Transgenia de Plantas e Interações com Insetos

Transcrição

1 Transgenia de Plantas e Interações com Insetos Eliseu J. G. Pereira Prof. de Entomologia Prédio da Entomologia, 103b Ramal eliseu.pereira@ufv.br

2 Biotecnologia Alguns Conceitos Conjunto de tecnologias que possibilitam utilizar, alterar e otimizar organismos vivos para gerar produtos, processos e serviços Áreas de saúde, agropecuária ria e meio ambiente Engenharia genética Modificação de um genótipo pela manipulação direta do DNA; sinônimo de tecnologia do DNA recombinante Permite isolar, transferir, duplicar e ativar genes Produção de vacinas, de proteínas por microorganismos, terapia gênica, produção de plantas ou animais transgênicos Transgênico Denominado organismo geneticamente modificado (OGM) pela legislação brasileira, é aquele cujo material genético (DNA/RNA) foi modificado por meio de engenharia genética

3 Por que utilizar plantas transgênicas? O que essas plantas tem a ver com insetos?

4 Transgenia de Plantas Evolução das plantas silvestres importância da mutação e seleção natural Agricultura origem das plantas cultivadas Descoberta do princípios pios de hereditariedade Melhoramento genético Variabilidade genética silvestre Indução de mutação Transgenia

5 Transgenia para Controle de Populações de Insetos Transgenia de plantas Transgenia de insetos e inimigos naturais

6 Como se Faz uma Planta Transgênica?

7 Como se Transfere Genes de Outros Organismos para Plantas?

8 Transferência de Genes Mediada por Agrobactérias rias Fonte: Zanettini & Pasquali,, 2004 Simples, processo natural Exige compatibilidade hospedeira Apenas plantas dicotiledôneas

9 Transferência de DNA para células c vegetais através s de poros abertos por choque elétrico Eletroporação - Transferência de DNA Fonte: Zanettini & Pasquali,, 2004

10 Transformação por Aceleração de Partículas Fonte: Zanettini & Pasquali,, 2004

11 Após a Transformação ão As células são crescidas em meio de cultura e a planta é regenerada!

12 1 a Geração de Plantas Transgênicas para Controle de Insetos Proteínas com atividade inseticida Principal fonte: Bacillus thuringiensis (Bt) Colônia de Bt Célula de Bt Estrutura molecular de Cry1Aa

13 O que é Bt? Bactéria encontrada em solo, folhas de plantas, etc. Produz proteínas cristalinas (Cry( Cry) ) durante esporulação São muito tóxicas t a larvas de alguns insetos Diferentes isolados de Bt produzem diferentes toxinas, cada uma codificada por um gene Nomenclatura das toxinas baseada na atividade e estrutura

14 Especificidade e Diversidade de Bt Toxinas Cry tem definido espectro de açãoa Cry1 Lepidoptera Cry2 Lepidoptera e Diptera Cry3 Coleoptera Cry4 Diptera Especificidade depende de fatores do inseto: ph intestinal Enzimas digestivas Receptores de membrana no intestino Grande diversidade mais de 90 de genes de toxinas Cry identificados

15 Como Toxinas de Bt Matam Ingestão da Toxina Insetos? Solubilização pelo ph Alcalino Ativação Proteolítica Ligação ao Receptor Formação de Poro Lise de Células Mortalidade

16 Bt como Agente de Controle Biológico ou Inseticida Disponível há mais de 50 anos Não-tóxico para mamíferos e organismos não-alvo Muito específico e age por ingestão Baixa persistência no campo Desvantagens superadas pelo uso em plantas transgênicas

17 Desenvolvimento de Plantas Bt Eficiente modo de ação a e segurança a de Bt era promissor Em 1981 Isolado o 1º 1 gene de Bt Em 1987 genes cry1a,, de Bt, foram inseridos em fumo, tomate e batata por meio de transformação com Agrobaterium tumefasciens Expressão ainda insuficiente para proteção das plantas e foi necessário otimização

18 E as Monocotiledôneas? Em 1995, 1 a transformação de de milho usando aceleração de partículas, a qual controlava lagartas com eficiência Em 1996 essa primeira geração de plantas transgênicas chegava ao mercado nos EUA, Canadá e Argentina

19 Adoção da Tecnologia por Agricultores a Nível N Mundial

20 Países que Adotam Culturas Transgênicas nicas*

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22 Adoção de Plantas Transgênicas no Mundo 134 milhões de ha plantados em 2009, sendo 32% para controle de insetos Crescimento de 60x desde 1996, numa taxa de 13% ao ano Em ordem de área plantada estão EUA, Brasil, Argentina, Índia, Canadá e China 5 principais culturas: Soja 32%, milho 25%, algodão 13% e Canola 5% Alta adoção reflete a satisfação dos agricultores

23 Plantas Transgênicas em Uso Comercial no Brasil

24 Quais os Benefícios e Riscos? Benefícios Uso de genes úteis de outras espécies Redução no uso de inseticidas perigosos ao homem e ao meio ambiente Aumento de produtividade em alguns casos Possíveis problemas Fluxo gênico Vertical Horizontal Não sexual Segurança a alimentar Organismos não- alvos Desenvolvimento de resistência nos insetos alvos

25 Benefícios do Uso de Culturas Bt Redução no uso de inseticidas EUA China India Austrália Aumento de produtividade Índia

26 Redução no Uso de Inseticidas e Aumento de Produtividade em Algodão Bt na Índia Medias ± (desvio padrão). *Indica diferença significativa.

27 Impacto de Plantas Trangêncicas no Ambiente, Organismos Não-Alvo e Segurança a Alimentar

28 Há Risco de Escape Gênico? Sim, por causa do fluxo gênico entre plantas Fenômeno comum na natureza, contribui para surgimento de novas combinações gênicas Agentes: pólen,, sementes ou plantas voluntárias do cultivo anterior Pode ser: Vertical entre indivíduos duos da mesma espécie Horizontal entre indivíduos duos de espécies diferentes Não sexual via incorporação de fragmentos de DNA, p.ex. por bactérias

29 Fluxo Vertical entre Plantas Varia com a espécie e condições ambientais Diferenças de % autofecundação entre espécies Autógamas: > 95% Ex. Soja Baixo risco, m de isolamento Alógamas gamas: : < 5% Ex.: Milho, polinização anemófila Alto risco, m Intermediárias: rias: entre 5 e 95% Ex.: Algodão Risco variável, vel, polinização entomófila, m Medidas para evitar o fluxo gênico variam de acordo com esses grupos

30 Risco de Fluxo Gênico no Brasil

31 Transferência Gênica para Microorganismos Tem que passar várias v etapas para se ter impacto ambiental Somente em condições ideais (em laboratório) rio) Frequência baxíssima 10-17

32 Conseqüências do Fluxo Gênico Melhoramento convencional vs. transgenia Pela transgenia se introduz combinações gênicas novas, geralmente com introdução de um caracter antes inexistente Fluxo gênico para as cultivares dos agricultores, que perderiam a identidade Fato ou Ficção? Apesar da introdução dos híbridos h de milho melhorados nos anos 30, algumas variedades crioulas continuam sendo utilizadas e mantiveram a identidade

33 Conseqüências do Fluxo Gênico E se o transgene fosse transferido? Talvez Bt tenha vantagem seletiva pela ocorrência de lagartas, ao contrário rio da tolerância a herbicidas Transferência para ervas daninhas Preocupação maior com tolerância a herbicidas Soja Roundup-Ready Ready

34 Efeitos em Organismos Não-Alvo Dada a especificidade de Bt, é esperado efeito adverso significante? Extensivos testes com fitófagos fagos não-alvos e insetos benéficos não tem detectado efeito adverso Baixo efeito na biota do solo, como minhocas, colêmbolas,, e microorganismos em geral Porém é necessário mais pesquisa de efeito em processos ecológicos, como decomposição

35 Processo para Determinar Efeitos de Plantas Bt em Inimigos Naturais Fonte: Romeis et al. 2001

36 Plantas Transgênicas e Inimigos Naturais de Insetos-Alvo Duas tendências gerais Nenhuma indicação de efeito direto em IN Efeitos adversos observados apenas em estudos com hospedeiro/presas que são fitófagos fagos suscetíveis às toxinas Cry Mais provável vel do efeito advir da mám qualidade da presa Menor ou maior impacto comparado àquele causado pelo uso de inseticidas químicos?

37 Segurança a Alimentar de Plantas Bt Antes da liberação comercial é avaliada a segurança Começa a desde a concepção da idéia ia de utilização de uma proteína inseticida Comparado a similaridade com a seqüência de aminoácidos com algum alergênico e/ou toxina Estudos toxicológicos com animais (OMS/FAO) Equivalência substancial da proteína a outras da dieta normal

38 Segurança a Alimentar de Plantas Bt Rotulagem Europa rotulagem se conter > 1% de soja ou milho transgênicos Brasil também m > 1% produtos embalados, granel ou in natura Deve ser informado a espécie doadora do gene Se animal, informar se alimentado com ração tendo ingrediente transgênico A cargo da CTNBio Comissão Técnica T Nacional de Biossegurança

39 Há Risco de Adaptação dos Insetos a Plantas Transgênicas? Alta persistência Alta exposição Pouco refúgio Alta Dose Intensa Pressão de Seleção

40 Resistência a Bt em Insetos Seleção em laboratório rio 11 de 18 populações desenvolveram significativos níveis n de resistência (>10x) 2 casos de sobrevivência em plantas transgênicas No campo Traça a das crucíferas, Plutella xylostella Resistência a plantas transgênicas Spodoptera frugiperda em Porto Rico Pectinophora gossypiella na Índia

41 Como o Inseto Alvo Pode se Tornar Resistente? Enzimas digestivas Alteração na ativação ou Degradação da toxina Ligação ao Receptor Redução de ligação, ou Redução de No. sítios s de ligação Outros

42 Fatores que Afetam o Desenvolvimento de Resistência Ecológicos e comportamentais Taxa de reprodução, mobilidade/dispersão, refúgio de exposição Genéticos Freqüência inicial de genótipos tolerantes, dominância, número n de genes, custo fisiológico da resistência Operacionais Uso das plantas transgênicas Estratégia de manejo da resistência

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44 Plantas Transgênicas Resistentes a Insetos Avanços Recentes e Perspectivas para o Futuro Eliseu José G. Pereira Universidade Federal de Viçosa eliseu.pereira@ufv.br RIPPI National Research Institute for Plant-Pest Interaction

45 Novas Plantas Transgênicas Resistentes a Insetos Expressão em toda planta ou tecido- específica? Expressão no floema e epiderme Indução por substâncias químicas (p.ex., etanol, cobre, tetraciclina, etc.) A idéia ia é criar refúgio dentro da própria pria planta, ou em plantas não induzidas ou que tiveram a expressão interrompida

46 Plantas Transgênicas com Vários V Objetivos Genes de Resistência Evitar adaptação pelos insetos - mais de um gene contra uma mesma espécie de inseto Controlar várias v espécies de insetos Ex.: Expressão Cry1Ac, Cry2A e GNA em arroz para controle de mastigadores e sugadores

47 Ampliação do Espectro de Ação A de Toxinas Cry de Bt Toxinas Cry tem 3 domínios Domínio I inserção na membrana celular do inseto Domínio II ligação ao receptor, importante para especificidade Domínio III também m auxilia na interação com o receptor

48 Diversidade de proteínas Cry permite fazer modificações na estrutura delas

49 Uso de Lectinas de Plantas Atividade inseticida contra insetos sugadores de seiva, fora do espectro de ação a de Bt GNA pode também m servir como proteína carreadora de peptídeos inseticidas e proteínas até a hemolinfa Alatostatina-GNA SF1-GNA, uma neurotoxina de Segestria florentina Segestria florentina

50 Exemplo de Lectina com Potencial Lectina de folhas de alho Similaridade com GNA 10x mais potente Expressa em fumo, reduz sobrevivência de Mizus persicae de Uso Fonte: Guta et al Plant Biotech J 3:

51 Uso de Inibidores de Enzimas Digestivas Até o presente, plantas transgênicas expressando IPs têm mostrado eficácia cia marginal contra insetos- praga Capacidade adaptativa em insetos fitófagos fagos por causa da diversidade genética em proteases e baixa potência de inibidores específicos Poderão ser efetivos se adaptação a eles puder ser superada

52 Fontes de Outras Toxinas para Resistência a Insetos Toxinas Vip de Bt produzidas na fase vegetativa da bactéria Espectro mais amplo Baixa similaridade com a toxinas convencionais Algodão transgênico com essas toxinas deve ser comercializado em breve Toxinas de bactérias simbiontes de nematóides entomopatogênicos Photorhabdus e Xenorhabdus

53 Expressão de Toxina de Photorhabdus em Plantas Lepidoptera: : alta atividade inseticida Coleoptera: : atividade moderada Fonte: Liu et al Nature Biotech 21:

54 Mecanismos Endógenos de Resistência de Plantas Existência de estratégias de defesa comuns contra patógenos e insetos fitófagos fagos Conhecimento de mecanismos de resistência não- hospedeira contra patógenos podem ser exploradas contra insetos Entendimento das bases moleculares da resposta a estresses bióticos devem propiciar manipulação de genes, padrões de expressão, etc.

55 Manipulação de Defesas Endógenas Elucidar mecanismos moleculares determinantes da resposta das plantas à herbivoria Decifrar os sinais que regulam a expressão gênica de resposta Moléculas sinalizadoras tais como ácido salicílico lico, ácido jasmômico e etileno estabelecem complexas interações que determinam respostas específicas

56 O Futuro de Plantas Transgênicas no Controle de Insetos - Síntese Geral Novas fontes de resistência Bactérias Photorhabdus e Xenorhabdus Novas estratégias de expressão Tecido-espec específica Induzível Novas construções gênicas Expressão de diferentes toxinas na planta Fusão de proteínas para ampliar espectro de açãoa Fusão de proteínas para carrear neurotoxinas/peptídeos Manipulação de defesas endógenas da planta

57 Fontes de Genes para Resistência Bactérias de Plantas a Insetos Bacillus thuringiensis Photorhabdus e Xenorhabdus Plantas Inibidores enzimáticos Lectinas Animais Avidina Peptídeos hormonais Neurotoxinas

58 O que Pretendemos no Futuro Pesquisas para garantir estável e durável uso de plantas transgênicas Investigação sobre defesas endógenas das plantas ao ataque de insetos Defesas induzidas Nível molecular ao ecológico

59 Sugestões de Leitura CTNBio - Comissão Técnica T Nacional de Biossegurança. a Disponível na página p Plantas transgências. In: Mir, L. (Ed.), Genômica. Editora Atheneu, eu, São Paulo, p (Capítulo 35). Considerações sobre segurança a de alimentos geneticamente modificados. In: Mir, L. (Ed.), Genômica. Editora Atheneu, São Paulo, p.? (Capítulo 36). Organismos geneticamente modificados: impacto do fluxo gênico modificado. In: Mir, L. (Ed.), Genômica. Editora Atheneu, São Paulo, p.? (Capítulo 38). James, C., Status Global of Culturas Tansgêncicas: ISAAA, Ithaca. Disponível em Shelton, A.M., Zhao, J.Z., Roush, R.T., Economic, ecological, food safety, and social consequences of the deployment of Bt transgenic plants. Annu Rev Entomol 47,