CENTRO UNIVERSITÁRIO FUNDAÇÃO SANTO ANDRÉ GINA PLOEGER MANSUELI DANIELLE FÉLIX DOS SANTOS

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1 0 CENTRO UNIVERSITÁRIO FUNDAÇÃO SANTO ANDRÉ GINA PLOEGER MANSUELI DANIELLE FÉLIX DOS SANTOS RELATÓRIO FINAL DO PROJETO PADRONIZAÇÃO E SISTEMATIZAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA DE PROTOZOÁRIOS SANTO ANDRÉ 2007

2 1 GINA PLOEGER MANSUELI (BOLSISTA) DANIELLE FÉLIX DOS SANTOS (COLABORADORA) RELATÓRIO FINAL DO PROJETO PADRONIZAÇÃO E SISTEMATIZAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA DE PROTOZOÁRIOS Relatório final apresentado ao Programa de Incentivo à Iniciação Científica do Centro Universitário Fundação Santo André Orientador: Prof. Dr. José Luis Laporta Colaboradores: Marcelo dos Santos Márcia Teixeira Garcia SANTO ANDRÉ 2007

3 2 RESUMO O Projeto de Iniciação Científica teve como objetivo geral a padronização e sistematização de meios de cultura de protozoários, preparados a partir de amostras coletadas no lago das iguanas, localizado no biotério do Centro Universitário Fundação Santo André. A coleta das amostras foi realizada durante 40 dias, no horário das 9:00 e das 12:00 horas, assim como a medição da temperatura e do valor de ph. A análise desses dados permitiu estabelecer um padrão de temperatura (entre 22 O C e 30 O C) e ph (entre 5,0 e 9,0), a ser utilizado para a preparação e manutenção de meios de cultura de protozoários. Definidos tais valores, foram realizados testes para estabelecer quais deles seriam os ideais para a preparação dos meios de cultura. A partir dos resultados obtidos, concluiu-se que os valores de ph ideais para o preparo e manutenção de tais meios variam de 5,0 a 7,0 e que todos os valores de temperatura testados são propícios para a manutenção dos meios de cultura. Palavras-chave: Protozoários. Meios de cultura de protozoários.

4 3 SUMÁRIO 1 Introdução Características gerais dos protozoários Classificação dos protozoários Morfologia dos protozoários Organelas de locomoção Ecologia dos protozoários Protozoários de vida livre Processos reprodutivos dos protozoários Reprodução assexuada Divisão binária Divisão múltipla Gemulação Reprodução sexuada Regeneração Características dos principais grupos de protozoários Amebas (Classe Sarcodina) Morfologia Locomoção Nutrição, respiração e excreção Comportamento Reprodução Alguns protozoários amebóides Flagelados (Classe Mastigophora) Morfologia Comportamento Nutrição Reprodução Ciliados (Classe Ciliata) Morfologia Locomoção Nutrição, respiração e excreção Comportamento Reprodução Alguns protozoários ciliados Esporozoários Meios de cultura de protozoários Estudo dos protozoários 21 2 Objetivos 22 3 Materiais e métodos 23 4 Resultados e discussão 25

5 4 4.1 Primeira etapa Segunda etapa 30 5 Conclusão 36 Referências 37 Apêndice A Roteiro de preparação e manutenção de meios 38 de cultura de protozoários

6 5 1 INTRODUÇÃO O Filo Protozoa compreende geralmente protistas unicelulares semelhantes a animais, de tamanho microscópico. Estrutural e funcionalmente, a única célula de um protozoário é mais complexa do que a célula de um animal metazoário, e por este motivo, estes organismos estão classificados no Reino Protista. (STORER et al., 2003). Alguns protozoários têm estrutura muito simples e outros são complexos, com organelas (órgãos celulares) que executam processos vitais particulares e são funcionalmente análogas aos sistemas de órgãos dos animais multicelulares. (STORER et al., 2003). Um total de tipos de Protozoa é conhecido e, em número de indivíduos, excedem de longe o de todos os animais. Cada espécie vive em determinado habitat úmido (na água do mar ou no fundo do oceano, em água doce, salobra ou poluída, na terra, no solo ou matéria orgânica em decomposição). (STORER et al., 2003). Muitos protozoários são de vida e de natação livre, enquanto outros são sésseis e alguns, de ambas as categorias, formam colônias. Ainda outros vivem sobre ou dentro de protistas, algumas plantas e de todos os tipos de animais, inclusive do homem. Em diferentes casos, as inter-relações variam de ocorrência casual até parasitismo estrito. Por sua vez, alguns tipos de bactérias vivem sobre ou dentro de protozoários, casualmente, como simbiontes ou como parasitas. (STORER et al., 2003). Os protozoários ocupam importante papel nas cadeias alimentares das comunidades naturais, servindo de alimento para outros organismos diminutos. De especial significação na economia de muitas comunidades, tanto em habitats terrestres úmidos quanto em ambientes aquáticos, são os protozoários saprófitas e que ingerem bactérias, fazendo uso de substâncias e organismos envolvidos na decomposição final das cadeias alimentares e, assim, fazendo recircular a matéria orgânica. Algumas espécies são úteis na purificação de filtros de água e de esgotos em estações de tratamento, enquanto outras são causadoras de doenças, como a disenteria amebiana, a malária e a doença africana do sono, no homem. (STORER et al., 2003).

7 6 1.1 Características gerais dos protozoários Os protozoários são pequenos (entre 2 e 4 µm), geralmente unicelulares, alguns em colônias de poucos a muitos indivíduos semelhantes. A simetria é bilateral, radial, esférica ou ausente. A forma da célula é geralmente constante, oval, alongada, esférica, ou outra, variada em algumas espécies e mudando com o ambiente ou idade em muitas. O núcleo é distinto, único ou múltiplo. Apresentam outras partes estruturais, como organelas; sem órgãos ou tecidos. (STORER et al., 2003). A locomoção é realizada através de flagelos, cílios, pseudópodes ou movimentos da própria célula. Algumas espécies têm envoltórios protetores (tecas). Muitas produzem cistos ou esporos resistentes para sobreviver a condições desfavoráveis e para dispersão. (STORER et al., 2003). A reprodução assexual ocorre por divisão binária, divisão múltipla ou brotamento, enquanto a reprodução sexual ocorre pela fusão de gametas ou por conjugação. (STORER et al., 2003). 1.2 Classificação dos protozoários A classificação dos Protozoa é complexa, envolvendo quatro Subfilos e oito Classes ou Superclasses. Estima-se em o número de espécies de protozoários. Desse total, cerca de são fósseis, são formas de vida livre e são parasitas. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980). Os principais grupos de protozoários são apresentados no Quadro 1. Como ali se verifica, a locomoção é um critério muito importante na diferenciação dos grupos. As amebas se movem por expansões de seu citoplasma. Os ciliados se movimentam por meio de finos apêndices, ou cílios, que impulsionam a célula através de ondulações sincrônicas. Os flagelados têm apêndices filiformes, ou flagelos, usualmente localizados numa das extremidades do corpo celular, que movem as células em ambiente líquido. Os esporozoários se locomovem por deslizamento (flexões somáticas), já que não possuem organelas de locomoção externas. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).

8 7 Grupos principais Subfilo Sarcomastigophora Superclasse Mastigophora (flagelados) Superclasse Sarcodina (amebas) Subfilo Sporozoa Subfilo Ciliophora (ciliados) Quadro 1 Principais grupos do Filo Protozoa Fonte: PELCZAR; REID; CHAN, Características Flagelos, pseudópodes ou ambos os tipos de organelas locomotoras; núcleo único; não há formação de esporos Um ou mais flagelos tipicamente presentes em trofozoítos; solitários ou coloniais; reprodução assexuada basicamente por fissão binária; reprodução sexuada desconhecida em muitos grupos; nutrição fototrófica, heterotrófica ou ambas Pseudópodes geralmente presentes; flagelos, quando presentes, restritos às fases de desenvolvimento; corpo nu ou com esqueletos externos ou internos de vários tipos e variada composição química; reprodução assexuada por fissão; reprodução sexuada, se presente, com gametas flagelados ou, mais raramente, amebóides Esporos geralmente presentes; núcleo único; cílios e flagelos ausentes; todas as espécies parasitas Cílios simples ou organelas ciliares compostas, ao menos em uma etapa do ciclo vital; dois tipos de núcleo; fissão binária na reprodução assexuada; reprodução sexuada por conjugação; nutrição heterotrófica 1.3 Morfologia dos protozoários Em geral, a célula individual dos protozoários representa um organismo completo. Como todas as células eucarióticas, a célula dos protozoários também consiste em citoplasma e núcleo (ou núcleos). (PELCZAR; REID; CHAN, 1980). O citoplasma é um material mais ou menos homogêneo, composto de moléculas protéicas globulosas, frouxamente reunidas para formar uma moldura molecular tridimensional. Embebidas em seu interior, encontram-se as várias estruturas que dão aos protozoários seu aspecto característico. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).

9 8 A contratibilidade dos protozoários é devida à presença de fibrilas protéicas submicroscópicas no citoplasma. Em diversas formas de protozoários, pigmentos se difundem no citoplasma, que, na maioria desses organismos, diferencia-se em ectoplasma e endoplasma. O ectoplasma é mais semelhante a um gel, enquanto o endoplasma é mais volumoso e fluido. A mudança de uma camada para a outra é gradual. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980). Como outras células eucarióticas, os protozoários possuem sistemas membranosos no citoplasma. Estes formam uma rede mais ou menos contínua de canais e de lacunas, dando origem ao retículo endoplasmático. Outras estruturas intracitoplasmáticas incluem ribossomos, complexo de Golgi, mitocôndrias, vacúolos nutritivos e contráteis e núcleos. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980). O citoplasma, com suas diversas estruturas, está separado do ambiente externo pelo envelope celular. Este funciona não somente na proteção, mas também no controle das trocas de substâncias e é o sítio de percepção dos estímulos químicos e mecânicos, servindo, igualmente, para estabelecer contatos com outras células. Este envelope contém, às vezes, uma película, intimamente aposta à membrana celular. Sua espessura, sua flexibilidade e seu número de camadas são variáveis. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980). Existem outros tipos de membranas protetoras, produzidos pelos protozoários, que são coberturas externas à película. São elas: carapaças, testes, loricas e cistos. Tais envelopes consistem em materiais diferentes e, em geral, possuem uma matriz orgânica reforçada pela incrustação de substâncias inorgânicas, tais como carbonato de cálcio ou sílica. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980). Cada protozoário tem, ao menos, um núcleo eucariótico. Muitos protozoários, contudo, possuem núcleos múltiplos durante a maior parte de seus ciclos vitais. Os núcleos são de várias formas, tamanhos e estruturas. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980). Em diversas espécies, cada indivíduo tem dois núcleos similares. Os macronúcleos controlam as atividades metabólicas e os processos de regeneração; os micronúcleos estão relacionados com os processos de reprodução. Os elementos estruturais básicos do núcleo são os cromossomos, a substância nucleolar, a membrana nuclear e o carioplasma (nucleoplasma). (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).

10 Organelas de locomoção Os protozoários podem se locomover por meio de três tipos de organelas: pseudópodes, flagelos e cílios. Além disso, algumas espécies podem desenvolver um movimento de deslizamento por flexões do corpo, sem o uso de organelas especializadas. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980). Um pseudópode é uma projeção temporária de parte do citoplasma dos protozoários que não apresentam uma película rígida. Tais organelas são, portanto, típicas das amebas. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980). O flagelo é uma extensão filamentosa do citoplasma, extremamente fina. Como regra geral, o número de flagelos presentes num indivíduo varia de um até oito. O flagelo se compõe de duas partes: um filamento elástico, chamado axonema, e a bainha citoplasmática contrátil, que envolve o axonema. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980). Os cílios são extensões celulares finas, curtas e filiformes. Podem apresentar comprimento uniforme ou não, dependendo de sua localização. De modo geral, se dispõem em fileiras longitudinais, oblíquas ou espiraladas, inseridos em arestas ou em sulcos. Além de sua função locomotora, os cílios também auxiliam na ingestão de alimentos e servem, muitas vezes, como organelas tácteis. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980). 1.4 Ecologia dos protozoários Do ponto de vista ecológico, os protozoários podem ser divididos em formas de vida livre e aquelas que vivem em outros organismos. Este último grupo é denominado de simbiótico ou parasita. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980) Protozoários de vida livre As fases vegetativas (tróficas) dos protozoários de vida livre ocorrem em qualquer tipo de água doce ou salgada, de areia, de solo ou de matéria orgânica em decomposição. Os fatores que influenciam sua distribuição e o seu número num

11 10 habitat compreendem a umidade, a temperatura, a luz, a presença de nutrientes e outras condições físicas e químicas. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980). Temperatura: na fase encistada (estrutura de parede espessa num período inativo), os protozoários podem suportar variações térmicas muito maiores do que na fase trófica. A tolerância térmica varia com as diferentes condições ambientais. A maior parte dos protozoários, contudo, apresenta uma temperatura ótima entre 16 e 25 o C, estando o limite máximo entre 36 e 40 o C. As temperaturas baixas são menos prejudiciais. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980). Luz: a luz solar é essencial para os protozoários portadores de cromatóforos, que efetuam fotossíntese. Assim, os protozoários exigentes de microorganismos fotossintéticos para sua alimentação também requerem a luz solar, ainda que indiretamente. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980). Concentração hidrogeniônica (ph): alguns protozoários podem tolerar uma ampla variação de ph (por exemplo, de 3,2 a 8,7). Para a maioria, no entanto, a faixa de ph entre 6 e 8 representa o ótimo para sua máxima atividade metabólica. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980). Nutrientes: a população de protozoários num ambiente aquático é influenciada pelos constituintes químicos da água. Alguns protozoários conseguem viver em águas ricas em oxigênio, com baixo teor de matéria orgânica; outros requerem água rica em sais minerais. Certos tipos crescem em águas onde houver ativa oxidação e degradação de materiais orgânicos (a maioria dos protozoários de água doce). Ainda outros preferem água com pouco oxigênio, mas abundante em produtos de decomposição. O suprimento nutritivo, num determinado habitat, é o principal fator determinante da distribuição e do número de protozoários. Como regra geral, aqueles que se alimentam de uma variedade de organismos demonstram larga distribuição; os que são mais seletivos têm distribuição limitada. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980). 1.5 Processos reprodutivos dos protozoários assexuados. Os protozoários reproduzem-se por diversos processos sexuados e

12 Reprodução assexuada A reprodução assexuada ocorre por simples divisão celular, que pode ser igual (originando células-filhas iguais) ou desigual (originando células-filhas diferentes). Divisão binária é aquela na qual ocorre formação de duas células-filhas. Divisão múltipla é aquela na qual ocorre a formação de muitas células-filhas. A gemulação é uma variante da divisão celular desigual. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980) Divisão binária A forma mais elementar de divisão binária é verificada entre as amebas. Nos flagelados, a divisão é geralmente longitudinal. A fissão transversa é característica para a maior parte dos ciliados, embora também possa ocorrer a divisão longitudinal em algumas espécies. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980) Divisão múltipla Na divisão múltipla, uma única célula-mãe se divide para formar muitas células-filhas. Usualmente, é precedida pela multiplicação nuclear, no interior da célula-mãe, que se cliva rapidamente a fim de formar um número correspondente de células-filhas. Nos ciliados e nos flagelados, este tipo de divisão é encontrado somente em algumas espécies. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980) Gemulação A gemulação é a formação de uma ou mais células menores, a partir de uma célula original. Em seu uso estrito em protozoologia, esta denominação deve ser reservada para aqueles casos em que a célula-mãe permanece séssil e libera uma ou mais células-filhas natatórias. Essas diferem da célula-mãe, não apenas quanto ao seu menos grau de diferenciação, mas também porque possuem organelas locomotoras especiais. A gemulação pode ser exógena (que envolve a formação e a separação da gêmula para fora) ou endógena (na qual a célula natatória é formada dentro da célula-mãe). (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).

13 Reprodução sexuada Vários tipos de reprodução sexuada foram observados entre os protozoários. A fusão sexuada de dois gametas ocorre em diversos grupos. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980). A conjugação, geralmente uma união temporária de dois indivíduos para troca de material nuclear, é observada, exclusivamente, nos ciliados. Depois da troca de núcleos, os conjugantes se separam e cada um dá origem à sua respectiva progênie por fissão ou gemulação. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980). Quando os gametas são morfologicamente iguais, recebem a denominação de isogametas. Quando são morfologicamente diferentes, chamam-se anisogametas (podendo ser microgametas ou macrogametas). Os microgametas são móveis, relativamente pequenos e usualmente numerosos, em contraste com os macrogametas. Os anisogametas são comuns entre os esporozoários. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980) Regeneração A capacidade de regenerar partes perdidas é característica de todos os protozoários, desde as formas mais simples até aquelas que apresentam estruturas altamente complexas. Quando um protozoário é cortado em dois, a porção nucleada se regenera, mas a porção anucleada degenera. Isto demonstra que, em geral, o núcleo é necessário para que acorra a regeneração. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980). 1.6 Características dos principais grupos de protozoários Amebas (Classe Sarcodina) A ameba parece ser a forma de vida mais simples do Reino Protista, uma célula independente com núcleo e citoplasma, mas com poucas organelas permanentes. A despeito da sua aparente simplicidade, ela pode mover-se, capturar, digerir e assimilar alimento complexo, eliminar resíduos não digeridos, respirar, produzir secreções e excreções, responder a estímulos de vários tipos (tanto do

14 13 ambiente interno quanto do externo), crescer e reproduzir-se. Realiza, assim, todas as atividades vitais essenciais e mostra especialização fisiológica em vários processos sem ter muitas partes estruturalmente diferenciadas para fazê-lo. (STORER et al., 2003) Morfologia As amebas se compõem de protoplasma, diferenciado em membrana citoplasmática, citoplasma e núcleo. O citoplasma apresenta grânulos e vacúolos contendo alimentos. A membrana mais externa é seletiva e permite a passagem de certos nutrientes solúveis para dentro da célula e de materiais para fora. O núcleo funciona na reprodução, no metabolismo e na transmissão dos caracteres hereditários. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980) Locomoção As amebas movimentam-se formando e estendendo projeções temporárias, os pseudópodes (gr. pseudos, falso + podos, pé), em qualquer lugar do seu corpo. Este tipo de fluxo irregular é chamado movimento amebóide. É provável que o movimento amebóide não seja só de um tipo, mas que seja diferente nos vários organismos que o utilizam. Três aspectos importantes da locomoção são: fixação ao substrato, possivelmente por uma secreção; transformação do plasmagel em plasmassol na extremidade posterior e o processo oposto na extremidade anterior; e aumento da força elástica do plasmagel à medida que ele passa para trás. A fixação faz-se melhor em superfícies ásperas, mas depende da natureza do líquido que circunda o protozoário e de suas condições fisiológicas. (STORER et al., 2003) Nutrição, respiração e excreção As amebas também utilizam os pseudópodes para capturar alimentos. As projeções cercam as partículas alimentares, que são armazenadas no interior de vacúolos, dentro do citoplasma. Com a passagem de enzimas da célula para o vacúolo, o alimento é digerido e assimilado. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).

15 14 As amebas comem outros protozoários, algas, rotíferos e protoplasma morto, preferindo pequenos flagelados e ciliados vivos. Cada ameba pode comer vários paramécios ou várias centenas de pequenos flagelados diariamente e mostra-se capaz de selecionar o alimento. O alimento pode ser tomado em qualquer parte da superfície celular. Os materiais absorvidos servem para crescimento e reprodução, assim como fornecem a energia para a locomoção. Os resíduos não digeridos são eliminados em qualquer parte da superfície celular. (STORER et al., 2003). O oxigênio dissolvido na água na qual a ameba vive difunde-se através da membrana celular. (STORER et al., 2003). O metabolismo resulta na produção de produtos de excreção, tais como dióxido de carbono e uréia, que são eliminados principalmente por difusão através da membrana celular. O vacúolo contrátil atua na excreção, mas sua função principal é regular o conteúdo de água no corpo celular. (STORER et al., 2003) Comportamento As amebas reagem aos vários estímulos físicos e químicos do ambiente. As respostas a estímulos ou mudanças em seu ambiente interno ou externo constituem seu comportamento. A fome é um estímulo interno ao qual a ameba responde com a procura de alimento. O contato com uma partícula alimentar é um estímulo externo ao qual ela responde emitindo pseudópodes para capturar o alimento. (STORER et al., 2003). A resposta ao toque ou contato é variada. Como na natureza a ameba é exposta à luz de intensidades variáveis, ela não responde a mudanças graduais de iluminação. A resposta à temperatura é demonstrada pelas mudanças na locomoção e ritmo de alimentação, que diminuem à medida que a temperatura da água se aproxima do congelamento. A locomoção é acelerada em temperaturas altas, mas cessa acima de 30 o C. Às soluções salinas fortes a ameba responde negativamente, mas a substâncias difundidas do alimento ela responde positivamente. (STORER et al., 2003).

16 Reprodução A reprodução das amebas se realiza pelo simples processo assexuado da fissão binária. Como proteção durante períodos desfavoráveis ao crescimento, algumas amebas mostram a capacidade de encistamento. Nesta condição, suas atividades metabólicas se reduzem ao mínimo, formando-se um cisto, que permite sua sobrevivência até que retornem os fatores favoráveis ao seu desenvolvimento. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980) Alguns protozoários amebóides Alguns protozoários amebóides de vida livre são os foraminíferos, muitos dos quais produzem uma carapaça com numerosas câmaras. Esses organismos obtêm sua alimentação por meio de pseudópodes, que se projetam através de poros presentes nas finas carapaças. Os radiolários são formas marinhas, que, em sua maioria, constroem carapaças de sílica. Os depósitos de seus esqueletos são incorporados em rochas. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980). Espécies do gênero Entamoeba habitam o intestino de muitos vertebrados. Muitas delas, como as que vivem na cavidade oral e no intestino humano são inócuas. No entanto, Entamoeba hystolitica é a causadora da disenteria amebiana nos seres humanos. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980) Flagelados (Classe Mastigophora) A presença de um ou mais flagelos longos e delicados, em algum ou em todos os estágios do ciclo vital, é característica dos Mastigophora. Os flagelos servem para locomoção e captura de alimentos e podem ser receptores sensitivos. O corpo celular é usualmente de forma definida (oval, longa ou esférica), coberto por uma película firme. Muitos flagelados são de vida livre e solitários, outros são sésseis e alguns formam colônias de poucos até milhares de indivíduos. Abundam em água doce e salgada e diversas espécies habitam o solo. (STORER et al., 2003). Os flagelados dividem-se em dois grupos: as formas semelhantes a plantas (fitoflagelados) e as formas semelhantes a animais (zooflagelados). Os fitoflagelados

17 16 geralmente contêm clorofila e são fotossintéticos. Os zooflagelados não possuem clorofila e realizam sua nutrição de modo heterotrófico. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980) Morfologia O corpo desses protozoários é de forma constante e apresenta uma extremidade anterior arredondada, que habitualmente se desloca dirigida para a frente e uma extremidade posterior, que é pontiaguda. A forma do corpo é mantida por uma membrana de revestimento fina e flexível (película). A extremidade anterior contém um citóstoma, que conduz a uma citofaringe. Um longo flagelo estende-se para fora através do citóstoma. (STORER et al., 2003) Comportamento Os movimentos dos flagelados ocorrem pelo batimento dos flagelos para trás e para frente, arrastando o protozoário através da água, com uma rotação em espiral, seguindo um curso reto. O flagelado pode também rastejar por movimentos espirais do corpo. Geralmente, esses protozoários reagem positivamente à luz, nadando na direção de uma fonte de intensidade favorável, mas realizam uma reação de repulsa à luz solar direta. STORER et al., 2003) Nutrição Alguns flagelados de vida livre capturam pequenos organismos, os quais são tomados dentro da citofaringe e digeridos em vacúolos digestivos no citoplasma (nutrição holozóica). (STORER et al., 2003). A nutrição realizada através da fotossíntese, na qual os alimentos são sintetizados dentro do corpo, é denominada holofítica. (STORER et al., 2003). A nutrição saprofítica consiste na absorção de materiais nutrientes dissolvidos na água. (STORER et al., 2003).

18 Reprodução Os flagelados reproduzem-se, freqüentemente, por fissão binária longitudinal. O núcleo divide-se em dois por mitose, então as organelas anteriores são duplicadas e o organismo fende-se em dois longitudinalmente. Também apresentam estágios inativos, quando se tornam imóveis e encistam-se. O encistamento é estimulado por falta de alimento ou pela presença de clorofila. (STORER et al., 2003) Ciliados (Classe Ciliata) Os ciliados possuem cílios durante toda a vida, os quais servem para locomoção e captura de alimento. Cada espécie possui forma constante e característica e a maioria delas tem um macronúcleo grande, relacionado com as funções vegetativas e um ou mais micronúcleos pequenos, importantes na reprodução. (STORER et al., 2003). Os ciliados são os protozoários mais especializados, por terem várias organelas para realizar processos vitais particulares. Isto resulta em divisão de trabalho entre as partes do organismo, análoga àquela de sistemas de órgãos em um animal multicelular. (STORER et al., 2003). Os ciliados constituem o maior grupo de protozoários, com cerca de 6 mil espécies e abundam em águas doces e salgadas. Muitos são de vida livre, alguns são comensais ou parasitas e outros são sésseis. (STORER et al., 2003) Morfologia O corpo celular longo é arredondado na extremidade que se move para frente (anterior), sendo a extremidade posterior afilada. A superfície externa é coberta pela película, com cílios finos, dispostos em séries longitudinais e de comprimento uniforme. Internamente à película, o conteúdo celular consiste de uma camada externa, ectoplasma, ao redor do endoplasma. (STORER et al., 2003). Esses protozoários apresentam citóstoma (boca celular), que abre-se em uma citofaringe. Logo atrás desta localiza-se o citoprocto (ânus celular), o qual pode ser visto apenas quando partículas são descarregadas através dele. No endoplasma, há

19 18 vacúolos digestivos de vários tamanhos, que contêm material em processo de digestão e, na direção de cada extremidade do corpo, há um vacúolo contrátil. (STORER et al., 2003) Locomoção Os ciliados movimentam-se muito rapidamente, devido ao pulsar rítmico dos cílios. Uma vez que estes podem pulsar em qualquer direção, torna-se possível tanto o movimento para frente como para trás e o organismo é capaz, também, de girar em qualquer direção. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980). Os cílios batem para trás para deslocar o organismo para frente e, como suas vibrações são oblíquas, este gira em seu eixo longitudinal. Para nadar para trás, o batimento ciliar é invertido, assim como o percurso da rotação. Se, quando nadando para frente, o ciliado encontra algum estímulo químico desfavorável, ele executa uma reação de repulsa: o batimento ciliar inverte-se, de modo que o protozoário move-se para trás. (STORER et al., 2003) Nutrição, respiração e excreção Os ciliados alimentam-se de bactérias, pequenos protozoários, algas e fermentos. Os ciliados ingerem o alimento através de um poro bucal fixo, situado na base de um sulco oral. As partículas alimentícias são dirigidas pelos cílios para dentro da célula e são coletadas em vacúolos intracelulares, onde são digeridas por enzimas. As partículas não digeridas são eliminadas pelo poro anal. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980). O oxigênio dissolvido na água circundante difunde-se através da película e daí por todo o organismo. O dióxido de carbono e os restos orgânicos resultantes do metabolismo são excretados por difusão na direção oposta. Os líquidos usados são coletados nos vacúolos contráteis, que têm posições fixas e regulam o conteúdo de água no corpo. (STORER et al., 2003).

20 Comportamento A resposta ao contato é variada nos ciliados. Temperaturas altas (maior que 28 o C) estimulam movimentos rápidos e reação de repulsa até que os protozoários escapem ou morram. Em água gelada eles também procuram escapar. À gravidade, há geralmente uma resposta negativa. Em uma lenta corrente de água os ciliados geralmente se alinham com a direção desta, opondo a extremidade anterior à corrente. A resposta é negativa à maioria das substâncias químicas. (STORER et al., 2003) Reprodução Os ciliados se reproduzem assexuadamente por fissão binária ou sexuadamente por conjugação. No primeiro processo, cada um dos núcleos se alonga e se divide em duas metades. A célula em si sofre um processo de constrição ao longo de uma linha mediana, produzindo duas células-filhas. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980). A conjugação realiza-se quando duas amostras diferentes de uma mesma espécie de ciliado entram em contato mútuo. Embora essas células não sejam diferenciadas como masculina e feminina, dois indivíduos, em circunstâncias especiais, podem se reunir. Quando se unem, seus núcleos sofrem divisões. Em cada conjugante, dois núcleos haplóides se fundem, originando um núcleo diplóide. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980) Alguns protozoários ciliados Os protozoários ciliados são representados por muitas formas. Colpoda é um gênero comum de águas doces. O gênero Didinium se alimenta de paramécios, que são capturados por uma estrutura especial e engolidos inteiros. O gênero Stentor compreende grandes protozoários. Ciliados coloniais ocorrem em grupos, presos a uma longa haste fibrosa. Os agrupamentos desses organismos são constituídos por muitas células-filhas. O único ciliado parasita é o Balantidium coli. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980).

21 Esporozoários O Subfilo Sporozoa compreende um grupo de protozoários esporogênicos, que são relativamente pequenos e obrigatoriamente parasitas. As formas adultas não possuem órgãos de locomoção. Sua alimentação deriva, em sua maior parte, das células hospedeiras ou dos líquidos orgânicos em que vivem. Muitas espécies apresentam ciclos vitais complexos, com algumas fases se desenvolvendo em um hospedeiro e outras fases em hospedeiros diferentes. Pode ocorrer uma fase reprodutiva sexuada durante o ciclo vital. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980). O corpo celular simples é arredondado ou alongado, com um núcleo e sem organelas locomotoras ou vacúolo contrátil. Alguns movem-se por modificações na forma do corpo. A respiração e a excreção ocorrem por simples difusão. (STORER et al., 2003). A maioria dos esporozoários multiplica-se rapidamente por divisão assexual múltipla, na qual a célula torna-se multinucleada por sucessivas mitoses e então o citoplasma se divide. Os merozoítos resultantes continuam a disseminar o esporozoário através dos tecidos do hospedeiro. Após uma fase de maturação, os merozoítos produzem macro e micro gametas, que se reúnem formando um zigoto. Este, em muitas espécies, produz esporozoítos, estágio no qual os organismos são espalhados de um indivíduo hospedeiro para outro. (STORER et al., 2003). Os esporozoários são os organismos parasitas de mais larga ocorrência. Espécies distintas ocorrem em diversos organismos, de protozoários a mamíferos. Alguns vivem dentro das células do hospedeiro e outros, nos líquidos ou cavidades do corpo. Podem habitar o trato digestivo, músculos, sangue, rins ou outros órgãos. Entre os mais importantes estão os agentes etiológicos da malária (todos do gênero Plasmodium). (STORER et al., 2003). 1.7 Meios de cultura de protozoários De acordo com PELCZAR; REID; CHAN, 1980, os cientistas aprenderam a cultivar muitos tipos de microrganismos, conseguindo fazê-los crescer e mantê-los viáveis. O estudo dos protozoários geralmente é feito por meio de preparações a fresco, obtidas de infusões, de culturas mistas ou puras, quando são utilizados

22 21 corantes vitais, supravitais e certas técnicas sem corantes. No entanto, várias observações são feitas em lâminas permanentes, onde os protozoários são eventualmente anestesiados, fixados, corados e finalmente montados num meio apropriado. Diversas são as fórmulas utilizadas para a preparação dos nutrientes oferecidos aos meios de cultura. Entre elas, há a utilização de recipientes com alguns grãos de arroz cru, que atua como fonte de matéria orgânica. Há também a afirmação que para um bom desenvolvimento destes seres, é necessário que o local seja moderadamente iluminado, pois locais escuros impedem o desenvolvimento de plantas microscópicas, que são parte importante para a nutrição dos protozoários e locais expostos à luz solar direta também deve ser evitada, pois aquece excessivamente os recipientes. (RODRIGUES, 1978). A compreensão dos meios físicos, como temperatura, ph, luminosidade, dentre outros, são fatores principais, pois juntos criam as condições ideais para o desenvolvimento celular. (PELCZAR; REID; CHAN, 1980). 1.8 Estudo dos protozoários O estudo dos protozoários é realizado na disciplina de Ciências nas escolas de ensino fundamental, em aulas de Biologia do ensino médio e nas aulas de Zoologia no ensino superior. De acordo com KRASILCHIK, 1983, ouvir falar sobre um organismo é em geral muito menos interessante e eficiente do que ver diretamente a realidade. Nos cursos de Biologia, as aulas práticas realizadas em laboratórios são essenciais, porque permitem um contato direto do aluno com os organismos observados. Mesmo reconhecendo essa importância, na realidade formam uma parcela muito pequena dos cursos de Biologia porque, segundo os professores, não há tempo suficiente para a preparação do material. (KRASILCHIK,1983). Para que se concretize, é importante a disponibilidade desses organismos, tornando-se necessária a preparação de meios de cultura, os quais contenham nutrientes e meios físicos apropriados para fornecer a eles crescimento e ambiente propícios à proliferação.

23 22 2 OBJETIVOS Objetivo geral Padronizar culturas de diferentes espécimes de protozoários, a partir de matrizes encontradas na água do recinto das tartarugas aquáticas, localizadas no biotério do Centro Universitário Fundação Santo André. Objetivos específicos Cultivar matrizes in-vitro, reproduzindo suas necessidades ambientais. Implementar a sistematização contínua de culturas de protozoários. Elaborar roteiro de preparação e manutenção dos meios de cultura para as aulas de biologia. Oferecer aos professores e graduandos resultados satisfatórios de visualização nas aulas práticas de microscopia com protozoários. Subsidiar informações complementares sobre protozoários para os professores de escolas da região.

24 23 3 MATERIAIS E MÉTODOS Inicialmente, foram realizadas, durante 10 dias, coletas de amostras de água do lago das iguanas e do lago das tartarugas (localizados no Biotério do Centro Universitário Fundação Santo André). Tais coletas foram feitas em dois horários: às 9:00 e às 12:00 horas. As amostras coletadas foram observadas entre lâmina e lamínula, ao microscópio óptico, do Laboratório de Zoologia do Centro Universitário Fundação Santo André, para a visualização de espécimes de protozoários. Baseado nas observações realizadas nos 10 primeiros dias de coleta, concluiuse que o melhor local para a retirada de amostras era o lago das iguanas e que o horário que apresentava melhores resultados era o das 12:00 horas. Assim, foram coletadas, durante 30 dias, amostras deste recinto, neste horário, anotando-se as temperaturas interna e externa (medidas com o uso de termômetro, cuja escala variava de 0 O C a 100 o C) o valor de ph do lago (medido com o uso de fitas indicadoras de ph, cuja escala de valores variava de 0 a 14) e a luminosidade do ambiente. Assim como as 10 primeiras, essas amostras também foram utilizadas para a observação de protozoários. Ao término dos 40 dias de coleta, foi feito um levantamento dos dados obtidos, com o objetivo de estabelecer um padrão de temperatura e ph a ser utilizado para a preparação e manutenção de meios de cultura de protozoários. Definidos os valores de ph e temperatura a serem utilizados, foram realizados testes para estabelecer quais deles seriam os ideais para a preparação dos meios de cultura. Os valores de ph testados foram mantidos com o uso de substâncias-tampão, preparadas, inicialmente, com a utilização de uma solução de cloreto de sódio a 0,9% (os ajustes necessários para a obtenção de cada valor foram feitos com o uso de hidróxido de sódio ou ácido clorídrico) e, posteriormente, com a utilização de cloreto de sódio misturado a água diluída. Os meios preparados com as substâncias-tampão e amostras de protozoários coletadas no lago das iguanas, foram mantidos em estufa (utilizada para manter estáveis as temperaturas a serem testadas) por um período de 24 horas. Posteriormente, com a impossibilidade da utilização de substâncias-tampão

25 24 (verificada a partir dos testes realizados), foi utilizada água proveniente de caixa d água para manter os meios. Finalizados os testes, foi estabelecida uma faixa de ph e temperatura ideal para a manutenção de meios de cultura de protozoários, assim como foi elaborado um roteiro de preparação e manutenção desses meios (Apêndice A), para que possam ser utilizados em aulas práticas de Biologia.

26 25 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 Primeira etapa A primeira etapa do Projeto Padronização e Sistematização de meios de cultura de protozoários consistiu em se realizar, durante 40 dias, coletas de amostras de água do recinto das tartarugas e do recinto das iguanas, localizados no Biotério do Centro Universitário Fundação Santo André. As dez primeiras coletas foram realizadas em dois horários diferentes, às 9:00 horas da manhã e às 12:00 horas, e tiveram como objetivo estabelecer qual dos dois horários apresentava melhores condições para a realização da segunda etapa do Projeto. Somente o lago das tartarugas seria utilizado para as coletas das dez primeiras amostras. No entanto, logo no início do desenvolvimento do Projeto, percebeu-se que este local provavelmente não apresentaria condições satisfatórias para a sua realização. Por ser lavado com uma freqüência maior que o lago das iguanas (todo dia ou a cada dois dias), seus padrões de ph e temperatura mudam constantemente, o que poderia afetar o resultado das coletas. Decidiu-se, então, realizar as coletas também no lago das iguanas, que apresentava mais estabilidade quanto às variáveis envolvidas no estudo (por não ser lavado com a mesma freqüência que o lago das tartarugas). Assim, seria possível comparar qual dos dois recintos apresentaria as melhores condições para a observação de espécimes de protozoários. Como pode ser observado na Tabela 1 e no Gráfico 1, que apresentam os resultados obtidos com as coletas realizadas no lago das tartarugas, foram feitas coletas nos dois horários especificados acima, durante dez dias. Das 20 coletas realizadas (10 em cada horário), 12 não apresentaram resultados satisfatórios, provavelmente devido à limpeza periódica do lago. Observou-se que, no dia da limpeza ou 1 dia após, não havia protozoários na amostra coletada. Os protozoários observados nas demais amostras pertenciam a 2 grupos: Ciliata (que possuem cílios como organela de locomoção) e Mastigophora (que apresentam flagelos como organela de locomoção). O objetivo era que houvesse, também, a observação de

27 26 protozoários do grupo Sarcodina (que realizam movimentos através dos pseudópodes), o que não ocorreu. Tabela 1: Resultados obtidos a partir das dez primeiras coletas realizadas no lago das tartarugas, no período de 08 a 22 de fevereiro de 2006 Dia Horário T O ext. T O int. Luminosidade ph Amostras ( o C) ( o C) 1 9:20 23,5 22 Parc. nublado 6,0 Ciliados 12: ,5 Parc. nublado 6,0 Nada 2 9:15 21,5 21 Parc. nublado 6,0 Ciliados e flagelados 12: Ensolarado 6,0 Nada 3 9:15 21,5 21,5 Parc. nublado 6,0 Nada 12:00 28,5 23,5 Ensolarado 7,0 Nada 4 9:10 23,5 21 Ensolarado 7,0 Ciliados e flagelados 12:00 29,5 23,5 Ensolarado 7,0 Ciliados 5 9:10 25,5 23,5 Ensolarado 7,0 Ciliados 12: Ensolarado 5,5 Nada 6 8: Nublado 5,5 Nada 11: Parc. nublado 5,5 Nada 7 9: Parc. nublado 6,0 Ciliados 12: ,5 Ensolarado 6,0 Ciliados 8 9: Parc. nublado 6,0 Nada 12:00 27,5 24 Parc. nublado 6,0 Nada 9 9: ,5 Chuvoso 6,0 Nada 12: ,5 Nublado 6,5 Nada 10 9: ,5 Nublado 5,0 Nada 11:50 29,5 24,5 Parc. nublado 6,0 Ciliados 2,5 2 1,5 1 0, o horário 2o horário Gráfico 1: Resultados obtidos a partir das dez primeiras coletas realizadas no lago das tartarugas, no período de 08 a 22 de fevereiro de 2006

28 27 De acordo com a observação dos resultados obtidos a partir das dez coletas iniciais, pode-se notar que a temperatura externa variou de 21,5 o C a 32 o C, enquanto a temperatura interna oscilou entre 21 o C e 26 o C. O valor do ph variou de 5,0 a 7,0. A Tabela 2 e os Gráfico 2 e 3 apresentam os dados obtidos a partir das coletas realizadas no lago das iguanas, também às 9:00 e às 12:00 horas (exceto no primeiro dia, em que foi realizada apenas às 13:30). Algumas amostras coletadas não apresentaram protozoários. No entanto, nas amostras em que eles foram observados, estes pertenciam aos 3 grupos objetos do estudo: ciliados, flagelados e sarcodinos (amebas). A presença de protozoários desses 3 grupos nas amostras coletadas no lago das iguanas foi fundamental para a escolha desse recinto como o local que seria utilizado para a realização das 30 coletas subseqüentes. As amostras coletadas no lago das iguanas foram feitas em dois pontos diferentes: no fundo e no tronco (localizado no meio do lago), pois julgou-se que eles apresentariam diferentes resultados. No entanto, observou-se, com a análise dos dados obtidos, que estes pontos não apresentavam diferenças significativas quanto aos espécimes observados. De acordo com o observado na Tabela 2, a temperatura externa oscilou entre 21,5 o C e 30 o C, enquanto temperatura interna variou entre 20 o C e 25,5 o C. O valor de ph ficou entre 5,5 e 7,0. Comparando-se os dados obtidos a partir das amostras coletadas no lago das tartarugas e no lago das iguanas, pode-se concluir que foram muito semelhantes. Isso evidencia que a observação de protozoários nas amostras coletadas em ambos os recintos não foi determinada, exclusivamente, pelas temperaturas interna e externa ou pelo ph, mas principalmente pela lavagem menos freqüente do lago das iguanas. Ou seja, a lavagem periódica do lago das tartarugas influenciou o resultado, de modo que não foi possível observar protozoários na maioria das amostras nele coletadas. Com relação ao horário, concluiu-se que este, provavelmente, não influenciava na presença de protozoários nas amostras coletadas. Assim, o horário das 12:00 foi o escolhido para a realização das 30 coletas subseqüentes. Tendo sido escolhido o lago das iguanas (devido à sua maior estabilidade) e o horário das 12:00 horas como local e período ideais para a próxima etapa do Projeto,

29 28 foram realizadas 30 coletas (uma por dia), nas quais foram observados e anotados as temperaturas externa e interna, o ph e a luminosidade. Tabela 2: Resultados obtidos a partir das nove primeiras coletas realizadas no lago das iguanas, no período de 09 a 22 de fevereiro de 2006 Dia Horário T O ext. T O int. Luminosidade ph Amostras Amostras ( o C) ( o C) (fundo) (tronco) : Ensolarado 6,0 Nada Nada 9:15 21,5 21,5 Parc. nublado 6,0 Ciliados Ciliados e flagelados 12:00 28,5 24,5 Ensolarado 6,0 Ciliados Ciliados 9:10 23,5 20 Ensolarado 6,0 Ciliados Ciliados 12:00 29,5 25,5 Ensolarado 6,0 Nada Ciliados 9:10 25,5 22,5 Ensolarado 6,0 Nada Nada 12: ,5 Ensolarado 5,5 Ciliados Nada 8: Nublado 5,5 Nada Nada 11: Parc. nublado 5,5 Ciliados Nada 9: ,5 Parc. nublado 5,5 Ciliados, Nada amebas e flagelados 12: ,5 Ensolarado 5,5 Ciliados Ciliados 9: Parc. nublado 5,5 Nada Ciliados 12:00 27,5 24,5 Parc. nublado 6,0 Ciliados Ciliados 9: ,5 Chuvoso 6,0 Ciliados Ciliados 12: ,5 Nublado 6,5 Ciliados Ciliados 9: ,5 Nublado 7,0 Nada Ciliados 12:00 29,5 24 Parc. nublado 7,0 Ciliados Ciliados e amebas 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0, o horário 2o horário Gráfico 2: Resultados obtidos a partir das nove primeiras coletas realizadas no lago das iguanas, no período de 09 a 22 de fevereiro de 2006

30 29 2,5 2 1,5 1 1o horário 2o horário 0, Gráfico 3: Resultados obtidos a partir das nove primeiras coletas realizadas no lago das iguanas, no período de 09 a 22 de fevereiro de 2006 A Tabela 3 apresenta os resultados obtidos com as amostras coletadas durante 30 dias. De acordo com os dados observados, pode-se notar que a temperatura interna variou de 17,5 o C a 24 o C, enquanto a temperatura externa oscilou entre 19 o C e 30 o C. O valor de ph ficou entre 5,5 e 9,0. Pode-se observar que 8 das 30 coletas realizadas não permitiram a observação de espécimes de protozoários, provavelmente devido à lavagem do lago no dia da coleta. Inicialmente, seriam realizadas 50 coletas nessa fase do Projeto. No entanto, o lago das iguanas teve que passar por uma reforma devido à ocorrência de rachaduras e vazamentos. Foi necessário cimentar o recinto, o que impediu a realização das coletas complementares. Independente disso, as 30 coletas realizadas foram suficientes para determinar um padrão de temperatura, ph e luminosidade ideal, que será utilizado para a preparação e manutenção de meios de cultura de protozoários.

31 30 Tabela 3: Resultados obtidos a partir de 30 coletas, realizadas no lago das iguanas, às 12:00 horas, no período de março a abril de 2006 Dia T O int. T O ext. ph Luminosidade Amostras ( o C) ( o C) ,5 6,0 Parc. nublado Ciliados, flagelados e amebas ,0 Ensolarado Ciliados ,5 Ensolarado Ciliados ,0 Ensolarado Ciliados 5 21,5 25 6,0 Parc. nublado Ciliados, flagelados e amebas 6 22,5 28 7,0 Ensolarado Ciliados ,0 Nublado Ciliados e flagelados ,0 Nublado Ciliados 9 23,5 25 6,0 Parc. nublado Ciliados, flagelados e amebas ,5 Nublado Nada ,0 Parc. nublado Nada ,5 6,0 Nublado Ciliados, flagelados e amebas ,5 5,5 Nublado Ciliados ,0 Ensolarado Nada ,5 6,5 Nublado Ciliados, flagelados e amebas ,5 6,0 Nublado Nada 17 21,5 23 6,0 Nublado Ciliados ,0 Parc. nublado Ciliados ,0 Parc. nublado Ciliados, flagelados e amebas ,0 Nublado Nada ,0 Ensolarado Ciliados, flagelados e amebas ,5 6,0 Ensolarado Ciliados e flagelados ,0 Parc. nublado Ciliados, flagelados e amebas ,0 Chuvoso Ciliados e amebas ,5 8,5 Parc. nublado Ciliados, flagelados e amebas ,0 Nublado Nada ,0 Nublado Ciliados e flagelados ,0 Nublado Ciliados e flagelados 29 20,5 21 7,0 Nublado Nada 30 17,5 20,5 9,0 Ensolarado Nada 4.2 Segunda etapa De acordo com as coletas e observações realizadas na primeira etapa do Projeto, foi possível estabelecer uma faixa de ph e temperatura ideal para a manutenção de um meio de cultura de protozoários. Assim, os valores de ph

32 31 utilizados e testados na segunda etapa foram: 5,0, 6,0, 7,0, 8,0 e 9,0 e os de temperatura foram: 22 o C, 24 o C, 26 o C, 28 o C e 30 o C. A segunda etapa do Projeto consistiu na realização de testes in-vitro com amostras que apresentavam diferentes valores de ph, mantidas em diferentes temperaturas. As amostras de protozoários utilizadas nos testes foram retiradas do lago das iguanas (localizado no biotério do Centro Universitário Fundação Santo André), local que apresentou melhores resultados na etapa anterior. Estas amostras foram mantidas em estufa para estabilizar os diferentes valores de temperatura a serem testados. Os valores de ph a serem testados foram obtidos a partir da preparação de soluções-tampão, utilizando-se, inicialmente, uma solução de cloreto de sódio a 0,9% (os ajustes necessários para a obtenção de cada valor foram feitos com o uso de hidróxido de sódio ou ácido clorídrico). Posteriormente, com a necessidade de se preparar uma outra solução-tampão, foi utilizado cloreto de sódio misturado com água diluída. O primeiro teste realizado foi em relação à temperatura de 30 o C. Uma amostra de protozoários do lago das iguanas (0,25mL) foi adicionada a 15mL de soluçãotampão para os diferentes valores de ph a serem testados. Assim, as cinco amostras foram colocadas em placas de Petri e mantidas, por 24 horas, na temperatura de 30 o C, na estufa. Um tubo controle contendo apenas a amostra retirada do lago (portanto, sem a adição de qualquer solução-tampão) também foi mantido nessa temperatura. O resultado obtido foi o seguinte: três amostras retiradas do tubo controle apresentaram espécimes de protozoários; porém, três amostras retiradas de cada uma das placas de Petri não apresentaram protozoários vivos. O mesmo teste foi realizado, mantendo-se as amostras na temperatura de 28 o C, também por 24 horas. O resultado obtido foi o mesmo do teste anterior, o que demonstrou que a variável temperatura, provavelmente, não era a responsável pela morte dos protozoários. Assim, mais um teste foi realizado, novamente na temperatura de 28 o C, mas mudando-se as concentrações da solução-tampão e da amostra retirada do lago. Dessa vez, foi acrescentado 10mL da solução-tampão e 10mL da amostra. No entanto, a observação, após 24 horas, das três amostras retiradas de cada placa,