B ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (DTB) Direct Detection Reagent Pack

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1 B ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (DTB) Direct Detection Reagent Pack JAA(04) Português UTILIZAÇÃO PRETENDIDA O BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (DTB) Direct Detection Reagent Pack (Embalagem de Reagentes para a Detecção Directa do Complexo Mycobacterium tuberculosis (DTB) BD ProbeTec ET), para utilização com o Sistema ET BD ProbeTec, utiliza tecnologia de Amplificação por Deslocamento de Cadeia (Strand Displacement Amplification - SDA) para a detecção qualitativa directa de ADN do complexo Mycobacterium tuberculosis a partir de amostras clínicas respiratórias digeridas e descontaminadas, tais como expectoração, expectoração induzida, lavados brônquicos e outras amostras respiratórias. O BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (DTB) Direct Detection Assay deve ser usado como teste directo para a avaliação de amostras provenientes de doentes não tratados e com suspeita de tuberculose. Os doentes não tratados são os que: (1) não receberam terapêutica anti-tuberculosa; (2) não receberam este tipo de terapêutica nos últimos 12 meses; ou (3) tiveram menos de 7 dias de terapêutica. RESUMO E EXPLICAÇÃO Cerca de um terço da população mundial está infectada com Mycobacterium tuberculosis, apresentando um risco de 10% de desenvolver a doença durante toda a vida. 1,2 Calcula-se que a tuberculose mate anualmente 3 milhões de indivíduos em todo o mundo, o que a torna a principal causa de morte por doença infecciosa. 1,3 O lento crescimento do microrganismo M. tuberculosis atrasa o diagnóstico clínico e o tratamento, contribuindo para a expansão da doença. O Centers for Disease Control and Prevention (Centro de Controlo e Prevenção de Doenças) dos E.U. recomendou aos laboratórios que efectuassem todos os esforços no sentido de utilizarem os métodos mais rápidos disponíveis para o teste de diagnóstico de micobactérias. 3 O uso de técnicas de amplificação de ADN, como a SDA, permite a detecção e identificação rápidas de ADN do complexo M. tuberculosis em amostras clínicas, promovendo assim uma intervenção médica mais rápida. O Mycobacterium tuberculosis complex (DTB) reagent pack é usado com o Sistema BD ProbeTec ET. O sistema de teste utiliza tecnologia de SDA homogénea como o método de amplificação e a transferência de energia (ET) fluorescente como o método para detectar a presença do complexo Mycobacterium tuberculosis direcamente a partir de amostras respiratórias digeridas e descontaminadas (sedimentos NALC-NaOH). O complexo Mycobacterium tuberculosis é constituído por M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum e M. microti. 4,5 PRINCÍPIOS DO PROCEDIMENTO O Ensaio BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (DTB) baseia-se na amplificação e detecção simultâneas do ADN alvo, utilizando primers de amplificação e uma sonda de detecção rotulada por fluorescência. 6-8 Os reagentes de SDA encontramse liofilizados em dois micropoços individuais descartáveis. O sedimento NALC-NaOH processado é adicionada ao micropoço de inicialização, que contém os primers de amplificação, as sondas de detecção com marcação fluorescente e outros reagentes. Após a incubação, a mistura da reacção é transferida para o micropoço de amplificação, que contém duas enzimas (uma ADN polimerase e uma endonuclease de restrição) necessárias à SDA. Os Micropoços de Amplificação são selados para evitar a contaminação e, depois, incubados num leitor fluorescente termocontrolado, que monitoriza a geração de produtos amplificados em cada reacção. Cada reação co-amplifica e detecta um Controlo de Amplificação Interno (CAI). O objectivo deste controlo consiste em confirmar a validade da reacção de amplificação e identificar a potencial inibição da amostra processada. Os resultados são apresentados como positivos, negativos ou indeterminados, através de um algoritmo. REAGENTES E MATERIAIS Cada BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (DTB) Direct Detection Reagent Pack (Embalagem de Reagente para Detecção Directa do Complexo Mycobacterium tuberculosis BD ProbeTec ET) contém: Micropoços de Inicialização DTB, 3 x 32: 4 Oligonucleótidos 7,6 pmol; dntp 37,6 nmol; Sondas detectoras 30 pmol; Oligonucleótido sintético cópias Micropoços de Amplificação DTB, 3 x 32: Enzima de restrição 25,5 unidades; ADN polimerase 8 unidades; dntps 10 nmol Acessórios: 10 Tampas, 8 Sacos para Eliminação, 16 Seladores Cada BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (DTB) Direct Detection Specimen Processing Kit (Kit de Processamento de Amostras para Detecção Directa do Complexo Mycobacterium tuberculosis BD ProbeTec ET) contém: Tampão de lavagem 1 DTB solução de 225 ml contendo ureia; Tampão CAPS; dimetil sulfóxido; glicerol e hidróxido de sódio; Tampão de lise 2 DTB 50 ml de solução de hidróxido de potássio; Tampão de Neutralização 3 DTB 150 ml de solução contendo bicina, hidróxido de potássio, dimetil sulfóxido, glicerol e 0,03% de Proclin (conservante). Cada BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (DTB) Direct Detection Control Set (Conjunto de Controlo para Detecção Directa do Complexo Mycobacterium tuberculosis BD ProbeTec ET) contém: Controlo Positivo DTB ADN de testículo de salmão seco 5 µg e 750 cópias de oligonucleótido sintético por reacção 5250 cópias no total. Controlo negativo DTB ADN de testículo de salmão seco 5 µg. 1

2 Instrumentos, equipamento e acessórios: Aparelho BD ProbeTec ET e Placa do Aparelho, Cabeça de Inicialização e Aquecimento BD ProbeTec ET, forno BD ProbeTec ET ou forno de laboratório de utilização geral capaz de aquecer a amostra até 101 C ± 1 C durante um mínimo de 30 min e um máximo de 35 min, Banho sónico BD ProbeTec ET e insersor do banho sónico, Pipeta e Alimentação Eléctrica BD ProbeTec ET, Suporte para Tubos de 2 ml, Suporte de Pipetagem Transparente, Tubos de Ensaio de 2 ml e Rolhas, Rolhas de 2 ml e BD ProbeTec ET Accessories Kit, Zaragatoas CultureSwab EZ. Material necessário mas não fornecido: Microcentrifugadora com confinamento de aerossóis e rotores padrão com capacidade para x g (tais como Microcentrifugadora Eppendorf Modelo 5417C), misturador de vórtex, luvas descartáveis, pipetas com pontas resistentes a aerossóis capazes de administrar volumes de 100 µl, 500 µl, 600 µl e 1 ml, hipoclorito de sódio a 1% (v/v) com Alconox*, recipientes estéreis capazes de suportar alíquotas dos 3 Tampões DTB, cronómetro, desinfectante tuberculocida, esponjas absorventes/compressas, termómetro calibrado. * Adicionar 7,5 g de Alconox por 1 L de hipocloreto de sódio a 1% (v/v) e misturar. Prepare diariamente. Requisitos de Armazenamento e Manuseamento: As embalagens de reagente DTB podem ser armazenados a temperaturas entre os 2 e os 33 C. Não utilizar as embalagens de reagentes fechadas após o fim do prazo de validade. Depois da abertura de uma bolsa, os micropoços permanecerão estáveis durante 4 semanas, desde que estejam correctamente selados ou até ao prazo de validade, o que ocorrer primeiro. Não congele. Os reagentes de processamento DTB podem ser armazenados a temperaturas entre os 2 e os 33 C. Não utilizar os reagentes após o fim do prazo de validade. Não congele. Os Controlos DTB podem ser armazenados a temperaturas entre os 2 e os 33 C. Não utilize os Controlos findo o prazo de validade. Não congele. ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES Para uso em Diagnóstico in-vitro. 1. O desempenho deste teste para a detecção do complexo M. tuberculosis a partir de amostras não respiratórias, incluindo mas não se limitando a sangue, LCR, fezes ou urina, não está demonstrado. O desempenho do Ensaio BD ProbeTec ET DTB não foi avaliado com amostras processadas por métodos diferentes dos descritos neste folheto informativo. 2. A manipulação e o processamento de amostras até ao passo de inactivação por calor devem ser efectuados numa Câmara de Segurança Biológica (BSC) de Classe II. A centrifugação da amostra antes do passo de inactivação por calor só deve ser feita usando o rotor com contenção de aerossóis. O rotor com contenção de aerossóis só deve ser aberto na BSC. Utilize apenas o rotor padrão para a centrifugação de amostras depois da inactivação por calor fora da BSC. 3. Proceda à cultura de todas as amostras processadas para determinar se estão presentes micobactérias diferentes da responsável pela tuberculose (MOTT), efectue testes de sensibilidade anti-micobacteriana, determine a subespécie do complexo M. tuberculosis e/ou avalie a viabilidade. 4. Microrganismos patogénicos, incluindo o vírus de Hepatite B e o Vírus da Imunodeficiência Humana (VIH), podem estar presentes nas amostras. Por conseguinte, as amostras devem ser manipuladas como se fossem infecciosas seguindo os procedimentos laboratoriais estabelecidos 9,10,11 e/ou as normas institucionais. 5. Não troque nem misture os Micropoços, os Controlos ou os tampões de processamento retirados de conjuntos com números de lote diferentes. 6. Cumpra as práticas de laboratório estabelecidas para descartar as pontas de pipeta, os tubos de ensaio, as tampas de Inicialização e os outros materiais descartáveis utilizados. 7. Utilize apenas o Pipetador e as pontas de Pipetas BD ProbeTec ET na transferência das amostras processadas para os Micropoços de Aparelhamento e na transferência das amostras dos Micropoços de Aparelhamento para os Micropoços de Amplificação. 8. As bolsas de reagentes que contenham Micropoços de Inicialização e Micropoços de Amplificação não usados T M de ser cuidadosamente seladas após a sua abertura. Antes de selar novamente a bolsa de reagentes, confirmar a presença de um exsicante. 9. A placa que contém os Micropoços de Amplificação TEM de ser correctamente selada com o Vedante de Amplificação, antes de ser deslocada do Forno de Aparelhamento e Aquecimento BD ProbeTec ET para o aparelho BD ProbeTec ET. A selagem é necessária para evitar contaminação do instrumento e da área de trabalho com produtos da reacção de amplificação. Não retire o material vedante dos micropoços em nenhum momento. 10. Na eventualidade de uma placa de teste exceder 6 colunas (> 48 amostras e Controlos), deve ser utilizada uma folha INTEIRA de vedante de Amplificação para prevenir uma possível contaminação. 11. Para evitar a contaminação do ambiente de trabalho com produtos da amplificação, utilize os sacos para resíduos fornecidos para eliminar micropoços de amplificação vedados após conclusão dos testes. 12. MUDE DE LUVAS nas fases especificadas durante o processamento de amostras e o procedimento de teste, para evitar a contaminação entre amostras. Se as luvas entrarem em contacto com uma amostra, mudá-las imediatamente para evitar a contaminação das outras amostras. 13. Em caso de contaminação da área ou do equipamento de trabalho com a amostra processada, lave bem a área contaminada com hipocloreto de sódio a 1% (v/v) em Alconox e enxaguar com água destilada/desionizada abundante. Antes de prosseguir, deixe as superfícies secar completamente. 14. Diariamente, limpe toda a área de trabalho topos de bancadas e superfícies do instrumento com hipoclorito de sódio a 1% com Alconox. Irrigue abundantemente com água destilada/desionizada. Antes de prosseguir com outros testes, deixe as superfícies secarem completamente. 2

3 15. Os Micropoços de Inicialização com líquido residual (após a transferência do líquido dos Micropoços de Inicialização para os Micropoços de Amplificação) representam uma fonte de contaminação. Sele cuidadosamente os micropoços de inicialização com o selador de placas, antes de os eliminar. 16. Não coloque os dedos nem as mãos no banho sónico quando os ultra-sons estiverem ligados (ON). Se o fizer poderá sentir desconforto e, possivelmente, irritação cutânea. Também poderão ocorrer lesões nos tecidos moles a longo prazo. 17. Não use um termómetro de mercúrio para verificar a temperatura do Banho Sónico. Para esta finalidade, é fornecido um termómetro digital. 18. Contactar os Serviços Técnicos, se ocorrem situações invulgares, tais como derrame no instrumento BD ProbeTec ET ou contaminação com ADN que não possa ser removida através de limpeza. 19. Se utilizar um forno de laboratório de utilização geral, siga as instruções do manual do utilizador do forno para obter as instruções de funcionamento adequadas e as precauções de segurança. 20. Utilize procedimentos laboratoriais estabelecidos para o manuseamento das amostras durante e/ou após a inactivação por calor. Cat. No. Descrição BBL MycoPrep Specimen Digestion/Decontamination Kit, dez frascos de 75 ml de Solução NALC-NaOH e 5 embalagens de tampão de fosfato BBL MycoPrep Specimen Digestion/Decontamination Kit, dez frascos de 150 ml de Solução NALC-NaOH e 10 embalagens de tampão de fosfato. Perigo H314 Provoca queimaduras na pele e lesões oculares graves. P260 Não respirar as poeiras/fumos/gases/névoas/vapores/aerossóis. P280 Usar luvas de protecção/vestuário de protecção/ protecção ocular/protecção facial. P264 Lavar cuidadosamente após manuseamento. P303+P361+P353 SE ENTRAR EM CONTACTO COM A PELE (ou o cabelo): retirar imediatamente toda a roupa contaminada. Enxaguar a pele com água/tomar um duche. P405 Armazenar em local fechado à chave. P501 Eliminar o conteúdo/recipiente de acordo com os regulamentos locais/ regionais/nacionais/internacionais. Cat. No. Descrição BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex (DTB) Direct Detection Specimen Processing Kit. Atenção H315 Provoca irritação cutânea. H319 Provoca irritação ocular grave. H335 Pode provocar irritação das vias respiratórias. P280 Usar luvas de protecção/vestuário de protecção/protecção ocular/protecção facial. P264 Lavar cuidadosamente após manuseamento. P312 Caso sinta indisposição, contacte um CENTRO DE INFORMAC A O ANTIVENENOS ou um médico. P405 Armazenar em local fechado à chave. P403+P233 Armazenar em local bem ventilado. Manter o recipiente bem fechado. P501 Eliminar o conteúdo/recipiente de acordo com os regulamentos locais/regionais/nacionais/internacionais. Perigo H302 Nocivo por ingestão. H314 Provoca queimaduras na pele e lesões oculares graves. P260 Não respirar as poeiras/fumos/gases/névoas/vapores/aerossóis. P280 Usar luvas de protecção/vestuário de protecção/ protecção ocular/protecção facial. P264 Lavar cuidadosamente após manuseamento. P303+P361+P353 SE ENTRAR EM CONTACTO COM A PELE (ou o cabelo): retirar imediatamente toda a roupa contaminada. Enxaguar a pele com água/tomar um duche. P405 Armazenar em local fechado à chave. P501 Eliminar o conteúdo/recipiente de acordo com os regulamentos locais/ regionais/nacionais/internacionais. Atenção H302 Nocivo por ingestão. P264 Lavar cuidadosamente após manuseamento. P301+P312 EM CASO DE INGESTA O: caso sinta indisposição, contacte um CENTRO DE INFORMAC A O ANTIVENENOS ou um médico. P501 Eliminar o conteúdo/recipiente de acordo com os regulamentos locais/regionais/nacionais/internacionais. 3

4 RECOLHA E MANUSEAMENTO DAS AMOSTRAS A colheita e o transporte de todas as amostras devem ser efectuados de acordo com as recomendações do CDC, do Clinical Microbiology Procedures Handbook (Manual de Procedimentos de Microbiologia Clínica) ou do manual de procedimentos do seu laboratório. 1,8 DIGESTÃO, DESCONTAMINAÇÃO E CONCENTRAÇÃO As amostras devem ser processadas utilizando o método de NALC-NaOH, tal como é recomendado pela publicação do CDC, Public Health Mycobacteriology: A Guide for the Level III Laboratory (Micobacteriologia de Saúde Pública: Um Guia para o Laboratório de Nível III) 1 Em alternativa, utilize o BBL MycoPrep kit para o processamento de amostras de micobactérias (consulte a secção Disponibilidade ). NOTA: Se o teste do Ensaio BD ProbeTec ET não for efectuado de imedio, os sedimentos NALC/NaOH podem ser armazenados da seguinte forma: (a) A 2 8 C durante um período máximo de 5 dias. (b) Para um armazenamento superior a 5 dias, congele e armazene a -20 C ou temperatura inferior (sem ciclismo) durante um período máximo de três meses. Os sedimentos congelados devem ser descongelados à temperatura ambiente antes do processamento para os testes BD ProbeTec ET DTB. PROCEDIMENTO DE PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS A. Preparação do Processamento de Amostras BD ProbeTec ET DTB - Fora da BSC 1. Os tampões de processamento da amostra devem estar à temperatura ambiente e bem misturados antes da utilização. Para evitar a contaminação dos tampões de stock, construa alíquotas de volumes suficientes dos tampões em recipientes estéreis adequadamente rotulados, da seguinte forma: a. Tampão de Lavagem 1 DTB 1 ml por sedimento de NALC-NaOH a processar mais 1 2 ml extra para uma pipetagem mais fácil. b. Tampão de Lise 2 DTB 0,1 ml por sedimento de NALC-NaOH e controlos a processar mais 0,5 1 ml extra para uma pipetagem mais fácil. c. Tampão de Neutralização 3 DTB 0,6 ml por sedimento de NALC-NaOH e controlos a processar mais 0,5 1 ml extra para uma pipetagem mais fácil. d. Para evitar contaminação dos tampões - não despeje o tampão que sobra novamente para os frascos. 2. Utilize as etiquetas fornecidas com os tubos de amostra e rotule um Tubo de Amostra de 2 ml para cada sedimento de NALC-NaOH a processar. 3. Retire as tampas dos Tubos de Amostra e dispense 1,0 ml de Tampão de Lavagem 1 DTB em cada tubo. Volte a tapar os tubos. 4. Mova os Tubos de Amostra para a BSC. B. Processamento das Amostras de Sedimento NALC-NaOH para Teste BD ProbeTec ET DTB - Dentro da BSC NOTA: Na preparação para decantar as amostras, prepare um recipiente para desperdícios líquidos com potencial risco biológico. 1. Misture o primeiro sedimento de NALC-NaOH no vórtex durante 5 sec. 2. Utilizando uma pipeta com uma nova ponta resistente a aerossóis, transfira 500 µl do sedimento NALC-NaOH para o tubo adequadamente rotulado como Tubo de Amostra contendo 1 ml de Tampão de Lavagem 1 DTB 3. Tape bem o tubo. 4. Repita os passos 1 3 para cada sedimento NALC-NaOH. 5. MUDE DE LUVAS. 6. Agite cada tubo de amostra no vortex durante 5 sec. 7. Coloque cada tubo no rotor com contenção de aerossóis e fixe firmemente a tampa de contenção de aerossóis. Limpe o exterior do rotor com folhas de papel ou compressas humedecidas com uma solução anti-microbiana. 8. Transfira o rotor com contenção de aerossóis para a microcentrifugadora. Centrifugue as amostras a x g durante 3 min. NOTA: Devem seguir-se as condições de centrifugação especificadas, dado que uma centrifugação insuficiente pode dar origem a resultados falsos negativos. 9. Imediatamente depois da centrifugação, retire cuidadosamente o rotor da microcentrifugadora (sem disromper o vedante de aerossóis) e volte a colocar o rotor na BSC. 10. Retire a tampa de contenção de aerossóis e retire imediatamente as amostras do rotor, usando de precaução para minimizar a re-mistura do sobrenadante e sedimento. 11. Destape o primeiro tubo e decante o sobrenadante para o recipiente de desperdícios líquidos na BSC. Use um movimento de inversão suave e termine com um movimento brusco descendente do tubo invertido. Nota: O sedimento pode desprender-se no decurso do tempo. Execute os passos 9, 10 e 11 sem demora. 12. Volte a colocar firmemente a tampa e coloque o tubo no Suporte para Tubos de Amostra de 2 ml. 13. Repita os passos 11 e 12 para todas as amostras. 14. MUDE DE LUVAS. 4

5 C.1. Aquecimento da amostra Forno BD ProbeTec ET. NotAs: Certifique-se de que os tubos de amostra estão firmemente tapados. Antes de aquecer as amostras no forno, inspeccione visualmente as tampas dos Tubos de Amostra para confirmar que os anéis em O estão correctamente assentes. Se o anel em O parecer distorcido ou estiver ausente, substitua por uma nova tampa. Consulte o Manual do Utilizador do Sistema BD ProbeTec ET para instruções de funcionamento completas, incluindo precauções e advertências relevantes. 1. Coloque o Suporte para Tubos de Amostra de 2 ml no forno e feche a porta. 2. Seleccione RUN #01 (EXECUTAR #01). prima OK. 3. Prima START (INICIAR) para inicializar a execução. 4. Quando o ciclo de aquecimento se iniciar, execute os seguintes passos: a. Prepare o Banho Sónico BD ProbeTec ET. Este inclui: (1) Coloque o insersor do Banho Sónico no banho. (2) Encha o Banho Sónico até à linha indicadora de Máximo com água corrente quente. (NOTA: Não se deve utilizar água desionizada.) (3) Defina a temperatura para 65 C e ligue o aquecedor. (4) Funcione com os ultrassons durante 60 min (predefinição) com a tampa do banho sónico colocada. b. Fixe o rotor padrão na microcentrifugadora. 5. Decorridos 15 minutos de ciclo de aquecimento, verifique e registe o termómetro externo do forno para se certificar que a temperatura é 95 C. 6. No final do ciclo de aquecimento do forno, será ouvido um apito e o LCD irá indicar que a execução terminou (DONE). Liberte o trinco da porta premino a tecla OPEN DOOR (ABRIR PORTA) e retire o Suporte para Tubos de Amostra de 2 ml. Nota: Qualquer micobactéria presente nos Tubos de Amostra é agora inviável e as manipulações subsequentes podem ocorrer fora da BSC. As amostras devem continuar a ser tratadas como representando um potencial risco biológico. C.2. Aquecimento de Amostras - Forno de Laboratorial de Utilização Geral NOTAS: Certifique-se de que os tubos de amostra estão firmemente tapados. Antes de aquecer as amostras na estufa, inspeccione visualmente as tampas dos Tubos de Amostra para confirmar que os anéis em O estão correctamente assentes. Se o anel em O parecer distorcido ou estiver ausente, substitua por uma nova tampa. Consulte o manual do utilizador do forno para instruções de funcionamento completas, incluindo precauções e advertências relevantes. 1. Coloque o Suporte para Tubos de Amostra de 2 ml na estufa e feche a porta. 2. A temperatura da amostra deve atingir 101 C ± 1 C por um mínimo de 30 min e um máximo de 35 min. Siga as instruções de tempo e temperatura de incubação adequadas. 3. Enquanto as amostras estão a ser aquecidas no forno, efectue os seguintes passos: a. Prepare o Banho Sónico BD ProbeTec ET. Este inclui: (1) Coloque o insersor do Banho Sónico no banho. (2) Encha o Banho Sónico até à linha indicadora de Máximo com água corrente quente. (NOTA: Não se deve utilizar água desionizada.) (3) Defina a temperatura para 65 C e ligue o aquecedor. (4) Funcione com os ultrassons durante 60 min (predefinição) com a tampa do banho sónico colocada. b. Fixe o rotor padrão na microcentrifugadora. 4. Concluído o ciclo de aquecimento do forno, retire o Suporte para Tubos de Amostra de 2 ml. ADVERTÊNCIA: Não manuseie o Suporte de Amostras quentes sem o Equipamento de Protecção Pessoal (EPP). A falha em efectuar esta acção pode causar queimaduras. NOTA: Qualquer microbactéria presente nos Tubos de Amostra é agora inviável e as manipulações subsequentes podem ocorrer fora da BSC. As amostras devem continuar a ser tratadas como representando um potencial risco biológico. D. Amostra de Lise - Banho Sónico BD ProbeTec ET ADVERTÊNCIA: Não coloque os dedos nem as mãos no banho sónico quando os ultra-sons estiverem ligados (ON). Se o fizer poderá sentir desconforto e, possivelmente, irritação cutânea. Também poderão ocorrer lesões nos tecidos moles a longo prazo. ADVERTÊNCIA: Não use um termómetro de mercúrio para verificar a temperatura do Banho Sónico. Para esta finalidade, é fornecido um termómetro digital. NOTA: Consulte o Manual do Utilizador do Sistema BD ProbeTec ET para instruções de funcionamento completas, incluindo precauções e advertências relevantes. 1. Coloque os Tubos de Amostra na microcentrifugadora com o rotor padrão. 2. Feche a tampa e pulse a centrífuga durante 10 sec. 3. Retire os tubos da centrífuga e examine os tampas dos tubos relativamente à presença de condensação. Se observar condensação, repita a centrifugação. 4. Volte a colocar os tubos no Suporte para Tubos de Amostra de 2 ml. 5

6 5. Retire a tampa do primeiro tubo. Utilizando uma pipeta com ponta resistente a aerossóis, dispense 100 µl de Tampão de Lise 2 DTB no tubo. Volte a colocar e aperte a tampa do tubo de amostra. 6. Repita para todas as amostras utilizando uma nova ponta para cada amostra. 7. MUDE DE LUVAS. 8. Leve todos os tubos ao vortex durante 5 sec. À medida que os tubos são colocados novamente no Suporte para Tubos de Amostra de 2 ml, assegure-se de que os tubos estão firmemente tapados e empurre o tubo de forma a que a margem do tubo fique assente na ranhura do suporte. Tal orienta correctamente os tubos para máxima exposição à energia ultra-sónica. 9. Desligue os ultrassons (OFF) e confirme que o nível de água fica entre as linhas indicadoras Mínimo e Máximo do insersor do Banho Sónico. Retire ou adicione água corrente quente conforme for necessário. Verifique a temperatura do banho sónico com o termómetro digital para garantir que a temperatura é de 65 ± 5 C. Retire o termómetro do banho. 10. Transfira a Suporte para Tubos de Amostra de 2 ml para o Insersor do Banho Sónico. Volte a colocar a tampa do banho sónico. 11. Defina o cronómetro do banho sónico para 45 min, ligue os ultrassons. 12. No final da aplicação de ultrassons, desligue o banho sónico e retire o Suporte para Tubos de Amostra de 2 ml. Coloque o suporte em folhas de papel absorvente para secar. E. Neutralização da Amostra 1. Coloque os Tubos de Amostra na microcentrifugadora com o rotor padrão. 2. Feche a tampa e pulse a centrífuga durante 10 sec. 3. Retire os tubos da centrífuga e examine os tampas dos tubos relativamente à presença de condensação. Se observar condensação, repita a centrifugação. 4. Coloque os tubos no Suporte de Pipetagem Transparente. 5. Retire a tampa do primeiro tubo. Utilizando uma pipeta com ponta resistente a aerossóis, dispense 600 µl de Tampão de Neutralização 3 DTB no tubo. Volte a colocar e aperte a tampa do tubo de amostra. 6. Repita para todas as amostras utilizando uma nova ponta para cada tubo. 7. MUDE DE LUVAS. 8. Agite todos os tubos no vortex durante 5 sec. 9. Centrifugue os tubos seguindo os passos 1 3, em cima. 10. Coloque novamente os tubos no Suporte de Pipetagem Transparente. 11. As amostras processadas estão agora prontas para serem testadas no Sistema BD ProbeTec ET. NOTA: Se o teste não for efectuado de imediato, as amostras processadas podem ser armazenadas da seguinte forma: a) A C durante um período máximo de 12 h. b) A 2 8 C durante um período máximo de 4 dias. As amostras devem ser reaquecidas no forno BD ProbeTec ET ou forno de laboratório de utilização geral capaz de aquecer a amostra até 101 C ± 1 C durante um mínimo de 30 min e um máximo de 35 min, antes de serem testadas. c) Congeladas a -20 C ou temperatura inferior (sem ciclismo) durante um período máximo de 3 meses. As amostras congeladas devem ser descongeladas à temperatura ambiente e reaquecidas no forno BD ProbeTec ET ou forno de laboratório de utilização geral capaz de aquecer a amostra até 101 C ± 1 C durante um mínimo de 30 min e um máximo de 35 min, antes de serem testadas. d) Depois dos tubos serem reaquecidos (nos passos b e c, acima) coloque os tubos na microcentrifugadora utilizando o rotor padrão. Feche a tampa e centrifugue durante 10 sec. Retire os tubos da centrífuga e examine as tampas dos tubos relativamente à presença de condensação. Se observar condensação, repita a centrifugação. Coloque os tubos no Suporte de Pipetagem Transparente. As amostras estão agora prontas para serem testadas no Sistema BD ProbeTec ET. PROCEDIMENTO DE TESTE A. Preparação do Aparelho 1. Ligue o aparelho e deixe aquecer antes de iniciar o ensaio. a. O aquecedor para inicialização e aquecimento requer aproximadamente 90 min para aquecimento e estabilização. A temperatura definida para o componente de inicialização do aquecedor para inicialização e aquecimento é de 72,5 C. A temperatura definida para o componente de aquecimento do aquecedor para inicialização e aquecimento é de 54 C. b. O aparelho BD ProbeTec ET é controlado por software e requer, aproximadamente, 30 min para aquecer. 2. As temperaturas dos Fornos de Inicialização e Aquecimento têm de ser verificadas antes de se iniciar o teste. A temperatura indicada no termómetro do Forno de Inicialização tem de estar situada no intervalo C. A temperatura indicada no termómetro do Forno de Aquecimento tem de estar situada no intervalo 53,5 54,5 C. 3. Verificar a temperatura apresentada no ecrã do BD ProbeTec ET. A temperatura deve situar-se entre 47,5 e 55 C. B. Pipetador BD ProbeTec ET Consulte o Manual de Operação do Sistema BD ProbeTec ET sobre a explicação pormenorizada das funções do teclado do Pipetador BD ProbeTec ET. 6

7 Para efectuar o ensaio DTB são necessários os seguintes programas: O Programa 1 transfere líquido das amostras processadas para os Micropoços de Inicialização. O programa 5 transfere líquido dos micropoços de inicialização para os micropoços de amplificação. Programar o pipetador do seguinte modo: Programa 1: 1. Ligue o pipetador (posição ON). O pipetador irá emitir um sinal sonoro, mostrar rapidamente ZERO, mostrar rapidamente o n. de versão do software e, por fim, emitirá novo sinal sonoro. 2. Prima a tecla azul Prog (Programa). Prima a tecla Vol (Volume), até ser exibido 1, para seleccionar o programa 1. Prima Enter. 3. Para entrar no modo de programação, prima e mantenha premida a tecla Prog. Mantendo a tecla Prog premida, prima em simultâneo a tecla de função especial com uma ponta de pipeta ou a extremidade de um clipe de papel. 4. Prima Fill. Premir a seta de direcção para cima, até aparecer 200. Prima Enter. 5. Prima Disp (Dispensar). Premir a tecla com a seta para cima, até aparecer 150. Prima Enter. 6. Prima Purge. (Purgar) Prima Enter. 7. Prima novamente Enter, para guardar o programa e sair. Será emitido um sinal sonoro para indicar que a programação foi concluída. 8. Verifique o programa, premindo o gatilho para avançar para a acção seguinte. À medida que efectua cada um dos passos, estabeleça a velocidade de aspiração/distribuição utilizando a tecla Vol. O indicador de Velocidade aparece em cada acção. Utilize a tecla Vol para regular o indicador de velocidade, de forma a mostrar 2 quadrados para os passos Encher e Distribuir e 3 quadrados para o passo de Purgar. Programa 5 1. Prima a tecla Prog. Prima a tecla Vol, até ser exibido 5, para seleccionar o programa 5. Prima Enter. 2. Para entrar no modo de programação, prima e mantenha premida a tecla Prog. Mantendo a tecla Prog premida, prima em simultâneo a tecla de função especial com uma ponta de pipeta ou a extremidade de um clipe de papel. 3. Prima Fill. Premir a seta de direcção para cima, até aparecer 100. Prima Enter. 4. Prima Disp. Premir a tecla com a seta para cima, até aparecer 100. Prima Enter. 5. Prima Mix (Misturar). Premir a tecla com a seta para cima, até aparecer 50. Prima Enter. 6. Prima novamente Enter, para guardar o programa e sair. Será emitido um sinal sonoro para indicar que a programação foi concluída. 7. Verifique o programa, premindo o gatilho para avançar para a acção seguinte. À medida que efectua cada uma dos passos, estabeleça a velocidade de aspiração/distribuição/mistura utilizando a tecla Vol. O indicador de Velocidade aparece em cada acção. Utilize a tecla Vol para ajustar o indicador de velocidade, de forma a mostrar 2 quadrados para as funções de aspiração e distribuição. Utilize a tecla Vol para regular a velocidade de mistura, de forma a serem mostrados 3 quadrados. Revisão do Programa Os programas devem ser revistos antes de se iniciar o procedimento. Para rever os programas, LIGUE o pipetador. Prima a tecla azul Prog. Prima a tecla Vol (Volume) até ser exibido o número indicando de programa a rever. Prima a tecla Enter. Utilize o gatilho de pipetagem para avançar uma acção de cada vez no programa. Programa 1: Este programa aspira 200 µl e distribui 150 µl. O visor do pipetador deve apresentar a seguinte leitura: Fill 200 µl S II Dispense 150 µl S II Purga S III Reveja o programa 5 da mesma forma: Programa 5: Este programa aspira 100 µl, dispensa 100 µl e mistura 50 µl três vezes. O visor do pipetador deve apresentar a seguinte leitura: Fill 100 µl S II Dispense 100 µl S II Mix 50 µl S III Zero (intermitente) C. Configuração da Placa O Relatório de Configuração da Placa é criado pelo aparelho BD ProbeTec a seguir ao tipo ou tipos de teste, à identificação da amostra e aos números de controlo dos lotes, sendo os números de lote dos conjuntos registados no sistema. O Relatório de Configuração da Placa mostra a configuração física das amostras e controlos de cada placa a testar. Esta orientação aplica-se à placa do Micropoço de Inicialização e à placa do Micropoço de Amplificação. Para o Ensaio DTB, os Micropoços de Inicialização são faixas de micropoços em laranja compacto. Os micropoços de amplificação são tiras de micropoços com riscas laranjas. D. Preparação dos Controlos do Ensaio Nota: Os Controlos BD ProbeTec ET DTB, Tampão de Lise 2 DTB e Tampão de Neutralização 3 DTB devem estar à temperatura ambiente antes da utilização. Use tampões que tenham sido previamente objecto de alíquotas para o processamento de amostra. Misture bem antes de utilizar. 7

8 1. Para cada série de tubos (placa) a ser testada, prepare um tubo de Controlo Negativo DTB e um tubo de Controlo Positivo DTB. Se uma placa contiver mais de um número de lote da embalagem de reagente DTB, os controlos devem ser testados com cada lote. 2. Retire a tampa do tubo de controlo negativo: a. Utilizando uma nova ponta de pipeta, dispense 100 µl de Tampão de Lise 2 DTB. b. Utilizando uma nova ponta de pipeta, dispense 600 µl de Tampão de Neutralização 3 DTB. 3. Volte a tapar firmemente o tubo e agite no vortex durante 5 sec. 4. Retire a tampa do tubo de controlo positivo: a. Utilizando uma nova ponta de pipeta, dispense 100 µl de Tampão de Lise 2 DTB. b. Utilizando uma nova ponta de pipeta, dispense 600 µl de Tampão de Neutralização 3 DTB. 5. Volte a tapar firmemente o tubo e agite no vortex durante 5 sec. 6. Coloque os tubos de controlo na microcentrifugadora com o rotor padrão. Feche a tampa e pulse a centrífuga durante 10 segundos. Retire os tubos do centrifugador e coloque no Suporte de Pipetagem transparente. E. Procedimento de Teste 1. Retire e descarte as tampas dos tubos de amostra e controlos para a primeira série. 2. MUDE DE LUVAS. 3. Utilizando o Relatório de Disposição da Placa como orientação, prepare a placa do Micropoço de Inicialização. 4. Volte a selar a bolsa do Micropoço de Inicialização, conforme indicado a seguir. a. Coloque a bolsa numa superfície plana. Segure horizontalmente o lado aberto com uma das mãos. b. Exercendo pressão, deslize um dedo pela parte exterior do selo, de uma extremidade da bolsa até à outra. c. Inspeccione para verificar se a bolsa está selada. 5. Seleccione o Programa 1 no Pipetador BD ProbeTec ET. 6. Adapte as pontas de pipetas. Expanda o pipetador, puxando totalmente o botão de afastamento. NOTA: Verifique se as pontas estão firmemente adaptadas no pipetador, para evitar fugas. Nota: Quando aspirar amostras, evite cuidadosamente escombros esféricos que podem entupir as pontas das pipetas e afectar os resultados do teste. 7. Aspire 200 µl da primeira coluna de amostras. 8. Colapse suavemente o pipetador, toque com as pontas das pipetas nas paredes laterais do poço e distribua 150 µl na primeira coluna de micropoços de inicialização (1A-H). Nota: A distribuição de líquidos contra a parede interior dos micropoços é importante para garantir exactidão e precisão e para evitar contaminação cruzada. 9. Descarte as pontas. Prima o gatilho de pipetagem para rearmar o pipetador. 10. Escolha novas pontas, desenrole o pipetador e aspire 200 µl da segunda coluna de amostras. 11. Colapse suavemente o pipetador, toque com as pontas das pipetas nas paredes laterais do poço e distribua 150 µl na segunda coluna de micropoços de inicialização (2 A-H). NOTA: Não aperte o pipetador sobre as amostras ou os micropoços, para evitar a contaminação. Os movimentos bruscos podem dar origem a salpicos ou aerossóis. 12. Descarte as pontas. NOTA: Elimine as pontas com cuidado para evitar a ocorrência de derrames ou gotículas que possam contaminar a área de trabalho. 13. Continue a transferir as outras amostras da série. 14. Tape a placa de micropoços de inicialização com a cobertura de placa de inicialização e deixe a placa incubar à temperatura ambiente durante, pelo menos, 20 min. (Pode incubar até 6 h.) NOTA: Tape as amostras processadas com tampas novas. MUDE DE LUVAS. 15. No fim da incubação de Inicialização, prepare a Placa de Micropoços de Amplificação. Configure os micropoços de amplificação na placa para corresponderem ao Relatório de Disposição da Placa (igual à placa de inicialização). Sele novamente a bolsa do Micropoço de Amplificação conforme descrito no passo Retire a tampa da placa de Micropoços de Inicialização e transfira a placa para o Forno de Inicialização. Coloque IMEDIATAMENTE a placa de micropoços de amplificação no aquecedor para aquecimento. 17. Regule o temporizador para 10 min (NOTA: O tempo neste passo é fundamental.) 18. No fim do período de incubação de 10 min (+/- 1 min), seleccione o programa 5 no pipetador. 19. Adapte imediatamente novas pontas de pipeta e transfira 100 µl da 1 coluna da placa de micropoços de inicialização para a 1 coluna da placa de micropoços de amplificação. Encoste as pontas de pipeta às paredes dos poços e dispensar o líquido. Após a distribuição, deixe o pipetador misturar automaticamente o líquido dos poços. 20. Descarte as pontas. Adapte novas pontas e continue a transferir a mistura da reacção dos micropoços de inicialização para os micropoços de amplificação, coluna a coluna, utilizando pontas novas para cada coluna. 8

9 21. Quando a última coluna tiver sido transferida, retire o apoio de um vedante de Amplificação. (Um Vedante de Amplificação [1/2] irá cobrir um máximo de 6 colunas; se a placa tiver mais do que 6 colunas, TEM de ser utilizada uma folha inteira de vedante). Segurar o vedante pelos bordos e aplicá-lo sobre os micropoços. Use as guias do Forno de Aquecimento como auxiliares na aplicação do vedante. Exercer pressão sobre o vedante para garantir que todos os micropoços ficam totalmente vedados. 22. Na interface do utilizador do BD ProbeTec ET, desloque o transportador para fora, abra a porta e levante a tampa da placa. Transfera IMEDIATAMENTE (no espaço de 30 sec) a placa de Micropoços de Amplificação selada para o Aparelho BD ProbeTec ET e inicie a série. (Para mais informações, consultar o Manual de Operação do Sistema BD ProbeTec ET). 23. Depois de iniciar a análise, complete a fase do procedimento de limpeza descrita a seguir: a. Sele a placa de Micropoços de Inicialização com um selador de amplificação e retire a placa do aquecedor para inicialização e aquecimento. (use a luva resistente ao calor para retirar a placa a temperatura é superior a 70 C). b. Deixe arrefecer a placa em cima da bancada durante 5 min. Elimine os Micropoços de Inicialização num recipiente próprio para resíduos de contaminantes biológicos perigosos. c. Limpe a placa de metal: Lave a placa com solução de hipoclorito de sódio a 1% (v/v) com Alconox. Lave a placa com água destilada ou desionizada. Envolva a placa numa toalha limpa e deixe secar completamente ao ar, antes de voltar a utilizar. 24. Quando a análise estiver concluída, será elaborada uma cópia impressa dos resultados do teste. 25. Retire da plataforma o transportador da placa, abra a porta e retire a placa. Feche a porta e coloque a plataforma da placa novamente dentro do aparelho. 26. Retire os micropoços de amplificação selados da placa. Cuidado: Não retire o material de selagem dos micropoços. Os micropoços selados podem ser facilmente retirados como uma unidade, segurando o selo em cima e em baixo e levantando a direito, para fora da placa. Colocar os micropoços selados no Saco de Eliminação. Selar o saco. 27. Limpe a placa de metal: Lave a placa com solução de hipoclorito de sódio a 1% (v/v) com Alconox. Lave a placa com água destilada ou desionizada. Envolva a placa numa toalha limpa e deixe secar completamente ao ar, antes de voltar a utilizar. 28. Após a última análise do dia, execute os seguintes procedimentos de limpeza: a. Limpe as bancadas com solução de hipoclorito de sódio a 1% (v/v) com Alconox. Deixe que a solução permaneça nas superfícies de trabalho durante 2 a 3 min, depois limpe com água destilada ou desionizada. b. Limpe a Suporte do Suporte de Tubos de Amostra e Suporte de Pipetagem Transparente mergulhando em hipoclorito de sódio a 1% (v/v) com Alconox durante menos de 60 sec. Lave minuciosamente com água destilada ou desionizada e deixe secar ao ar. c. Limpe as superfícies exteriores do Forno de Aquecimento e Inicialização e do Aparelho BD ProbeTec ET com hipoclorito de sódio a 1% (v/v) com Alconox. Limpe as superfícies com água destilada ou desionizada. d. Limpe a pega do Pipetador (APENAS A PEGA) com solução de hipoclorito de sódio a 1% (v/v) com Alconox. Limpe a pega com água destilada ou desionizada e seqye com um pano limpo. e. Recarregar o Pipetador. f. Descartar o Saco de Eliminação e o lixo que represente perigo biológico, de acordo com os procedimentos para eliminação de material contaminado. Controlo de Qualidade O BD ProbeTec ET DTB Control Set é fornecido em separado. Em cada série de ensaios e para cada novo número de lote do kit de reagentes devem ser incluídos um controlo positivo e um controlo negativo. Os controlos podem estar posicionados ao acaso. O controlo positivo DTB monitoriza falhas de reagente, conclusão dos elementos essenciais do procedimento (pipetagem e incubações), amplificação e detecção. O controlo negativo DTP monitoriza a contaminação de reagentes e/ou ambiental. Os controlos positivo e negativo DTB têm de ser testados, respectivamente, como positivo e negativo, para o relatório de resultados das amostras. Se o desempenho dos controlos não for o esperado, a série do ensaio é considerada inválida e o instrumento não apresenta os resultados do doente. Caso o CQ não atinja os resultados esperados, repita toda a série utilizando um novo conjunto de controlos, novos micropoços e amostras processadas. Se a repetição do CQ não apresentar os resultados esperados, contacte os Serviços Técnicos (consultar Interpretação dos resultados ). Consulte a secção D de PROCEDIMENTO DO TESTE, para obter instruções sobre a preparação de controlos. Após a preparação dos controlos, prossiga com os testes, conforme descrito na secção E de PROCEDIMENTO DO TESTE. Um Controlo de Amplificação Interno (IAC) está incorporado no Micropoço de Inicialização. O IAC contém o ácido nucleico pretendido, que é amplificado na presença da matriz da amostra. O IAC destina-se a confirmar a validade da reacção de amplificação e identificar a potencial inibição da amostra processada. 9

10 Controlo do Processamento da Amostra: Para testar a eficácia do processamento da amostra, deve ser testado por rotina um controlo do procedimento, em conformidade com as regulamentações locais. O controlo do procedimento consiste numa suspensão de M. tuberculosis (como, por exemplo, Colheita de Cultura do Tipo Americano, H37Ra ATCC 25177). A suspensão deve ser preparada da seguinte forma: 1. Prepare uma suspensão de McFarland Nº 1 do microrganismo. 2. Dilua a suspensão de McFarland a 1:100 em Albumina Bovina (Fração V), (por exemplo, pipete 0,1 ml de suspensão de McFarland em 9,9 ml de Albumina Bovina e homogeneíze totalmente). 3. Alíquotas de 1,0 ml podem ser congeladas a -20 C ou a temperatura inferior (sem ciclismo). 4. A suspensão de células deve ser preparada como uma amostra de rotina para teste no sistema BD ProbeTec ET. Monitorização da Presença de Contaminação por ADN: Antes da primeira execução do ensaio BD ProbeTec ET DTB e pelo menos uma vez por mês, deverá efectuar o procedimento de teste descrito em seguida, de forma a monitorizar a área de trabalho e as superfícies do equipamento em relação à contaminação com ADN. A monitorização ambiental é essencial para detectar a contaminação antes que se desenvolva um problema. 1. Use uma zaragatoa CultureSwab EZ para cada área a testar*. 2. Rotule um Tubo de Amostra por cada área a monitorizar com zaragatoa e pipete 100 µl de Tampão de Lise 2 e 600 µl de Tampão de Neutralização 3 DTB para cada tubo. 3. Mergulhe a primeira zaragatoa no tampão de mistura do Tubo de Amostra e limpe a primeira área com um movimento de limpeza amplo. 4. Misture a zaragatoa na mistura tampão, aperte a zaragatoa, tape novamente o tubo e leve ao vortex durante 5 sec. Descarte as zaragatoas. 5. Repita o processo em todas as áreas. 6. Coloque os tubos no Suporte de Tubo de Amostra e aqueça no forno (secção C do PROCEDIMENTO DE PREPARAC A O DA AMOSTRA). 7. Enquanto os tubos estão a incubar, remova a mistura tampão das superfícies tratadas, utilizando toalhetes limpos embebidos em água. 8. Depois de aquecer, coloque os tubos na microcentrifugadora com o rotor padrão, feche a tampa e rode com pulsos durante 10 sec. 9. Retire os tubos da centrífuga e examine os tampas relativamente à presença de condensação. Se observar condensação, repita a centrifugação. 10. Coloque os tubos no Suporte de Pipetagem Transparente e prossiga para o PROCEDIMENTO DE TESTE. * Áreas a testar recomendadas: superfície do forno, banho sónico, Suporte para Tubos de Amostra de 2 ml, Suporte de Pipetagem Transparente, Aquecedor de Inicialização e e Aquecimento, placas do micropoço negro, pega do pipetador, teclas de toque do instrumento, teclado do instrumento e bancada de trabalho. Se uma área produzir um resultado positivo, limpá-la com hipocloreto de sódio a 1% (v/v) em Alconox. Humedeça toda a área com a solução de lixívia e deixe a solução de lixívia permanecer na superfície durante, pelo menos, 2 min ou até secar. Se necessário, remova o excesso de solução de lixívia com um toalhete limpo. Limpe a área com um toalhete limpo embebido em água destilada ou desionizada e deixe secar a superfície. Teste novamente a área. Repita até obter resultados negativos. Se a contaminação não for resolvida, contacte os Serviços Técnicos para mais informações. INTERPRETAÇÃO DE RESULTADOS Resultado do Ensaio DTB Positivo Negativo Indeterminado Relatório Recomendado O ensaio de sonda é positivo para a presença de ADN do complexo M. tuberculosis. Cultura AFB pendente. O ensaio de sonda é negativo para a presença de ADN do complexo M. tuberculosis. Cultura AFB pendente. Repira o ensaio de sonda a partir da amostra processada. Se for positivo ou negativo, utilize a afirmação adequada descrita em cima. Se ainda for indeterminado, relate como O resultado do ensaio de sonda inicial e repetido é indeterminado. Por favor, envie uma nova amostra para testar. Cultura AFB pendente. LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO 1. Este método só foi testado com amostras respiratórias tais como expectoração (induzida ou expectorada), lavados brônquioaveolares e aspirados brônquicos e traqueais. Não foi avaliado o desempenho com outras amostras. 2. Um resultado negativo não exclui a possibilidade de existir uma concentração do microrganismo alvo abaixo da sensibilidade do teste. 3. à semelhança do que acontece com outros testes de diagnóstico, os resultados obtidos com o ensaio DTB devem ser interpretados juntamente com outros dados laboratoriais e clínicos a que o médico tenha acesso. 4. O Ensaio DTB não distingue entre membros do complexo M. tuberculosis complex M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum e M. microti. 5. Um desempenho ideal deste teste requer a colheita e manipulação adequadas das amostras. 6. Devem seguir-se as condições de centrifugação especificadas, dado que uma centrifugação insuficiente pode dar origem a resultados falsos negativos. 10

11 7. O Ensaio DTB não detecta variantes do complexo M. tuberculosis que não possuam a sequência de inserção IS A utilização do ensaio DTB está limitada a pessoas com formação adequada sobre o procedimento de ensaio e sobre o Sistema BD ProbeTec ET. 9. O ensaio DTB não pode ser utilizado para avaliar o sucesso ou falha de terapêutica, uma vez que os ácidos nucleicos de microrganismos do complexo Mycobacterium tuberculosis podem persistir após terapêutica antimicrobiana. 10. O ensaio DTB não se destina a substituir a cultura para fins de teste de sensibilidade antimicrobiana. 11. O Ensaio DTB faculta resultados qualitativos. Não pode ser estabelecida nenhuma correlação entre a grandeza do valor MOTA e o número de células numa amostra positiva. 12. A sequência de sonda do complexo M. tuberculosis, IS6110, é específica para M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum e M. microti. 13. O Ensaio DTB irá detectar variantes de espécies de micobactérias não tuberculosas que possam conter a sequência IS O valor preditivo de um ensaio depende da prevalência da doença numa determinada população. 15. O efeito de outras variáveis potenciais tais como a terapêutica antimicrobiana ou amostras co-infectadas não está determinado. 16. Se estiver a utilizar um forno de laboratório de utilização geral, certifique-se de que o líquido existente nos tubos de amostra atinge uma temperatura de 101 C ± 1 C durante, pelo menos, 30 min para tornar inviável qualquer microbactéria presente nos tubos. RESULTADOS ESPERADOS Foram testadas com o BD ProbeTec ET DTB um total de 1157 amostras colhidas de 986 doentes em dois locais geográficos distintos de estudo clínico. A distribuição da frequência dos valores MOTA iniciais é mostrada na Figura 1. Os resultados do BD ProbeTec ET DTB são apresentados em comparação com resultados de esfregaço TB de referência e de bacilos ácido-rápidos (AFB). Um resultados de referência de TB foi baseado num resultado de cultura micobacteriana ou no diagnóstico do doente com base na revisão do processo clínico. A presença ou ausência de complexo Mycobacterium tuberculosis é determinada relacionando os resultados de BD ProbeTec ET DTB MOTA para as amostras com valores limite pré-determinados. O resultado MOTA é utilizado para avaliar a grandeza do sinal produzido em resultado da reacção. A grandeza do resultado MOTA não constitui uma indicação do nível de organismo presente na amostra. Todos os cálculos são efectuados automaticamente pelo software do instrumento. As amostras testadas nos dois locais foram identificadas pelo BD ProbeTec ET como positivas, negativas ou indeterminadas. Foi apenas uma amostra que produziu um resultado indeterminado no teste original. Esta amostra resolveu como negativa quando repetida. Figura 1: Distribuição de Frequência dos Valores MOTA DTB Frequência < Referência TB (-) ReferênciaTB (+) DTB MOTA Resultado de Esfregaço e Referência TB Esfregaço (+) TB (+) Esfregaço (+) TB ( ) Esfregaço ( ) TB (+) Esfregaço ( ) TB ( )