Desenvolvimento de método biomolecular para detecção e quantificação de arroz em amostras de café através do Sistema TaqMan

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1 Desenvolvimento de método biomolecular para detecção e quantificação de arroz em amostras de café através do Sistema TaqMan Ferreira, T. 1, Oliveira, T. C. 2, Lima, I. S. 3, Morais, A. C. F. 4, Farah, A. 1, Oliveira, E. M. M Programa de Pós-graduação em Nutrição e Núcleo de Pesquisa em Café Prof. Luiz Carlos Trugo (NUPECAFÉ), Instituto de Nutrição, Universidade Federal do Rio de Janeiro CEP: , Rio de Janeiro, RJ, Brasil Telefone: 55(21) thfsctaa@gmail.com 2- Laboratório de Diagnóstico Molecular, Embrapa Agroindústria de Alimentos CEP: , Rio de Janeiro, RJ, Brasil Telefone: 55(21) edna.oliveira@embrapa.br 3- Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio de Janeiro CEP: , Rio de Janeiro, RJ, Brasil Telefone: 55(21) ivanildalima@gmail.com 4- Faculdade de Ciências Biológicas, Centro Universitário Estadual da Zona Oeste CEP: , Rio de Janeiro, RJ, Brasil Telefone: 55(21) anakarolina_rj@hotmail.com RESUMO As metodologias empregadas para detecção de adulterações em alimentos são laboriosas e, algumas vezes subjetivas. A PCR em tempo real (RT-PCR) se apresenta como uma alternativa viável, já que apresenta sensibilidade, especificidade e robustez necessárias para detecção e quantificação de alvos em baixas concentrações. O objetivo desse trabalho foi definir um sistema de detecção de arroz em amostras de café torrado e moído usando RT-PCR. Amostras de arroz foram obtidas no comércio local e o DNA foi extraído através do método CTAB. As soluções de DNA foram submetidas à RT-PCR, utilizando-se primers e sonda do tipo TaqMan, específicos para arroz, para a construção da curva padrão. Também foram conduzidas reações para a verificação da especificidade do sistema proposto. Os LOD e LOQ foram de 4,0x10-2 ng/μl e 1,31x10-1 ng/μl, respectivamente, com eficiência de 83,4% e a especificidade do sistema foi confirmada. ABSTRACT The techniques normally used to detect food adulterations are laborious and, sometimes, subjective. Real Time PCR (RT-PCR) is a practicable option because of its sensitivity, specificity, and robustness needed to detect and quantify targets in low concentrations. The aim of this work was to propose a rice detection system in roast and grinded coffee by RT-PCR. Rice samples were acquired in local shops and DNA extraction was made by CTAB method. The DNA solutions were submitted to RT-PCR, with primers and TaqMan probe, rice specific, for the generation of a standard curve. There were also reactions to verify the specificity of the proposed system. The values of LOD and LOQ were 4,0x10-2 ng/μl and 1,31x10-1 ng/μl, respectively. The specificity of the system was confirmed, and the reaction efficiency was 83,4%. PALAVRAS-CHAVE: café, arroz, PCR em tempo real, adulteração. KEYWORDS: coffee, rice, real time PCR, adulteration.

2 1. INTRODUÇÃO O café é uma bebida muito apreciada e consumida por grande parte da população mundial, sendo a commodity mais importante do ramo alimentício, segundo Yating Shi (2016). Tal fato o faz ser alvo de adulterações através da adição de grãos de menor valor, como, por exemplo, o arroz. Esses grãos, quando submetidos à torra e moagem, e adicionados ao pó de café, resultam em uma mistura homogênea e a adulteração fica imperceptível. De acordo com Oliveira et.al (2015), nos últimos anos, os consumidores têm demonstrado um maior interesse em relação à procedência e qualidade dos produtos que compram, especialmente quando se trata do gênero alimentício. A qualidade está associada à autenticidade dos produtos, o que nos leva a um cenário no qual metodologias de detecção de fraudes/adulterações precisam ser desenvolvidas. Embora alguns estudos estabeleçam parâmetros e marcadores adequados para detecção de adulterantes em cafés, a maioria das metodologias desenvolvidas são com base em métodos cromatográficos, conforme Garcia et al. (2009), Oliveira et al. (2009) e Pauli et al. (2011). Entretanto, por mais que sejam eficazes, são laboriosas, dispendiosas e não tão apropriadas para análise de rotina, segundo Reis et al. (2013). Segundo Oliveira et.al (2013) é evidente a dificuldade de implementação de um método eficiente e sensível para detecções rotineiras de fraudes em laboratórios de pesquisa e mesmo prestação de serviços. São ainda necessários métodos fáceis e rápidos de serem empregados e que possuam confiabilidade de resultados compatíveis com a exigência do mercado consumidor. Ferreira et.al (2016) mostrou que uma alternativa é a técnica da Reação em Cadeia da DNA Polimerase em tempo real (RT-PCR), a qual apresenta sensibilidade, especificidade e robustez necessárias para detecção e quantificação de alvos em baixas concentrações. A RT-PCR, utilizando sondas TaqMan, se baseia na detecção da fluorescência emitida pela mesma, em tempo real, e esse sinal luminoso é transformado em sinal gráfico. Essa capacidade de emissão se deve à utilização da atividade 5' exonuclease da enzima Taq DNA polimerase em sondas marcadas com corantes fluorescentes (TaqMan). As sondas são específicas para o segmento gênico cuja expressão se deseja estudar e são formadas por bases nitrogenadas com uma molécula capaz de emitir fluorescência, reporter, na extremidade 5 e outra capaz de absorver a fluorescência, quencher, na extremidade 3. Na sua posição nativa, toda a luz emitida pelo reporter é absorvida pelo quencher e, assim, a sonda não emite fluorescência antes do início da reação. Com o decorrer do tempo e formação dos produtos, a sonda se hibridiza com o fragmento alvo e se expõe à atividade exonuclease da DNA polimerase. Consequentemente, a sonda é degradada e, como o reporter se afasta do quencher, a fluorescência emitida é detectada pelo sistema. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi desenvolver um sistema de detecção de arroz, através do sistema TaqMan, para posterior aplicação em amostras de café comercial para detecção de adulterações. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1. Amostras As amostras de arroz foram adquiridas no comércio local do Rio de Janeiro Extração e Quantificação de DNA

3 A extração de DNA das amostras de arroz foi realizada através do método CTAB e a avaliação do rendimento, por quantificação em espectrofotômetro Jenway Genova Nano (Bibby Scientific Ltd, UK) PCR em Tempo Real As soluções de DNA resultantes da extração foram utilizadas para a RT-PCR, nas seguintes condições: 300 nm de primers, 200 nm de sonda, 40 ng de DNA para um volume final de 50 µl. As condições de termociclagem de todas as reações realizadas foram as seguintes: 95 C por 10 minutos, 40 ciclos de 95 C por 15 segundos e 60 C por 1 minuto Curva Padrão Uma diluição seriada, com oito pontos, foi preparada para a realização de uma RT- PCR nas mesmas condições mencionadas anteriormente. Com isso, uma curva padrão foi construída e parâmetros de desempenho, como limite de detecção (LOD), limite de quantificação (LOQ), repetibilidade, reprodutibilidade e robustez, foram determinados. A concentração inicial de DNA molde foi de 40 ng/μl. 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Com a técnica de RT-PCR, é possível monitorar o andamento da reação através do Ciclo de Threshhold, ou Ct, que indica o número de ciclos de reação necessários para que a fluorescência emitida pelo produto seja detectada pelo equipamento, e, conforme os ciclos vão se repetindo, a fluorescência tende a aumentar caso a amplificação esteja ocorrendo. Conforme mostra a Figura 1, podemos observar a repetibilidade e consistência dos resultados a partir os valores de Ct encontrados para o alvo investigado utilizando-se o sistema de sonda TaqMan proposto. O valor médio de número de ciclos para a detecção do alvo foi de 23,92 ± 0,06 (n=3). Figura 1 Curva de amplificação obtida com os primers e sonda para o arroz

4 Ct médio A construção de uma curva padrão é de extrema importância uma vez que a mesma correlaciona a intensidade dos sinais de fluorescência, gerados durante os ciclos de amplificação, com as concentrações conhecidas da sequência que se deseja quantificar. A curva padrão gerada a partir das reações com as soluções diluídas em série é mostrada na Figura 2. Figura 2 Curva Padrão para o sistema proposto de sonda TaqMan específica para arroz Curva Padrão de Arroz y = -3,796x + 30,717 R² = 0, ,5-1 -0,5 0 0,5 1 1,5 2 Log das concentrações O LOD através desse método foi 4,0x10-2 ng/μl enquanto que o LOQ foi 1,31x10-1 ng/μl. O LOD foi considerado igual a menor concentração detectável através do método e o LOQ foi calculado a partir da fórmula Ct LOQ = Ct LOD 2 (σ CtLOD ), onde o Ct LOQ e o Ct LOD, são os Cts relacionados aos limites de quantificação e detecção, respectivamente, e σ CtLOD é o desvio padrão referente ao limite de detecção do método. A eficiência da reação foi de 83,4%, calculada segunda a fórmula [10 (-1/slope) -1]x100. Com isso, pode-se dizer que a reação com primers e sonda específicos para arroz mostrou-se satisfatória uma vez que o slope da curva padrão foi de -3,796, valor bem próximo ao de referência que é -3,32, conforme Barros et al. (2008), Cankar et al. (2006) e European Commission (2007). A especificidade da reação para os primers e sonda de arroz foi confirmada através de reação usando soluções de DNA de outras espécies vegetais. O resultado esperado, e que foi confirmado, conforme mostra a Figura 3, é a não amplificação, garantindo assim que os primers e sonda avaliados são específicos para arroz, já que não houve reação na presença de DNA de outros alvos.

5 Figura 3 Curva de amplificação resultante da PCR em tempo real com primers e sonda para arroz na presença de outros DNA alvos 4. CONCLUSÃO Os valores determinados para LOD e LOQ foram 4,0x10-2 ng/μl e 1,31x10-1 ng/μl, respectivamente, e a eficiência da reação foi de 83,4%. Comparando-se os resultados encontrados ao estabelecido em protocolos de validação de análises de detecção/quantificação de sequências específicas de DNA, pode-se dizer que essa ferramenta molecular apresenta grande potencial de aplicação para o controle da qualidade na indústria do café. 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Barros, N. E. F. de Oliveira., E. M. M., Marin, V. A. (2008.) Aplicabilidade da metodologia de reação de polimerase em cadeia em tempo real na determinação do percentual de organismos geneticamente modificados em alimentos. Revista de Nutrição,, 21 (1), Cankar, K., Štebih, D., Dreo, T., Žel, J., Gruden, K. (2006) Critical points of DNA quantification by real-time PCR effects of DNA extraction method and sample matrix on quantification of genetically modified organisms. BMC Biotechnology,, 6 (37), European Commission. Joint Research Centre. Event-specific method for the quantification of soybean line A using Real-time PCR. (2007). Disponível em: the quantification-of-soybean-line-a using-real-time-pcr-pblbna22910/downloads/lb-na en- C/LBNA22910ENC_002.pdf?FileName=LBNA22910ENC_002.pdf&SKU=LBNA22910ENC_PDF& CatalogueNumber=LB-NA EN-C.

6 Ferreira, Thiago., Farah, Adriana.,; Oliveira, Tatiane Corrêa., Lima, Ivanilda Santos., Vitório, Felipe., Oliveira, Edna Maria Morais. (2016). Using Real Time PCR as a tool for monitoring the authenticity of commercial coffees. Food Chemistry. 199; Garcia, L. M. Z., Pauli, E. D., Cristiano, V., Camara, C. A. P., Scarminio, I. S., Nixdorf, S. L. (2009) Chemometric evaluation of adulteration profile in coffee due to corn and husk by determining carbohydrates using HPAEC-PAD. Journal of Chromatographic Science, 47(9), Novais, Caroline Monteiro., Pires-Alves, Melissa. (2004) PCR em Tempo Real: Uma Inovação Tecnológica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento. 33, Oliveira, E. M. M.; Oliveira, T. C. de; Lima, I. S. de; Ferreira, T. (2011) Utilização de ferramentas de bioinformática na construção de primers para detecção de sequências específicas de DNA. Rio de Janeiro: Embrapa Agroindústria de Alimentos. Disponível em: Oliveira, Edna Maria Morais; Santos, Thiago Ferreira; Oliveira, Tatiane Corrêa; Lima, Ivanilda Santos; Ribeiro, Felipe Vitório; Pereira, Adriana Farah de Miranda. (2013). Definição de Marcador Molecular para detecção de milho em café comercial usando PCR em Tempo Real. Embrapa Agroindústria de Alimentos. Disponível em: Oliveira, Edna Maria Morais; Santos, Thiago Ferreira; Souza, Andressa Moreira; Oliveira, Tatiane Corrêa; Lima, Ivanilda Santos. (2015) Métodos de Extração de DNA em Matriz de Café Torrado e Moído. Embrapa Agroindústria de Alimentos. Disponível em: Pauli, E. D., Cristiano, V., Nixdorf, S. L. (2011) Método para determinação de carboidratos empregado na triagem de adulterações em café. Química Nova, 34 (4), Reis, N., Franca, A. S., Oliveira, L. S. (2013) Discrimination between roasted coffee, roasted corn and coffee husks by Diffuse Reflectance Infrared Fourier Transform Spectroscopy. LWT - Food Science and Technology, 50, (2), Shi, Y., Wo, H., Wang, C., Guo, X., Du, J., Du, L. (2016). Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in coffee and tea samples by magnetic solid-phase extraction coupled with HPLC FLD. Food Chemistry. 199,