e a n e i. A b a c t é r i a s i m b i ó t i c a n ã o é c a p a z d e s e r e p l i c a r f o r a d a c é l u l a h o s p e d e i r a e s o f r e l i s e o s m ó t i c a p o u c a s h o r a s a p ó s o s e u i s o l a m e n t o. J á o p r o t o z o á r i o c u r a d o ( o b t i d o a p ó s

22 4 t r a t a m e n t o c o m a n t i b i ó t i c o ), s ó c o n s e g u e s o b r e v i v e r i n v i t r o s e s u p l e m e n t o s n u t r i c i o n a i s f o r e m a d i c i o n a d o s a o m e i o d e c u l t u r a ( r e v i s t o p o r D e S O U Z A & M O T T A, ). A l é m d i s s o, e s s a c e p a a p o s i m b i ó t i c a é i n c a p a z d e c o l o n i z a r i n s e t o s ( F A M P A e t a l., ). É p o s s í v e l o b t e r u m a c e p a a p o s i m b i ó t i c a, t a m b é m c h a m a d a c e p a c u r a d a, a p ó s o c r e s c i m e n t o d o p r o t o z o á r i o e m m e i o c o n t e n d o c l o r a n f e n i c o l, u m a n t i b i ó t i c o q u e i n i b e a s í n t e s e p r o t é i c a e m p r o c a r i o t o s, c o m o d e s c r i t o p o r M u n d i m e t a l. e m p a r a C r i t h i d i a d e a n e i e p o r C h a n g e m p a r a B l a s t o c r i t h i d i a c u l i c i s e C r i t h i d i a o n c o p e l t i. A s s i m, é p o s s í v e l s e u t i l i z a r u m a c e p a a p o s i m b i ó t i c a e m e s t u d o s c o m p a r a t i v o s c o m a c e p a n o r m a l o u s e l v a g e m p a r a c o m p r e e n s ã o d o p a p e l m e t a b ó l i c o d o s i m b i o n t e n a b i o l o g i a d o p r o t o z o á r i o h o s p e d e i r o. A i n t e n s a t r o c a m e t a b ó l i c a o b s e r v a d a n a e n d o s s i m b i o s e d e t r i p a n o s o m a t í d e o s c o n f e r e a o p r o t o z o á r i o h o s p e d e i r o b a i x a e x i g ê n c i a n u t r i c i o n a l. U m e x e m p l o é o f a t o d a C. d e a n e i n ã o n e c e s s i t a r d e f o n t e s e x t e r n a s d o s a m i n o á c i d o s o r n i t i n a, a r g i n i n a e c i t r u l i n a, j á q u e o s i m b i o n t e c o n t é m a e n z i m a o r n i t i n a c a r b a m o i l t r a n s f e r a s e ( O C T ), q u e t o r n a o c i c l o d a u r é i a c o m p l e t o n e s t e s p r o t o z o á r i o s ( C A M A R G O & F R E Y M Ü L L E R, ). A p r e s e n ç a d o e n d o s s i m b i o n t e a u m e n t a a c a p a c i d a d e b i o s s i n t é t i c a d e h e m i n a j á q u e a b a c t é r i a c o n t é m p r e c u r s o r e s m e t a b ó l i c o s e a e n z i m a u r o p o r f i r i n o g ê n i o s i n t a s e, e n v o l v i d a n a f o r m a ç ã o d e g r u p a m e n t o s h e m e ( S A L Z M A N e t a l., ).

23 5 A b i o s s í n t e s e d e p o l i a m i n a s, q u e e s t á d i r e t a m e n t e r e l a c i o n a d a à p r o d u ç ã o d e o r n i t i n a, m o s t r a - s e e l e v a d a e m t r i p a n o s o m a t í d e o s q u e c o n t ê m o e n d o s s i m b i o n t e ( F R O S S A R D e t a l., ). E s t e s p o l i c á t i o n s e s t ã o e n v o l v i d o s e m p r o c e s s o s c e l u l a r e s c o m o d u p l i c a ç ã o d o D N A, p r o l i f e r a ç ã o e d i f e r e n c i a ç ã o c e l u l a r ( H E R B Y & P E R S S O N, ; P E G G e t a l., ). R e c e n t e m e n t e, n o s s o g r u p o d e m o n s t r o u a c a p a c i d a d e d a b a c t é r i a s i m b i ó t i c a e m p r o d u z i r u m f a t o r p r o t é i c o q u e a u m e n t a a a t i v i d a d e d a o r n i t i n a d e c a r b o x i l a s e ( O D C ), q u e e s t á d i r e t a m e n t e l i g a d a a b i o s s í n t e s e d e p o l i a m i n a s, a t u a n d o n a c o n v e r s ã o d a o r n i t i n a e m p u t r e s c i n a. N a s e s p é c i e s d e t r i p a n o s o m a t í d e o s c o m s i m b i o n t e, a m a i o r a t i v i d a d e d e s t a e n z i m a p r o m o v e u m a m a i o r p r o l i f e r a ç ã o d e s t a s c é l u l a s, q u a n d o c o m p a r a d a s à c e p a c u r a d a e t a m b é m a o u t r o s p r o t o z o á r i o s d a f a m í l i a ( F R O S S A R D e t a l., ). N o s s o g r u p o c o n s t a t o u d i f e r e n ç a s e n t r e a s c e p a s n o r m a l e c u r a d a e m u m e s t u d o s o b r e a i n f l u ê n c i a d o e n d o s s i m b i o n t e n a b i o s s í n t e s e d e f o s f o l i p í d e o s d o p r o t o z o á r i o h o s p e d e i r o. A p r e s e n ç a d a b a c t é r i a s i m b i ó t i c a i m p l i c a e m m a i o r p r o d u ç ã o d e f o s f o l i p í d e o s p e l o p r o t o z o á r i o, s e n d o a f o s f a t i d i l c o l i n a ( P C ) o p r i n c i p a l f o s f o l i p í d e o f o r m a d o. E s t e d a d o r e f o r ç a a i m p o r t â n c i a d a s í n t e s e d e P C e m C. d e a n e i, u m f o s f o l i p í d e o m a j o r i t á r i o n a c o m p o s i ç ã o d a m e m b r a n a p l a s m á t i c a e t a m b é m n a s m e m b r a n a s m i t o c o n d r i a i s ( P A L M I É - P E I X O T O e t a l., ). A p r e s e n ç a d o e n d o s s i m b i o n t e p r o m o v e a l t e r a ç õ e s u l t r a e s t r u t u r a i s n a c é l u l a h o s p e d e i r a. A s c e p a s s e l v a g e m e c u r a d a

24 6 d e e s p é c i e s q u e c o n t é m a b a c t é r i a s i m b i ó t i c a a p r e s e n t a m u m a e s t r u t u r a p a r a x i a l r e d u z i d a ( G A D E L H A e t a l., ) e u m c i n e t o p l a s t o a r r e d o n d a d o, o n d e o a r r a n j o d e f i b r i l a s d e D N A é m a i s f r o u x o ( C A V A L C A N T I e t a l., ). A l é m d i s s o, e s t e s t r i p a n o s o m a t í d e o s a p r e s e n t a m u m a m i t o c ô n d r i a m a i s r a m i f i c a d a e m i c r o t ú b u l o s s u b p e l i c u l a r e s a u s e n t e s n o s p o n t o s e m q u e o s r a m o s m i t o c o n d r i a i s e s t ã o p r ó x i m o s à m e m b r a n a p l a s m á t i c a ( F I G U R A 2 ) ( F R E Y M U L L E R & C A M A R G O, ). O e n d o s s i m b i o n t e p a r e c e d i v i d i r - s e e m s i n c r o n i a c o m o u t r a s e s t r u t u r a s d o t r i p a n o s o m a t í d e o h o s p e d e i r o, j á q u e c a d a c é l u l a f i l h a c o n t é m a p e n a s u m a ú n i c a b a c t é r i a s i m b i ó t i c a ( M O T T A e t a l., ). P e l a a n á l i s e u l t r a e s t r u t u r a l e b i o q u í m i c a d a r e l a ç ã o e n t r e C r i t h i d i a d e a n e i e s u a b a c t é r i a s i m b i ó t i c a, f o i c o n s t a t a d a a l o c a l i z a ç ã o d e g l i c o s s o m o s p r ó x i m o s a o e n d o s s i m b i o n t e. E s t e d a d o, s o m a d o à b a i x a a t i v i d a d e d a c a d e i a r e s p i r a t ó r i a d a b a c t é r i a, s u g e r e q u e o p r o t o z o á r i o h o s p e d e i r o p o d e e s t a r f o r n e c e n d o, a t r a v é s d o m e t a b o l i s m o g l i c o s s o m a l, p a r t e d o A T P c o n s u m i d o p e l o e n d o s s i m b i o n t e. A l é m d i s s o, a p r e s e n ç a d e u m a e c t o A T P a s e n o e n v o l t ó r i o d o e n d o s s i m b i o n t e, s u g e r e q u e a e n e r g i a r e s u l t a n t e d a h i d r ó l i s e d e A T P p o d e e s t a r s e n d o u t i l i z a d a p a r a t r a n s p o r t e a t i v o d e s u b s t â n c i a s e s s e n c i a i s à b a c t é r i a s i m b i ó t i c a ( M O T T A e t a l., a ). Q u a n t o à m o r f o l o g i a d o e n d o s s i m b i o n t e, e s t u d o s i m u n o c i t o q u í m i c o s d e m o n s t r a m q u e a s u a m a t r i z é c o m p o s t a p o r u m a r e g i ã o g r a n u l a r e u m a z o n a f i b r i l a r. A r e g i ã o g r a n u l a r é

25 F i g u r a 2 U l t r a e s t r u t u r a d e C r i t h i d i a d e s o u z a i. M i c r o s c o p i a e l e t r ô n i c a d e t r a n s m i s s ã o d e C r i t h i d i a d e s o u z a i e v i d e n c i a n d o a m o r f o l o g i a d e t r i p a n o s o m a t í d e o s q u e c o n t é m o e n d o s s i m b i o n t e : c i n e t o p l a s t o ( K ) a r r e d o n d a d o c o m a r r a n j o d e D N A f r o u x o ; e n d o s s i m b i o n t e ( E ) p r ó x i m o a o n ú c l e o ( N ) ; a u s ê n c i a d e m i c r o t ú b u l o s s u b - p e l i c l a r e s n o s p o n t o s e m q u e o s r a m o s m i t o c o n d r i a i s ( M ) s e a p r o x i m a m d a m e m b r a n a p l a s m á t i c a d o h o s p e d e i r o. F = f l a g e l o ; F P = b o l s a f l a g e l a r ; G = c o m p l e x o d e G o l g i ; V = a g r e g a d o d e p a r t í c u l a s v i r a i s X. S o a r e s e t a l.,

26 8 e l é t r o n - d e n s a, s e n d o c o m p o s t a p r i n c i p a l m e n t e p o r r i b o s s o m o s e d i s t i n g u e - s e d a f i b r i l a r, q u e é m a i s e l é t r o n - l u c e n t e e c o m p o s t a p o r D N A ( M O T T A e t a l., ) O e n v o l t ó r i o b a c t e r i a n o B a c t é r i a s G r a m n e g a t i v a s s ã o d e l i m i t a d a s p o r d u a s u n i d a d e s d e m e m b r a n a s e p a r a d a s e n t r e s i p e l o e s p a ç o p e r i p l a s m á t i c o, o n d e e s t á p r e s e n t e u m a c a m a d a d e m u r e í n a o u p e p t i d i o g l i c a n o ( F I G U R A 3 ). E s t a e s t r u t u r a m a c r o m o l e c u l a r é c o m p o s t a p o r g l i c a n a s u n i d a s c o v a l e n t e m e n t e p o r l i g a ç õ e s p e p t í d i c a s, a p r e s e n t a n d o a f u n ç ã o d e m a n t e r o f o r m a t o c e l u l a r e c o n f e r i r e s t a b i l i d a d e o s m ó t i c a ( C A B E E N & J A C O B S - W A G N E R, ; R U I Z e t a l, ). A s m e m b r a n a s p l a s m á t i c a s d e p r o c a r i o t o s n o r m a l m e n t e n ã o a p r e s e n t a m e s t e r ó i s e s u a c o m p o s i ç ã o f o s f o l i p í d i c a é v a r i a d a. E m E s c h e r i c h i a c o l i a m e m b r a n a i n t e r n a a p r e s e n t a % d e f o s f a t i d i l e t a n o l a m i n a ( P E ), % d e f o s f a t i d i l g l i c e r o l ( P G ) e 5 % o u m e n o s d e c a r d i o l i p i n a ( C L ). E s t e s p e r c e n t u a i s s ã o s i m i l a r e s a o s e n c o n t r a d o s n a m e m b r a n a e x t e r n a, e m b o r a o s f o s f o l i p í d e o s s e l o c a l i z e m a p e n a s n o f o l h e t o i n t e r n o, p o i s o f o l h e t o e x t e r n o d e s t a m e m b r a n a é c o m p o s t o e x c l u s i v a m e n t e p o r l i p o p o l i s a c a r í d e o s ( L P S ) ( R U I Z e t a l., ). A P C e s t á a u s e n t e n a m a i o r i a d o s p r o c a r i o t o s, m a s c o m p õ e m o e n v o l t ó r i o d e b a c t é r i a s i n t i m a m e n t e a s s o c i a d a s a e u c a r i o t o s ( L Ó P E Z - L A R A & G E I G E R, ).

27 F i g u r a 3 E n v o l t ó r i o c e l u l a r d e b a c t é r i a s G r a m - n e g a t i v a s. D e s e n h o e s q u e m á t i c o o b t i d o d o s i t e h t t p : / / w w w. c o n c e p t d r a w. c o m e v i d e n c i a n d o a s e s t r u t u r a s q u e c o m p õ e m o e n v o l t ó r i o d e b a c t é r i a s G r a m - n e g a t i v a s : m e m b r a n a i n t e r n a, q u e d e l i m i t a o c i t o p l a s m a, c o m p o s t a p o r p r o t e í n a s e f o s f o l i p í d e o s ; p e r i p l a s m a ( o u e s p a ç o p e r i p l a s m á t i c o ), o n d e s e e n c o n t r a a c a m a d a d e p e p t i d i o g l i c a n o ; e m e m b r a n a e x t e r n a, l i g a d a a c a m a d a d e p e p t i d i o g l i c a n o p o r l i p o p r o t e í n a s e c o n s t i t u í d a p o r l i p o p o l i s a c a r í d e o s e p r o t e í n a s c o m o a s p o r i n a s. h t t p : / / w w w. c o n c e p t d r a w. c o m / s a m p l e t o u r / m e d i c a l / G r a m N e g a t i v e E n v e l o p e. g i f 9

28 1 0 O e n v o l t ó r i o d o e n d o s s i m b i o n t e é c o m p o s t o p o r d u a s u n i d a d e s d e m e m b r a n a, e n t r e t a n t o a n á l i s e s u l t r a e s t r u t u r a i s m o s t r a m q u e u m a p a r e d e c e l u l a r d e b a c t é r i a s G r a m - n e g a t i v a s e s t á r e d u z i d a ( F I G U R A 4 ) ( S O A R E S & D e S O U Z A, ; M O T T A e t a l., ). S e g u n d o M o t t a e t a l. ( b ), a a ç ã o d e a n t i b i ó t i c o s β- l a c t â m i c o s e m C. d e a n e i a f e t a t a n t o a f o r m a q u a n t o a d i v i s ã o d a b a c t é r i a s i m b i ó t i c a s u g e r i n d o q u e, a p e s a r d e e x t r e m a m e n t e r e d u z i d a, a p a r e d e c e l u l a r d e s e m p e n h a p a p é i s e s s e n c i a i s n o e n d o s s i m b i o n t e. A e x i s t ê n c i a d e d u a s m e m b r a n a s e a p r e s e n ç a d e u m a p a r e d e r e d u z i d a ( F I G U R A 4 A - B ) l e v a a u m a c o n t r o v é r s i a q u a n t o à o r i g e m d a m e m b r a n a e x t e r n a. A l g u n s a u t o r e s d e f e n d e m a h i p ó t e s e d e q u e e s t a m e m b r a n a é d e r i v a d a d a m e m b r a n a p l a s m á t i c a d o p r o t o z o á r i o h o s p e d e i r o n o m o m e n t o e m q u e a b a c t é r i a f o i i n c o r p o r a d a, f o r m a n d o o s i m b i o s o m o v a c ú o l o q u e c o n t é m a b a c t é r i a s i m b i ó t i c a ( C H A N G, ). P o r é m, p a r a o u t r o s a u t o r e s a m e m b r a n a e x t e r n a t e m c a r a c t e r í s t i c a s p r o c a r i o t a s, p o r a p r e s e n t a r p o r i n a s ( A N D R A D E e t a l., ) e a l t a q u a n t i d a d e d e p r o t e í n a s t r a n s m e m b r a n a ( F I G U R A 4 C ), c o m o d e s c r i t o e m b a c t é r i a s G r a m n e g a t i v a s ( M O T T A e t a l., ; S O A R E S & D E S O U Z A, ). E s t u d o s r e c e n t e s c o n f i r m a r a m a a u s ê n c i a d e e s t e r ó i s n o e n v o l t ó r i o d o e n d o s s i m b i o n t e e m o s t r a r a m q u e s u a c o m p o s i ç ã o f o s f o l i p í d i c a é c o n s t i t u í d a p o r 2 5, 7 % d e C L, 2 0, 1 % d e P C, 1 9 % d e P E e 1 5, 4 % d e P I ( P A L M I É - P E I X O T O e t a l., ). I m p o r t a n t e m e n c i o n a r q u e P C n ã o e s t á p r e s e n t e e m p r o c a r i o t o s, m a s

29 1 1 A B C F i g u r a 4 E n v o l t ó r i o d o e n d o s s i m b i o n t e d e t r i p a n o s o m a t í d e o s. E m A, m i c r o s c o p i a e l e t r ô n i c a d e t r a n s m i s s ã o d o e n d o s i m b i n o t e ( E ) d e B l a s t o c r i t h i d i a c u l i c i s. S e t a s i n d i c a m o a u m e n t o d a f i g u r a A n a f i g u r a B X E m B, m i c r o s c o p i a e l e t r ô n i c a d e t r a n s m i s s ã o m o s t r a n d o e m m a i o r a u m e n t o d a f i g u r a A ( s e t a s ), e v i d e n c i a n d o a s m e m b r a n a s i n t e r n a ( I M ) e m e m b r a n a e x t e r n a ( O M ). N o t a r q u e a f o r m a d a b a c t é r i a n ã o é b e m d e f i n i d a s u g e r i n d o a a u s ê n c i a d e p a r e d e e x t e r n a e n t r e a s d u a s m e m b r a n a s d o s i m b i o n t e. P M = m e m b r a n a p l a s m á t i c a X. E m C, c r i o f r a t u r a d o e n d o s s i m b i o n t e r e v e l a n d o p r o t e í n a s t r a n s m e m b r a n a s p r e s e n t e s n o e n v o l t ó r i o d a b a c t é r i a s i m b i ó t i c a. P F o = f a c e p r o t o p l a s m á t i c a d a m e m b r a n a e x t e r n a ; P F i = f a c e p r o t o p l a s m á t i c a d a m e m b r a n a i t e r n a ; E F o = f a c e e x t r a c e l u l a r d a m e m b r a n a e x t e r n a ; E F i = f a c e e x t r a c e l u l a r d a m e m b r a n a i t e r n a X. S o a r e s & D e S o u z a

30 1 2 e n c o n t r a s - s e n o e n v o l t ó r i o d e b a c t é r i a s i n t i m a m e n t e a s s o c i a d a s a c é l u l a s e u c a r i o t a s, s e j a p o r s i m b i o s e o u p a t o g ê n i c a s ( L Ó P E Z - L A R A & G E I G E R, ) M e t a b o l i s m o d e f o s f a t i d i l c o l i n a O e s t u d o d a e s t r u t u r a d o s f o s f o l i p í d e o s, b e m c o m o d e s u a s f u n ç õ e s e v i a s d e s í n t e s e, t e v e g r a n d e s a v a n ç o s n a d é c a d a d e 5 0, q u a n d o E u g e n e K e n n e d y e c o l a b o r a d o r e s u t i l i z a r a m b a c t é r i a s c o m o m o d e l o e x p e r i m e n t a l. N a s d é c a d a s s e g u i n t e s, v á r i o s e s t u d o s f o r a m r e a l i z a d o s s o b r e a r e g u l a ç ã o d a s v i a s d e s í n t e s e d e f o s f o l i p í d e o s, u t i l i z a n d o i n c l u s i v e a b o r d a g e n s m o l e c u l a r e s. D e u m m o d o g e r a l, o s f o s f o l i p í d e o s a p r e s e n t a m i m p o r t a n t e s f u n ç õ e s : s ã o c o n s t i t u i n t e s m a j o r i t á r i o s d a m e m b r a n a p l a s m á t i c a ; i n t e r a g e m c o m e n z i m a s e p r o t e í n a s i n t e g r a i s, c o n t r i b u i n d o p a r a a a q u i s i ç ã o d e u m a c o n f o r m a ç ã o f u n c i o n a l f i n a l ; p a r t i c i p a m d e i m p o r t a n t e s p r o c e s s o s d e s i n a l i z a ç ã o c e l u l a r e i n f l u e n c i a m a e x p o r t a ç ã o p r o t é i c a e a r e p l i c a ç ã o d e D N A ( C R O N A N, ). C o m f u n ç õ e s t ã o i m p o r t a n t e s e d i v e r s i f i c a d a s, e s s a s m a c r o m o l é c u l a s a p r e s e n t a m c o m p o s i ç ã o e d i s t r i b u i ç ã o v a r i a d a n o s d i f e r e n t e s t i p o s c e l u l a r e s ( D O W H A N, ; K E N T, ). A f u n ç ã o u n i c a m e n t e e s t r u t u r a l d e P C, f o s f o l i p í d e o p r e d o m i n a n t e n a m e m b r a n a p l a s m á t i c a d e e u c a r i o t o s, a i n d a é d i s c u t i d a. A s s i m c o m o P C, P E é u m f o s f o l i p í d e o z w i t t e r i ô n i c o, e t a m b é m p a r e c e d e s e m p e n h a r u m p a p e l i m p o r t a n t e n a e s t r u t u r a ç ã o d e m e m b r a n a s e n a c i t o c i n e s e b a c t e r i a n a ( M A T S U M O T O e t a l., ). J á P I, p a r t i c i p a d a s i n a l i z a ç ã o c e l u l a r e m e u c a r i o t o s, a p ó s s e r f o s f o r i l a d o a

31 1 3 f o s f a t i d i l i n o s i t o l 4, 5 - b i f o s f a t o q u e é s u b s t r a t o d a f o s f o l i p a s e C, r e s u l t a n d o n a p r o d u ç ã o d e i n o s i t o l 1, 4, 5 - t r i f o s f a t o ( I P 3 ), q u e l i b e r a C a + + d e e s t o q u e s i n t r a c e l u l a r e s, e d i a c i l g l i c e r o l ( D A G ) q u e a t i v a p r o t e í n a s c i n a s e C ( S A S A K I e t a l., ). O s f o s f o l i p í d e o s p o s s u e m v á r i a s v i a s d e s í n t e s e, q u e p o d e m v a r i a r d e u m o r g a n i s m o p a r a o u t r o. E n t r e t a n t o, a b i o s s í n t e s e d e f o s f o l i p í d e o s s e m p r e c o m e ç a c o m a f o r m a ç ã o d e á c i d o f o s f a t í d i c o ( P A ) a p ó s d u a s a c i l a ç õ e s d e s n - g l i c e r o l P. N e s t a s v i a s d e s í n t e s e, u m f o s f o l i p í d e o f o r m a d o p o d e s e r c o n v e r t i d o e m o u t r o, c o n s i d e r a n d o a s e n z i m a s e n v o l v i d a s n e s t e s p r o c e s s o s e o s p r e c u r s o r e s m e t a b ó l i c o s d i s p o n í v e i s ( D O W H A N, ). E m b o r a r e s u l t e m n o s m e s m o s f o s f o l i p í d e o s, a s v i a s d e s í n t e s e d e s s a s m a c r o m o l é l u l a s v a r i a m e n t r e p r o c a r i o t o s e e u c a r i o t o s ( D O W H A N, ; K E N T, ). D e n t r e s e s t a s v i a s, a d e s í n t e s e d e P C é u m a l v o d e e s t u d o m u i t o i m p o r t a n t e p e l o f a t o d e s t e f o s f o l i p í d e o e s t a r a u s e n t e e m p r o c a r i o t o s l i v r e s, m a s p r e s e n t e e m b a c t é r i a s a s s o c i a d a s i n t i m a m e n t e a e u c a r i o t o s ( L Ó P E Z - L A R A & G E I G E R, e R U D D E R e t a l., , ). A s í n t e s e d e P C p o d e o c o r r e r a p a r t i r d e t r ê s v i a s p r i n c i p a i s : K e n n e d y, G r e e n b e r g e P C s i n t a s e. A l g u n s d a d o s r e l a c i o n a d o s à s e n z i m a s p r e s e n t e s n a s v i a s d e s í n t e s e d e P C f o r a m r e u n i d o s e m u m a t a b e l a n o f i n a l d e s t e c a p í t u l o ( T A B E L A 1 ).

32 V i a d e K e n n e d y T a m b é m c o n h e c i d a c o m o v i a d a C D P - c o l i n a, a v i a d e K e n n e d y é a p r i n c i p a l v i a d e s í n t e s e d e P C e m c é l u l a s d e m a m í f e r o s. N e s s a v i a, a c o l i n a l i v r e é u t i l i z a d a p a r a s í n t e s e d e P C, p a s s a n d o p o r 3 e t a p a s : a p r i m e i r a c o n t a c o m a a ç ã o d a e n z i m a c o l i n a c i n a s e, q u e f o s f o r i l a a c o l i n a l i v r e e m f o s f o c o l i n a ; a s e g u n d a e t a p a, q u e é l i m i t a n t e d a r e a ç ã o, t e m c o m o e n z i m a c a t a l i s a d o r a a C T P : f o s f o c o l i n a c i t i d i l i l t r a n s f e r a s e ( C C T ), q u e f o r m a C D P - c o l i n a a p a r t i r d e c o l i n a f o s f a t o e C T P ; f i n a l m e n t e, n a t e r c e i r a e t a p a a e n z i m a C D P - c o l i n a : 1, 2 - d i a c i l g l i c e r o l c o l i n a f o s f o t r a n s f e r a s e c o n v e r t e C D P - c o l i n a e d i a c i l g l i c e r o l e m P C ( F I G U R A 5 ). A m i l t e f o s i n a a t u a c o m o d r o g a i n i b i d o r a d e s s a v i a, a o i m p e d i r a l i g a ç ã o d a C T P : f o s f o c o l i n a c i t i d i l i l t r a n s f e r a s e à m e m b r a n a, p a r a q u e e s t a t o r n e - s e a t i v a ( U R B I N A, ; C U I & H O U W E L I N G, ). E n t r e t a n t o, e s t a d r o g a a p r e s e n t a o u t r o s a l v o s n a c é l u l a, c o m o o s g l i c o s s o m o s ( L U X e t a l., ) e a m i t o c ô n d r i a, d e s e n c a d e a n d o o p r o c e s s o d e a p o p t o s e ( W I E D E R e t a l., ) V i a d e G r e e n b e r g P o s t e r i o r m e n t e d e n o m i n a d a v i a d a s m e t i l a ç õ e s p o r C u i e H o u w e l i n g ( ), e s t a v i a é d e s c r i t a c o m o a p r i n c i p a l e m c é l u l a s p r o c a r i o t a s e c o m o u m a v i a a d i c i o n a l e m h e p a t ó c i t o s. A v i a d e G r e e n b e r g u t i l i z a c o m o s u b s t r a t o i n i c i a l a P E p a r a f o r m a r P C e m t r ê s e t a p a s. T a i s e t a p a s s ã o c o n s t i t u í d a s p o r

33 1 5 V i a d e Kennedy V i a d e Gr e e nberg F i g u r a 5 V i a d e K e n n e d y e V i a d e G r e e n b e r g. A s í n t e s e d e P C o c o r r e p r e d o m i n a n t e m e n t e p e l a V i a d e K e n n e d y e m e u c a r i o t o s s u p e r i o r e s. J á e m e u c a r i o t o s i n f e r i o r e s e e m a l g u m a s b a c t é r i a s i n t i m a m e n t e a s s o c i a d a s a e u c a r i o t o s ( p a r a s i t a s e s i m b i o n t e s ), a V i a d e G r e e n b e r g é d e s c r i t a c o m o a p r i n c i p a l. C K = c o l i n a c i n a s e ; C C T = C T P : f o s f o c o l i n a c i t i d i l i l t r a n s f e r a s e ; C P T = f o s f a t i d i l c o l i n a t r a s n f e r a s e ; P m t = f o s f a t i d i l e t a n o l a m i n a m e t i l t r a n s f e r a s e ; S A M = S - a d e n o s i l m e t i o n i n a ; S A H = S - a d e n o s i l h o m o c i s t e í n a L Ó P E Z - L A R A & G E I G E R,

34 1 6 r e a ç õ e s d e m e t i l a ç ã o, o n d e a P E p a s s a p e l o s i n t e r m e d i á r i o s m o n o m e t i l f o s f a t i d i l e t a n o l a m i n a ( M M P E ) e d i m e t i l f o s f a - t i d i l e t a n o l a m i n a ( D M P E ) a n t e s d e f o r m a r o p r o d u t o f i n a l, a P C ( F I G U R A 5 ). N e s t a v i a, o c o r r e a a ç ã o d e d u a s i s o f o r m a s d a e n z i m a f o s f a t i d i l e t a n o l a m i n a -Ν - m e t i l t r a n s f e r a s e ( P m t ), a m b a s d e r i v a d a s d e u m ú n i c o g e n e. T a i s i s o f o r m a s s ã o c a p a z e s d e c a t a l i z a r r e a ç õ e s p a r a a f o r m a ç ã o d e P C, m a s a p r e s e n t a m d i f e r e n ç a s q u a n t o a a t i v i d a d e e a l o c a l i z a ç ã o c e l u l a r : n o f í g a d o, a P m t 1 é r e s p o n s á v e l p o r c e r c a d e 8 0 % d a a t i v i d a d e m e t i l t r a n s f e r a s e e l o c a l i z a - s e n o r e t i c u l o e n d o p l a s m á t i c o ; j á a P m t 2 r e p r e s e n t a a p e n a s 2 0 % d e s s a a t i v i d a d e e l o c a l i z a - s e e x c l u s i v a m e n t e e m m e m b r a n a s a s s o c i a d a s à m i t o c ô n d r i a ( C U I & H O U W E L I N G, ). E m b o r a t e n h a c o m o a l v o a i n i b i ç ã o d a s í n t e s e d e e s t e r ó i s, o 2 2, a z a s t e r o l p o d e s e r u t i l i z a d o c o m o i n i b i d o r d e s s a v i a p o r i n i b i r a a t i v i d a d e d a s P m t ( U R B I N A, ; R O D R I G U E S e t a l., ; P A L M I É - P E I X O T O e t a l., ) V i a d a P C s i n t a s e D e s c r i t a e m p r o c a r i o t o s c o m í n t i m a a s s o c i a ç ã o a e u c a r i o t o s, c o m o n o c a s o d e s i m b i o s e s, e s s a v i a a p r e s e n t a - s e c o m o u m a a l t e r n a t i v a à s í n t e s e d e P C e m b a c t é r i a s c o m o S i n o r h i z o b i u m m e l i l l o t i. S e g u n d o R u d d e r e c o l a b o r a d o r e s ( ) m u t a n t e s d o g ê n e r o R h i z o b i u m d e f i c i e n t e s e m N - m e t i l t r a n s f e r a s e a p r e s e n t a r a m P C e m s u a s m e m b r a n a s, s u g e r i n d o u m a v i a a l t e r n a t i v a à d e G r e e n b e r g p a r a a s í n t e s e d e s t e f o s f o l i p í d e o.

35 1 7 E m , R u d d e r e c o l a b o r a d o r e s d e s c r e v e r a m, e m p r o c a r i o t o s i n t i m a m e n t e a s s o c i a d o s a e u c a r i o t o s, u m a v i a a l t e r n a t i v a p a r a s í n t e s e d e P C. N e s t a v i a, P C é s i n t e t i z a d a e m a p e n a s u m a r e a ç ã o : a e n z i m a f o s f a t i d i l c o l i n a s i n t a s e ( P c s ) c a t a l i z a a r e a ç ã o d e C D P - d i a c i l g l i c e r í d e o c o m c o l i n a l i v r e, f o r m a n d o P C e C M P ( F I G U R A 6 ). N e s t e t r a b a l h o v e r i f i c a m o s a i n f l u ê n c i a d o e n d o s s i m b i o n t e n a s í n t e s e d e f o s f o l i p í d e o s d e C. d e a n e i e s u a p o s s í v e l d e p e n d ê n c i a d a c é l u l a h o s p e d e i r a p a r a a s í n t e s e d e P C. O e s t u d o d a s v i a s d e s í n t e s e d e f o s f o l i p í d e o s e m C. d e a n e i p o d e r á r e v e l a r n o v a s t r o c a s m e t a b ó l i c a s e n t r e a b a c t é r i a s i m b i ó t i c a e o p r o t o z o á r i o h o s p e d e i r o, p o s s i b i l i t a n d o m a i o r c o m p r e e n s ã o s o b r e o e s t a b e l e c i m e n t o d a e n d o s s i m b i o s e e m t r i p a n o s o m a t í d e o s.

36 1 8 p c s C M P c o l i n a CDP-diacilglicerol Fosfatifilcolina F i g u r a 6 V i a d a P C S i n t a s e ( P C S ). V i a a l t e r n a t i v a d e s í n t e s e d e P C d e s c r i t a e m a l g u m a s b a c t é r i a s i n t i m a m e n t e a s s o c i a d a s a e u c a r i o t o s, e m c a s o s d e p a r a s i t i s m o s e s i m b i o s e s.

37 1 9 T a b e l a 1 E z i m a s d a s v i a s d e s í n t e s e d e P C ( V i a d e K e n n e d y, V i a d e G r e e n b e r g e V i a d a P C S i n t a s e ). E n z i m a V i a F u n ç ã o R e a g e n t e P r o d u t o T i p o I n i b i d o r e s c e l u l a r C o l i n a c i n a s e K e n n e d y F o s f o r i l a ç ã o d a C o l i n a l i v r e C o l i n a E u c a r i o t o s H e m i c h o l i u m - 3 ( C K ) c o l i n a e f o s f a t o ( H C - 3 ) e t a n o l a m i n a C T P : f o s f o c o l i n a K e n n e d y A d i ç ã o d e C M P C o l i n a f o s f a t o + c i t i d i l i l t r a n s f e r a s e ( C T ) à c o l i n a C T P C D P - c o l i n a : 1, 2 - d i a c i l g l i c e r o l c o l i n a f o s f o t r a n s f e r a s e ( C P T ) F o s f a t i d i l s e r i n a d e s c a r b o x i l a s e F o s f a t i d i l - e t a n o l a m i n a -Νm e t i l t r a n s f e r a s e ( P m t ) f o s f o r i l a d a ( e t a p a l i m i t a n t e ) K e n n e d y T r o c a d a C M P p e l o 1, 2 d i a c i l g l i c e r o l G r e e n b e r g D e s c a r b o x i l a ç ã o d a f o s f a t i d i l s e r i n a M e t i l a ç ã o d a P E e i n t e r m e d i á r i o s C D P - c o l i n a + D A G C D P - c o l i n a E u c a r i o t o s L i s o f o s f o l i p í d e o s : m i l t e f o s i n a ( H e P C ) ; e d e l f o s i n a ( E T O C H 3 ) P C E u c a r i o t o s F a r s e n o l ; g e r a n i l g e r a n o l ; c e l e r i t r i n a F o s f a t i d i l s e r i n a P E E u c a r i o t o s P E ; M M P E ; D M P E P C s i n t a s e P c s S í n t e s e d e P C c o l i n a + C D P - d i a c i l g l i c e r o l M M P E ; D M P E ; P C C M P + P C E u c a r i o t o s, p r o c a r i o t o s P r o c a r i o t o s í n t i m a m e n t e a s s o c i a d o s a e u c a r i o t o s A z a s t e r o l

38 2 0 2 Objetivo s 2. 1 O b j e t i v o G e r a l E s t u d a r a s í n t e s e d e f o s f o l i p í d e o s e m C r i t h i d i a d e a n e i e e m s e u e n d o s s i m b i o n t e i s o l a d o O b j e t i v o s e s p e c í f i c o s C o m p a r a r a s í n t e s e d e f o s f o l i p í d e o s n a s c e p a s n o r m a l e c u r a d a d e C. d e a n e i ; O b s e r v a r p o r m i c r o s c o p i a d e t r a n s m i s s ã o a u l t r a e s t r u t u r a d a s f r a ç õ e s d e s i m b i o n t e e m i t o c ô n d r i a a p ó s 3 h o r a s d e i s o l a m e n t o ; A v a l i a r a c o m p o s i ç ã o f o s f o l i p í d i c a d a s f r a ç õ e s d e s i m b i o n t e e m i t o c ô n d r i a ( m o d e l o c o m p a r a t i v o ) o b t i d a s d e C. d e a n e i c r e s c i d a e m m e i o c o n t e n d o 3 2 P i ; A n a l i s a r a c a p a c i d a d e d e s í n t e s e d e f o s f o l i p í d e o s e m e n d o s s i m b i o n t e s e m i t o c ô n d r i a s i s o l a d o s d e C. d e a n e i ; I d e n t i f i c a r e n z i m a s e n v o l v i d a s n a s í n t e s e d e P C n o g e n o m a d o e n d o s s i m b i o n t e ; C a r a c t e r i z a r a v i a d e s í n t e s e d e P C p e l o s i m b i o n t e i s o l a d o d e C. d e a n e i ; O b s e r v a r a d i f e r e n ç a n o c o n s u m o d e O 2 e n t r e c e p a s n o r m a l e c u r a d a d e C. d e a n e i ; O b s e r v a r o c o n s u m o d e O 2 e m f r a ç õ e s d e s i m b i o n t e e m i t o c ô n d r i a d e C. d e a n e i, v i s a n d o p r o v a r a v i a b i l i d a d e.

39 2 1 3 M a t e r i al e métodos 3. 1 C u l t i v o A s c e p a s n o r m a l e c u r a d a d e C r i t h i d i a d e a n e i f o r a m c u l t i v a d a s c o m i n o c u l o d e 1 0 % d e c é l u l a s e m m e i o W a r r e n ( W A R R E N, ) e n r i q u e c i d o c o m 1 0 % d e s o r o f e t a l b o v i n o ( C u l t i l a b ). A s c é l u l a s f o r a m m a n t i d a s a t r a v é s d e r e p i q u e s s e m a n a i s, o n d e u m i n ó c u l o d e 1 0 % d a c u l t u r a d e c é l u l a s f o i a d i c i o n a d o a o m e i o f r e s c o. E m s e g u i d a, a s c é l u l a s f o r a m c r e s c i d a s p o r 2 4 h o r a s e m e s t u f a a 2 8 C. A p ó s 2 4 h o r a s, a s c é l u l a s f o r a m a r m a z e n a d a s e m g e l a d e i r a a 4 C p o r 7 d i a s a t é o p r ó x i m o r e p i q u e F r a c i o n a m e n t o c e l u l a r O b t e n ç ã o d a s f r a ç õ e s d e e n d o s s i m b i o n t e e m i t o c ô n d r i a P a r a i s o l a r o e n d o s s i m b i o n t e d e C r i t h i d i a d e a n e i f o i u t i l i z a d a a t é c n i c a d e f r a c i o n a m e n t o c e l u l a r e s t a b e l e c i d a p o r A l f i e r i e t a l. ( ) c o m a l g u m a s m o d i f i c a ç õ e s, c o m o d e s c r i t o a s e g u i r. F o r a m c r e s c i d a s e n t r e m L e 1, 2 l i t r o s d e c é l u l a s, o b t e n d o - s e a c o n c e n t r a ç ã o d e c é l u l a s / m L ( c o n c e n t r a ç ã o c e l u l a r e m q u e a C r i t h i d i a d e n e i a t i n g e a f a s e l o g d e c r e s c i m e n t o ), e m m e i o W a r r e n ( W A R R E N, ) c o n t e n d o 1 0 % d e s o r o f e t a l b o v i n o. O s p r o t o z o á r i o s f o r a m c e n t r i f u g a d o s e l a v a d o s 2 v e z e s e m t a m p ã o f o s f a t o d e s ó d i o ( P B S ), p H 7, 2 e c e n t r i f u g a d o s a g p o r 1 0

40 2 2 m i n u t o s a 4 C e m c e n t r í f u g a S o r v a l l ( R C - 5 B r e f r i g e r a t e d s u p e r s p e e d c e n t r i f u g u e D u P o n t I n s t r u m e n t s ). O s e d i m e n t o o b t i d o f o i r e s s u s p e n s o e m 4 a 6 m L d e á g u a d e i o n i z a d a g e l a d a o n d e é m a n t i d o e m t u b o d e e n s a i o, e m b a n h o d e g e l o, p o r c e r c a d e 3 5 m i n u t o s. A p ó s e s s e t e m p o, a s c é l u l a s f o r a m c e n t r i f u g a d a s a g p o r 1 0 m i n u t o s a 4 C n a m e s m a c e n t r í f u g a e r e s s u s p e n s a s e m 1 0 a 1 3 m L d e t a m p ã o t r i s - H C L 2 0 m M, p H 7, 6 c o n t e n d o s a c a r o s e 0, 2 5 M. O r o m p i m e n t o c e l u l a r f o i r e a l i z a d o p o r u l t r a - s o m ( U l t r a s o n i c p r o c e s s o r m o d e l G E X ) e m b a n h o d e g e l o, o n d e f o r a m a p l i c a d a s t r ê s s e s s õ e s d e t r ê s s é r i e s d e p u l s o s d e 1 5 s c o m a m p l i t u d e d e 1 0 %. E n t r e c a d a s é r i e d e p u l s o s, d e u - s e u m i n t e r v a l o d e u m m i n u t o p a r a p r o m o v e r a s e d i m e n t a ç ã o d a s c é l u l a s i n t e i r a s, o q u e o t i m i z a o r o m p i m e n t o. E m s e g u i d a, o h o m o g e n e i z a d o o b t i d o d o r o m p i m e n t o f o i i n c u b a d o e m p r o v e t a d e 5 0 m L e m e s t u f a a 2 5 C p o r 3 0 m i n u t o s e m u m v o l u m e f i n a l d e s o l u ç ã o d e 2 0 m L d e t a m p ã o t r i s - H C L 2 0 m M, p H 7, 6 c o n t e n d o s a c a r o s e 0, 2 5 M, C a C l 2 2 m M e M g C l m M e 2 5 µ g / m L d e D N A s e ( S i g m a t i p o I ). A p ó s e s t e p e r í o d o, a d i c i o n o u - s e 1 0 m L d e t a m p ã o t r i s - H C L 2 0 m M, p H 7, 6 c o n t e n d o s a c a r o s e 0, 2 5 M e á c i d o e t i l e n o d i a m i n o t e t r a - a c é t i c o ( E D T A ) 2 m M. O v o l u m e t o t a l d e 3 0 m l é h o m o g e n e i z a d o e c e n t r i f u g a d o a g p o r 2 0 m i n u t o s a 4 C e m c e n t r í f u g a S o r v a l l. O s e d i m e n t o o b t i d o f o i r e s s u s p e n d i d o e m 2 0 m L t a m p ã o t r i s - H C L 2 0 m M, p H 7, 6 c o n t e n d o s a c a r o s e 0, 2 5 M e 0, 5 m g / m L d e P r o n a s e ( p r o t e a s e t i p o X I V d e S t r e p t o m y c e s g r i s é u s, S i g m a ). E m s e g u i d a, a s o l u ç ã o

41 2 3 f o i c e n t r i f u g a d a e m c e n t r í f u g a S o r v a l l p o r 2 0 m i n u t o s a g 4 C e o s e d i m e n t o f o r m a d o f o i r e s s u s p e n d i d o e m 2 0 m L d e t a m p ã o t r i s - H C L 2 0 m M, p H 7, 6 c o n t e n d o s a c a r o s e 0, 2 5 M e E D T A 2 m M. C o m o o b j e t i v o d e r e t i r a r a s c é l u l a s i n t e i r a s p e r s i s t e n t e s, o h o m o g e n e i z a d o f o i c o l o c a d o s o b c o l c h ã o d e s a c a r o s e 0, 5 M d i l u í d a e m t a m p ã o t r i s - H C L 2 0 m M, p H 7, 6 ( p r o p o r ç ã o d e 2, 5 m L d e h o m o g e n e i z a d o p a r a 2, 5 m L d e t a m p ã o c o n t e n d o s a c a r o s e ). A p ó s c e n t r i f u g a ç ã o a g p o r 1 0 m i n u t o s 4 C e m c e n t r í f u g a r e f r i g e r a d a ( S p i n I V I n c i b r á s ), o s e d i m e n t o c o n t e n d o a s c é l u l a s i n t e i r a s f o i d e s c a r t a d o e p a r t e d o s o b r e n a d a n t e ( a b a n d a f o r m a d a n a p a r t e s u p e r i o r d e c a d a t u b o ) f o i c e n t r i f u g a d a a g p o r 1 0 m i n u t o s 4 C e m c e n t r í f u g a S o r v a l l. O s e d i m e n t o o b t i d o a p ó s e s t a c e n t r i f u g a ç ã o e q u i v a l e à f r a ç ã o d e s i m b i o n t e, a i n d a i m p u r a, u t i l i z a d a n o s e x p e r i m e n t o s. J á o s o b r e n a d a n t e o b t i d o f o i c e n t r i f u g a d o a g p o r 1 0 m i n u t o s 4 C e m c e n t r í f u g a S o r v a l l, d o n d e o b t e v e - s e a f r a ç ã o d e m i t o c ô n d r i a s. A p u r i f i c a ç ã o d a f r a ç ã o d e s i m b i o n t e s e d e u r e s s u s p e n d e n d o o s e d i m e n t o e m 6 m L d e t a m p ã o t r i s - H C L 2 0 m M, p H 7, 6 c o n t e n d o s a c a r o s e 0, 2 5 M e a p l i c a d o e m g r a d i e n t e d e s a c a r o s e : c a d a t u b o c o n t é m 1 m L d e u m a s o l u ç ã o 0, 8 8 M d e s a c a r o s e n a f a s e i n f e r i o r ; 2 m L d e s o l u ç ã o 0, 4 4 M d e s a c a r o s e n a f a s e i n e r m e d i á r i a ; e, n a f a s e s u p e r i o r, 1 m L d o h o m o g e n e i z a d o c e l u l a r. A p ó s c e n t r i f u g a ç ã o a g p o r 3 0 m i n u t o s a 4 C e m c e n t r í f u g a B e c k m a n ( L M u l t r a c e n t r i f u g u e, c o m r o t o r S W ), o b t e v e - s e u m s e d i m e n t o r i c o e m s i m b i o n t e s.

42 M i c r o s c o p i a E l e t r ô n i c a d e T r a n s m i s s ã o C o m o b j e t i v o d e a n a l i s a r u l t r a e s t r u t u r a l m e n t e a s c e p a s n o r m a l e c u r a d a d e C. d e a n e i e a s f r a ç õ e s d e s i m b i o n t e e m i t o c ô n d r i a, b e m c o m o a i n t e g r i d a d e d a s f r a ç õ e s a p ó s 3 h o r a s d e i s o l a m e n t o d o p r o t o z o á r i o h o s p e d e i r o, f o i u t i l i z a d a a m i c r o s c o p i a e l e t r ô n i c a d e t r a n s m i s s ã o c o m o f e r r a m e n t a d e a n á l i s e, s e g u i n d o p r o t o c o l o d e p r o c e s s a m e n t o d e r o t i n a. O s p r o t o z o á r i o s e a s f r a ç õ e s d e s i m b i o n t e e m i t o c ô n d r i a f o r a m f i x a d o s c o m g l u t a r a l d e í d o 2, 5 % d i l u í d o e m t a m p ã o c a c o d i l a t o d e s ó d i o 0, 1 M p H 7, 2. A p ó s c e n t r i f u g a ç ã o e l a v a g e m n e s t e m e s m o t a m p ã o, o m a t e r i a l f o i p ó s - f i x a d o p o r 1 h o r a e m s o l u ç ã o d e f e r r o c i a n e t o d e p o t á s s i o 1, 2 5 % e t e t r ó x i d o d e ó s m i o 1 % d i l u í d o s e m i g u a l p r o p o r ç ã o n o t a m p ã o c a c o d i l a t o d e s ó d i o 0, 1 M p H 7, 2. A p ó s c e n t r i f u g a ç ã o e l a v a g e m n o t a m p ã o c a c o d i l a t o d e s ó d i o 0, 1 M p H 7, 2, o m a t e r i a l f o i d e s i d r a t a d o e m c o n c e n t r a ç õ e s c r e s c e n t e s d e a c e t o n a ( 5 0 %, 7 0 %, 9 0 % e d u a s v e z e s % ). E m s e g u i d a o m a t e r i a l f o i i n f i l t r a d o ( e m u m f r a s c o f e c h a d o, o m a t e r i a l f i c o u m e r g u l h a d o n a s o l u ç ã o e s p e c i f i c a d a ) p o r a p r o x i m a d a m e n t e 1 2 h s e m r e s i n a e p ó x i ( E p o n ) d i l u í d a e m a c e t o n a % 1 : 1. N o d i a s e g u i n t e, o m a t e r i a l f o i i n f i l t r a d o e m r e s i n a E p o n p u r a o n d e p e r m a n e c e u p o r c e r c a d e 6 h o r a s e d e p o i s f o i i n c l u í d o e m r e s i n a E p o n p u r a e m p o ç o s d e p l a c a e s p e c í f i c a p a r a i n c l u s ã o, o n d e o c o r r e u a p o l i m e r i z a ç ã o a 6 0 C e m f o r n o ( B i o m a t i c ) p o r 4 8 h. C o r t e s u l t r a f i n o s f o r a m o b t i d o s a p ó s u l t r a m i c r o t o m i a d o s b l o c o s e m u l t r a m i c r ó t o m o R e i c h e r t u l t r a c u t s ( t i p o

43 2 5 L e i c a ) e c o l e t a d o s c o m g r a d e d e c o b r e d e m e s h. S e g u i u - s e p a r a o c o n t r a s t e d o s c o r t e s d a s g r a d e s e m a c e t a t o d e u r a n i l a 5 % e H 2 O e c i t r a t o d e c h u m b o e o b s e r v a ç ã o e m m i c r o s c ó p i o e l e t r ô n i c o d e t r a n s m i s s ã o ( Z e i s s ) I n c o r p o r a ç ã o d e t r a ç a d o r e s r a d i o a t i v o s A i n c o r p o r a ç ã o f o i m e d i d a s e g u i n d o o p r o t o c o l o d e E I N I C K E R - L A M A S e t a l. ( ). E s t e s e n s a i o s t i v e r a m c o m o o b j e t i v o, f a z e r u m a a n á l i s e c o m p a r a t i v a d a i n c o r p o r a ç ã o d e 1 0 µ C i d e 3 2 P i e n t r e a s c e p a s n o r m a l e c u r a d a, b e m c o m o a n a l i s a r a c a p a c i d a d e d e s í n t e s e d e f o s f o l i p í d e o s p e l a s f r a ç õ e s d e s i m b i o n t e e m i t o c ô n d r i a ; e v e r i f i c a r a v i a d e s í n t e s e d e P C n o s s i m b i o n t e s i s o l a d o s a p a r t i r d a i n c o r p o r a ç ã o d e 2, 5 µ C i [ 3 H ] - c o l i n a p e l a f r a ç ã o e m e s t u d o. A s c e p a s n o r m a l e c u r a d a d e C. d e a n e i, b e m c o m o a s f r a ç õ e s d e s i m b i o n t e e m i t o c ô n d r i a, f o r a m m a n t i d a s e m m e i o W a r r e n e n r i q u e c i d o c o m 1 0 % d e s o r o f e t a l b o v i n o n a c o n c e n t r a ç ã o d e c é l u l a s / m L. N e s t e m e i o f o i a d i c i o n a d o o t r a ç a d o r r a d i o a t i v o ( 3 2 P i o u [ 3 H ] - c o l i n a ) e a i n c u b a ç ã o f o i r e a l i z a d a p o r 1 h o r a e 3 h o r a s e m t e m p e r a t u r a a m b i e n t e E x t r a ç ã o d e l i p í d e o s A s c e p a s n o r m a l e c u r a d a d e C. d e a n e i e a s f r a ç õ e s d e s i m b i o n t e e m i t o c ô n d r i a s f o r a m c e n t r i f u g a d a s p o r 3 m i n u t o s a g e m c e n t r í f u g a C ( E p p e n d o r f ). O s o b r e n a d a n t e f o i d e s c a r t a d o e f o i a d i c i o n a d o 0, 3 m L d e H 2 O a o t u b o. A s o l u ç ã o f o i

44 2 6 h o m o g e n e i z a d a e t r a n s f e r i d a p a r a t u b o d e s e d i m e n t a ç ã o, o n d e t a m b é m a d c i o n o u - s e 2 m L d e s o l u ç ã o c l o r o f ó r m i o : m e t a n o l : á c i d o c l o r í d r i c o 0, 6 N ( : : 0, 7 5, v / v ). À s o l u ç ã o h o m o g e n e i z a d a f o i a d i c i o n a d a 0, 3 m L d e á c i d o c l o r í d r i c o 0, 6 N. A s o l u ç ã o f o i c e n t r i f u g a d a a g p o r 1 0 m i n u t o s ( E x c e l s a B a b y I 2 0 6, F A N E M ) p a r a s e p a r a ç ã o d e f a s e s, e s t a n d o o s f o s f o l i p í d e o s n a f a s e i n f e r i o r. À f a s e i n f e r i o r r e c o l h i d a f o r a m a d i c i o n a d o s 2 m L d e s o l u ç ã o c l o r o f ó r m i o : m e t a n o l : H 2 O ( 3 : 4 8 : 4 7, v / v ), s e g u i n d o - s e p a r a c e n t r i f u g a ç ã o a g p o r 1 0 m i n u t o s ( E x c e l s a B a b y I 2 0 6, F A N E M ) p a r a n o v a s e p a r a ç ã o d e f a s e s. A f a s e s u p e r i o r f o i d e s c a r t a d a e a f a s e i n f e r i o r p e r m a n e c e u n o t u b o o n d e o s f o s f o l i p í d e o s f o r a m s e c o s s o b f l u x o d e N C r o m a t o g r a f i a e m c a m a d a f i n a A c r o m a t o g r a f i a f o i r e a l i z a d a s e g u n d o o p r o t o c o l o u t i l i z a d o p o r E I N I C K E R - L A M A S e t a l. ( ), s e n d o t o d o s o s r e a g e n t e s u t i l i z a d o s d a m a r c a M e r c k e o s p a d r õ e s d a m a r c a S i g m a. I n i c i a l m e n t e, f e z - s e a d e l i m i t a ç ã o d e e s p a ç o s n a p l a c a p a r a a a p l i c a ç ã o d a s a m o s t r a s, g u a r d a n d o - s e 2 c m a p a r t i r d a b a s e d a p l a c a. A p l a c a d e s í l i c a f o i c o l o c a d a n a e s t u f a a C p o r 1 0 m i n u t o s p a r a q u e a á g u a a d s o r v i d a e v a p o r a s s e. O c o n t e ú d o l i p í d i c o d e c a d a a m o s t r a f o i r e s s u s p e n d i d o e m 9 0 µ L d e s o l u ç ã o c l o r o f ó r m i o : m e t a n o l : H 2 O ( 7, 5 : 2, 5 : 0, 2, v / v ). U m v o l u m e t o t a l d e 6 0 µl d e s t a s o l u ç ã o j á h o m o g e n e i z a d a c o m a a m o s t r a, f o i a p l i c a d o n a p l a c a, s e n d o 1 0 µ L d e c a d a v e z. U t i l i z a r a m - s e c o m o p a d r õ e s : P A, C L, P E, P C e P I, q u e f o r a m d i l u í d o s e m c l o r o f ó r m i o : m e t a n o l

45 2 7 ( 2 : 1 ) p a r a a c o n c e n t r a ç ã o 1 0 m g / m L. O v o l u m e a p l i c a d o d o s p a d r õ e s f o i d e 5 µl. O s o l v e n t e u t i l i z a d o p a r a a c o r r i d a f o i c l o r o f ó r m i o : a c e t o n a : m e t a n o l : á c i d o a c é t i c o : H 2 O ( : 4 5 : 3 9 : 3 6 : 2 4, v / v ). A c o r r i d a s e g u i u p o r a p r o x i m a d a m e n t e 8 0 m i n u t o s d e n t r o d a c a p e l a d e e x a u s t ã o. P o s t e r i o r m e n t e, r e t i r o u - s e a p l a c a d a c u b a d e c o r r i d a e o s o l v e n t e f o i e v a p o r a d o p o r c e r c a d e 1 2 h e m c a p e l a d e e x a u s t ã o a t e m p e r a t u r a a m b i e n t e. C o m o i n t u i t o d e v i s u a l i z a r o s f o s f o l i p í d e o s p r e s e n t e s n a p l a c a e s t a f o i c o l o c a d a e m u m a c u b a c o n t e n d o i o d o m e t á l i c o, q u e s u b l i m a e p a s s a r a p i d a m e n t e p a r a o e s t a d o g a s o s o. O s v a p o r e s d e i o d o s e l i g a m n a s d u p l a s l i g a ç õ e s d e l i p í d i o s, p e r m i t i n d o a s s i m a v i s u a l i z a ç ã o d o s l i p í d e o s d a a m o s t r a e d o s p a d r õ e s u t i l i z a d o s. A s s i m, f o i r e a l i z a d a c r o m a t o g r a f i a e m c a m a d a f i n a e m p l a c a d e s í l i c a d a s c e p a s n o r m a l e c u r a d a d e C. d e a n e i e t a m b é m d a s f r a ç õ e s d e s i m b i o n t e e m i t o c ô n d r i a, c o m o d e s c r i t o p r e v i a m e n t e. A p ó s c r o m a t o g r a f i a, e m e x p e r i m e n t o s e m q u e a [ 3 H ] - c o l i n a f o i u t i l i z a d a c o m o t r a ç a d o r r a d i o a t i v o, o s f o s f o l i p í d e o s f o r a m i d e n t i f i c a d o s n a p l a c a d e s í l i c a e a s b a n d a s f o r a m a u t o - r a d i o g r a f a d a s c o m f i l m e d e r a i o - X ( K o d a k T - M a t ) o u o b s e r v a d a u s a n d o P h o p h o r S c r e e n e m e q u i p a m e n t o P h o s p h o r - I m a g e. N o c a s o e m q u e o t r a ç a d o r u t i l i z a d o f o i o 3 2 P i, o s f o s f o l i p í d e o s t a m b é m f o r a m i d e n t i f i c a d o s n a c r o m a t o g r a f i a e a s b a n d a s f o r a m a u t o - r a d i o g r a f a d a s c o m f i l m e d e r a i o - X ( K o d a k T - M a t ). N e s t e c a s o, a q u a n t i f i c a ç ã o d o s f o s f o l i p í d e o s ( i d e n t i f i c a d o s n a p l a c a d e s í l i c a )

46 2 8 f o i r e a l i z a d a r a s p a n d o a b a n d a c o r r e s p o n d e n t e a c a d a f o s f o l i p í d e o e d e t e r m i n a n d o a r a d i o a t i v i d a d e e m c i n t i l a d o r ( T R I - C A R B T R P a c k a r d B i o s c i e n c e ), m e d i d a e m c p m ( c i n t i l a ç õ e s p o r m i n u t o ) P e s q u i s a g e n ô m i c a E m b o r a o g e n o m a d o s i m b i o n t e a i n d a n ã o e s t e j a c o m p l e t a m e n t e s e q ü e n c i a d o, o s c o n t i g s a t é o m o m e n t o d e s c r i t o s f o r a m u t i l i z a d o s p a r a a b u s c a d e g e n e s q u e c o d i f i c a m e n z i m a s e n v o l v i d a s n a s í n t e s e d e P C, c o m o a P m t ( v i a d e G r e e n b e r g ) e a P C S ( v i a d a P C S ). T o d a s a s b u s c a s f o r a m r e a l i z a d a s u t i l i z a n d o o p r o g r a m a B L A S T ( B a s i c L o c a l A l i g n m e n t S e a r c h T o o l ), c o m a M a t r i z b l o s u m 6 2 ( A L T S C H U L e t a l., ). A p e s q u i s a g e n ô m i c a d a e n z i m a P C S f o i i n i c i a d a c r i a n d o - s e u m b a n c o d e d a d o s n o f o r m a t o F A S T A a t r a v é s d o s c o m a n d o s d e b u s c a p c s [ a l l f i e l d s ] b r u c e l l a [ o r g a n i s m ] ( e n z i m a s c o m o n o m e P C S d o g ê n e r o B r u c e l l a ), p c s [ a l l f i e l d s ] r h i z o b i u m ( e n z i m a s c o m o n o m e P C S c r u z a n d o c o m o n o m e r h i z o b i u m ) e p c s [ a l l f i e l d s ] ( t o d a s a s e n z i m a s c o m o n o m e P C S ) d o b a n c o d e d a d o s P R O T E I N d o N C B I ( ). A p r i m e i r a b u s c a g e r o u 4 s e q u ê n c i a s, a s e g u n d a g e r o u 9 e a t e r c e i r a g e r o u 3 5 s e q u ê n c i a s, r e s p e c t i v a m e n t e. O s g ê n e r o s B r u c e l l a e R h i z o b i u m f o r a m u t i l i z a d o s p o r a p r e s e n t a r e m a a t i v i d a d e d e s t a e n z i m a ( C O M E R C I e t a l., ; D E R U D D E R e t a l., ). E n t ã o, t o d a s a s s e q ü ê n c i a s d e c a d a b a n c o d e d a d o s f o r a m c r u z a d a s c o m o b a n c o d e d a d o s d o g e n o m a d o e n d o s s i m b i o n t e ( P R O B S T e t a l., ) c o m o e v a l u e d e e

47 2 9 C o m r e l a ç ã o à P m t, f o r a m c r i a d o s t r ê s b a n c o s d e d a d o s d e s e q ü ê n c i a s d e p r o t e í n a s n o f o r m a t o F A S T A. I n i c i a l m e n t e f o r a m r e a l i z a d a s a s b u s c a s p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e m e t h y l t r a n s f e r a s e ( t o d a s a s e n z i m a s c o m o n o m e p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e m e t h y l t r a n s f e r a s e ) ( s e q ü ê n c i a s ) e p m t [ a l l f i e l d s ] b o r d e t e l l a [ o r g a n i s m ] ( e n z i m a s c o m o n o m e P M T d o g ê n e r o B o r d e t e l l a ) ( 2 s e q ü ê n c i a s ). T a m b é m n e s s e c a s o, t o d a s a s s e q ü ê n c i a s d o s b a n c o s d e d a d o s t a m b é m f o r a m c r u z a d a s c o m o b a n c o d e d a d o s d o g e n o m a d o e n d o s s i m b i o n t e c o m o e v a l u e d e e P a r a l e l a m e n t e, b u s c a n d o a p r e s e n ç a d e u m a f o s f o l i p a s e D, f o i c r i a d o u m b a n c o d e d a d o s d e s t a p r o t e í n a u s a n d o o c o m a n d o d e b u s c a p l d [ a l l f i e l d s ] b o r d e t e l l a [ o r g a n i s m ], o n d e f o r a m e n c o n t r a d a s 3 9 s e q ü ê n c i a s. T o d a s a s s e q ü ê n c i a s o b t i d a s f o r a m c r u z a d a s c o m o b a n c o d e d a d o s d o g e n o m a d o e n d o s s i m b i o n t e c o m o e v a l u e d e e C o n s u m o d e O 2 P a r a o c o n s u m o d e O 2 d a s c e p a s n o r m a l e c u r a d a d e C. d e a n e i f o i m e d i d o e m o x í g r a f o c o m e l e t r o d o C l a r k ( O x y t h e r m, H a n s a t e c h I n s t r u m e n t ) e e m r e s p i r o m e t r i a d e a l t a r e s o l u ç ã o ( O r o b o r o s O x y g r a p h - 2 K, I n s t r u m e n t s, I n n s b r u c k ), c o n f o r m e e s p e c i f i c a ç õ e s d o s f a b r i c a n t e s. F o i u t i l i z a d o o t o t a l d e c é l u l a s / m l, c o n c e n t r a ç ã o c e l u l a r e m q u e o p r o t o z o á r i o a t i n g e a f a s e l o g, q u e f o r a m a c o n d i c i o n a d a s e m m e i o W a r r e n s u p l e m e n t a d o

48 3 0 c o m 1 0 % d e s o r o f e t a l b o v i n o a 2 8 C. E s t e m e i o t a m b é m f o i u t i l i z a d o p a r a n o r m a l i z a r a l e i t u r a d o e q u i p a m e n t o. O f l u x o t o t a l d e c o n s u m o d e o x i g ê n i o e m t e m p o r e a l f o i d a d o p e l a e q u a ç ã o d o p r o g r a m a D a t a L a b : J O 2 = - d C O 2 / d t * ( C O 2 * b 0 + a 0 ) O n d e : J O 2 = F l u x o d e o x i g ê n i o v o l u m e e s p e c í f i c o ( p m o l * s - 1 * m l - 1 ) ; C O 2 = C o n c e n t r a ç ã o d e O 2 e m µm; J 0 v,, O 2 = F l u x o d o c o n s u m o d e o x i g ê n i o p e l o s e n s o r p o l a r o g r á f i c o ( C O 2 * b 0 + a 0 ) ; b 0 = P e n d e n t e d a r e t a ; a 0 = F l u x o d e r e t r o d i f u s ã o d e O 2 d o s i s t e m a a z e r o o x i g ê n i o d i s s o l v i d o ( - 1, 5 p m o l * s - 1 * m l - 1 ). O s v a l o r e s d e a 0 e b 0 f o r a m p r e v i a m e n t e d e t e r m i n a d o s n a c a l i b r a ç ã o d o o x i g ê n i o d i s s o l v i d o n o o x í g r a f o O R O B O R O S O x y g r a p h - 2 K. O c o n s u m o d e O 2 d a s f r a ç õ e s d e m i t o c ô n d r i a e s i m b i o n t e d e C. d e a n e i f o i m e d i d o a p e n a s e m o x í g r a f o c o m e l e t r o d o C l a r k ( o x y t h e r m, H a n s a t e c h I n s t r u m e n t ), c o n f o r m e e s p e c i f i c a ç õ e s d o s f a b r i c a n t e s. A c o n c e n t r a ç ã o d e s i m b i o n t e s e m i t o c ô n d r i a s f o i r e l a t i v a a o b t i d a a p ó s o f r a c i o n a m e n t o, n ã o s e n d o p o s s í v e l q u a n t i f i c a r. A s f r a ç õ e s f o r a m a c o n d i c i o n a d a s e m m e i o W a r r e n s u p l e m e n t a d o c o m 1 0 % d e s o r o f e t a l b o v i n o a 2 8 C.

49 3 1 T a m b é m n e s t e c a s o, o m e i o f o i u t i l i z a d o p a r a n o r m a l i z a r a l e i t u r a d o e q u i p a m e n t o.

50 3 2 4 R e s u l ta d o s 4. 1 S í n t e s e d e f o s f o l i p í d e o s n a s c e p a s n o r m a l e c u r a d a d e C. d e a n e i Q u a n d o a d i c i o n a m o s 3 2 P i a o m e i o d e c u l t u r a, p a r a o c r e s c i m e n t o d a s c e p a s n o r m a l e c u r a d a, o b s e r v a m o s u m a d i f e r e n ç a s i g n i f i c a t i v a n a i n c o r p o r a ç ã o d e s t e t r a ç a d o r e m f o s f o l i p í d e o s ( F I G U R A 7 A - C ). A q u a n t i f i c a ç ã o d o s f o s f o l i p í d e o s, o b s e r v a d a a p ó s 5 h o r a s d e i n c u b a ç ã o n a p r e s e n ç a d o t r a ç a d o r, m o s t r o u q u e a c e p a n o r m a l s i n t e t i z o u c e r c a d e 3 v e z e s m a i s P C ( F I G U R A 7 A ), c e r c a d e 4 v e z e s m a i s P E ( F I G U R A 7 B ) e c e r c a d e 2 v e z e s m a i s P I ( F I G U R A 7 C ) d o q u e a c e p a c u r a d a. E s s a r e l a ç ã o s e m a n t e v e a p ó s 1 0 h o r a s d e c r e s c i m e n t o. E m a m b a s a s c e p a s, a m a i o r p a r t e d o 3 2 P i f o i i n c o r p o r a d o e m P C, o f o s f o l i p í d e o m a j o r i t á r i o, s e g u i d o p o r P E e P I U l t r a e s t r u t u r a d e C. d e a n e i e d a s f r a ç õ e s d e s i m b i o n t e e d e m i t o c ô n d r i a O s p r o t o z o á r i o s e a s f r a ç õ e s d e s i m b i o n t e e d e m i t o c ô n d r i a u t i l i z a d o s n e s t e e s t u d o f o r a m a n a l i s a d o s u l t r a e s t r u t u r a l m e n t e p o r m i c r o s c o p i a e l e t r ô n i c a d e t r a n s m i s s ã o ( F I G U R A 8-9 ). C r i t h i d i a d e a n e i a p r e s e n t a e s t r u t u r a s t í p i c a s d e t r i p a n o s o m a t í d e o s, c o m o n ú c l e o, c i n e t o p l a s t o e g l i c o s s o m o s. É i n t e r e s s a n t e o b s e r v a r a p r o x i m i d a d e d o s i m b i o n t e e m r e l a ç ã o a o

51 3 3 I n c o r p o r a ç ã o d e P i c p m x 1 0 P C A I n c o r p o r a ç ã o d e P i c p m x 1 0 P E B I n c o r p o r a ç ã o d e P i c p m x 1 0 P I C F i g u r a 7 I n c o r p o r a ç ã o d e 3 2 P i e m f o s f o l i p í d e o s p e l a s c e p a s s e l v a g e m e a p o s i m b i ó t i c a d e C. d e a n e i. O s g r á f i c o s m o s t r a m o s r e s u l t a d o s d e 3 e x p e r i m e n t o s i n d e p e n d e n t e s d a i n c u b a ç ã o d e c é l u l a s d e c a d a c e p a ( s e l v a g e m ( + ) e a p o s i m b i ó t i c a ( - ) ) p o r 5 e 1 0 h o r a s c o m 3 2 P i e m m e i o r W a r r e n s u p l e m e n t a d o c o m 1 0 % d e s o r o f e t a l b o v i n o. E m A, i n c o r p o r a ç ã o d e 3 2 P i e m P C. E m B, i n c o r p o r a ç ã o d e 3 2 P i e m P E. E m C, i n c o r p o r a ç ã o d e 3 2 P i e m P I. O b s e r v a r, p e l a e s c a l a d o s g r á f i c o s, q u e P C é o f o s f o l i p í d e o c o m m a i o r i n c o r p o r a ç ã o d e 3 2 P i. A s b a r r a s i n d i c a m a m é d i a d a i n c o r p o r a ç ã o.

52 34 BF F E N M M A BF C M G E N B Figura 8 Ultraestrutura de Crithidia deanei. Miscroscopia eletrônica de transmissão de rotina (ver Material e Métodos) do protozoário hospedeiro. Em A, notar a proximidade do endossimbionte (E) em relação ao núcleo (N) e ao retículo endoplasmático (setas). Em B, notar a a proximidade do endossimbionte (E) em relação aos glicossomos (G) C = cinetoplasto; BF = bolsa flagelar; F = flagelo; M = mitocôndria. Barras de aumento = 1 µm.

53 35 A C B Figura 9 Ultraestrutura das frações de simbionte e mitocôndria. Miscroscopia eletrônica de transmissão de rotina (ver Material e Métodos) das frações de simbionte e mitocôndria após incubação de 3 horas em meio Warren suplementado com 10 % de soro fetal bovino. Em A, as setas indicam a membrana externa do envoltório formado por duas unidades de membrana, revelando a integridade da membrana mesmo após 3 horas de fracionamento. Em B, as setas pretas indicam as cristas mitocondriais; setas vermelhas indicam membrana interna; setas azuis indicam membrana externa. C = cinetoplasto. Barras de aumento = 1 µm.

54 3 6 n ú c l e o, a o r e t í c u l o e n d o p l a s m á t i c o ( F I G U R A 8 A ) e t a m b é m a o s g l i c o s s o m o s ( F I G U R A 8 B ). A f r a ç ã o d a b a c t é r i a s i m b i ó t i c a t a m b é m f o i a n a l i s a d a p o r m i c r o s c o p i a e l e t r ô n i c a d e t r a n s m i s s ã o a p ó s 3 h o r a s d e i s o l a m e n t o. C o n s t a t o u - s e a p r e s e n ç a d a s d u a s u n i d a d e s d e m e m b r a n a q u e c o m p õ e m o e n v o l t ó r i o d o e n d o s s i m b i o n t e. O f a t o d o e n v o l t ó r i o d o e n d o s s i m b i o n t e p e r m a n e c e r í n t e g r o v a l i d o u a r e a l i z a ç ã o d o s e s t u d o s d e i d e n t i f i c a ç ã o d o s f o s f o l i p í d e o s. ( F I G U R A 9 A ) N a a n á l i s e u l t r a e s t r u t u r a l d a f r a ç ã o d e m i t o c ô n d r i a, f o i p o s s í v e l o b s e r v a r q u e, a p e s a r d e f r a g m e n t a d a s p e l o f r a c i o n a m e n t o, a s m i t o c ô n d r i a s a p r e s e n t a m d u a s u n i d a d e s d e m e m b r a n a e a s c r i s t a s m i t o c o n d r i a i s ( F I G U R A 9 B ) Q u a n t i f i c a ç ã o d e f o s f o l i p í d e o s d a s f r a ç õ e s d e e n d o s s i m b i o n t e e d e m i t o c ô n d r i a o b t i d a s d e C. d e a n e i c r e s c i d a e m m e i o c o n t e n d o 3 2 P i N o s e n s a i o s e m q u e o s p r o t o z o á r i o s f o r a m c r e s c i d o s e m m e i o d e c u l t u r a c o n t e n d o 1 0 µ C i d e 3 2 P i e e m s e g u i d a s u b m e t i d o s a o f r a c i o n a m e n t o c e l u l a r, o b s e r v a m o s q u e t a n t o n a f r a ç ã o d e s i m b i o n t e c o m o n a d e m i t o c ô n d r i a o t r a ç a d o r r a d i o a t i v o f o i u t i l i z a d o p r i n c i p a l m e n t e p a r a a f o r m a ç ã o d e P C ( o b s e r v a r a e s c a l a d a i n c o r p o r a ç ã o. F o r a m e n c o n t r a d a s m e n o r e s q u a n t i d a d e s d e f o s f o l i p í d e o s m a r c a d o s c o m 3 2 P i n a f r a ç ã o d e s i m b i o n t e ( F I G U R A 1 0 A ) e m r e l a ç ã o a f r a ç ã o m i t o c o n d r i a l ( F I G U R A 1 0 B ) : 7 v e z e s m a i s P C, 6 v e z e s m a i s P I e 1 0 v e z e s m a i s P E.

55 3 7 A B F i g u r a 1 0 Q u a n t i f i c a ç ã o f o s f o l i p í d i c a d e s i m b i o n t e s e m i t o c ô n d r i a s d e C. d e a n e i. E m A, q u a n t i f i c a ç ã o f o s f o l i p í d i c a d e s i m b i o n t e s i s o l a d o s o b t i d o s d e C. d e a n e i c r e s c i d a e m m e i o c o n t e n d o 3 2 P i. E m B, q u a n t i f i c a ç ã o f o s f o l i p í d i c a d e m i t o c ô n d r i a s i s o l a d a s o b t i d a s d e C. d e a n e i c r e s c i d a e m m e i o c o n t e n d o 3 2 P i. G r á f i c o s r e p r e s e n t a t i v o s d e 3 e x p e r i m e n t o s i n d e p e n d e n t e s. P I = f o s f a t i d i l i n o s i t o l ; P C = f o s f a t i d i l c o l i n a ; P E = f o s f a t i d i l e t a n o l a m i n a.

56 C a p a c i d a d e d e s í n t e s e d e f o s f o l i p í d e o s e m e n d o s s i m b i o n t e s e m i t o c ô n d r i a s i s o l a d o s d e C. d e a n e i e i n c u b a d o s c o m 3 2 P i A s í n t e s e d e f o s f o l i p í d e o s p o r f r a ç õ e s d e s i m b i o n t e e m i t o c ô n d r i a f o i o b s e r v a d a p o r a t é 3 h o r a s d e i n c u b a ç ã o e m m e i o d e c u l t u r a c o n t e n d o 3 2 P i. A f r a ç ã o d e m i t o c ô n d r i a n ã o m o s t r o u a c a p a c i d a d e d e i n c o r p o r a r 3 2 P i o u s i n t e t i z a r f o s f o l i p í d e o s n a p r e s e n ç a d o t r a ç a d o r r a d i o a t i v o, m e s m o a p ó s 3 h o r a s d e i n c u b a ç ã o ( F I G U R A 1 1 ). J á o s s i m b i o n t e s i s o l a d o s, f o r a m c a p a z e s d e i n c o r p o r a r 3 2 P i e s i n t e t i z a r f o s f o l i p í d e o s ( F I G U R A 1 1 ), c o m o o b s e r v a d o a p ó s e x t r a ç ã o e s e p a r a ç ã o p o r c r o m a t o g r a f i a e m c a m a d a f i n a ( T L C ). A c o m p a r a ç ã o e m f u n ç ã o d o t e m p o m o s t r a u m a m o d i f i c a ç ã o n o p e r f i l f o s f o l i p í d i c o d o e n d o s s i m b i o n t e. A p ó s 3 h o r a s, a P C d e i x a d e s e r o f o s f o l i p í d e o m a j o r i t á r i o, d a n d o l u g a r à P E ( F I G U R A 1 2 ). C o n t u d o, a m a i o r t a x a d e i n c o r p o r a ç ã o d o t r a ç a d o r d e s t i n o u - s e à s í n t e s e d e P I : a p ó s 3 h o r a s, o b s e r v o u - s e i n c o r p o r a ç ã o 2 2 v e z e s m a i o r q u a n d o c o m p a r a d o c o m o t e m p o d e 1 h o r a. O c o n t e ú d o d e P C e d e P E t a m b é m a u m e n t o u d e p o i s d e 3 h o r a s : c e r c a d e 6 v e z e s p a r a P C e c e r c a d e 1 3 v e z e s p a r a P E ( F I G U R A 1 2 ).

57 3 9 M S S P E P C P I O 3 h o r a s 1 h o r a 3 h o r a s F i g u r a 1 1 S í n t e s e d e f o s f o l i p í d e o s p e l a s f r a ç õ e s d e s i m b i o n t e e m i t o c ô n d r i a. A p ó s f r a c i o n a m e n t o c e l u l a r, a s f r a ç õ e s d e s i m b i o n t e e m i t o c ô n d r i a d e C. d e a n e i f o r a m i n c u b a d a s c o m 3 2 P i e m m e i o W a r r e n s u p l e m e n t a d o c o m 1 0 % d e s o r o f e t a l b o v i n o p o r 1 e 3 h o r a s. O s r e s u l t a d o s m o s t r a m i n c o r p o r a ç ã o d e 3 2 P i e m P C, P E e P I n a f r a ç ã o d e s i m b i o n t e s ; p o r é m, n e n h u m a i n c o r p o r a ç ã o é o b s e r v a d a n a f r a ç ã o d e m i t o c ô n d r i a s. 3 F i l m e m e r a m e n t e i l u s t r a t i v o d a i n c o r p o r a ç ã o d e 2 P i d e 5 e x p e r i m e n t o s i n d e p e n d e n t e s. M = f r a ç ã o d e m i t o c ô n d r i a s ; S = f a c ã o d e s i m b i o n t e s ; P E = f o s f a t i d i l e t a n o l a m i n a ; P C = f o s f a t i d i l c o l i n a ; P I = f o s f a t i d i l i n o s i t o l ; O = o r i g e m.

58 4 0 fosfolipídeos PE PC PI PI PC PE 1h h cpm x 104 F i g u r a 1 2 Q u a n t i f i c a ç ã o f o s f o l i p í d i c a d a f r a ç ã o d e s i m b i o n t e i s o l a d a. A p ó s f r a c i o n a m e n t o c e l u l a r, a f r a ç ã o d e s i m b i o n t e f o i i n c u b a d a c o m 3 2 P i e m m e i o W a r r e n s u p l e m e n t a d o c o m 1 0 % d e s o r o f e t a l b o v i n o p o r 1 e 3 h o r a s. A p ó s e x t r a ç ã o l i p í d i c a e c r o m a t o g r a f i a e m c a m a d a f i n a, a s b a n d a s c o r r e s p o n d e n t e s a o s f o s f o l i p í d e o s P C, P E e P I f o r a m r a s p a d a s d a p l a c a d e s í l i c a e s e g u i u - s e p a r a a q u a n t i f i c a ç ã o a t r a v é s d a c i n t i l a ç ã o d o t r a ç a d o r r a d i o a t i v o. O b s e r v a r q u e h á i n c o r p o r a ç ã o d o 3 2 P i p a r a o s f o s f o l i p í d e o s, s e n d o q u e a i n c o r p o r a ç ã o a p r e s e n t a p e r f i s d i f e r e n t e s e n t r e 1 e 3 h o r a s : P C q u e e r a o p r i n c i p a l f o s f o l i p í d e o i n c o r p o r a n d o 3 2 P i e m 1 h o r a, p a s s a a s e r o d e m e n o r i n c o r p o r a ç ã o a p ó s 3 h o r a s. P E = f o s f a t i d i l e t a n o l a m i n a ; P C = f o s f a t i d i l c o l i n a ; P I = f o s f a t i d i l i n o s i t o l ; 1 h = 1 h o r a ; 3 h = 3 h o r a s.

59 I n c o r p o r a ç ã o d e [ 3 H ] - c o l i n a p e l o e n d o s s i m b i o n t e i s o l a d o d e C. d e a n e i C o n s i d e r a n d o q u e a v i a d a P C s i n t a s e f o r m a P C a p a r t i r d a i n c o r p o r a ç ã o d e c o l i n a, s i m b i o n t e s i s o l a d o s f o r a m i n c u b a d o s c o m [ 3 H ] - c o l i n a p a r a c h e c a r a p o s s i b i l i d a d e d e i n c o r p o r a ç ã o d o t r a ç a d o r p e l a b a c t é r i a s i m b i ó t i c a. E s t e t r a ç a d o r r a d i o a t i v o f o i a d i c i o n a d o à f r a ç ã o s i m b i ó t i c a c o n c e n t r a d a e m m e i o W a r r e n c o n t e n d o 1 0 % d e s o r o f e t a l b o v i n o e a p ó s 1 e 3 h o r a s a s a m o s t r a s f o r a m s u b m e t i d a s à e x t r a ç ã o l i p í d i c a ( v e r M a t e r i a l e M é t o d o s ). O s r e s u l t a d o s n ã o r e v e l a r a m m a r c a ç ã o r a d i o a t i v a p e l a 3 H - c o l i n a, s u g e r i n d o a n ã o i n c o r p o r a ç ã o d o t r a ç a d o r e m P C ( F I G U R A 1 3 ) B u s c a d e e n z i m a s d a s v i a s d e s í n t e s e d e P C n o g e n o m a d o s i m b i o n t e d e C. d e a n e i F o r a m r e a l i z a d a s b u s c a s n o g e n o m a d o e n d o s s i m b i o n t e p a r a o s g e n e s p m t ( q u e c o d i f i c a a P E m e t i l t r a n s f e r a s e ) e p c s ( q u e c o d i f i c a a P C s i n t a s e ), a m b o s e n v o l v i d o s n a s í n t e s e d e f o s f a t i d i l c o l i n a. S e q ü ê n c i a s d e a m i n o á c i d o s d e s t a s e n z i m a s f o r a m o b t i d a s n o b a n c o d e d a d o s P R O T E I N d o N C B I ( ). A s e n z i m a s P C S p e s q u i s a d a s f o r a m d e b a c t é r i a s d o g ê n e r o B o r d e t e l l a, a n c e s t r a l e v o l u t i v o d o e n d o s s i m b i o n t e, e d o g ê n e r o R h i z o b i u m. J á a s e n z i m a s P M T p e s q u i s a d a s f o r a m e x c l u s i v a m e n t e d e b a c t é r i a s d o g ê n e r o B o r d e t e l l a. A b u s c a f o i f e i t a c r u z a n d o o s d a d o s d o b a n c o d e d a d o s c r i a d o c o m t o d a s a s s e q ü ê n c i a s d e a m i n o á c i d o s d a s e n z i m a s e n c o n t r a d a s n o N C B I ( ). C o m r e l a ç ã o a o e n d o s s i m b i o n t e, o s c o n t i g s s e q ü e n c i a d o s a t é o m o m e n t o n ã o

60 4 2 P I S - 1 h S - 3 h S - 1 h S - 3 h P C P E P I S - 1 h S - 3 h S - 1 h S - 3 h P C P E F i g u r a 1 3 I n c o r p o r a ç ã o d e [ 3 H ] - c o l i n a p e l a f r a ç ã o d e s i m b i o n t e. A p ó s f r a c i o n a m e n t o c e l u l a r, a f r a ç ã o d e s i m b i o n t e f o i i n c u b a d a c o m [ 3 H ] - c o l i n a e m m e i o W a r r e n s u p l e m e n t a d o c o m 1 0 % d e s o r o f e t a l b o v i n o p o r 1 e 3 h o r a s. A p ó s e x t r a ç ã o l i p í d i c a e c r o m a t o g r a f i a e m c a m a d a f i n a, n ã o f o i o b s e r v a d a m a r c a ç ã o r a d i o a t i v a e m P h o s p h o r S c r e e n d a s b a n d a s c o r r e s p o n d e n t e s a o s f o s f o l i p í d e o s P C, P E e P I d a p l a c a d e s í l i c a. À e s q u e r d a, e x t r a ç ã o l i p í d i c a d e f r a ç õ e s d e s i m b i o n t e s n o p e r í o d o d e 1 e 3 h o r a s ( d u a s a m o s t r a s d e c a d a t e m p o ). À d i r e i t a, t e l a s e n s í v e l a o t r í t i o s o b r e p o s t a à p l a c a d e T L C, o n d e a i n c o r p o r a ç ã o d e 3 H - c o l i n a m o s t r a - s e n u l a. I m a g e m r e p r e s e n t a t i v o d e 3 e x p e r i m e n t o s i n d e p e n d e n t e s. P I = p a d r ã o d e f o s f a t i d i l i n o s i t o l ; P E = p a d r ã o d e f o s f a t i d i l e t a n o l a m i n a ; P C = p a d r ã o d e f o s f a t i d i l c o l i n a ; S - 1 h = f r a ç ã o d e s i m b i o n t e d e 1 h o r a d e i n c u b a ç ã o ; S - 3 h = f r a ç ã o d e s i m b i o n t e d e 3 h o r a s d e i n c u b a ç ã o.