Revista de Biologia e Ciências da Terra ISSN: Universidade Estadual da Paraíba Brasil

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1 Revista de Biologia e Ciências da Terra ISSN: revbiocieter@yahoo.com.br Universidade Estadual da Paraíba Brasil Miranda Furtado, Cristiane; Frota Chagas Carvalho, Julita Maria; Pereira de Castro, Juliana; Silva, Humberto Comparação da freqüência de regeneração in vitro do amendoim (Arachis hipogaea), utilizando diferentes citocininas Revista de Biologia e Ciências da Terra, vol. 7, núm. 1, primer semestre, 2007, pp Universidade Estadual da Paraíba Paraíba, Brasil Disponível em: Como citar este artigo Número completo Mais artigos Home da revista no Redalyc Sistema de Informação Científica Rede de Revistas Científicas da América Latina, Caribe, Espanha e Portugal Projeto acadêmico sem fins lucrativos desenvolvido no âmbito da iniciativa Acesso Aberto

2 REVISTA DE BIOLOGIA E CIÊNCIAS DA TERRA ISSN Volume 7- Número 1-1º Semestre 2007 Comparação da freqüência de regeneração in vitro do amendoim (Arachis hipogaea), utilizando diferentes citocininas Cristiane Miranda Furtado 1 ; Julita Maria Frota Chagas Carvalho 2 ; Juliana Pereira de Castro 1 e Humberto Silva 3 RESUMO A utilização de hormônios vegetais no cultivo de tecido é de fundamental importância. As citocininas são hormônios que se caracterizam por apresentar uma grande capacidade de multiplicidade de brotos. Além de que, o desenvolvimento de protocolo para induzir eficiente proliferação em um genótipo independente, é um procedimento desejável para a transformação de genótipos do amendoim. O presente trabalho objetivou determinar a citocinina mais eficiente na indução do superbrotamento da cultivar de amendoim BR-1, conduzindo-se a regeneração de plântulas em dois tipos de explantes (hipocótilo e gema cotiledonar), determinando a melhor concentração de cada citocinina. O meio utilizado para indução foi de Murashige e Skoog, (1962) suplementado com combinações dos hormônios 6-benzilaminopurina (BAP), Cinetina (CIN) e Tiadiazurom (TDZ), nas concentrações 0,0 (testemunha); 0,5; 2,5; 5,0; 10,0 e 20,0 mg/l de cada uma das citocininas. Foram utilizados dez frascos por tratamento com um explante por frasco, em um delineamento inteiramente casualizado. As avaliações foram realizadas após 60 dias, observando-se o número de brotos por explante. Após 60 dias de cultivo pôde-se constatar no explante gema cotiledonar, a formação de múltiplos brotos para os três hormônios utilizados. As melhores concentrações encontradas para cada citocinina, foram quando utilizados 20,0 mg/l para os três hormônios, apresentando diferenças significativas entre elas, com as maiores médias de número de brotos alcançadas ao se utilizar o TDZ, seguido pelo BAP e CIN. O explante hipocótilo respondeu apenas em formação de calos ao se empregarem as três citocininas, ocorrendo poucas diferenças significativas entre os tratamentos utilizados. Palavras-chave: Amendoim, Micropropagação, Cultura de tecido ABSTRACT Frequency comparison of in vitro regeneration of peanut (Arachis hipogaea),using different cytokinins The usage of vegetable in cropping of tissue is fundamental. Cytokinin are hormones which featured by showing a great capacity of multiplicity of brunches. Despite it protocol development to induce proliferation in independent genotype,is a desirable approach to change peanut genotypes. The work had the aim to determine more efficient cytokinin over brunching of peanut BR-1, conducting regeneration of explants showing a best concentration of each cytokinin. Used method was Murashige and Skoog (1962) supplemented with hormone concentration of 6- benzilaminopurine (BAP), Kinetin (KIN) and Thidiazuron (TDZ), on concentration 0.0 (witness); 0.5; 2.5; 5.0; 10.0 and 20.0 mg/l of each cytokinin in a randomized 51

3 blocks.ten bottles were used by treatment with explant. Evaluation were carried out after 60 days and it can be observed a multiple brunch. Better concentration to each cytokinin when 20.0 mg/l to the three hormones showing differences among them, with bigger averages using BAP and CIN. Hypocotyl explant showed of split formation usig three cytokinin, occurring significative differences amond used treatments. Keywords: Peanut, Micropropagation, Tissue culture 1 INTRODUÇÃO O amendoim cultivado é uma espécie anual, e a duração do seu ciclo do plantio a maturação pode variar de dias a 180 em função do genótipo, sendo que para um mesmo genótipo, há variações em função do ambiente (GODOY et ai., 1999). A micropropagação in vitro oferece condições para obter plantas de difícil propagação e de ciclos de vida longa, em um menor espaço de tempo do que o método convencional. Além de que, uma eficiente regeneração in vitro protocola a compatibilidade com os métodos de transformação genética, que podem ser muito utilizadas no desenvolvimento de amendoins transgênicos. A utilização de hormônios vegetais no cultivo de tecido é de fundamental importância. A adição de fitorreguladores em meios nutritivos tem o objetivo principal de suprir possíveis deficiências dos teores endógenos de hormônios nos explantes que se encontram isolados das regiões produtoras na planta-matriz. Simultaneamente, a adição de fitorreguladores estimula certa resposta como alongamento ou multiplicação da parte aérea (GRATTAPAGLLA e MACHADO, 1998). As citocininas, derivadas da N 6 - adenina, foram descobertas em 1950 e apresentam a função de acelerar o desenvolvimento de embriões nas plantas e promover o desenvolvimento de tecidos e células isoladas in vitro, atuando fortemente na divisão celular. Este fitorregulador atua em processos como quebra da dominância apical, a formação de brotos, senescência da folha, crescimento da raiz, germinação de semente e respostas do estresse (BARCISZEWSKI et al., 2006). Martinelli et ai. (1985), cita que este regulador se caracteriza por apresentar uma grande capacidade de multiplicidade de brotos, ou seja, induz a formação de grande número de brotos e alta taxa de multiplicação em muitos sistemas de micropropagação. Entretanto, como a resposta morfogênica é fortemente influenciada pelo genótipo, é fundamental que seja realizada adaptação dos protocolos em cada cultivar a ser utilizada. O presente trabalho objetivou induzir o superbrotamento da cultivar de amendoim BR- 1, observando a regeneração de plântulas em dois tipos de explantes (hipocótilo e gema cotiledonar), determinando a melhor concentração de diferentes citocininas para o superbrotamento. 2 METODOLOGIA Sementes de amendoim cv. BR-1 desinfestadas em álcool a 70% e posteriormente imersas em soluções de hipoclorito de sódio a 1,8% de cloro ativo, ao qual se adicionou uma gota de Tween 20 para cada 100ml de solução durante 20 minutos. Após os procedimentos de esterilização, foram cultivadas in vitro os eixos embrionários retirados das sementes, em meio MS (MURASHIGE e SKOOG, 1962) suplementado com 30,0 g/l de sacarose e 0,55% de ágar, e o ph ajustado para 5,8 utilizando NaOH ou HCl antes da autoclavagem a 120 C. As culturas permaneceram no escuro por 72 horas até a formação da planta matriz. Posteriormente, em câmara de fluxo laminar e com auxílio de instrumentos cirúrgicos esterilizados, foram separados e excisados das plantas matrizes com 18 dias de cultivo, os explantes hipocótilo, e gema cotiledonar. Em seguida, os explantes foram 52

4 inoculados em meio básico MS suplementados com as seguintes citocinina: 6 benzilaminopurina (BAP), tidiazuron (TDZ) e cinetina (CIN), utilizando-se 0,0 mg/l (controle T 0 ); 0,5 mg/l (T 1 ); 2,5 mg/l (T 2 ); 5,0 mg/l (T 3 ); 10,0 mg/l (T 4 ); 20,0 mg/l (T s ), de uma solução estoque de 1,0 mg/l de cada hormônio, em frasco de cultivo dando ao todo, seis diferentes tratamentos para cada hormônio vegetal utilizado. Todos os meios utilizados neste trabalho foram suplementados com 3% de sacarose e 0,55% de ágar e o ph do meio ajustado para 5,8 antes da autoclavagem, à 120 ºC. Em todos os casos, a incubação foi mantida a 25±2 C com um fotoperíodo de 16h de luz / 8h de escuro e intensidade luminosa de 30 µmol m -2 S -1. O subcultivo foi realizado a cada 15 dias. Foram utilizados dez frascos por tratamento, com um explantes por frasco. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado no arranjo fatorial 3x6x2 (3 tipos de citocininas, 6 tratamentos e 2 tipos de explantes). As avaliações foram realizadas aos 45 dias de cultivo em meio com presença de hormônio, sendo observado qual hormônio respondeu a indução em menor espaço de tempo. Nesta avaliação somente aqueles explantes que formaram mais que dois brotos foram considerados como indução de múltiplos brotos. Na avaliação, foram considerados os seguintes parâmetros: NGE (número de gemas por explante) e PCE (produção de calos por explante). A variável NGE ao se comparar os tratamentos em cada citocinina e para comparação das citocininas dentro de cada tratamento foi submetida à análise da variância e as médias dos tratamentos comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Utilizou-se a transformação y = x + 1 para a estabilização das variâncias dos erros experimentais (GOMES, 1985). Para os fatores qualitativos na comparação das citocininas e explante gema cotiledonar realizou-se o teste de Tukey a 5% de probabilidade. Para os explantes que só produziram calos, avaliou-se a biomassa a partir da pesagem dos mesmos, considerando-se calos pequeno aqueles que apresentaram peso entre 0,20 e 1,20, médio de 1,20 à 2,20 e grande de 2,20 à 6,20. Para a comparação das citocininas na variável PCE foi utilizada a metodologia de dados categorizados por modelos lineares, descrita em Wada (1977). Os dadas foram analisadas pelo procedimento CATMOD do SAS (Statistical Analysis System), versão 8.2 (SAS I STAT ). Consideraram-se de interesse apenas os contrastes com resultados significativos a 1 ou a 5% de probabilidade. 3 RESULTADOS De acordo com os tipos de explantes utilizados, quando cultivados em meio MS suplementado com diferentes concentrações das citocinina TDZ, BAP e CIN, foram obtidas plantas sadias superbrotadas, como no caso das gemas cotiledonares (Figura 1). Este resultado deve-se provavelmente ao fato de que a região da gema cotiledonar ser a parte mais regenerativa do amendoim, devido possivelmente conter meristemas préexistentes (Narasimhulu and Reddy, 1983). Segundo Howell et al., (2003) citocininas promovem o desenvolvimento de brotos e a divisão celular aumentada. Portanto, a adição de citocininas ao meio de cultura quebra o dominância apical e promove um controle de um programa complexo da expressão do gene na cultura do tecido, resultando na formação dos brotos. 53

5 Figura 1: Explante gema cotiledonar da cv. BR-1 de amendoim com formação de vários brotos (superbrotamento); A) Indução do superbrotamento utilizando 20 mg/l de TDZ. B) Indução do superbrotamento utilizando 20 mg/l de BAP. C) Indução do superbrotamento utilizando 20 mg/l de CIN. D) Explante cultivado em meio sem hormônio (controle). Foto: Cristiane Miranda Furtado (2005) Na tabela 1 e no gráfico 1 encontramse os resultados da comparação das três citocininas utilizadas na indução do superbrotamento no explante gema cotiledonar. A Tabela 1 contém a análise da variância para comparação das citocininas, permitindo constatar uma interação significativa ao se utilizarem os tratamentos e citocininas isoladamente e para a interação tratamento x citocininas. Este resultado sugere que uma maior eficiência no superbrotamento é dependente da concentração e citocinina utilizada. Tabela 1. Análise da variância referente aos dados obtidos para a comparação das citocininas BAP, CIN e TDZ na indução do superbrotamento no explante gema cotiledonar F.V GL SQ QM F Tratamento (T) 5 147,048 29,409 87,04** Citocinina (C) 2 74,018 37, ,54** T x C 10 20,106 2,011 5,95** Resíduo ,736 0,337 Total ,908 **Significativo (p<0,01) pelo teste F 54

6 A eficiência das citocininas BAP, CIN e TDZ pode ser observado no figura 2. Neste gráfico é possível visualizar, que ao se comparar as citocininas utilizadas, o TDZ induziu uma maior formação de brotos no explante gema cotiledonar em todos os tratamentos, exceto no controle, apresentando médias superiores do BAP e CIN. Ao se comparar o BAP e a CIN, observa-se que o BAP se apresentou mais eficiente que a CIN, que respondeu em um menor índice de brotos por explante. Estes resultados confirmam o estudo de Akasaka, Daimon and Mii (2000), em estudo de micropropagação do amendoim, onde foram verificados ao utilizar citocininas, que o TDZ estimulou maior multiplicação de brotos, em concentrações bem inferiores as do BAP e em tempo inferior ao tempo requerido ao se utilizar o BAP. Neste mesmo estudo, também se constatou que a CIN apresentou uma baixa freqüência na proliferação de brotos, sendo inferior ao TDZ e ao BAP. Marino e Bertazza (1990), ao induzir uma micropropagação em Actinidia deliciosa utilizando as citocininas BAP, CIN e zeatina obtiveram uma maior proliferação de brotos em ao se utilizar o BAP. Entretanto foi observado que, uma concentração elevada períodos longos da incubação dos explantes na presença do BAP (Dunstan, Turner and Lazaroff, 1985) ou TDZ ocorre uma maior inibição do crescimento dos brotos e um aumento o tamanho das folhas do que com a CIN. 6 5,5 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1, ,5 2, BAP CIN TDZ Figura 2. Representação gráfica dos valores médios da comparação das citocininas em função dos tratamentos Na Tabela 2, encontra-se os resultados referentes a concentração mais adequada de cada citocinina utilizada. A partir destes resultados observados em coluna, a concentração mais adequada para cada citocinina foi a utilizada no tratamento 5, 20 mg/l. Apesar de as concentrações utilizadas das citocininas BAP e TDZ não apresentarem diferenças significativas entre os demais tratamentos, com exceção do controle, considera-se que há tendência do T 5 ser o mais eficiente por produzir uma quantidade de brotos superior aos demais aos 45 dias de cultivo. Para a CIN o tratamento T 5 não diferiu estatisticamente dos tratamentos com contendo as concentrações 5,0 e 10,0 mg/l CIN (T 3 e T 4 respectivamente), porém também se pode considerar que provavelmente este tratamento seja mais eficiente por apresentar um maior número de brotos e conseqüentemente maior valor médio, do que os demais tratamentos. 55

7 Tabela 2. Valores médios da indução de número de brotos por explante (NBE), referente à gema cotiledonar, conduzida em diferentes tratamentos para cada citocinina BAP, CIN ou TDZ. Citocininas Tratamento BAP CIN TDZ T 0 - MS 1,803b 1,722d 1,690b T 1 - MS + 0,5 mg/l 3,978ab 2,670c 4,908a T 2 - MS + 2,5 mg/l 3,580b 2, 993bc 5,117a T 3 - MS + 5,0 mg/l 3,970ab 3,337ab 5,237a T 4 - MS + 10,0 mg/l 3,827ab 3,427a 4,799a T 5 - MS + 20,0 mg/l 4,449a 3,630a 5,489a Médias seguidas peias mesmas não diferem significativamente pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade O explante hipocótilo respondeu apenas em formação de calos (aglomerados de células) (Figura 3), de onde se esperava o surgimento de alguns brotos, porém os tratamentos com as concentrações quaisquer das citocininas utilizadas não induziram formação de brotos. Analisando-se os estudos de Kanyand, Dessai and Prakash (1994), sobre regeneração de amendoim in vitro utilizando o hormônio tidiazuron, e os explantes hipocótilo, cotilédone, internodal, folha com pecíolo e folha sem pecíolo, obtiveram uma alta freqüência de regeneração, com uma formação calos em baixos níveis de TDZ, porém, a formação de brotos nestes explantes foi induzida antes ou durante a formação de calos, o que difere dos resultados obtidos neste trabalho por não induzir formação de brotos. Figura 3. Explante hipocótilo com formação de calos em todos os tratamentos. A) Formação de calo em meio contendo BAP. B) Formação de calo em meio contendo CIN. Foto: Cristiane Miranda Furtado (2005) Na Tabela 3 pode-se observar os resultados referentes à comparação das citocininas na indução de calos. De acordo com esta Tabela, pode-se constatar que todos os tratamentos, incluindo o tratamento sem a presença de hormônios (T 0 ), induziram formação de calos, porém de acordo com os contrastes apresentados, pôde-se observar que só ocorreram diferenças significativas em poucos os tratamentos contendo a presença de 56

8 citocininas, podendo ser observado diferenças significativas ao se contrastar o tratamento contendo 0,5 mg/l (T 1 ) do hormônio BAP e CIN, assim como entre os tratamentos contendo 2,5 mg/l (T 2 ) destes mesmos hormônios. Tabela 3. Comparação das citocininas BAP, TDZ e CIN na indução de calos no explante hipocótilo Contraste X 2 Pr>Chisq T 0 BAP x T 0 TDZ 11,01* 0,0117 T 0 BAP x T 0 CIN 0,32 ns 0,9569 T 0 TDZ x T 0 C1N 11,55** 0,0091 T 1 BAP x T 1 TDZ 3,39 ns 0,3353 T 1 BAP x T 1 CIN 33,13** <,0001 T 1 TDZ x T 1 CIN 6,31 ns 0,0976 T 2 BAP X T 2 TDZ 1,61 ns 0,6576 T 2 BAP x T 2 CIN 9,70* 0,0213 T 2 TDZ x T 2 CIN 5,11 ns 0,1637 T 3 BAP x T 3 TDZ 2,92 ns 0,4042 T 3 BAP x T 3 CIN 2,92 ns 0,4042 T 3 TDZ x T 3 CIN 0,00 ns 1,0000 T 4 BAP x T 4 TDZ 6,98ns 0,0725 T 4 BAP x T 4 CIN 2,49ns 0,4771 T 4 TDZ x T 4 CIN 1,29ns 0,7325 T 5 BAP x T 5 TDZ 1, 63ns 0,6515 T 5 BAP x T 5 CIN 4,49ns 0,2318 T 5 TDZ x T 5 CIN 1,29 ns 0,7325 *Significativo (p<o,5) pelo teste de Qui-quadrado ** Significativo (p<o,01) pelo teste de Qui-quadrado 4 CONCLUSÃO De acordo com os resultados obtidos, pode-se considerar que as diferentes citocininas utilizadas induzem o superbrotamento no explante gema cotiledonar, e para o explante hipocótilo induzem apenas a formação de calos; A citocinina TDZ é mais eficiente para proliferação de brotos para gema cotiledonar, sendo seguida pelo BAP e CIN; O BAP, o TDZ e a CIN induzem a formação de calo no explante hipocótilo, e diferem estatisticamente em poucos os tratamentos. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Akasaka Y., Daimon H., Mii M. Improved plant regeneration from cultured leaf segments in peanut (Arachis hypogaea L.) by limited exposure to thidiazuron. Plant Science, v. 156, 2000, p Barciszewski J., Massino F.. Clar, B. F.C. Kinetin A multiactive molecule. International Journal of Biological Macromolecules: doi: , 2006, 11p. Dunstan D.I., Turner K.E., Lazaroff W.R. Propagation Invitro of the Apple Rootstock M4 - Effect of Phytohormones on Shoot Quality. Plant Cell Tissue and Organ Culture, v.4, 1985, p Godoy, L.J., Moraes, S.A., Zanotto, M.D., Santos, R.C. Melhoramento do Amendoim. IN: BOREM, A Melhoramento de Espécies Cultivadas, Viçosa - Minas Gerais: Ed. UFV, 1999, p Gomes, F. P. Curso de estatística experimental. 11 ed. Piracicaba: Nobel, 1985, 466p. Grattapaglla, D. and Machado, M. A Micropropagação. IN: TORRES, A C., 57

9 CALDAS, L. S.; BUSO, J. A. Cultura de Tecido e Transformação Genética. Brasília: Embrapa-SPII Embrapa-CNPH, v.1, 1998, p Howell S.H., Lall S., Che, P. Cytokinins and shoot development. Trends in Plant Science, v. 8, 2003, p Kanyand M., Dessai A.P., Prakash C.S. Thidiazuron Promotes High-Frequency Regeneration of Peanut (Arachis hypogaea) Plants in-vitro. Plant Cell Reports, v. 14, 1994, p Marino G., Bertazza G. Micropropagation of Actinidia-Deliciosa Cvs Hayward and Tomuri. Scientia Horticulturae, v. 45, 1990, p Martinelli, L.; Scienza, A.; Gianazza, E.; Vila, P. L. Somatic embryogenesis from leaves and petioles of grapevine. Acta Horticulturae, Wageningen, v.289, 1985, p , Murashige T., Skoog F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures. Physiologia Plantarum, v.15, 1962, p.473-&. Narasimhulu S.B. and Reddy G.M. Plantlet Regeneration from Different Callus-Cultures of Arachis-Hypogaea L. Plant Science Letters, v.31, 1983, p Wada, C. Y. Análise de dados categóricos por modelos lineares. São Paulo: IME/USP, 1977, 120 p. [1] Graduada em Ciência Biológicas na Universidade Estadual da Paraíba UEPB; [2] Pesquisador da Embrapa Algodão [3] Professor do Departamento de Biologia da Universidade Estadual da Paraíba - UEPB 58