COMPARAÇÃO DIRETA ENTRE RESINAS CROMATOGRÁFICAS NA PURIFICAÇÃO DO ÁCIDO CLAVULÂNICO

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1 COMPARAÇÃO DIRETA ENTRE RESINAS CROMATOGRÁFICAS NA PURIFICAÇÃO DO ÁCIDO CLAVULÂNICO 1 Patrícia Harumi Yonamine, 2 Clóvis Sacardo da Silva, 3 Marlei Barboza Pasotto 1 Bolsista de Iniciação Científica PIBIC/FAPESP/UFSCar, discente do curso de Engenharia Química 2 Aluno de Pós-Graduação da Universidade Federal de São Carlos, discente do curso de Engenharia Química 3 Professor do Departamento de Engenharia Química da Universidade Federal de São Carlos 1, 2, 3 Departamento de Engenharia Química - UFSCar, Via Washington Luis, Km 235, CEP: São Carlos - SP, Brasil marlei@ufscar.br RESUMO - O uso do processo de adsorção cromatrográfica é uma importante etapa na concentração e purificação do inibidor de enzimas beta-lactamase, o ácido clavulânico (). O desenvolvimento de novas técnicas em cromatragrafia, bem como inúmeras fases estacionárias com diferentes conformações estruturais, tem proporcionado excelentes resultados no que se refere à purificação de produtos biotecnológicos. Este trabalho demonstra os resultados obtidos na avaliação de um conjunto de resinas comerciais dentre as quais são necessárias na etapa de extração e purificação do, analisando quais apresentam melhor rendimento, fator de purificação e fator de concentração. Os resultados obtidos mostram que, dentro do conjunto de resinas de troca-iônicas, algumas resinas aniônicas apresentaram capacidade de concentrar o ácido clavulânico com fatores de concentração acima de 1,8, fatores de purificação entre e 2,35 e rendimentos próximo a 95%. Palavras-Chave: ácido clavulânico, purificação, resinas cromatográficas. INTRODUÇÃO O processo de adsorção é uma técnica bastante usada na purificação e concentração de biomoléculas. O uso da engenharia genética possibilitou o desenvolvimento de inúmeras proteínas recombinantes, exigindo o desenvolvimento de resinas principalmente de troca iônica e estratégias de separação e purificação. No entanto, poucos são os trabalhos apresentados na literatura para a separação e purificação de antibióticos envolvendo este desenvolvimento das resinas de troca iônicas, principalmente em relação aos antibióticos beta- lactâmicos. Os antibióticos β-lactâmicos representam aproximadamente 65% do mercado mundial para antibióticos (Elander, 2003). Sua importância farmacêutica se dá pelo fato de serem inibidores do crescimento de bactérias, combatendo assim muitas infecções em seres humanos e animais. Porém, vários microrganismos patogênicos apresentam resistência aos antibióticos betalactâmicos devido à ação de beta-lactamases produzidas por estes microrganismos. O ácido clavulânico (), apesar de possuir uma fraca atividade bacteriana é um potente inibidor da enzima beta-lactmase, o uso conjugado com penicilinas e cefalosporina dão-lhes a proteção contra betalactamases, enzimas produzidas pelas bactérias resistentes a antibióticos beta-lactâmicos (Mayer et al., 1997). O não apresenta nenhum grupo fortemente hidrofóbico e é quimicamente instável, principalmente em altas temperaturas e phs maiores que 7,0 e menores que 5,0 (Bersanetti et al., 2005). Estas características fazem com que seu processo de produção e separação tenha baixos rendimentos. Este fator depreciativo é carregado durante todas as etapas de purificação. Com isso, torna-se essencial o estudo de processos que diminuam a hidrólise do e o número de etapas necessárias na purificação. O processo de purificação do proveniente da fermentação envolve uma série de etapas, dentre as quais se destaca, inicialmente, a filtração do fermentado para separação dos sólidos e células presentes, seguido do isolamento do produto, o qual pode ser por extração líquido-líquido ou por técnicas de separação cromatográfica, tal como a que utiliza os princípios de troca iônica (Mayer et al., 1996). O processo de adsorção cromatográfica em coluna de leito fixo é o mais conhecido e empregado na indústria nos processos de separação e purificação de compostos biotecnológicos. Neste tipo de sistema, conseguese um nível de separação e remoção equivalente a muitos estágios do processo em tanque agitado. Geralmente, os processos de separação por adsorção cromatográfica ocorrem através de um sistema cíclico, no qual o adsorvente é VIII Congresso Brasileiro de Engenharia Química em Iniciação Científica 27 a 30 de julho de 2009 Uberlândia, Minas Gerais, Brasil

2 alternadamente posto em contato com a corrente de carga (etapa de adsorção), durante a qual os componentes desejados são seletivamente adsorvidos. Posteriormente, segue-se a etapa de regeneração do adsorvente, durante a qual os componentes anteriormente retidos são dessorvidos (etapa de dessorção) (Ward, 1991). Portanto, o DEQ-UFSCar vem trabalhando em pesquisas na área de Bioquímica com a meta de desenvolver técnicas eficientes na produção e separação do. Assim, contribuindo para o desenvolvimento do projeto global de pesquisa Purificação de antibióticos beta-lactâmicos de caldos de bioprocessos, este trabalho objetivou o estudo da purificação do via troca iônica em coluna de leito fixo, realizando experimentos em diversas resinas cromatográficas com o intuito de se determinar estratégias que promovam melhor rendimento para o processo. Materiais MATERIAIS E MÉTODOS Ácido clavulânico: Todos os ensaios foram realizados com caldos produzidos por fermentação com Streptomyces clavuligerus ATCC 27064, cujos meios de cultura são essencialmente constituídos de glicerol, isolado protéico de soja, SUPRO 783, suplementação de ornitina, solução de sais, (NH4)2SO4 e KH2PO4 (Teodoro, et al., 2005). Resinas cromatográficas: Amberlite IRA- 400, Amberlite IRA-402, Amberlite IRA-410, ANX FF, DEAE FF, Q FF, Q XL, Streamline DEAE (todas aniônicas), CM FF, SP FF, SP XL (catiônicas), Amberlite XAD-2, Amberlite XAD-4, Amberlite XAD-1180 e Diaion HP-20 (não iônicas). Métodos Analíticos Determinação da concentração do : A concentração de ácido clavulânico foi determinada por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) segundo o método descrito por Foulstone & Reading (1982) com reação com imidazol, em um cromatógrafo com detector de fotodiodo (Waters 996 com PDA) utilizando uma coluna de fase reversa (C-18, µ-bondapak, de 3,9x300 mm). Análise da concentração de contaminantes: A concentração de contaminantes foi determinada por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) a 280nm em um cromatógrafo com detector de fotodiodo (Waters 996 com PDA) utilizando uma coluna de fase reversa (C-18, µ-bondapak. De 3,9x300 mm), descontando-se a influência da concentração de ácido clavulânico nesse comprimento de onda. Pré-tratamento do caldo fermentado: O caldo cultivado contendo micélios foi filtrado por de membranas de microfiltração de µm (modelo CFP-2-E-8A). Na seqüência o filtrado proveniente da microfiltração foi ultrafiltrado por uma membrana de ultrafiltração de 3kDa (modelo UFP-3-E-3MA), ambas as membranas fornecidas pela Amersham Biosciences. O filtrado resultante foi armazenado a ph 6,2 em ultra-freezer a -70ºC. Ressalta-se que as condições de micro e ultrafiltração foi aquelas previamente estabelecidas em estudos realizados por Silva et al., (2007). PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL A extração do foi realizada em pequenas colunas de leito fixo contendo 1 ml de volume de resina. As condições de trabalho para cada resina foram de acordo com o recomendado pelo fabricante. Em relação às alíquotas coletadas, após passarem pela coluna, foram determinadas as concentrações de. O aparato experimental está representado no esquema simplificado da Figura 1. Figura 1 Esquema do aparato experimental Após a saturação da coluna, esta foi lavada com água e a eluição foi realizada com um gradiente recomendado pelo fabricante. Foram coletadas alíquotas do efluente da coluna, sendo as concentrações de ácido clavulânico e os contaminantes determinados conforme descrito anteriormente. ANÁLISE DOS RESULTADOS Em cada experimento com a respectiva resina cromatográfica, foram calculados os fatores de concentração (F C ) e purificação (F P ), para posterior análise. São calculados conforme as equações 1 e 2, respectivamente. Cfração F C = (1) C amostra onde C fração é concentração do componente na fração, C amostra é concentração do componente na amostra inicial.

3 CfraçãoCCo F P = (2) C C amostra Cofração onde C C0 é concentração de contaminantes na amostra inicial e C C0fração é concentração de contaminantes na fração coletada. O rendimento será determinado de acordo com a Equação 3. CfraçãoVfração R = 100 (3) CamostraVamostra onde V fração é volume da fração coletada e V amostra é volume da amostra inicial contendo. A degradação do (D ) pela resina foi determinada pela Equação 4. D = 1 (4) R RESULTADOS E DISCUSSÃO Resultados das resinas de troca aniônica Os resultados das resinas de troca aniônica da série Amberlite IRA-400, IRA-402 e IRA-410 de base forte podem ser observados nas figuras 2 a 4. O comportamento da concentração do e dos contaminantes nas frações coletadas foram próximos para as resinas IRA-400 e 402. Quando a coluna está sendo alimentada e as frações coletadas apresentam concentração relativa do produto acima de 5, este ponto é designado de ponto de ruptura. Em um processo industrial, quando a concentração atinge o ponto de ruptura a alimentação é interrompida. Considerando o ponto de ruptura para as resinas IRA-400 e IRA- 402, estes ocorreram próximos a 6 min e 7 min, respectivamente (Figura 2 e 3). Nota-se que, para resina IRA-410, não foi observado o ponto de ruptura do leito, este fato deve ao volume de amostra ser insuficiente para que se ocorra o ponto de ruptura (Figura 4). Em relação aos contaminantes, a série Amberlite apresentou comportamento semelhante em relação ao fator de concentração nas frações coletadas durante a fase de eluição. Nas figuras 5 e 6 estão representados os resultados das resinas de base fraca Dietilaminoetil (DEAE). Observa-se que para ambas as resinas StreamLine DEAE e DEAE-FF, o volume de amostra aplicado não foi suficiente para que houvesse o ponto de ruptura do leito. Os contaminantes apresentaram comportamento semelhante durante a etapa de adsorção e dessorção para ambas as resinas. Os resultados das resinas de base fortes Q-XL e Q-FF pode ser observado nas Figuras 7 e 8, respectivamente. Nota-se que a resina Q-FF apresentou dessorção do na etapa de lavagem (água) para a retirada do excesso da amostra nos interstícios do leito (Figura 8). Na Figura 9, pode se observar o comportamento da resina mista (troca iônica e interação hidrofóbica) ANX FF. Neste caso, a lavagem com água deionizada foi suficiente para que houvesse a dessorção do da resina Figura 2 Curva da evolução da adsorção de e contaminantes na resina IRA Figura 3 Curva da evolução da adsorção de e contaminantes na resina IRA-402

4 2, Figura 4 Curva da evolução da adsorção de e contaminantes na resina IRA-410 Figura 7 Curva da evolução da adsorção de e contaminantes na resina Q-XL 6 5 Streamline Deae 2,5 4 1, , Figura 5 - Curva da evolução da adsorção de e contaminantes na resina Streamline DEAE Figura 8 Curva da evolução da adsorção de e contaminantes na resina Q-FF 1, Figura 6 Curva da evolução da adsorção de e contaminantes na resina DEAE-FF Figura 9 Curva da evolução da adsorção de e contaminantes na resina ANX-FF

5 Resultados das resinas de troca catiônica Os resultados das resinas de troca catiônicas podem ser observados nas figuras 10 a 12. Sendo as resinas do tipo trocadoras de cátions e o em solução um ânion ( - ), observa que o não foi adsorvido pelas resinas catiônicas (Figura 10 a 12). O fato de que as frações coletadas durante a eluição apresentar concentração relativa próxima a podem estar relacionadas à baixa velocidade de difusão do nos poros das resinas, fato este observado em resinas porosas. Os contaminantes não apresentaram concentração relativa na etapa de eluição, como se observa nas figuras 10 a 12, indicando que os principais contaminantes no caldo de pré-tratado por membrana de ultrafiltração de 3 kda apresentam características aniônicas. 1, Figura 10 Curva da evolução da adsorção de e contaminantes CM-FF Figura 12 Curva da evolução da adsorção de e contaminantes na resina SP-XL Resultados das resinas não-iônicas Geralmente, as propriedades de separação das resinas não-iônicas (resinas hidrofóbicas) provem da sua estrutura macro reticular (contendo uma fase contínua de polímero e uma fase contínua porosa), da sua grande área superficial e de sua natureza aromática. Esse tipo de resina absorve e libera espécies iônicas através de interações polares e hidrofóbicas. Os resultados da adsorção do nas resinas hidrofóbicas podem se observados nas Figuras 13 a 16. Todas as resinas apresentaram baixa adsorção do. No entanto, a resina XAD- 4, foi capaz de separar o de uma parte dos contaminantes como mostra a Figura 14. Deve se ressaltar que estas resinas são utilizadas em vários processos de purificação de antibióticos beta lactâmicos como pré-tratamento do caldo para eliminação de coloração e contaminantes Figura 11 Curva da evolução da adsorção de e contaminantes SP-FF Figura 13 Curva da evolução da adsorção de e contaminantes na resina XAD-2

6 Figura 14 - Curva da evolução da adsorção de e contaminantes na resina XAD Figura 15 Curva da evolução da adsorção de e contaminantes na resina XAD ,5 1,5 0,5 Análise do fator concentração e purificação das resinas O conjunto de resultados apresentado nas figuras 2 a 16 pode ser melhor analisado comparando-se os fatores de concentração (F C ) e de purificação (F P ) para cada ensaio. O fator de concentração e purificação foi calculado referente à fração coletada de maior concentração de. Esses parâmetros podem ser observados na Tabela 1. As resinas não-iônicas e catiônicas apresentaram fatores de purificação menores que 1, sendo que a resina XAD-1180 e HP-20 apresentaram degradação superior a 20%. Por outro lado, os resultados demonstram que o conjunto de resinas aniônicas apresenta capacidade de concentrar o e fatores de purificação entre 1,1 e 2,3, com rendimentos acima de 90%. No entanto, as resinas aniônicas da série Amberlite apresentaram as maiores taxas de degradação pelos sítios ativos da resina, fato este observado por Barboza et al. (2002). Tabela 1 Fatores de concentração e purificação do conjunto avaliado de resina para purificação do F P F C R RESINA (-) (-) (%) IRA ,56 77 IRA-402 1,19 1,18 56 IRA-410 1,71 0,58 72 Aniônica S. DEAE 1,53 2,60 82 DEAE FF 1,12 0,55 78 Q-XL 2, Q-FF 2,20 1,82 95 ANX FF 2, SP XL 8 0,54 90 Catiônica SP FF 0, CM FF 0,95 0,95 92 XAD-2 0,93 1,37 92 Nãoiônica XAD XAD HP Figura 16 Curva da evolução da adsorção de e contaminantes HP-20 CONCLUSÃO Pelos resultados obtidos, o processo de recuperação do utilizando coluna de leito fixo é um processo viável quando utilizado resinas aniônicas, ocorrendo separação do antibiótico de muitos contaminantes, como mostrado pelos fatores de purificação obtidos. As resinas catiônicas e hidrofóbicas não conseguem concentrar e purificar o. Entretanto, podem ser utilizadas em conjunto com

7 as aniônicas, como que em um pré-tratamento para retirada prévia de contaminantes. No geral, as resinas que obtiveram os melhores resultados foram as aniônicas QX-L, Streamline DEAE e Q-FF, apresentando valores altos de purificação próximos a 2,3 e de concentração entre 1,8 e 2,6. AGRADECIMENTOS Agradecimentos a FAPESP pela bolsa de Iniciação Científica e pelo auxílio financeiro e a CNPq pela bolsa de doutorado. NOMENCLATURA C o : concentração de na amostra inicial (mg/l) : concentração de contaminantes (mg/l) R : rendimento (%) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BARBOZA et al., (2003). Influence of temperature on the kinetics of adsorption and desorption of clavulanic acid by ionic exchange. Biochemical Engineering Journal, v.14, p BERSANETTI et al., (2005). O. Kinetic studies on clavulanic acid degradation. Biochemical Engineering Journal, v.23, p BROWN et al., (1976). Naturally Ocurring Lactam Inhibitors with Antibacterial Activity. The Journal of Antibiotics, v. 29, n. 6, p ELANDER, R. P., (2003). Industrial production of β-lactam antibiotics. Applied Biochemistry and Biotechnology, v.61, p FOULSTONE, M. e READING, C., (1982). Assay of Amoxicilin and Clavulanic Acid, the Components of Augmentin, in Biological Fluids with High-Performance Liquid Chromatography. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, p MAYER et al., (1996). Purification of Clavulanic Acid by Ion-Pairing Systems. Bioseparation, v.6, p MAYER et al., (1997). Diffusivities of clavulanic acid in porous sorption systems with ionpairing. Chemical Engineering Science. v.52, p SILVA et al., (2007). Studies on Fouling Index in Tangential Filtration Applied for Separation of Clavulanic Acid from Fermentation Broths. Book of Abstracts II International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology (BioMicroWorld), p.721, Seville (Spain). TEODORO et al., (2005). Influence of feeding conditions on clavulanic acid production in fed-batch cultivation with medium containg glycerol, Applied Microbiology Biotechnology. v.72, p WARD, O. P., (1991). Biochemical Separations. Bioprocessing. Van Nostrand Reinhold, New York, cap.4, p