Aplicações da Dinâmica Molecular ao. Estudo das Proteínas

Transcrição

1 Aplicações da Dinâmica Molecular ao Estudo das Proteínas

2 Cutinase, uma proteína fúngica A cutinase é um enzima produzido por fungos fitopatogénicos, cuja função é digerir a cutícula de cutina que protege as plantas contra os invasores. Dinâmica de proteínas à escala do picosegundo

3 Cutinase em solução aquosa Tempo: 0-20 ps Dinâmica de proteínas à escala do picosegundo

4 Cutinase em solução aquosa Tempo: 0-20 ps Dinâmica de proteínas à escala do picosegundo

5 A ubiquitina humana A ubiquitina é uma pequena proteína (76 aminoácidos) cuja função consiste em marcar outras proteínas para serem destruídas Dinâmica de proteínas à escala do nanosegundo

6 Mecanismo de ubiquitinação

7 Ubiquitina em solução aquosa Tempo: 0-1 ns (1 ns = 10-9 s) Dinâmica de proteínas à escala do nanosegundo

8 Ubiquitina em solução aquosa Tempo: ns = µs (1 µ s = 10-6 s) ~100 dias de CPU AMD Athlon 1200 Dinâmica de proteínas à escala do microsegundo

9 Daura et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:925 Formação de uma hélice em solução aquosa

10 Dinâmica de uma proteína no meio aquoso

11 Estado desnaturado O problema do folding Estado nativo

12 G unfolding tempo Energia Livre

13 Mecanismos de folding

14 O paradoxo de Levinthal O número de conformações de uma proteína com N aminoácidos de comprimento é superior a 10 N, no entanto a conformação nativa é alcançada num tempo da ordem do segundo. Escala de tempo dos movimentos moleculares: ~10-12 s Para uma proteína com 200 aminoácidos de comprimento: x s = segundos = ~ anos!!!! Mas a maioria das proteínas atinge a forma nativa em tempos da ordem de 10-3 a 10 1 s, e as mais simples podem consegui-lo em apenas ~10-5 s!! A conformação nativa não é encontrada por enumeração completa de estados O folding é um problema NP-completo (10 N ) Levinthal,C.(1968)J.Chim.Phys.,65:44-45

15 Simular o folding A simulação do processo de folding por dinâmica molecular é extremamente difícil porque: A superfície de energia é extraordinariamente complexa, com múltiplos mínimos em múltiplas dimensões. As funções de energia (campos de força) ainda têm diversos problemas que impedem uma descrição absolutamente rigorosa das interacções física envolvidas A necessidade de incorporar o meio aquoso obriga a simular um sistema com um elevado número de átomos A própria descrição do meio aquoso ainda apresenta incorrecções grave Por estas razões apenas foi possível até agora simular o folding de proteínas extremamente pequenas, tais como o fragmento de vilina (36 a.a.) ou caixa de triptofano (20 a.a.)

16 State of the art: 1 µs MD simulation of a small protein Villin headpiece: small 36- residue chain that folds spontaneously in about 1-4 µs Simulation box with 3000 water molecules Simulation took 4 months CPU time on massively parallel computer (Cray T3) A transient state was observed for about 150 ns which resembles the native state A: Initial state B: Partially folded (980 ns) C: Native state D: Native state (red), simulation (blue) E: transient state Duan, Y. & Kolmann, P. (1998) Nature 282:740-4

17 Folding da vilina Zagrovic B, Snow CD, Shirts MR, and Pande VS (2002) J. Mol. Biol. (2002) 323:

18 Folding de uma Trp cage Snow et al. (2002) J. Am. Chem. Soc. 124:1458

19 Folding da vilina por REMD (Replica Exchange Molecular Dynamics Parâmetros: 40 Replicas K K AMBER moléculas H 2 O 100 ns (4 µs accumulated) 3 meses num cluster de 40 CPU s AMD Opteron Simulação não viciada : A conformação inicial é uma conformação extendida. D. Paschek, H. Nymeyer, A.E. García, J. Struct. Biol. 157, (2007)

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21 Docking de ligandos a proteínas

22 Docking Problema 1: encontrar a conformação (ou conformações) de mais baixa energia para associação de duas moléculas Problema 2: calcular diferenças de energia livre entre ligandos de uma mesma proteína (semi-quantitativo) Problema 3: calcular energias livres absolutas de ligação de ligandos a proteínas (desenvolvimento de métodos) Ordem de dificuldade: 1,2,3. Para o problema 1, o mais fácil, conseguem-se bons resultados em muitos casos. Para o problema 3 ainda estamos longe de ter uma solução rigorosa e geral.

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24 Docking e scoring A descoberta das conformações óptimas receptor-ligando envolve dois passos distintos: Busca de conformações (docking): encontrar as soluções que produzem o score mais baixo. Este é um problema de minimização Avaliação das conformações (scoring): ordenar as conformações encontradas por ordem de energia descrecente, calculada pela função de scoring (uma espécie de campo de forças). ligand complex docking scoring receptor X-ray structure & G etc

25 Importância do docking molecular Uma grande parte dos mecanismos bioquímicos envolve a interacção específica de pequenos ligandos a moléculas de proteína (enzimas, receptores, etc.). A grande maioria dos fármacos existentes são inibidores enzimáticos ou interagem com receptores no organismo A indústria farmacêutica necessita de formas de descobrir ligandos específicos sem ter que passar pelo processo, moroso e caro, de síntese de todos os compostos em estudo Processos de interacção proteína-proteína

26 Avaliação da energia de interacção numa grelha A molécula de receptor é considerada rígida, apenas o ligando é flexível Quanto mais fina for a grelha, mais detalhado será o cálculo (e mais lento) Tem que ser calculada uma grelha para cada tipo de átomo do ligando (tipicamente C, N, O, H,...) Pré-calculo energias de interacção com todos os átomos do receptor de cada um dos tipos de átomos do ligando nos nodos de uma grelha Para calcular a energia de uma dada conformação do ligando faz-se simplesmente interpolação dos valores calculadas na grelha. Isto é muito mais rápido do que calcular directamente a energia da cada conformação

27 Ligação da biotina à streptavidina

28 Ligação da cânfora ao citocromo P450cam

29 Ligação do inibidor benzamidina à tripsina

30 Docking de um inbidor na protease do HIV

31 Ciclo de vida do HIV

32 Candidato a inibidor O xk262 foi um de muitos compostos testados para a sua capacidade de inibir a protease do HIV.

33 Docking do xk262 no centro activo da protease do HIV

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36 Antiretrovirais inibidores de protease

37 O desenho de fármacos por computador funciona!

38 Bases de dados e formatos de estrutura

39 O desenvolvimento das técnicas de determinação da estrutura molecular levou à acumulação de um número considerável de estruturas de proteínas Estruturas determinadas por difracção (cristalografia) de raios X ou por ressonância magnética nuclear (RMN) O principal repositório de estruturas de proteínas é o Protein Databank (PDB)

40 Protein Data Bank O Protein Data Bank (PDB) foi fundado em 1971, incluindo à data da sua criação 7 estruturas de proteínas Inicialmente gerido pelo Brookhaven National Laboratory, está actualmente nas mãos de um consórcio americano, o Research Colaboratory for Structural Bioinformatis (RCSB) Em 2006 foi criada uma organização mundial, o wwpdb (worldwide Protein Databank), destinada a gerir e a coordenar a deposição de estruturas de macromoléculas numa rede interanacional de centros de biologia estrutural O PDB é uma base de dados de domínio público e acesso livre

41 Estatísticas do PDB Número total de estruturas em 2/11/2010 : Estatísticas de 2003:

42 Crescimento do PDB

43 Estrutura vs. sequência Estrutura Sequência

44 Portal de acesso do PDB

45 Formatos de representação da estrutura A representação da estrutura molecular em bancos de dados passa pela descrição das coordenadas atómicas, do tipo de átomo, e das ligações químicas presentes. No caso das proteínas, a topologia de ligação dos 20 aminoácidos standard pode ser assumida a priori A topologia de outras moléculas, tais como grupos prostéticos, deverá ser especificada O formato tradicional de representação de estrutura no PDB é o formato PDB.

46 Formato PDB Cabeçalho contendo informações gerais sobre a molécula: nome, método experimental, sequência, referências, etc... Coordenadas dos átomos proteicos (ATOM) Coordenadas de átomos não-proteicos (HETATM) Descrição da conectividade de grupos não-proteicos (CONECT).

47 Ficheiro PDB (cabeçalho)

48 Ficheiro PDB (cabeçalho)

49 Ficheiro PDB (cabeçalho)

50 Ficheiro PDB (atom section)

51 Ficheiro PDB (hetero atom and connect secions)

52 Outros formatos de representação mmcif: macromolecular Crystalography Information File, o formato usado para representação interna de informação no PDB ASN.1: formato criado pelo National Centre for Biotechnology Information (NCBI) para representação de estruturas, sequências, genes, genomas e outros objectos de dados.

53 Exemplo de mmcif

54 Pesquisa e comparação de estruturas

55 Pesquisa de estruturas Como encontrar e obter estruturas, para posterior análise e comparação? Pelo nome, ou código da proteína: usando directamente a interface do PDB Pela sequência de aminoácidos: uso de portais como Entrez ou SRS SRS Entrez -

56 Entrez

57 Sequence Retrieval System (SRS)

58 Comparação de estruturas Diferentes problemas: Comparar duas estruturas para avaliar o seu grau de semelhança Sobrepor duas estruturas para inspecção visual Pesquisar uma estrutura contra uma base de dados de estruturas, para encontrar vizinhos estruturais

59 Medida de semelhança entre duas estruturas Para quantificar o grau de semelhança entre duas estruturas é usual utilizar a chamada Raiz do Desvio Quadrático Médio (RMSD root mean square deviation), dada pela seguinte expressão: ( xi yi) RMSD = N i 2 em que xi e yi são as coordenadas dos átomos das duas proteínas a comparar, e N o número total de átomos usado na comparação. NOTA: nada é dito sobre a forma como os dois conjuntos de átomos são escolhidos, apenas que têm que ter o mesmo número de elementos!

60 Comparação de estruturas x i y i 1 N 1 N Minimização do RMS A comparação de estruturas pressupõe a definição de uma correspondência entre os átomos das moléculas A e B RMSD = N i x y i i N RMSD - root mean square deviation, tem dimensões de comprimento é geralmente é dado em Ångstron 2

61 Relação entre RMSD e identidade de sequência Tripsina humana versus Tripsina bovina Tripsina humana versus Tripsina S.griseus RMSD 0.8 Å RMSD 1.8 Å 40% identidade de sequência 34% identidade de sequência

62 Relação entre RMSD e identidade de sequência Tripsina humana versus Proteinase A S.griseus As duas proteínas têm clara semelhança estrutural, mas não é detectável por comparação de sequências RMSD 5.7 Å 20% identidade de sequência

63 Relação entre RMSD e identidade de sequência Tripsina humana versus Proteinase V8 S.aureus As duas proteínas têm clara semelhança estrutural, mas esta não é detectável por comparação das duas sequências RMSD 2.5 Å 19% identidade de sequência E-value: 8.6x10 2 PDB files: 2RA3, 1WCZ

64 Relação entre RMSD e identidade de sequência Percentagem de identidade ~20% id Comprimento da sequência A relação entre a percentagem de identidade e a similaridade estrutural das proteínas depende do comprimento do alinhamento! A para identidades inferiores a 20% não é possível inferir nada sobre a similaridade estrutural.

65 Alinhamento estrutural O alinhamento estrutural é em geral muito mais difícil que o alinhamento de sequências, pois é necessário estabelecer a correspondência entre os átomos que minimiza o RMS x x 6 y 5 y 6 5 Fácil x 1 Y 1 x 2 Y 2 x 3 x 4 x 2 x 1 + y 3 y 4 x 7 y 1 y 2 y 7 a correspondência é óbvia x 3 Y 3 x 4 Y 4... x 7 Y 7 x 5 x 6 Díficil! x 3 x 4 x 7 x 1 x 2? a correspondência NÃO é óbvia

66 Sobreposição: minimização do RMSD Pesquisa: Encontrar o elemento na base de dados que apresenta o RMSD mínimo quando comparado com o objecto de busca A comparação e sobreposição têm implícito um alinhamento prévio das estruturas!

67 Sites para alinhamento e pesquisa estrutural DALI: (prestes a ser desactivado) SSM: VAST: CE:

68 Modelação da estrutura terciária por homologia

69 Modelação por homologia A previsão da estrutura tri-dimensional de uma proteína a partir da sua sequência é extremamente importante, já que o número de sequências conhecidas (~ ) excede largamente o de estruturas (~20000). Dos vários métodos para previsão de estrutura, a modelação por homologia é o mais bem é aquele que dá melhores resultados Para se poder construir um modelo por homologia fiavel é necessário que a sequência a modelar apresente uma homologia com uma proteína de estrutura conhecida de pelo menos 30-40%! Fundamento da Modelação por homologia: A conservação da sequência está associada à conservação de estrutura!

70 Relação entre sequência e estrutura

71 Alinhamento estrutural das proteases de serina

72 Passos na modelação por homologia Alinhamento estrutural das proteínas de estrutura conhecida homólogas da proteína que se pretende modelar. Inspecção visual do alinhamento e eventuais correções. Alinhamento da sequência da proteína a modelar contra o profile, ou conjunto, das sequências alinhadas no passo anterior Construção do modelo tridimensional da proteína através das restrições impostas pela correspondência entre os resíduos alinhados com o conjunto das estruturas. Optimização das cadeias laterais da proteína por selecção de rotâmeros adequados para cada resíduo e localização. Optimização da estrutura dos loops existentes no modelo. Optimização global da estrutura por minimização e/ou dinâmica molecular Validação do modelo por critérios estereoquímicos e fenomenológicos Se necessário, corrigir os alinhamentos e voltar a produzir modelos até estes serem correctamente validados

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75 Comparação da criptogeína com o modelo da oligandrina

76 Erros na modelação por homologia (1) Empacotamento das cadeias laterais incorrecto. Quando a divergência de sequências se torna elevada verificam-se diferenças no empacotamento do core da proteína. Erros graves se ocorrerem em zonas ligadas à função (centros activos, etc..) Distorções e deslocações em zonas correctamente alinhadas. Podem ser devidas à divergência das sequências ou a artefactos na determinação da estrutura, como o empacotamento das moléculas no cristal. Erros em regiões para as quais não há correspondência nas moléculas de estrutura conhecida - loops. São as regiões mais difíceis de modelar. Para sequências pequenas (<9 aa.), certos métodos podem determinar correctamente a conformação do backbone da proteína. Erros devidos a um alinhamento incorrecto das sequências. São a principal fonte de erros na modelação por homologia, quando a percentagem de identidade é < 30 %. Usar um número grande de sequências para melhorar o alinhamento. Escolha incorrecta da estutura ou estruturas a usar como base para a construção do modelo. Este problema ocorre para identidades muito baixas, < 25%

77 Erros na modelação por homologia (2)

78 3DJigsaw Swiss-MOD Modeller Software e servers

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