INFLUÊNCIA DA FLORA DE EXCLUSÃO COMPETITIVA SOBRE O PH DO PAPO DE FRANGOS DE CORTE

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1 0 INFLUÊNCIA DA FLORA DE EXCLUSÃO COMPETITIVA SOBRE O PH DO PAPO DE FRANGOS DE CORTE PATRÍCIA SOARES¹, EURÍPEDES VILELA DA SILVA², BERNARDO REZENDE CARVALHO 3, DAISE APARECIDA ROSSI 4, PAULO LOURENÇO DA SILVA 5 RESUMO O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da suplementação de frangos de corte com probiótico contendo Lactobacillus plantarium, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus acidofillus, Lactobacillus ruminosus, Enterococcus faecium, Bifidobacterium bifidum e Estreptococcus thermofilusna sobre o ph do papo. Foram utilizados 120 frangos de corte, sendo 60 animais suplementados com o probiótico e 60 animais sem suplementação, sendo este o grupo controle. Todas as aves tratadas e controles receberam ração à vontade até 28 dias de idade, sendo os tratamentos avaliados em diferentes idades (1 dia, 7, 12, 18, 23 e 28 dias) para a contagem de enterobactérias, lactobacilos e Clostridium sp. e aferição do ph do papo. Os resultados permitem concluir que a adição de probiótico na ração levou a uma diferença significativa no ph do papo dos animais e pode ser utilizado no tratamento preventivo à infecções bacterianas. O controle de enterobactérias observado pode ser um indício da exclusão competitiva realizada pelas bactérias lácticas, inibindo o crescimento das enterobactérias presentes no trato gastrintestinal. Não foi evidenciado o controle efetivo da população de Clostridium sp. nas condições em que foi realizado este estudo. PALAVRAS-CHAVE: Clostridium sp., enterobactérias, frangos de corte, ph do papo, probióticos. 1 Bolsista CNPq/UFU, acadêmica do curso de Medicina Veterinária FAMEV-UFU, Rua Tupaciguara, 455. B.Aparecida, Uberlândia-MG, CEP Endereço eletrônico: psoares.vet@hotmail.com 2 Acadêmico do curso de Medicina Veterinária FAMEV-UFU. Endereço eletrônico: eurípedes_vilela@hotmail.com. 3 Médico Veterinário Perdigão S/A - Endereço eletrônico: bernardo_vet@yahoo.com.br 4 Coordenadora do Laboratório de Biotecnologia Animal Aplicada FAMEV-UFU Endereço eletrônico: daiser@umuaram.ufu.br. 5 Orientador/Professor da Faculdade de Medicina Veterinária FAMEV UFU - Endereço eletrônico: plsilva@umuarama.ufu.br

2 1 INFLUENCE OF THE COMPETITIVE EXCLUSION FLORA IN ph THE CROP OF BROILERS CHICKEN PATRÍCIA SOARES ¹, EURÍPEDES VILELA DA SILVA ², BERNARDO REZENDE CARVALHO 3, DAISE APARECIDA ROSSI 4, PAULO LOURENÇO DA SILVA 5. ABSTRACT The objective of this study was to evaluate the effect of supplementation of broilers with containing probiotic Lactobacillus plantarium, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus acidofillus, Lactobacillus ruminosus, Enterococcus faecium, Bifidobacterium bifidum and Estreptococcus thermofilusna on the ph of the crop. It was used 120 broiler chickens, 60 animals supplemented with the probiotic and 60 animals without supplementation, which is the control group. All birds were treated and controls at will feed up to 28 days old, the treatments being evaluated at different ages (1 day, 7, 12, 18, 23 and 28 days) for the counting of enterobacteria, lactobacilli and Clostridium sp. and measuring the ph of the crop. The results show that the addition of the probiotic feed led to a significant difference in ph of the crop of animals and can be used in preventive treatment for bacterial infections. The control of enterobacteria observed may be a sign of competitive exclusion held by lactic acid bacteria, inhibiting the growth of enterobacteria present in the gastrointestinal tract. We were shown the effective control of the population of Clostridium sp. the conditions in which this study was conducted. KEYWORDS: Clostridium sp., enterobacteria, broiler chicken, ph of the crop, probiotic,. 1 INTRODUÇÃO Na atividade avícola, a produção de ovos férteis e a eclosão das aves, em escala industrial, são realizadas de forma a reduzir, ao máximo, as contaminações por microrganismos. Essa ausência de contato do pintainho com uma microbiota natural interfere no desenvolvimento intestinal e no crescimento da ave (Silva, 2000). A pouca diversidade da microflora intestinal de aves recém-nascidas, além de ser considerada como um fator limitante para a digestão, também possibilita a colonização intestinal por patógenos entéricos. O efeito negativo desse processo tem sido

3 2 contornado, em parte, com o uso de promotores de crescimento, os quais tem sido responsáveis pela melhoria na produtividade animal, especialmente nos períodos iniciais de criação (Lorençon et. al., 2007). Entre os aditivos mais empregados para promover o crescimento estão os antibióticos. No entanto, o uso indiscriminado dos antibióticos pode resultar no desenvolvimento de populações bacterianas com possível resistência, dificultando assim o seu uso (Fuller, 1989). Além disso, podem quebrar a simbiose entre a microbiota desejável e o animal (Mulder, 1991 apud Furlan et. al., 2004). Os problemas supracitados instigam os pesquisadores na busca por alternativas que propiciem o controle dos microorganismos patogênicos sem, no entanto, provocar uma queda no desempenho do animal ( Furlan et. al., 2004). Langhout (2005) relata que a simples retirada dos antibióticos promotores de crescimento da dieta de frangos leva a uma diminuição média no desempenho das aves de 3% a 7%. Havendo ainda, um impacto negativo sobre a saúde animal e um acréscimo na mortalidade. Ainda que se discuta a relevância prática destes estudos, há um consenso geral de que a proibição total dos antibióticos promotores de crescimento resulte em menor lucratividade para o setor. Para que se possam ter dietas sem o uso de promotores de crescimento, faz-se necessário a introdução de novas estratégias visando contornar os efeitos negativos sobre o desempenho e a saúde das aves. Assim, algumas alternativas têm surgido para promover o equilíbrio na microbiota intestinal dos frangos, a fim de obter um bom desempenho produtivo sem riscos para a saúde humana (Furlan et. al., 2004). Os probióticos apresentam-se não como substitutos, mas como alternativa aos antibióticos promotores de crescimento (Macari e Furlan, 2005). Probióticos são microorganismos vivos, que geram benefícios quando introduzidos no trato gastrintestinal, competindo com a flora patogênica por nutrientes, locais de adesão no epitélio intestinal e sintetizando metabólitos (ácidos orgânicos, substâncias antibióticas) ou pela redução do ph que criam resistência ao crescimento de organismos patogênicos (Junqueira e Duarte, 2005). Esta competição em que os microorganismos benéficos são favorecidos é importante, pois o desequilíbrio em favor de bactérias indesejáveis pode resultar em infecção intestinal, o que comprometeria a

4 3 digestibilidade da ração, o desenvolvimento animal e ainda favorecer o aumento na mortalidade (Sato et. al., 2002). Os principais reservatórios de microorganismos patogênicos no trato gastrintestinal de frangos são o papo, o intestino e o ceco (Furlan et. al., 2004). Assim sendo, este trabalho teve por objetivo avaliar os efeitos da utilização de uma flora de exclusão competitiva sobre o crescimento de enterobactérias e de Clostridium sp. em frangos de corte verificando a influência desta adição sobre o ph do papo. 2 REVISÃO DE LITERATURA Um dos fatores que contribuíram para a obtenção da alta produtividade apresentada pela indústria avícola foi sem dúvida a utilização de aditivos nas dietas. O termo aditivo inclui todas as substâncias as quais, quando adicionadas às rações, são capazes de melhorar o desempenho animal ou as características físicas dos alimentos (Araújo et. al., 2007). A concepção de que o desenvolvimento de microflora poderia levar a prejuízos em lotes de frangos, seja pela concorrência pelo alimento ou devido a lesões provocadas nos vilos da mucosa intestinal pelas bactérias patogênicas, levou a utilização de aditivos - os antibióticos, os quais foram erroneamente denominados de promotores de crescimento (Furlan et. al., 2004). Entretanto, o uso de antibióticos promotores de crescimento tem sido bastante discutido atualmente (Rutz e Lima, 2001). Há uma forte campanha para banir o uso dos antimicrobianos na produção animal. Esta seria uma medida cautelar embasada na alegação de que as moléculas de alguns desses aditivos apresentam semelhanças com a de antibióticos utilizados na terapêutica humana. Acredita-se que por meio do uso indiscriminado e contínuo dos antibióticos, possa induzir-se, por pressão seletiva, a emergência de bactérias patogênicas multiresistentes a essas drogas (Edqvist & Pedersen, 2002 apud Machado et. al., 2007). A busca por alternativas na alimentação de aves é realidade constante e estudos são necessários para que se possa afirmar até que ponto eles podem ou não ser utilizados, e em que condições e dimensões são realmente viáveis ( Araújo et. al., 2007). Em 1877, Pasteur e Joubert observaram uma atividade antagonista entre diferentes amostras bacterianas, este estudo mostrou que o controle de bactérias patogênicas poderia ser realizado com bactérias não patogênicas. No início do século XX, Metchnikoff (1907) sugeriu que

5 4 bactérias lácticas poderiam ser usadas com o intuito de promover a saúde humana (Pedroso et. al., 2005). Nurmi e Rantala (1973) administraram o conteúdo intestinal de aves adultas normais a pintinhos de 1 a 2 dias de idade e preveniram a colonização intestinal por Salmonella Infantis, ou seja, a administração deste produto permitia uma rápida colonização da mucosa intestinal e aumentava a resistência dos pintinhos a Salmonella spp., este procedimento foi denominado conceito de Nurmi ou Exclusão Competitiva (EC). A princípio, a idéia era só a proteção intestinal contra enteropatógenos sem se verificar o aspecto saúde geral e produtividade animal. Posteriormente, verificou-se que a colonização intestinal por outros patógenos como Escherichia coli e Campylobacter spp., também pode ser prevenida através do uso de probióticos. Na mesma época, outros autores demonstraram, também, que a aplicação de probiótico constituído por Lactobacillus acidophilus melhorava a conversão alimentar e o ganho de peso em aves tratadas (Tortuero, 1973). O princípio da exclusão competitiva baseia-se no fato de que um organismo não pode ocupar o mesmo espaço de outro, portanto impede a entrada de um agente em um ambiente já colonizado (Ferreira e Ferreira, 2006). Os produtos de exclusão competitiva poderiam tornar-se uma alternativa ao uso dos promotores de crescimento, pois é produto natural composto de bactérias que não são nocivas às aves, ao homem e ao meio ambiente, além de não induzir resistência a nenhum medicamento (Ferreira e Ferreira, 2006). Neste sentido, uma das alternativas que tem sido mais exaustivamente avaliada é a utilização de probióticos (Rutz e Lima, 2001). Os probióticos atuam inibindo a proliferação de bactérias patógenas pela produção de ácidos orgânicos e substâncias antibióticas ou pela redução de ph. As bactérias benéficas atuam produzindo enzimas digestivas e metabólitos capazes de neutralizar as toxinas bacterianas; ainda aumentam a imunidade da mucosa intestinal proliferando no trato digestivo e competindo com as bactérias patogênicas (Ferket, 1990). Ewing & Cole (1994) descreveram que os lactobacilos são capazes de influenciar a atividade das enzimas dos microvilos, as quais estão envolvidas no processo de absorção dos nutrientes e, dessa forma, beneficiam o hospedeiro. O termo probiótico foi introduzido por Lilly e Stillwell (1965) para descrever

6 5 substâncias produzidas por um organismo que estimula o crescimento de outros. A definição mais comum utilizada é a de Fuller (1989) que chama probióticos aqueles microrganismos que acrescentados ao alimento afetam beneficamente o balanço microbiano intestinal; sendo então, o efeito primário, sua influência benéfica no ecossistema intestinal produzindo proteção contra as infecções gastrointestinais e doenças inflamatórias do intestino. Independente do conceito utilizado, os probióticos atuam favorecendo a saúde do hospedeiro, não deixa resíduos nos produtos de origem animal e não favorecem a resistência aos antimicrobianos, o que os torna uma excelente alternativa aos antibióticos como aditivos alimentares (Carli, 2002) Os probióticos promovem o equilíbrio da microbiota intestinal e melhoram o ganho de peso e a eficiência alimentar das aves, justamente por competirem com os patógenos no intestino e evitarem lesões nos vilos permitindo a regeneração da mucosa intestinal (Sato et al., 2002). Esta competição em que os microorganismos benéficos são favorecidos é importante, pois o desequilíbrio em favor de bactérias indesejáveis pode resultar em infecção intestinal, o que comprometeria a digestibilidade da ração, o desempenho animal e sua imunidade (Furlan, 2004). Entre os principais modos de ação dos Probióticos, estão: (a) Competição por sítios de ligação; (b) Produção de substâncias antibacterianas e enzimas; (c) Competição por nutrientes; (d) Estímulo do sistema imune, o que está representado no Quadro 1, adaptado de Reynolds (2004). Quadro 1: Possíveis mecanismos de Exclusão Competitiva. Ataque direto Produção de substâncias antimicrobianas, como ácidos orgânicos (acético e lático), o peróxido de hidrogênio e o dióxido de carbono que deixam um ph e/ou um ambiente químico desfavorável às bactérias patogênicas. Competição por nutrientes Competição por receptores Estimulação imune Barreira física Fonte: Reynolds (2004). Competição pelos nutrientes disponíveis no Intestino. A escassez destes nutrientes disponíveis na luz intestinal que possam ser metabolizados pelas bactérias patogênicas é um fator limitante de manutenção das mesmas neste ambiente. Competição pelos locais de ligação nos enterócitos do intestino. As bactérias probióticas ocupam o sítio de ligação na mucosa intestinal formando uma barreira física às bactérias patogênicas. Assim, estas bactérias seriam excluídas por competição de espaço. Do sistema imune não-específico do intestino pela microflora normal. As bactérias probióticas têm a capacidade de modulação de respostas imunes sistêmicas aumentando o número e atividade de células fagocíticas do hospedeiro (Silva, 2000). Bloqueio do acesso bacteriano para a mucosa

7 6 Embora as formas de ação não sejam inteiramente claras, os probióticos são introduzidos na flora intestinal como competidor contra as bactérias patogênicas inibindo suas atividades antagonistas (Mutus et al., 2006). Estes aditivos podem conter bactérias totalmente conhecidas e quantificadas ou culturas bacterianas não conhecidas. Os principais microorganismos bacterianos considerados como probióticos são aqueles dos gêneros Lactobacillus e Bifidobacterium, além de Escherichia, Enterococcus e Bacillus (Morais & Jacob, 2006). As espécies animais para as quais existem produtos comerciais disponíveis são aves, suínos, bovinos, ovinos, eqüinos, cães e gatos. As espécies de bactérias mais comuns utilizadas no preparo dos probióticos são: Lactobacillus bulgaricus, L. acidophilus, L. casei, L. lactis, L. salivarius, L.plantarium, L. reuteri, L. johonsii, Streptococcus thermophilus, Enteroccus faecium, E.faecalis, Bifidobacterium spp, Bacillus subtilis e B. Toyoi (Loddi, 2002). Para uma boa eficiência, devem-se utilizar os probióticos já nos primeiros dias de vida, para que ocorra a exclusão competitiva, principalmente beneficiando um bom equilíbrio entre os microrganismos benéficos e para se obterem, assim, melhores resultados (Lorençon et al., 2007). A microbiota intestinal das aves é composta de inúmeras espécies de bactérias, formando um sistema complexo e dinâmico. Aquelas que colonizam o trato intestinal no início tendem a persistir ao longo da vida da ave, passando a compor a microbiota intestinal (Furlan et. al., 2004). A formação desta microbiota se dá imediatamente após o nascimento das aves e aumenta durante as primeiras semanas de vida (Flemming, 2005). O número e composição dos microorganismos da microflora intestinal das aves variam consideravelmente ao longo do trato gastrintestinal (TGI). No inglúvio (papo) existe a predominância de lactobacilos que, produzindo ácido lático e acético, reduzem o ph impedindo o crescimento de bactérias. O ph no proventrículo e moela é extremamente baixo, e poucas bactérias são capazes de tolerar este ambiente. No duodeno, o ph é neutro e os microorganismos colonizam este segmento do intestino delgado, bem como o jejuno e íleo. O ceco é reconhecido como o segmento de maior colonização de microorganismos, sendo que grande número de bactérias Gram-positivas e negativas estão presentes neste local (Macari e Furlan, 2005).

8 7 De acordo com Menten e Pedroso (2005), as diferenças entre microbiotas do trato intestinal são devidas a alterações de ph, de secreção enzimática da região, da velocidade de trânsito do bolo alimentar a da concentração de ácidos graxos voláteis. Em aves, as bactérias patogênicas atingem o trato digestivo após vencerem a barreira do papo (inglúvio). A existência de um ambiente ácido com ph baixo no papo é muito importante para impedir ou diminuir a colonização de patógenos no trato digestivo. A quantidade alta de Lactobacillus e ph baixo no papo têm mostrado reduzir a ocorrência de Salmonella (Hinton et al., 2000). Esta variada composição da microflora intestinal pode ser tanto benéfica quanto prejudicial para o hospedeiro, dependendo da natureza e da quantidade de microorganismos. Os efeitos prejudiciais seriam: diarréia, infecções, distúrbios hepáticos, carcinogênese, putrefação intestinal, redução da digestão e da absorção de nutrientes. Já os benefícios estariam vinculados à inibição do crescimento de bactérias patogênicas, estímulos ao sistema imune, síntese de vitaminas, redução da produção de gases e melhor digestão e absorção dos nutrientes (Furlan et.al., 2004), benefícios que podem ser introduzidos com a utilização de probióticos na dieta. Por tudo acima citado, embora haja a necessidade de mais pesquisas, os probióticos assumem importância significativa para a avicultura industrial por serem uma excelente alternativa na manutenção da alta produtividade, na melhoria do desempenho animal, no controle de patógenos e na qualidade dos alimentos. 3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Local e Amostragem A coleta das amostras foi realizada em frangos de corte machos, da linhagem Cobb e de uma mesma origem. As aves permaneceram de 1 a 28 dias de idade alojadas na Granja Experimental da Fazenda do Glória da Universidade Federal de Uberlândia, localizada na região do Triângulo Mineiro, no período de junho a julho de As aves eram provenientes de lotes de matrizes de produção comercial de uma empresa avícola localizada na região do Triângulo Mineiro certificada pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e do Abastecimento. No experimento foram utilizadas 120 aves de corte, sendo 60 tratadas e 60 controles, alojadas em gaiolas separadas e identificadas. Cada gaiola albergou 10 aves. Os animais foram alojados 2 horas após

9 8 serem eclodidos em ambiente controlado para temperatura e umidade. 3.2 Estudo os tratamentos avaliados em diferentes idades (1 dia, 7, 12, 18, 23 e 28 dias) Determinação do ph do papo Inoculação de Probiótico nas aves As aves teste receberam ração suplementada com probiótico (contendo Lactobacillus plantarium, L. bulgaricus, L. acidofillus, L. ruminosus, Enterococcus faecium, Bifidobacterium bifidum, Estreptococcus thermofilus ) na dosagem de 1 grama do produto para 6,8 kg de ração farelada. A ração, contendo em sua fórmula básica sorgo e farelo de trigo, foi misturada na própria granja. O probiótico foi pesado em balança analítica de seis (6) dígitos localizada no Laboratório de Biotecnologia Animal da Universidade Federal de Uberlândia (LABIO-UFU). A ração foi pesada na própria granja em balança de alta precisão e calibrada pelo INMETRO. Na granja houve a mistura minuciosa do probiótico à ração. Os animais controle receberam a mesma ração das aves teste, porém sem a presença de probióticos. As rações foram pesadas para verificar o consumo das aves. Todas as aves tratadas e controles receberam ração à vontade até 28 dias de idade, sendo Nos dias 1, 7, 12, 18, 23 e 28 de idade foram retiradas aves de cada grupo (tratadas e controle) para estudo. Nas idades de 1 e 7 dias foram retiradas 12 aves em cada dia e nas demais idades 9 aves, aleatoriamente. As aves foram imediatamente enviadas ao LABIO-UFU e pesadas individualmente (balança GEHAKA). Após a pesagem, as aves foram eutanasiadas por meio do deslocamento da coluna cervical com prévia insensibilização pelo éter. Para aferir o ph foi feita uma incisão no papo e introduzido o eletrodo do medidor de ph (aparelho TEC- 3MP). Após cada aferição o eletrodo foi lavado com água destilada e secado com papel toalha e, em seguida, recalibrado Contagem de microorganismos Após homogeneização do conteúdo do ceco e intestino dos animais foi retirada uma amostra de 25g. Esta amostra foi adicionada a 225 ml de água peptonada tamponada estéril (APT) e homogeneizada (diluição 10-1 ). A partir da diluição 10-1 foram realizadas as demais diluições

10 9 decimais seriadas, sempre com a transferência de 1 ml para 9 ml de APT. A contagem de enterobactérias foi realizada pela inoculação de 1 ml de cada seleção selecionada em Agar cristal Violeta Vermelho Bile Glicose (VRBG), seguida da incubação a 36 o C por 18 a 24 horas (Brasil, 2004). Foram contadas e anotadas as colônias de coloração vermelha, rodeadas ou não por halo de precipitação da bile com 0,5 a 2 mm de diâmetro. Selecionou-se 3 a 5 colônias típicas para confirmação pelas características de oxidase negativa e de bactérias Gram-negativas. Este resultado multiplicado pela recíproca da diluição utilizada será o número de UFC.g -1. A contagem de Clostridium sulfito redutor foi realizada em ágar Triptose Sulfito Cicloserina - TSC (Brasil, 2004) incubado em anaerobiose (Probac anaerobic generator ) a 37ºC por 24 horas. Foram contadas e anotadas as colônias negras de 1 a 3 mm de diâmetro. Este resultado multiplicado pela recíproca da diluição utilizada será o número de UFC.g RESULTADOS E DISCUSSÃO A comparação do ph do inglúvio (Tabela 1) por meio do teste t de Student, detectou diferença nas idades de 7, 18, 23, 28 dias (p<0,05), assim como na idade de 12 dias (p< 0,01). O ph do inglúvio (papo) dos indivíduos tratados tiveram seu valor reduzido. Não houve diferença (p>0,05) entre o ph do papo dos pintos de um dia tratados e controle. Tabela 1 Medidas médias do ph do papo de aves tratadas e controles enas diferentes idades. Média do ph do Idade papo t Controle Teste 1 6,80 4,98 2,4823 c 7 4,39 2,98 2,0221ª 12 3,37 3,06-0,8707 b 18 5,71 3,88 3,9861ª 23 4,58 4,11 1,3646ª 28 4,86 4,55-0,1952 a Média ph 4,95ª 3,93ª - a p<0,05 b p< 0,01 c p>0,05 O ph do papo nas aves tratadas e controles apresentou diferença significativa (p<0,05) nas idades de 7, 18, 23, 28 dias, e (p<0,01) na idade de 12 dias. O ph mais baixo nas aves tratadas pode ser indicio de uma maior colonização de bactérias láticas devido à produção de acido lático (Mathew, 1996). Essa redução no ph é considerada importante pois pode representar um ambiente desfavorável à sobrevivência e multiplicação de bactérias patogênicas como

11 10 a Salmonella e outras enterobacterias, que se multiplicam em uma faixa de ph de 6 a 8 (Carli, 2002). Esses resultados diferem de Silva et. al. (2000) que não encontraram diferença no valor de ph entre aves tratadas e controle. A comparação do peso corporal (Tabela 2) realizado por meio do teste t student mostrou que não houve diferença estatística entre os tratamentos controle e teste. Tabela 2 Média de peso das aves tratadas e controles em diferentes idades. Idade Média de peso Controle Teste T 1 45,42 45,79-0,262 c 7 127,49 138,69-1,4173 c ,00 281,80-0,1214 c ,24 501,64-0,5852 c ,33 859,34-0,9863 c , ,73-1,2782 c c p>0,05. As aves do grupo tratado consumiram 37,28 kg de ração, enquanto o grupo controle consumiu 37,33 kg, não apresentando diferença estatística. Os índices de mortalidade e morbidade do experimento foram iguais a zero. Não houve diferença significativa (p<0,05) entre o grupo tratado e controle quanto ao peso dos animais. Estes resultados estão de acordo com os obtidos por Henrique et. al. (1998) quando avaliaram o uso de probióticos na dieta de frangos de corte na fase de crescimento. Os autores observaram que a utilização de probióticos não promoveu melhorias significativas no desempenho e no rendimento de carcaça de frangos de corte, mas reduziram a mortalidade. Do mesmo modo, Campos et al. (2002), trabalhando com vários níveis de inclusão de probióticos na ração (0, 50, 100, 150 e 1000 g/ton), não encontraram efeitos significativos para o consumo de ração, ganho de peso e conversão alimentar. Porém os autores observaram uma diminuição do índice de mortalidade e o atribuíram a uma possível melhoria no sistema imune das aves que ingeriram probiótico. Este fato não foi comprovado no presente estudo, pois não foram observados mortalidade e morbidade. Os resultados das contagens de enterobactérias obtidas nos intestinos e cecos de frangos de corte são mostrados na Tabela 3. A contagem de microorganismos nas aves tratadas e controles apresentaram diferença significativa (p<0,05) nas idades de 7, 18, 28 dias, e na idade de 12 dias não houve diferença estatística entre os grupos. Oliveira et. al. (2004) observaram uma ligeira queda no número de isolamentos de enterobactérias no decorrer da idade, o

12 11 que também foi observado neste experimento. Tabela 3 Contagem de enterobactérias das aves tratadas e controles em diferentes idades. UFC.g -1 x 10 6 Idade T Controle Teste pelas bactérias lácticas, inibindo o crescimento das enterobactérias presentes no trato gastrintestinal. A Figura 1 revela como ocorreu a variação das médias das contagens de enterobactérias nos grupos controle e tratamento, de acordo com as idades das aves ,5171 a,b ,9211 c ,934 a,b ,6-6,1130 a,b a p<0,05 b p<0,01 c p>0,05 O período de 7 a 12 dias de idade foi aquele em que a contagem de as enterobactérias são encontradas na natureza, onde a maioria habita o intestino do homem e dos animais, seja como membros da microbiota normal ou como agentes de infecção (Trabulsi e Campos, 2002). A queda no número de isolamentos observada após o 12º dia, tanto nas aves tratadas como nas aves controle, pode ser devida ao amadurecimento do sistema imune e à instalação gradual da microbiota intestinal impedindo a colonização do trato digestivo por microrganismos patogênicos. Entretanto, a queda mais acentuada na contagem de enterobactérias no grupo teste pode ser um indício da exclusão competitiva Figura 1 - Variação das médias das contagens de enterobactérias de acordo com as idades das aves. Segundo Daile (1992) apud Pedroso (2003), a base para utilização dos probióticos em animais é que os microorganismos presentes na microbiota intestinal natural não são suficientes para se alcançar uma boa produtividade. Partindo-se deste princípio, a adição de bactérias benéficas pode fazer com que o animal se torne mais saudável, aproveite melhor os nutrientes dos alimentos e resista à colonização de bactérias prejudiciais por

13 12 exclusão competitiva, o que pôde ser comprovado neste experimento. Apesar da evidência de que o probiótico utilizado inibiu o crescimento de enterobactérias, o mecanismo pelo qual este atua e contribui positivamente com o organismo hospedeiro ainda não é bem definido (Boekhorst et. al., 2004). Segundo Ermann et. al. (2002) e Jin et. al. (2000), existem dois possíveis mecanismos para os benefícios das bactérias ácido-lácticas como probióticos: a capacidade de produzir substâncias como o ácido láctico e bacteriocinas, que ajudam a impedir o crescimento de outros microorganismos, também citada por De Vuyst & Vandamme (1994); e a capacidade de aderir à mucosa do TGI e formar uma barreira contra a colonização por patógenos. Os resultados do presente estudo podem indicar exclusão competitiva, mas a população de bactérias lácticas não diferiu significativamente entre os grupos e, portanto, não aumentou a ponto de conseguir superar a microbiota natural do habitat em que se encontravam. Vale ressaltar que não foi realizado um estudo qualitativo, e não se sabe se uma determinada cepa das bactérias ácidolácticas utilizadas obteve crescimento melhor que outras, sendo responsável pela ação benéfica ao hospedeiro, seja pela produção de substâncias antimicrobianas ou por competição por sítios de ligação na mucosa do TGI. Silva (2006) utilizando diferentes probióticos como bactérias ácido-lácticas, Bokashi e antibióticos promotores de crescimento, também observou que não houve aumento da população de bactérias lácticas entre os grupos controle e teste. Porém, na ocasião, o único tratamento que obteve contagem menor de enterobactérias foi o que utilizou bactérias lácticas na alimentação, todos os outros obtiveram contagens maiores que o controle. Com relação às contagens de Clostridium sp. obtidas nos intestinos e cecos de frangos de corte, os resultados são mostrados na Tabela 4. Tabela 4 Contagem de Clostridium sp. das aves tratadas e controles em diferentes idades. Idade UFC.g -1 x 10 6 T Controle Teste 18 0,546 0,159-1,1970 a 23 5,6 9,7 0,5237 b 28 10,8 11,7 0,2006 b a p<0,05 b p>0,05

14 13 De acordo com estes resultados, só houve diferença significativa na contagem de Clostridium sp. entre os grupos controle e teste em aves aos 18 dias de idade. Segundo Gomes (2007), a maior prevalência de acometimento das aves por espécies de Clostridium está entre a 2ª e 4ª semana de vida das mesmas, tornando o resultado deste estudo benéfico no período de maior predisposição ao agente em questão. Entretanto, com o avanço da idade, a contagem de Clostridium sp. do grupo teste tornou-se maior que a do grupo controle, o que não afirma que não houve controle de clostrídios, pois o aumento da colonização por bactérias ácido-lácticas pode ter influenciado no aumento da colonização por Clostridium sp. para equilíbrio da flora, o que só poderia ser afirmado com análises qualitativas, não realizadas neste experimento. Além disso, em aves doentes, elevadas contagens microbianas (10 8 UFC/g) são encontradas. Em contrapartida, para aves saudáveis, contagens baixas (0 a10 5 UFC/g) são consideradas normais (Broussard et al., 1986), situação em que se enquadram as aves deste estudo. Outro fator a ser considerado é a dieta utilizada, sendo neste experimento composta de sorgo e trigo. Riddell e Kong (1992), ao estudarem a influência da dieta na enterite necrótica em aves, demonstraram o tipo de alimento utilizado na composição da ração ser um fator extrínseco correlacionado à incidência da doença que tem como agente ao microorganismo Clostridium perfringens. As lesões da enterite são mais freqüentes com dietas compostas de ingredientes de baixa digestibilidade e ricas em polissacarídeos insolúveis, como centeio, trigo e cevada. O estímulo à secreção de muco, desencadeado por estes tipos de alimentos, favorece a colonização do Clostridium perfringens pela sua atividade mucolítica intensa (Collier et al., 2003). Diversos fatores podem prejudicar ou beneficiar o desenvolvimento da flora intestinal. Entre esses fatores estão o uso de antibióticos, promotores de crescimento, estresse fisiológico, radiação, alteração do peristaltismo do trato gastrointestinal e mudança da dieta (Hawrelak e Myers, 2004). Segundo Silva et. al. (1999), os promotores de crescimento não atuam de forma uniforme contra as bactérias. 4 CONCLUSÃO Os resultados permitem concluir que nesse experimento a adição de probiótico na ração de aves levou a uma diferença significativa no ph do papo dos animais e

15 14 pode ser utilizado no tratamento preventivo a infecções bacterianas. Apesar de não haver diferença estatística, em todas as idades, as aves tratadas apresentaram um peso maior que o controle, o que para a indústria pode representar um lucro adicional. O controle de enterobactérias observado no grupo teste pode ser um indício da exclusão competitiva realizada pelas bactérias lácticas, inibindo o crescimento das enterobactérias presentes no trato gastrintestinal. Porém, o mecanismo de ação precisa ser melhor investigado em futuras pesquisas. Não foi evidenciado o controle efetivo da população de Clostridium sp. nas condições em que foi realizado este estudo, o que pode ser verificado utilizandose outra metodologia. 5 AGRADECIMENTOS Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela Bolsa de Iniciação Científica concedida (Projeto E- 018/2007). 6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ARAÚJO, J. A; SILVA, J. H. V; AMÂNCIO, A. L. L. et. al. Uso de aditivos na alimentação de aves. Acta Veterinaria Brasílica, v.1, n.3, p.69-77, BOEKHORST, J.; SIEZEN, R. J.; ZWAHLEN, M.; VILANOVA, D. et. al. The complete genomes of Lactobacillus plantarum and Lactobacillus johnsonii reveal extensive differences in chromosome organization and gene content. Microbiology, v. 150, p , BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Portaria nº 11, de 09/01/2004. Disponível em: Acesso em: 11 de agosto de BROUSSARD, C. T.; HOFACRE, C. L.; PAGE, R. K.; FLETCHER, O. J. Necrotic enteritis in cage-reared commercial layer pullets. Avian Disease, v. 30, n. 3, p , CAMPOS, D.M.B. et al. Níveis de inclusão de probiótico sobre o desempenho de frangos de corte. Revista Brasileira de Ciência Avícola, Campinas, v. 4, supl. 4, p. 36, CARLI, E. M. Utilização de Lactobacillus paracasei como Probiótico para Controle

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