Respostas morfológicas em vinca in vitro em função de balanços de fitorreguladores e níveis de sacarose

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1 9 Respostas morfológicas em vinca in vitro em função de balanços de fitorreguladores e níveis de sacarose SOUSA, C.M. 1 ; SILVA, R.L.; 2 MIRANDA, R.M. 3 1 Autor para correspondência. Prof. Substituto do DFITO-IA-UFRuralRJ, Doutorando em Fitotecnia UFRRJ. . sousacm@yahoo.com.br. Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Instituto de Agronomia, Departamento de Fitotecnia, Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais. Br 465 km 07, Seropédica-RJ ; 2 Licencianda em Ciências Agrícolas UFRRJ; 3 Prof. DFITO-IA-UFRRJ. . rmottam@ufrrj.br RESUMO: Avaliou-se o efeito de balanços de fitorreguladores e níveis de sacarose na morfogênese in vitro de explantes de segmentos nodais de Catharanthus roseus (L) DON. Não foi observada interação significativa entre os fatores estudados. Os balanços de fitorreguladores não apresentaram diferenças significativas para a proliferação de brotos e a formação de calo. Os níveis de sacarose influenciaram na proliferação de brotos, formação de calo, massa fresca e seca dos brotos e a massa fresca do tecido caloso. Com o incremento da concentração de sacarose houve tendência de aumentar a formação de tecido caloso, enquanto para a proliferação de brotos ocorreu o inverso, indicando que, possivelmente, a sacarose esta envolvida no processo organogênico. Palavras-chave: Catharanthus roseus, regeneração, açúcar, fitorreguladores. ABSTRACT: Effects of growth regulators balances and levels of sucrose on in vitro morphogenesis of Catharanthus roseus. In this study there was evaluated the effect of the balances of growth regulators and levels of sucrose on in vitro morphogenesis of Catharanthus roseus nodal segment explants was evaluated. The interaction of sucrose levels with growth regulators balances was not significant for the variables evaluated. The balance of growth did not significantly affect proliferation of sprouts and formation of calli. The levels of sucrose influenced the proliferation of sprouts, formation of calli, dry and fresh mass of sprouts and fresh mass of calli. The increase of sucrose concentration tended to increase callus formation, whereas the reverse occurred for the proliferation of sprouts, indicating the possible involvement of, sucrose in organogenesis. Key words: Catharanthus roseus; sugar, growth regulators, regeneration. INTRODUÇÃO A utilização de Catharanthus roseus (L) DON na medicina popular data de algumas décadas (Reis 2001). Sua aplicação farmacológica está associada à produção de alguns metabólitos secundários, identificados como alcalóides Vinca, entre os quais, destacam-se vimblastina e vincristina, utilizados na terapia anti-câncer (Dicosmo & Misawa, 1995). O baixo rendimento destes metabólitos e, conseqüentemente, seus altos preços no mercado, justificam os investimentos em pesquisas referentes a metodologias alternativas para sua produção, uma vez que a planta intacta cultivada in vivo não constitui um sistema eficiente para estudar a produção destas moléculas. Culturas de células, tecidos e órgãos nem sempre são autotróficos, necessitando desta forma, de suplemento de Carbono para atender as demandas energéticas durante o processo de regeneração in vitro. Por outro lado, alguns autores citam que, junto com os hormônios, açúcares são essenciais durante o processo da diferenciação celular (Paiva Neto & Otoni, 2003). Entretanto, além de suprir as demandas energéticas, os açúcares estão envolvidos em todos os processos fisiológicos, sendo que na literatura encontram-se poucos trabalhos neste sentido, a maioria abordando a relação dos açúcares na expressão gênica (Koch, 2004; Coruzzi & Zhou, 2001; Recebido para publicação em 16/03/2006 Aceito para publicação em 02/02/2007

2 10 Farrar et al., 2000; Smeekens, 1998; Koch, 1996). Diante do envolvimento na regulação de genes (Smeekens, 1998; Koch, 1996), os açúcares de forma indireta podem interferir na regeneração de plantas in vitro, uma vez que este evento depende da expressão de determinados genes (Peres, 2002), e no caso das medicinais, podendo influenciar na síntese de moléculas com ação farmacológica. Em cultura de calos de Catharanthus roseus, o incremento de sacarose até 6% causou maior acúmulo de biomassa, aumento da síntese de alcalóides indólicos e ainda influenciou em outras características como na coloração, tamanho e grau de compactação dos calos. Em contraste, acima de 7% de sacarose ocorreu decréscimo no acúmulo de biomassa e na produção de alcalóides (Zhao et al., 2001). Os fitorreguladores são moléculas orgânicas que atuam, em baixas concentrações, no desenvolvimento vegetal (Davies, 1995). O balanço de fitorreguladores, acrescentados ao meio de cultura, junto com os hormônios produzidos pela própria planta, apresenta grande importância na regeneração de tecidos in vitro, sendo um dos principais fatores responsáveis pela divisão, diferenciação e expansão das células (Oliveira et al., 1995). O uso de reguladores de crescimento in vitro, tem como principal objetivo, em suprir as possíveis deficiências dos níveis endógenos de hormônios nos explantes que se encontram isolados das regiões produtoras na planta matriz (Grattapaglia & Machado, 1990). Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito de diferentes combinações de AIB e BAP e níveis de sacarose na morfogênese in vitro em Catharanthus roseus, visando a obtenção de culturas que apresentam potencial de síntese dos alcalóides vinca. MATERIAL E MÉTODO O experimento foi conduzido no Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais do Departamento de Fitotecnia do Instituto de Agronomia da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica-RJ. Utilizou-se o delineamento de blocos ao acaso, do tipo fatorial 4 X 4, em esquema fatorial 4 x 4, sendo, quatro níveis de sacarose (30; 60; 90 e 120 g L -1 ) e quatro balanços de fitorreguladores (15 mg L -1 de AIB x 0,1 mg L -1 de BAP; 15 mg L -1 de AIB x 0,3 mg L -1 de BAP; 30 mg L -1 de AIB x 0,1 mg L -1 de BAP; 30 mg L -1 de AIB x 0,3 mg L -1 de BAP), com três repetições e seis explantes por unidade experimental. Foi utilizado meio de cultura contendo os sais do meio MS (Murashige & Skoog, 1962), vitaminas (2 mg L -1 de glicina; 0,5 mg L -1 de ácido nicotínico; 0,5 mg L -1 de piridoxina e 0,1 mg L -1 de tiamina), 100 mg L -1 de inositol, na consistência sólida com 6 g L -1 de Agar, sendo o ph ajustado a 5,7 antes do processo de autoclavagem e suplementado com os balanços de fitorreguladores e os níveis de sacarose propostos. Os explantes foram preparados a partir de plântulas in vitro, oriundas de sementes, com oito semanas de idade, contendo uma gema axilar e em torno de 0,5 cm de comprimento. Os explantes foram inoculados em frascos de vidro com capacidade de 600 ml, contendo 50 ml dos meios com os tratamentos propostos e vedados com filme PVC, após, foram transferidos para a sala de crescimento com fotoperíodo de 16 horas de luz a 45 µmol m -2 s -1 e temperatura de 25±3ºC, onde foram mantidos até o final do experimento. Avaliou-se a taxa de sobrevivência, freqüência de brotação e de formação de calo com intervalos semanais e, massa fresca e seca dos brotos e calos aos 48 dias após a implantação do experimento. Os dados foram submetidos a ANOVA, sendo que a comparação das médias dos balanços de fitorreguladores foi feita pelo teste Tukey, ao nível de 5% de probabilidade de erro, e para os níveis de sacarose realizou-se análise de regressão polinomial, todos utilizando o programa SAEG (Sistema para Análise Estatísticas). A análise estatística da formação de calo foi realizada com os dados coletados aos 14 dias após a implantação do experimento, uma vez que, a partir deste período todos os explantes formaram calo. RESULTADO E DISCUSSÃO A interação dos níveis de sacarose com os balanços de fitorreguladores não foi significativa para nenhuma das variáveis avaliadas. Somente a massa fresca dos brotos foi influenciada pelos balanços dos fitorreguladores. Os níveis de sacarose influenciaram em todas as variáveis estudadas, com exceção da massa seca dos calos. Para a proliferação de brotos e a formação de tecido caloso ocorreu tendência de resposta inversa com o incremento do nível de sacarose. Enquanto aumentou a freqüência da formação de tecido caloso, reduziu a proliferação de brotos (Figura 1). Cheng et. al. (1992) relataram que o incremento de sacarose no meio de cultura influencia na formação de tecido caloso, uma vez que as concentrações de 2 a 6% de sacarose favoreceram o enraizamento em explante de Eucalyptus sideroxylon, enquanto que nas de 4 e 6% aumentaram a formação de calo. A formação de calo foi mais intensa na base dos explantes, sendo que em alguns casos houve a formação na parte aérea, o mesmo fato sendo reportado no trabalho de Reis (2001). Os explantes que formaram tecido caloso na base apresentaram escurecimento do meio de cultura, provavelmente, por

3 11 % Sacarose (mg. L -1 ) FIGURA 1. Formação de calo e proliferação de brotos (%) em explantes de Catharanthus roseus (L.) Don in vitro, em função de diferentes níveis de sacarose, independentes dos balanços de fitorreguladores. liberarem compostos fenólicos. Segundo Assis & Teixeira (1998), as citocininas, o boro, a sacarose, a presença de luz e a idade fisiológica dos explantes são fatores que influenciam na síntese de substâncias fenólicas, que em contato com o meio de cultura provocam o escurecimento. Conforme Mendoza & Kaeppler (2002), a auxina utilizada apresenta maior influência durante o processo da regeneração de plântulas e da formação de calos. Neste trabalho este fato não foi observado, provavelmente, devido aos balanços utilizados terem sido escolhidos em função dos os melhores resultados para a formação de calos e brotos, que não diferenciaram entre si (Relatório PIBIC - dados não publicados) e, desta forma, o efeito da sacarose ficou mais evidente. Aloni (1980) propôs que a diferenciação do floema ocorre em resposta a auxina, enquanto xilema é formado em resposta a auxina com alguns fatores adicionais, neste caso os açúcares podem estar envolvidos. A variação da concentração de sacarose no meio de cultura, conseqüentemente altera o potencial osmótico no meio. Paiva Neto & Otoni (2003) ressaltam que além do efeito da concentração e da fonte de Carbono, o potencial osmótico do meio, que na maioria das vezes é controlado pela fonte de Carbono, também influencia durante o processo organogênico, desta forma, a tendência de redução na freqüência de proliferação de brotos e aumento na formação de calo também pode estar associada com o potencial osmótico do meio. Outra hipótese para explicar estes eventos fisiológicos seria a inativação de moléculas de fitorreguladores, através da conjugação com açúcares derivados da hidrolise da sacarose, glicose e frutose (Coruzzi & Zhou, 2001), alterando desta forma o balanço das moléculas ativas de auxina e citocinina com o incremento de sacarose e o balanço final, não sendo suficiente para induzir a mesma resposta fisiológica. Em alstroemeria, (planta ornamental) com o incremento da concentração de sacarose ocorreu tendência de redução na taxa de multiplicação (Kristiansen et al., 1999). Já para a formação de embriões somáticos em Euonymus europaeus L. com o incremento de sacarose ocorreu tendência de aumento na freqüência de formação de embriões somáticos (Biahoua & Bonneau, 1999). Os açúcares podem causar alterações na regulação de genes. Devido a sacarose ser rapidamente hidrolizada em glicose e frutose, a sinalização específica pela sacarose tem sido difícil de ser elucidada. Experimentos recentes indicaram evidencias que existe uma sinalização especifica pela sacarose durante a transcrição e translação de mrna em plantas, incluindo a indução de genes, produção de proteínas, expressão e repressão de genes (Coruzzi & Zhou, 2001). Desta forma, como proposto

4 12 por Peres (2002) que a regeneração depende de uma classe de genes homeóticos, cuja variação nas expressões destes genes interfere processo de regeneração, podendo em alguns casos induzir ou inibir a expressão de genes responsáveis pela formação de determinados órgãos. Independente dos balanços de fitorreguladores, as massas fresca e seca dos brotos formados apresentaram os melhores resultados no meio com 30 g L -1 de sacarose, havendo tendência de redução nas massas com o incremento de sacarose (Figura 2). Apesar de concentrações elevadas de sacarose incrementarem a síntese de alcalóides, Zhao et al. (2001) relataram que há tendência de redução no acúmulo de biomassa com o incremento de sacarose no meio. A massa fresca dos brotos foi influenciada pelos balanços de fitorreguladores, independente dos níveis de sacarose (Figura 3). As maiores médias foram encontradas nos balanços com as maiores concentrações relativas. Nos balanços formados com o maior nível de AIB (30 mg L -1 ), observaram as maiores médias, enquanto a menor (Figura 3) foi observada na combinação do menor nível de AIB (15 mg L -1 ) e no maior de BAP (0,3 mg L -1 ). mg Sacarose (g. L -1 ) FIGURA 2. Massa fresca (MFB) e seca (MSB) das brotações formadas em explantes de segmento nodal de Catharanthus roseus (L.) Don in vitro nos diferentes níveis de sacarose, independente dos balanços de fitorreguladores, aos 48 dias após a implantação do experimento. *Médias seguidas de mesma letra não diferenciam entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade de erro. FIGURA 3. Massa fresca (g) das brotações formadas em explantes de segmento nodal de Catharanthus roseus (L.) Don in vitro em função de diferentes balanços entre AIB e BAP, aos 48 dias após a implantação do experimento.

5 13 Em relação ao acúmulo de massa fresca nos calos, ocorreu tendência de redução com o incremento da concentração de sacarose (Figura 4). Associando a freqüência de formação de calos com o acúmulo de massa seca, observou-se tendência inversa (Figuras 1 e 4). Enquanto aumentou a freqüência de formação de calos, reduziu o acúmulo de massa fresca, demonstrando que os tratamentos que proporcionaram maior freqüência da formação de calo, apresentaram calos com menor acúmulo de massa fresca. mg Sacarose (g. L -1 ) FIGURA 4. Massa fresca de calo (MFC) formados em explantes de segmento nodal de Catharanthus roseus (L.) Don in vitro em função dos níveis de sacarose, independente dos balanços de fitorreguladores, aos 48 dias após a implantação do experimento. CONCLUSÃO Os níveis de sacarose influenciaram a proliferação de brotos, formação de calos, massa seca de brotos, massa fresca de calos e brotos, sendo que a massa fresca de brotos também influenciada pelas combinações entre AIB e BAP. De acordo com os resultados observados, a sacarose parece estar envolvida no processo de regeneração em explantes de Catharanthus roseus, sendo necessário realizar outros estudos para melhor compreender o envolvimento da sacarose na morfogênese. REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA ALONI, R. Role of auxin and sucrose in the differentiation of sieve and tracheary elements in plant tissue cultures. Planta, v.150, p , ASSIS, F.T.; TEIXEIRA, L.S. Enraizamento de plantas lenhosas. In: TORRES, A.C.; CALDAS, L.S.; BUSO, J.A. Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. Brasília: Embrapa Hortaliças, v.1, p BIAHOUA, A., BONNEAU L. Control of in vitro somatic embryogenesis of the spindle tree (Euonymus europaeus L.) by the sugar type and the osmotic potential of the culture medium. Plant Cell Reports, v.19, p , CHENG, B.; PETERSON, C.M.; MITCHELL, R.J. The role of sucrose, auxin and explant source on in vitro rooting of seedling explants of Eucalyptus sideroxylon. Plant Science, v.87, n.2, p , CORUZZI, G.M.; ZHOU, L. Carbon and nitrogen sensing and signaling in plants: emerging matrix effects. Current Opinion in Plant Biology, v.4, p , DAVIES, P.J. The plant hormones concept: concentration, sensitivity and transport. In: DAVIES, P.J. (Ed.) Plant hormones: physiology, biochemistry and molecular biology. Dorderecht: Kluwer Academic Publi., p DICOSMO, F.; MISAWA, M. Alternatives for metabolites production. Plant Cell and Tissue Culture: Biotechnology advances, v.13, p , FARRAR, J.; POLLOCK, C.; GALLAGHER, J. Sucrose and the integration of metabolism in vascular plants. Plant Science, v.154, p.1-11, GRATTAPAGLIA, D.; MACHADO, M.A. Micropropagação. In: TORRES, A.C.; CALDAS, L.S. Técnicas e aplicações da cultura de tecidos de plantas. Brasília: ABCTP/ EMBRAPA-CNPH, p KOCH, K. Sucrose metabolism: regulatory mechanisms and pivotal roles in sugar sensing and plant development. Current Opinion in Plant Biology, v.7, p , Disponível em: < Acesso em : 20 set

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