Biossegurança em centros de tecnologia celular

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1 capítulo 16 Biossegurança em centros de tecnologia celular Lygia da Veiga Pereira Juliana Andréa de Oliveira Georges Introdução A terapia celular pretende gerar, no laboratório, células de diferentes órgãos/tecidos que, quando transplantadas, promovem a regeneração deles no paciente. Nesse contexto, as células mais adequadas para esse fim são denominadas células-tronco (CT), que apresentam capacidade prolongada e ilimitada de proliferação, e são capazes de gerar descendentes mais especializados. As CT podem ser divididas em dois grandes grupos: as adultas e as embrionárias. Neste capítulo, serão discutidas as características específicas e as aplicações das CT adultas e embrionárias, assim como os aspectos de biosseguranca envolvidos na geração, na produção e no uso desses tipos celulares. Células-tronco adultas As CT que conhecemos há mais tempo são as CT hematopoiéticas da medula óssea, que dão origem a todos os tipos de células que compõem o sangue. Desde a década de 1950, são realizados transplantes de CT da medula óssea para o tratamento de doenças hematológicas, com o intuito de substituir o tecido hematopoiético deficiente de um paciente pelo de um doador saudável. Porém, somente no final da década de 1990, a partir de experimentos em modelos animais, começaram a surgir evidências de que, na medula óssea, existem também outros tipos de CT capazes de regenerar órgãos como o coração, o fígado e até o sistema nervoso 1. Esses achados deram início a várias pesquisas para o desenvolvimento de novas terapias com células da medula óssea para doenças comuns, como infarto, diabetes, cirrose hepática e lesão de medula espinal 2. Além disso, como os transplantes de medula óssea são realizados há décadas, sabe-se que o uso dessas células é seguro, e, assim, os testes clínicos de terapia celular em seres humanos logo tiveram início também. A pesquisa da palavra-chave stem cell (célula-tronco) no registro do governo norte-americano 3 apresenta um grande número de testes clínicos com CT para o tratamento de doenças não hematológicas (Quadro 1). Alguns desses estudos, como os de epilepsia e acidente vascular encefálico, ainda estão em fase inicial, enquanto outros, como os de doenças cardíacas, já se encontram em estágios mais avançados, nos quais a segurança do procedimento já foi verificada. O objetivo dessas análises é demonstrar a sua eficácia em um grande número de pacientes. Além da medula óssea, outras fontes de CT adultas têm sido utilizadas, como o sangue do cordão umbilical e da placenta (SCUP), o tecido adiposo, a placenta, a polpa do dente e a veia do cordão umbilical. Por enquanto, o SCUP é a única fonte alternativa de CT adultas cujo uso clínico já está consolidado para doenças tradicionalmente tratadas por transplante de medula óssea 4. Para o tratamento de doenças mais comuns, o SCUP segue em fase de testes clínicos junto com as CT da medula. Uma classe especial de CT adultas são as neurais, provenientes do cérebro, que podem dar origem a todos os tipos de células encontradas no sistema nervoso. As CT cerebrais possuem grande potencial para o tratamento de Biosseguranc a 16.indd :28:08

2 2 Manual biossegurança Quadro 1. Ensaios clínicos registrados de terapia com CT adultas* Número de ensaios clínicos em andamento Doença No mundo No Brasil Cardiopatias Diabetes 18 1 Isquemia de membros 16 1 Lúpus eritematoso 8 Acidente vascular encefálico 6 1 Esclerose múltipla 6 Cirrose hepática 4 1 Doença de Parkinson 2 Doença de Alzheimer 1 Lesão de medula espinal 1 Epilepsia 1 1 Enfisema 0 1 *CT provenientes de medula óssea, sangue de cordão umbilical e placenta, tecido adiposo e cordão umbilical. várias doenças neurológicas, como a doença de Parkinson. Alguns testes clínicos com esse tipo de células estão em andamento, entre eles, dois estudam as doenças genéticas neurodegenerativas de Pelizaeus-Merzbacher e de Batten (StemCells Inc., Estados Unidos), e um analisa o acidente vascular encefálico (Reneuron, Reino Unido). As pesquisas com as CT adultas já estão bem avançadas em modelos animais para aplicação potencial em várias doenças humanas. Porém, é fundamental ficar claro que esse tipo de terapia ainda está restrito ao âmbito da pesquisa. Células-tronco embrionárias Identificadas no início dos anos 1980 em camundongos, as CT embrionárias são extraídas de blastocistos (embriões pré-implantação) compostos de dois tipos de células: as que originam a placenta e as que produzem todos os tecidos do indivíduo adulto as células do botão embrionário 5 (Figura 1). Estas são retiradas do embrião e cultivadas no laboratório em condições especiais, de forma a manter sua pluripotência, ou seja, sua capacidade de se diferenciar em tecidos dos três folhetos embrionários: endoderma, ectoderma e mesoderma. Quando injetadas em camundongos imunodeficientes, as CT embrionárias iniciam um processo desorganizado de diferenciação, dando origem a teratomas e tumores compostos de tecidos derivados dos três folhetos embrionários, demonstrando, assim, a pluripotência dessas células. É importante salientar que as CT embrionárias são capazes de originar todos os tipos de célula do Figura 1. CT embrionárias. À esquerda, blastocisto humano com massa celular interna (MCI) aparente (círculo). À direita, duas colônias de CT embrionárias humanas indiferenciadas, cultivadas a partir da MCI. corpo humano, enquanto as CT adultas podem produzir somente alguns tipos. Para o uso das CT embrionárias como fonte de tecidos para transplantes, é necessário, ainda in vitro, dirigir a sua diferenciação para os tipos celulares desejados. Nos quase 30 anos de pesquisas com CT embrionárias, descobriu-se como cultivá-las e diferenciá-las em células da medula óssea e do músculo cardíaco, em neurônios, entre outras. Ao serem transplantadas em animais com alguma enfermidade, as células derivadas das CT embrionárias são capazes de aliviar os sintomas de diversas doenças, desde leucemia e doença de Parkinson até paralisia causada por lesão de medula espinal 6. Em 1998, surgiram as primeiras linhagens de CT embrionárias derivadas de embriões humanos, que, da mesma forma que as de camundongo, têm um efeito terapêutico importante em modelos animais de diversas doenças 7. Porém, antes de iniciarem os testes clínicos de transplante de células derivadas de CT embrionárias em seres humanos, algumas questões fundamentais deveriam ser resolvidas. A primeira diz respeito à segurança da utilização dessas células. Sabemos que quando injetadas em animais imunodeficientes, as CT embrionárias não diferenciadas formam teratomas. Por isso, todas as estratégias de uso terapêutico dessas células envolvem sua diferenciação in vitro no tipo celular desejado, de acordo com a doença a ser tratada. Porém, com frequência, o processo de diferenciação não é 100% eficiente, gerando uma fração de células ainda não diferenciadas que podem se comportar de forma descontrolada no organismo. Assim, é necessário desenvolver protocolos robustos de diferenciação das CT embrionárias, de forma que os tecidos gerados a partir delas não contenham células ainda indiferenciadas que possam dar origem a tumores nos pacientes. A segunda questão fundamental diz respeito à compatibilidade entre as CT embrionárias e os tecidos do paciente. Para qualquer transplante, deve haver com- Biosseguranc a 16.indd :28:15

3 Biossegurança em centros de tecnologia celular 3 patibilidade entre doador e receptor, de modo que o órgão não seja rejeitado. Pode se esperar esse tipo de compatibilidade para o transplante de CT embrionárias? Na verdade, ainda não se sabe quanto ou se os tecidos derivados das CT embrionárias induzirão uma resposta imunológica do paciente 6. E se houver necessidade de compatibilidade entre as CT embrionárias e os tecidos do paciente? Uma solução seria criar um banco dessas células, cada uma derivada de um embrião diferente, de forma a encontrar uma compatível com o paciente. Vários países têm adotado essa estratégia 7,8. Notem que, com as CT adultas, em geral, as terapias são feitas com células do próprio paciente, e, assim, não existe rejeição. Finalmente, o outro obstáculo a se vencer para tornar as CT embrionárias uma realidade terapêutica é a polêmica em torno da destruição de embriões humanos. No Brasil, a discussão foi resolvida com a Lei de Biossegurança, promulgada em 24 de março de 2005, que permite o uso, para pesquisa e terapia, de embriões produzidos para fins reprodutivos, doados com o consentimento dos pais, e que estejam congelados há pelo menos 3 anos. Essa legislação permitiu o desenvolvimento das pesquisas com CT embrionárias no país, e, em 2008, foi estabelecida a primeira linhagem de CT embrionárias humanas brasileiras, chamada BR-1, proporcionando autonomia para o desenvolvimento de terapias com essas células 8. O primeiro teste clínico com células derivadas de CT embrionárias teve início em Após três anos de testes exaustivos em modelos animais, a empresa Geron obteve permissão para injetar oligodendrócitos derivados de CT embrionárias em pacientes com lesão de medula espinal 9. Os primeiros pacientes foram tratados no final de 2010 e os objetivos principais do experimento foram verificar a segurança das células produzidas (i. e., se não formaram tumores) e a resposta imunológica dos pacientes. O segundo teste clínico aprovado nos EUA será conduzido pela empresa Advanced Cell Technologies, que tratará pacientes com um tipo de degeneração da mácula utilizando células de retina produzidas a partir de CT embrionárias 10. Células-tronco pluripotentes induzidas Desenvolvidas no Japão em 2006, as denominadas CT pluripotentes induzidas (ipsc) são produzidas a partir de células da pele ou do sangue, nas quais são inseridos genes ou proteínas características de CT embrionárias 11. Essas modificações genéticas induzem a reprogramação da célula, que regride a um estágio de célula pluripotente, equivalente a uma CT embrionária. A tecnologia de produção de ipsc foi uma revolução na área de pesquisa em CT. Por ser o processo mais simples de obtenção de CT pluripotentes, foi adotado com rapidez por dezenas de laboratórios no mundo todo. No entanto, além de o risco de gerar tumores ser equivalente ao das CT embrionárias, as ipsc são ainda menos seguras para terapias por serem geneticamente modificadas. Assim, por enquanto, essas células pluripotentes são mais exploradas como ferramenta de pesquisa do que como fonte de tecidos para transplante. As ipsc geradas a partir de células de pacientes com diferentes doenças genéticas auxiliam o entendimento dos mecanismos moleculares dessas doenças. Por exemplo, recentemente, um grupo de pesquisa dos Estados Unidos produziu neurônios a partir de ipsc de pacientes com esclerose lateral amiotrófica e descobriu um novo mecanismo fisiopatológico dessa doença neurodegenerativa 12. A partir desses estudos, as ipsc poderão também ser utilizadas para identificar e experimentar novas drogas que melhorem a funcionalidade in vitro dos neurônios afetados, antes de as testar nos pacientes. Estratégias semelhantes vêm sendo desenvolvidas para outras doenças, com ipsc geradas a partir de células de pacientes com síndrome de Down, doença de Parkinson e diabetes, entre outras. Assim, as ipsc são uma poderosa ferramenta para a pesquisa básica e aplicada, servindo como uma plataforma de identificação e validação de novas drogas in vitro (Figura 2). Rede Nacional de Terapia Celular No Brasil, os Ministérios da Saúde e da Ciência e Tecnologia estão investindo ainda mais nas pesquisas com CT, criando a Rede Nacional de Terapia Celular 13 com patient biopsy induced pluripotent stem cells (ips) reprogramming cellular therapy disease-affected cell type differentiation research, drug development Figura 2. CT ipsc. Células somáticas de um paciente são cultivadas e reprogramas em ipsc. Estas podem ser diferenciadas em tipos celulares relevantes para a doença em questão e aquelas usadas para terapia ou pesquisa. Biosseguranc a 16.indd :28:18

4 4 Manual biossegurança o objetivo de estruturar o esforço nacional de pesquisa em terapia celular, ampliar a geração de conhecimento por meio de uma maior interação entre a comunidade científica e qualificar os novos profissionais. Dessa rede participam oito laboratórios de produção de diferentes tipos de CT. Entre eles, está o Laboratório Nacional de Células-tronco Embrionárias (LaNCE), dedicado às pesquisas com CT pluripotentes, embrionárias e ipsc, para futura disponibilização dessas células para a terapia celular pelo sistema público de saúde. Centros de tecnologia celular Transfusões de sangue e transplantes de medula óssea e/ou sangue de cordão umbilical são regidos por normas específicas. Porém, à medida que as terapias celulares evoluem da pesquisa básica e dos ensaios pré-clínicos para os testes clínicos, e que se amplia a diversidade de fontes de células, como as CT, e de procedimentos para terapia, é necessária a elaboração de normas sanitárias e de biossegurança para a produção de células em condições adequadas para uso em seres humanos. Terapias com CT podem ser divididas em duas grandes classes, de acordo com a extensão de manipulações, às quais as células são submetidas: terapias com células isoladas de algum tecido (medula óssea, tecido adiposo, SCUP) e logo (ou após criopreservação e posterior descongelamento) transplantadas para o paciente; e terapias com células isoladas e cultivadas in vitro, com a finalidade de expansão e/ou diferenciação delas em algum tipo celular específico (Figura 3). Os dois grupos envolvem riscos distintos de contaminação do produto celular e, assim, devem ser tratados separadamente. A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa), em sua resolução RDC n. 9 de 14/3/2011, definiu como centro de tecnologia celular (CTC) o serviço que, com instalações físicas, recursos humanos, equipamentos, materiais, reagentes e produtos para diagnóstico de uso in vitro e metodologias, realiza atividades voltadas à utilização de células humanas, inclusive seus derivados, em pesquisa clínica e/ou terapia 14. Os CTC são classificados em tipos 1 e 2. O CTC tipo 1 é um centro que trabalha exclusivamente com CT adultas e autólogas, em procedimentos que não envolvam seu cultivo as células podem ser processadas, purificadas, e até criopreservadas, porém sem serem submetidas ao cultivo in vitro. Um exemplo de CTC tipo 1 são os laboratórios que recebem aspirados de medula óssea para ensaios clínicos em cardiologia a fração mononuclear é purificada e imediatamente encaminhada à sala de Tecido Embrião CT Embr ipsc Coleta Processamento Expansão/reprogramação * Diferenciação * Criopreservação Uso AUTÓLOGO/ALOGÊNICO 4 Figura 3. As etapas da terapia celular. Dependendo da fonte de células a ser usada (tecidos ou células pluripotentes, incluindo CT embrionárias e ipsc), existem diferentes passos até o uso terapêutico das células. Dependendo do tecido, as células podem ser processadas a partir do tecido coletado (por exemplo, medula óssea ou sangue de cordão umbilical), e imediatamente (1) ou após criopreservação (2) serem utilizadas em terapia (à esquerda). Essas mesmas células podem ainda ser expandidas em cultura antes da criopreservação e do uso terapêutico (3). Já no caso de CT pluripotentes (à direita), elas precisam ser processadas, expandidas, reprogramadas (no caso das ipsc), diferenciadas no tipo celular desejado e então utilizadas em terapias (4). Etapas que requerem extensa manipulação in vitro das células estão marcadas com (*). Biosseguranc a 16.indd :28:20

5 Biossegurança em centros de tecnologia celular 5 cirurgia para ser injetada no paciente. Outro exemplo é um banco de CT de SCUP, que recebe o SCUP, também purifica a fração mononuclear e criopreserva o material em nitrogênio líquido para uso futuro. Vale salientar que, apesar de se encaixar na definição de CTC tipo1, esse tipo de banco é regido pela RDC n. 56 de 16/12/2010 da Anvisa que trata de células hematopoiéticas 15. O CTC tipo 2 está apto a trabalhar com qualquer tipo de CT, seja adulta, embrionária, autóloga ou alogênica. Além das atividades de um CTC tipo 1, o tipo 2 pode também cultivar as células in vitro, visando à expansão e/ou à diferenciação delas. No que diz respeito às CT embrionárias, o CTC tipo 2 pode receber e armazenar embriões humanos doados para pesquisa e terapia, e cultivá-los até o estágio de blastocisto. Além disso, somente um CTC tipo 2 está apto a gerar as ipsc para uso clínico 14,15. Biossegurança em centros de tecnologia celular No que diz respeito às normas de biossegurança, todo CTC deve seguir as normas gerais de segurança de laboratório na área da saúde (ver Capítulos 1, 2, 4, 5 deste livro). Do ponto de vista do pesquisador, cuidados gerais devem ser tomados com produtos de origem humana, visando evitar a contaminação por patógenos (ver Capítulo 4). Do ponto de vista do produto celular produzido pelo CTC, a principal preocupação é referente à sua contaminação, e por isso a manipulação e a exposição de material biológico e de materiais, reagentes e produtos durante o processamento deve ocorrer exclusivamente em ambiente classificado como ISO 5 (Classe 100), com capela de fluxo laminar. Além disso, nos CTC tipo 1, o fluxo laminar deve estar instalado em uma sala com classificação mínima ISO 8 (Classe ). O controle do ambiente nos CTC de tipo 2 deve ser mais rigoroso, uma vez que nesses centros são realizadas extensas manipulações de células, aumentando a chance de elas sofrerem alguma contaminação. Assim, no CTC tipo 2, o fluxo laminar deve estar instalado em uma sala com classificação mínima ISO 7 (Classe ) (ver Capítulo 11). Além disso, aqueles CTC tipo 2 que trabalharem com células modificadas geneticamente (por exemplo, na geração de ipsc) devem ter Certificado de Qualidade em Biossegurança emitido pela Comissão Técnica Nacional de Biossegurança (CTNBio). MO SCUP PD Adip Plac VCU C.A. Emb Triagem/consentimento Coleta Processamento Criopreservação Cultivo in vitro Expansão Diferenciação Reprogramação Controle de qualidade/liberação para uso Uso AUTÓLOGO Uso ALOGÊNICO Figura 4. Esquema de funcionamento e diferentes atividades dos centros de tecnologia celular tipos 1 (dentro do pontilhado) e 2 (todos). Diferentes fontes de CT: medula óssea (MO), sangue do cordão umbilical e placentário (SCUP), tecido adiposo (Adip), placenta (Plac), veia do cordão umbilical, células adultas para geração de ipsc (CA) e embriões humanos (Emb). Doadores de material biológico passam por triagem clínica e devem assinar termo de consentimento informado. Após processamento (e cultivo por CTC tipo 2), as células devem passar por controle de qualidade para serem liberadas para uso clínico, autólogo ou alogênico. Biosseguranc a 16.indd :28:23

6 6 Manual biossegurança Na Figura 4, está esquematizado o funcionamento dos CTC. Notem que os CTC tipo 1 realizam somente as atividades dentro da região pontilhada, enquanto os tipo 2 podem realizar todas as atividades listadas. Alguns pontos mais importantes de cada etapa serão discutidos a seguir. Infraestrutura mínima: os CTC devem ter infraestrutura física de uso e acesso exclusivo para tal finalidade. Se inserido em um laboratório de pesquisa, o CTC deve ter espaços físicos independentes para circulação de pessoas, reagentes e materiais biológicos. É necessária a existência de antecâmara e vestiário de barreira dotado de lavatório e área de paramentação no acesso à sala na qual será processado o material biológico. Deve ser instalado sistema emergencial de energia elétrica. O controle microbiológico de ambientes, equipamentos (incubadora de CO 2 ) e meios de cultura deve ser realizado. Reagentes: todos os reagentes utilizados pelos CTC devem ser estéreis, apirogênicos e não citotóxicos, e estar regularizados pela Anvisa. Os CTC devem manter registro de origem, validade e número de lote de todos os reagentes utilizados, de forma a garantir a possibilidade de rastreamento. O uso de produtos de origem animal deve ser evitado, porém, se utilizados, devem ter certificação de ausência de agentes infecciosos e contaminantes. Seleção de doador/paciente: deve respeitar os preceitos legais e éticos sobre o assunto, ficando garantidos o sigilo, a não percepção de remuneração ou de benefício direto e o termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE), conforme legislação vigente. Os CTC devem realizar triagem clínica e laboratorial determinada para a doação de sangue (conforme legislação vigente) em doadores e/ou pacientes. A obtenção de embriões ou células-tronco embrionárias deve seguir os critérios da Lei n , de 24 de março de , e devem ser obtidas as informações de triagem clínica e laboratorial realizadas pelo banco de células e tecidos germinativos (BCTG), como disposto no regulamento técnico para o funcionamento dos BCTG. Processamento e armazenamento: para impossibilitar a contaminação cruzada e a troca de material, não é permitido o processamento simultâneo de células humanas e seus derivados de mais de um doador/paciente no mesmo ambiente. A manipulação e a exposição de material biológico e de materiais, reagentes e produtos para diagnóstico in vitro durante o processamento deve ocorrer exclusivamente em ambiente classificado como ISO 5 (Classe 100). Todos os materiais biológicos submetidos a cultivo ou criopreservação prévios ao seu uso terapêutico devem ter alíquota representativa criopreservada e armazenada nas mesmas condições, para uso em testes de controle de qualidade de processo. Os CTC devem instalar os tanques de nitrogênio líquido para armazenagem de células em salas de criopreservação com visualização externa do seu interior, sensor do nível de oxigênio ambiental (com alarme visual e sonoro, interno e externo à sala), sistema de exaustão mecânica com descarga para o ambiente externo do prédio, e termômetro com registro de temperaturas ambientais mínima e máxima. Células e derivados com testes microbiológicos positivos ou com resultado reagente em pelo menos um dos marcadores para infecções transmissíveis pelo sangue devem ser armazenados em congelador ou tanque específico, separados das demais unidades com testes negativos, ou deverá ser utilizado um sistema de embalagem externa ou equipamento que garanta a proteção das demais unidades criopreservadas. Controle de qualidade do produto final: os CTC devem garantir a segurança e a qualidade das células humanas e seus derivados antes de os liberar para uso, realizando, no mínimo: testes microbiológicos; contagem e viabilidade celular; fenotipagem e teste de função celular, quando couber; controle de estabilidade cromossômica para células cultivadas; identificação dos antígenos de histocompatibilidade (HLA), para caso de uso alogênico. Em conclusão, terapias com células-tronco são uma área em intenso desenvolvimento. Nos últimos anos, assistiu-se ao rápido crescimento da área e ao desenvolvimento de diferentes fontes de células e estratégias de cultivo e terapia. Resta, porém, verificar quais delas passarão pelo rigoroso crivo dos testes clínicos e serão consolidadas de fato como alternativas terapêuticas. As normas de biossegurança aqui descritas ainda oferecem certa flexibilidade, como no que diz respeito ao uso de produtos de origem animal. Essa flexibilidade é fundamental para o avanço de uma ciência ainda em desenvolvimento. Ao mesmo tempo, esses avanços trarão novos conhecimentos que deverão ser incorporados em futuros aperfeiçoamentos das normas de biossegurança para CTC. Referências bibliográficas 1. Krause DS, Theise ND, Collector MI, Henegariu O, Hwang S, Gardner R et al. Multi-organ, multi-lineage engraftment by a single bone marrow-derived stem cell. Cell. 2001;105: Grove JE, Bruscia E, Krause DS. Plasticity of bone marrow-derived stem cells. Stem Cells. 2004;22: Disponível em: Acesso em: 4. Rubinstein P, Stevens CE. The New York Blood Center s Placental/Umbilical Cord Blood Program. Experience with a new source of hematopoietic stem cells for transplantation. Ernst Schering Res Found Workshop. 2011;33: Evans MJ, Kaufman MH. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. 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