Av. Pádua Dias, 11. CP 9, CEP Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz ESALQ, Piracicaba SP 2,3

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1 ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE FUNGOS MICORRÍZICOS DE GOMEZA SP. (ORCHIDACEAE) EM UMA FLORESTA DE ARAUCÁRIA DO ESTADO DE SÃO PAULO ISOLATION AND IDENTIFICATION OF MYCORRHIZAL FUNGI FROM THE ROOTS OF GOMEZA SP. (ORCHIDACEAE) AN ORCHID FROM A SÃO PAULO STATE ARAUCARIA FOREST VALADARES, R. B. S. 1 ; PEREIRA, M. C. 2 ; KASUYA, M. C. M 3 ; CARDOSO, E. J. B. N. 4 1,4 Av. Pádua Dias, 11. CP 9, CEP Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz ESALQ, Piracicaba SP 2,3 Universidade Federal de Viçosa, Viçosa-MG rafaelbsvaladares@gmail.com Apoio: Projeto BIOTA/FAPESP CAPES Resumo As sementes de orquídeas não possuem reservas capazes de serem metabolizadas e, portanto, precisam de uma fonte externa de energia para germinar. Na natureza, esta energia é provida pelo fungo micorrízico, que é capaz de colonizar as sementes e fornecer açúcares simples, propiciando a germinação simbiótica das plantas. O objetivo deste trabalho foi isolar e identificar fungos micorrízicos associados a uma espécie do gênero Gomeza sp. Secções de raízes contendo pélotons foram transferidas de forma asséptica para meio BDA. Foram obtidos seis diferentes morfotipos, que foram caracterizados com base nas suas características visuais e morfométricas. Cinco isolados foram agrupados no gênero Ceratorhiza e um isolado no gênero Rhizoctonia, indicando uma tendência desta Orchidacea a se associar a estes grupos de fungos. O seqüenciamento destes isolados será fundamental para a classificação destes fungos em nível de espécie. Abstract Orchid seeds has not an avaliable energy source capable of being metabolized and therefore needs an external source of energy to germinate. In nature, this energy is provided by mycorrhizal fungi, which is able to colonize the seeds and provide simple sugars, promoting the symbiotic germination of plants. The aim of this research was isolate and identify mycorrhizal fungi associated with one specie of Gomeza gender. Roots sections containing pelotons were transferred assepticaly to PDA medium. Six different morphotypes were obtained, which were characterized based on their visual and morphometric characteristics. Five isolates were grouped in Ceratorhiza and one in Rhizoctonia gender, indicating a trend of this Orchidaceae to associate with this fungal clades. The sequencing of these isolates will be crucial for the classification of these fungi in specie level. Introdução A família Orchidaceae é a maior família botânica entre as angiospermas e está distribuída numa grande diversidade de habitats. Dentre estes, a Floresta de Araucária merece atenção especial, pois está ameaçada de extinção. Nesse ambiente são inexistentes os relatos sobre fungos micorrízicos associados a orquídeas. Uma característica marcante das orquídeas é a produção de sementes diminutas, usualmente chamadas dust-seeds. Estas sementes não possuem reservas capazes de serem metabolizadas e, portanto, precisam de uma fonte externa de energia para germinarem. Na natureza, esta energia é provida pelo fungo micorrízico, que é capaz de colonizar as sementes e fornecer açúcares simples, propiciando a germinação simbiótica das plantas. Portanto, as orquídeas, em ambientes naturais, apresentam uma relação simbiótica mutualista, obrigatória em sua fase juvenil, e esta interação pode permanecer por todo seu ciclo de vida.

2 Os fungos, pertencentes principalmente ao grupo dos rizoctonióides, podem exercer diversas funções nos ecossistemas naturais. Além da associação micorrízica com orquídeas, os fungos rizoctonióides podem ter hábito saprófita facultativo, serem parasitas de plantas, ou mesmo, estabelecer interações ectomicorrízicas com plantas superiores. As características morfológicas que distinguem este grupo de fungos são: a ramificação das hifas em ângulos de noventa graus, uma constrição primária próxima ao ponto de ramificação e um septo no ponto de origem da hifa ramificada (Otero, 2001). Freqüentemente, possuem cadeias de células modificadas, infladas em formato ovalar, esférico, ou em forma de barril, denominadas células molinióides (Sneh, Burpee e Ogoshi, 1991, Smith e Read 1997). Em um programa de reintrodução de espécies de orquídeas, deve-se considerar a construção de um banco de sementes e culturas de fungos compatíveis, sendo que ambos, preferencialmente, devem ser originados do mesmo ambiente. Assim, através da germinação e cultivo simbiótico das plantas, é possível aumentar a chance de sucesso nos processos de reintrodução de espécies em seu ambiente natural. O objetivo deste trabalho é isolar e comparar por técnicas morfológicas, fungos micorrízicos rizoctonióides associados a uma espécie do gênero Gomeza, em uma Floresta de Araucária localizada no sul do Estado de São Paulo. Material e Métodos Coleta A coleta foi realizada no município de Barra do Chapéu, próximo a Apiaí-SP. Amostras de raízes de Gomeza sp. foram coletadas, armazenadas em sacos de papel. As amostras foram transportadas para o laboratório e armazenadas em câmara fria (4 C) por sete dias. Isolamento As raízes amostradas foram cuidadosamente lavadas em água corrente e cortadas em segmentos de aproximadamente 8 cm. Os segmentos foram desinfestados superficialmente pela imersão consecutiva em etanol a 70 % por 1 min, solução de água sanitária a 20 % por 6 min e três vezes em água desmineralizada e esterilizada. Os segmentos foram seccionados transversalmente sob lupa estereoscópica Leica MZ12 5, para observação da colonização pelo fungo micorrízico. Secções transversais dos segmentos contendo pélotons tiveram a região do córtex, rasgada e transferida, com auxílio de duas agulhas estéreis, para placa de Petri contendo 15 ml de meio BDA (15 g de ágar, 15 de glicose e 1 L do caldo de 250g de batata cozida em água desmineralizada, ph 5,6) com a adição de 1 mg de estreptomicina. O corante Rosa Bengala também foi adicionado com o objetivo de inibir o rápido crescimento de fungos esporulantes. As placas de Petri foram monitoradas diariamente e as colônias fúngicas foram transferidas para uma nova placa contendo o mesmo meio. Destas placas foram selecionados e cultivados os fungos com características semelhantes aos agrupados como rizoctonióides. Observação das características culturais Os isolados obtidos foram cultivados em placas contendo 15 ml de meio BDA. Após 21 dias foram as seguintes características: cor, aspectos do micélio e da borda da colônia, presença ou ausência de micélio aéreo e o diâmetro da colônia após 72 horas. Lamínulas estéreis foram também enterradas numa inclinação de 45, de modo a permitir o crescimento das hifas e posterior observação em microscópio óptico. As taxas de crescimento em meios CMA (15g de ágar e 1 litro de caldo obtido através do cozimento de 40g de canjiquinha em água desmineralizada) e BDA foram obtidas a partir de marcações traçadas no verso das placas de Petri, em intervalos de 24 horas. Para a indução das células monilióides, os isolados foram cultivados em placas contendo 20 ml de meio CMA. Também foram enterradas lamínulas estéreis com o intuito de facilitar a observação microscópica. As placas foram incubadas à temperatura ambiente por 40 dias e em microscópio invertido Olympus CK2. As lamínulas foram coradas com azul de tripano e em microscópio óptico Olympus BX40. Medição das estruturas vegetativas As imagens de microscopia obtidas foram capturadas com uma câmera digital Leica acoplada ao microscópio, processadas editadas e analisadas com o auxílio dos softwares Leica IM50, Adobe Photoshop CS e Image Tool Também foi fotografada uma escala micrométrica para possibilitar a medição do diâmetro da hifa vegetativa, diâmetro e comprimento das células monilióides.

3 Coloração de núcleos Discos de ágar de 9 mm de diâmetro, contendo os micélios fúngicos de cada isolado, foram transferidos para lâminas microscópicas contendo gotas de 30 µl de meio BDA. Após o crescimento do micélio, as lâminas foram tratadas com SYBR GREEN diluído 1000 vezes em KH 2PO 4 a 10mmol.L- 1, contendo 18 % de glicerol e 1 µg ml -1 de calcofluor (Campos, 2004). As lâminas foram em microscópio óptico com acessório para epifluorescência e as imagens capturadas para análise. Resultados e Discussão Foram obtidos seis diferentes morfotipos a partir do isolamento de cortes contendo pélotons. As características visuais e morfométricas são apresentadas na tabela 1, juntamente com a condição nuclear de cada isolado. Todos os isolados apresentaram hifas com mais de 4 µm de diâmetro, septadas, com ramificações em ângulos de 90 e, geralmente, com constrições e um septo juntos ao ponto de ramificação. Todos os isolados variam em cor, aspecto da colônia e no padrão de zoneamento. Os isolados RupR5A, R5B e R5C apresentam em comum o aspecto aveludado e a cor marrom após 21 dias de incubação. O isolado RupR9A se destaca por apresentar abundância de células monilióides em forma de barril, em cadeias, muitas vezes coalescidas, formando escleródios aéreos, espalhados pela superfície do meio de cultivo. O isolado apresenta a cor laranja e tem uma rápida taxa de crescimento em meios BDA e CMA. O Isolado RupR6D é o único isolado multinucleado, possui cor branca e taxa de crescimento ainda mais rápida que RupR9A. O isolado RupR9A pode ser seguramente classificado no gênero Ceratorhiza, pelas suas características morfológicas, condição nuclear binucleada e pela característica de suas células monilióides. Os isolados Rup R5a, R5b, R5c e R8d também podem ser classificados no mesmo gênero, apesar de possuírem características visuais e de células monilióides distintas de RupR9a. Já o isolado Rupr6d, por ser multinucleado é classificado no gênero Rhizoctonia. O seqüenciamento destes isolados será fundamental para assegurar a identificação a nível de espécie. Ensaios de germinação terão o objetivo de comprovar a capacidade dos fungos em formar associação micorrízica com as orquídeas e comprovar a eficiência destes isolados em suprir a demanda energética, promovendo a germinação simbiótica das sementes. Os isolados foram crescidos em tubos contendo 10mL de meio BDA vertido em ágar inclinado e armazenados a 4 C. Conclusões As orquídeas do gênero Gomeza apresentam uma alta tendência a se associar a uma diversidade de fungos do gênero Ceratorhiza e Rhizoctonia. Diferentes espécies deste gênero podem estar envolvidas em estádios fenológicos distintos da planta. A identificação através de métodos moleculares incluindo o sequenciamento destes fungos, será fundamental para confirmar sua genealogia. Juntamente aos testes de germinação simbiótica, serão ferramentas indispensáveis na continuidade destes estudos.

4 Tabela 1: Características visuais e morfométricas dos isolados da Orchidacea Gomeza sp. * Não foi possível determinar. Isolado Rup r5a Rup r5b Rup r5c Rup r9a Rup r6d Rup r8d Cor 72h Creme com zonas amareladas Salmão Creme Laranja Branca Creme 21d Marron Marron Marron Laranja Branca Creme Aspecto da colônia Aveludado Aveludado Aveludado Grumoso Cotonoso Aveludado Zoneamento Irregular Irregular Circular Circular Ausente Irregular Escleródios <1mm, pretos <1mm, pretos e no fundo das placas <2mm, aéreos e disperos pelo meio de cultura Micélio aéreo Escasso Escasso Escasso Abundante Escasso Escasso Margem Imersa Imersa Imersa Imersa Imersa Imersa Condição nuclear binucleada binucleada binucleada binucleada multinucleada binucleada DC após 72 horas cm 1,5 1,2 2,3 7,5 9,0 1,4 TBDA mm/h 0,005 0,004 0,012 0,048 * 0,006 TCMA 0,008 0,005 0,014 0,049 * 0,006 Diametro de hifa μm Células Monilióides Em forma de barril, formam os escleródios Em forma de barril, formam os escleródios Abundantes, em forma de barril Largura μm Comprimento μm Identificação Ceratorhiza sp Ceratorhiza sp. Ceratorhiza sp Ceratorhiza sp Rhizoctonia sp. Ceratorhiza sp.

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