Formas de diagnóstico da Maedi-Visna. (Diagnostic forms of Maedi-Visna )

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1 Formas de diagnóstico da Maedi-Visna (Diagnostic forms of Maedi-Visna ) Tânia Valeska Medeiros DANTAS *, Suzana Aparecida Costa de ARAÚJO, Jean Berg Alves da SILVA, Aracelly Rafaelle Fernandes RICARTE & Maria Fátima da Silva TEIXEIRA Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias/FAVET/Universidade Estadual do Ceará RESUMO Maedi-Visna vírus é um lentivírus ovino da família Retroviridae, sendo causa comum de prejuízo econômico e responsável por muitas mortes em países produtores de ovinos, devido às lesões pulmonares, na glândula mamária, sistema nervoso e /ou articulações. Várias formas de diagnóstico podem ser usadas para detectar esta enfermidade, entre elas, o isolamento viral, ensaio imunoenzimático (ELISA), imunodifusão em gel de ágar (IDGA), hibridização in situ, microscopia eletrônica, histopatologia, imunohistoquímica, imunofluorescência indireta e dot-blot. A reação em cadeia da polimerase (PCR) por sua vez tem sido utilizada de forma mais restrita devido ao seu elevado custo. O isolamento em cultura de células da membrana sinovial de pequenos ruminantes ou células do plexo coróide é determinante, porém demorada e dispendiosa. A hibridização in situ, microscopia eletrônica, histopatologia e imunohistoquímica, são importantes, apesar de menos sensíveis, porque permitem a localização do vírus in situ ou as lesões decorrentes da infecção contribuindo desta forma para o estudo da patogênese viral. A sorologia é o método mais utilizado para diagnóstico da enfermidade sendo o IDGA e o ELISA os mais empregados. O IDGA é o mais usado rotineiramente devido a sua praticidade e baixo custo, e por ser recomendado pela Organização Internacional de Epizootias (OIE). O ELISA apesar de boa especificidade e possibilitar um rápido diagnóstico, tem sido menos utilizado. Tendo em vista a dificuldade de controle da Maedi-Visna é importante a escolha de técnicas que propiciem um diagnóstico precoce e confiável da infecção. PALAVRAS-CHAVES: diagnóstico, lentivírus ovino, Maedi-Visna ABSTRACT Maedi-Visna has been a common cause of economic damage and responsible for many deaths in producing countries of sheep, which had its lesions in lung, mammary gland, nervous system and/ or joints. The Virus Maedi-Visna is sheep lentivirus of the Retroviridae family. Some tests can be used to detect the disease, between them, the viral isolation, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), agar gel immunodiffusion test (IDGA), Hibridização in situ, electronic microscopy, histopathology, immunohistochemistry, indirect imunofluorescence, dot-blot. The PCR has been used of more restricted form which had its high cost. The isolation in cell s culture of the membrane small ruminant sinovial or the choroids plexus cells is decisive, however it is slow and costly. The hibridizacao in situ, electronic microscopy, histopathology and immunohistochemistry are important, although less sensible, because they allow to the localization of the virus in situ or lesons decorrent of infection, contributing for the study of viral pathogenesis. The serology is method more used for * Autor para Correspondência LABOVIR-PPGCV-UECE Av. Paranjana, 1700, Itaperi Fortaleza-CE taniavet@yahoo.com.br 89

2 diagnostic of disease being the IDGA and ELISA the more employee. The IDGA is more used routinely who had its praticid and low cost and for being the recommended one for the Organization International of Epizootias (OIE). Already the ELISA, although good specific and to make possible a fast diagnosis, has been less used. In view of the difficulty of control of the Maedi-Visna the choice of techniques is important that propitiate a precocious and trustworthy diagnosis of the infection. KEY WORDS: diagnosis, sheep lentivirus, Maedi-Visna INTRODUÇÃO O Maedi-Visna Vírus (MVV) é um vírus de ovino não oncogênico que pertence à família Retroviridae, gênero Lentivírus (PASICK, 1998) que ocasiona a doença Maedi-Visna (MV). A MV é uma importante doença de ovinos, resultante de uma infecção persistente, constituindo uma doença progressiva e lenta. Os animais acometidos desenvolvem uma doença neurológica degenerativa e inflamatória e/ou uma pneumonia progressiva após um longo período de incubação (FEVEREIRO et al., 1999). A transmissão ocorre principalmente pela ingestão de colostro e leite infectado e a principal forma de infecção de rebanhos livres se dá por meio da introdução de animais portadores oriundos de rebanhos contaminados (BLACKLAWS et al., 2004). O MVV infecta in vivo preferencialmente células da linhagem monócito/macrófago (NARAYAN & CLEMENTS, 1989). Esta enfermidade pode ser diagnosticada diretamente por isolamento do vírus através de cultivo celular, microscopia eletrônica, reação em cadeia de polimerase, hibridização in situ, histopatologia e imunohistoquímica e indiretamente por imunodifusão em gel de agarose, imunofluorescência indireta, dot-blot e imunoadsorção enzimática (ELISA). Vários testes têm sido desenvolvidos para detectar anticorpos contra MVV incluindo imunodifusão em gel de ágar (IDGA) (CUTLIP et al., 1977), recomendado pela Organização Internacional de Epizootias (OIE), que apesar de boa especificidade pode apresentar resultados falsos negativos (KNOWLES, 1997), ELISA (HOUWERS et al., 1982) e imunoblot (TORFASON et al., 1992). O controle da MV baseia-se na detecção e sacrifício dos ovinos soropositivos. (MOOJEN, 2001). Desta forma, é fundamental para o controle desta enfermidade o bom conhecimento das formas de diagnóstico do agente. O diagnóstico da MV pode ser obtido tanto pelo uso de técnicas diretas, que objetivam a identificação do agente em tecidos, secreções ou líquidos corpóreos, quanto pelo uso de técnicas indiretas que baseiam-se na identificação de anticorpos circulantes contra o agente. Portanto esta revisão teve como objetivo descrever as principais formas de diagnóstico de Maedi-Visna, mostrando os resultados de trabalhos realizados com as diversas técnicas. 1. Métodos Diretos 1.1. Isolamento Viral Apesar do isolamento em cultivo celular ser um diagnóstico definitivo da infecção pelo MVV, esta técnica é demorada, dispendiosa e requer a implantação e manutenção de cultivos celulares (KNOWLES, 1997). O MVV pode ser isolado de animais pelo cocultivo de células como leucócitos do sangue periférico (De la CONCHA BERMEJILLO, 1997), células somáticas do leite, células de plexo coróide ovino (RUSSO et al., 1982) e células de membrana sinovial de pequenos ruminantes (PINHEIRO, 2001). O MVV infecta ovinos e caprinos tanto natural como experimentalmente (BANKS et al., 1983; LEROUX et al., 1995; CASTRO et al., 1999 ). Infecta, in vivo, células das linhagens de monócitos e macrófagos (NARAYAN & CLEMENTS, 1989). In vitro, o MVV replica em cultivos de células fetais do plexo coróide (SIGURDSSON et al., 1960), músculo liso cardíaco (LEROUX et al., 1995), baço, timo, linfonodo escapular (NARAYAN et al., 1980), 90

3 membrana sinovial caprina (CRAWFORD et al., 1980), células de linhagens fibroblásticas imortalizadas (TEIXEIRA et al., 1997) e tecido epitelial (LEE et al., 1996). O efeito citopático produzido consiste na formação de células gigantes multinucleadas (sincício) e lise celular (CAREY & DALZIEL, 1983). No Brasil, MOOJEN et al. (1995) obteviveram o MVV pelo isolamento em células infectadas de ovinos soropositivos. As células infectadas foram submetidas à microscopia eletrônica, concluído assim o primeiro isolamento deste vírus no país Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) A reação em cadeia de polimerase tem sido utilizada em alguns laboratórios de forma mais restrita, pois é ainda um teste caro, porém possui alta sensibilidade e especificidade, sendo indicado para animais de alto valor zootécnico e para aqueles que o resultado de outros testes não tenham sido conclusivos (MOOJEN, 2001). Vários trabalhos têm demonstrado com sucesso o uso da técnica de PCR na detecção do DNA proviral do MVV. A PCR permite a identificação por amplificação direta de um fragmento do ácido nucléico viral específico de células de animais infectados (PINHEIRO, 2001). Devido sua alta sensibilidade e especificidade a PCR pode ser utilizada como teste confirmatório em casos de resultados inespecíficos da sorologia. O que pode ser bastante útil em programas de erradicação da enfermidade (KNOWLES, 1997). A técnica de PCR também é bastante versátil e já foi adaptada para vários tipos de amostras clínicas, como sangue, leite, sêmen e outros tecidos (BARLOUGH et al., 1994; RIMSTAD et al., 1993; WAGTER et al., 1998; TRAVASSOS et al.,1999; CELER, et al., 2000; EXTRAMIANA et al., 2002). Entretanto, em se tratando de animais jovens em estágios iniciais da doença, as amostras sanguíneas são mais eficientes para a detecção de DNA proviral (WAGTER et al., 1998) Hibridização in situ (HIS) Segmentos específicos de ácido nucléico de origem viral encontrados em tecidos ou células infectados são capazes de ser detectados por sondas marcadas por enzimas ou radiotivamente através da HIS (BROWN, 1998). ZINK et al. (1990) detectaram através da HIS, quais as células e tecidos de caprinos naturalmente infectados pelo vírus da artrite encefalite caprina (CAEV) apresentavam replicação viral, e observaram células com transcritos virais nos pulmões, cérebro, glândula mamária, articulações e medula espinhal Microscopia Eletrônica CUTLIP & LAIRD (1976) estudando in vitro, células embrionárias de pulmão ovino infectado com o MVV observaram, por microscópio eletrônico, vários brotamentos virais com 120 a 140 nm de diâmetro, além de virions livres no espaço extracelular, e, virions e fragmentos virais no citoplasma de células infectadas. MOOJEN (1996), no Brasil, observou partículas virais maduras na superfície e brotamentos intracitoplasmáticos em cortes ultrafinos de cultivo celular da MSC infectadas com amostras de CAEV de origem francesa e, de diferentes estados brasileiros. ALMEIDA (2003) utilizando soro ovino de um animal comprovadamente soropositivo e apresentando sintomatologia característica da doença, identificou partículas virais de MVV de 80nm através da microscopia eletrônica, e visualizou monócitos infectados usando a técnica de imunoperoxidase Histopatologia e Imunohistoquímica Os exames anátomohistopatológico e imunohistoquímica têm sido utilizados para auxiliar o diagnóstico de infecções por lentivírus de pequenos ruminantes (PINHEIRO, 2001). GEORGSSON & PÁLSSON (1971) fizeram um estudo histopatológico em ovinos infectados natural e experimentalmente com MVV e obtiveram como principais achados uma inflamação intersticial crônica com densa infiltração celular, hiperplasia do músculo liso no septo alveolar e hiperplasia linfóide perivascular e peribronquial. Com o passar do 91

4 tempo à análise histopatológica passou a ser utilizada como um auxílio ao diagnóstico, uma vez que a mesma não é conclusiva, mesmo quando associada ao conhecimento do quadro clínico e epidemiológico. O exame histológico de tecidos pulmonares e mamários de ovinos naturalmente infectados revelou a presença de fatores tipicamente associados com o MVV. Os pulmões apresentaram infiltração difusa de células linfóide e macrófagos no interstício pulmonar, com acúmulo peribronquiolar e perivascular local. A glândula mamária mostrou pronunciada hiperplasia linfóide e infiltração de células mononucleares (CARROZZA et al., 2003). ARAÚJO et al. (2004) fazendo um estudo histológico de pulmões sorologicamente positivos encontraram lesões macroscópicas e histopatológicas características de MV nestes animais e a imunohistoquímica de secções destes pulmões, utilizando a IgG anti-gp 135, demonstrou o agente viral em secções do pulmão de animais soropositivos. 2 Métodos indiretos 2.1. Imunodifusão em Gel de Agarose (IDGA) Recomendado pela OIE, por ser de fácil aplicabilidade e não exigir equipamentos nem instalações sofisticadas, o IDGA é a forma de diagnóstico mais utilizada em todo mundo, principalmente em programas de controle da doença que já são empregados em vários países (MOOJEN, 1995). Além da fácil aplicabilidade o IDGA tem alta especificidade, o que acaba credenciando-o para a realização dos diagnósticos de triagem (VAREA et al., 2001). De acordo com TIZARD (1998), os testes de imunodifusão consistem em reações de precipitação, realizada em gel de ágar em uma placa de Petri ou em uma lâmina de microscópio. Neste desenvolve-se uma linha de precipitação visível entre os orifícios no ponto em que é alcançada a relação ótima entre antígeno e anticorpo. Segundo VITU (1982), o teste de IDGA é capaz de identificar animais experimentalmente infectados com MVV cerca de quatro a cinco meses após a infecção, e afirma ainda que este teste mostrou-se mais sensível que o teste de fixação do complemento, sendo que quando comparado com ELISA mostrou resultados correlacionados, apesar de quando o teste utilizado é o ELISA a infecção pode ser identificada de forma mais precoce (sete semanas pós período de incubação). Este fato foi confirmado por LARSEN et al. (1982), que avaliando ovinos infectados experimentalmente observaram que a presença de anticorpos precipitantes, podiam ser detectados de forma mais precoce e com maior intensidade que a fixação do complemento. O teste IDGA também pode ser utilizado para a detecção de anticorpos anti-mvv tanto no soro sanguíneo quanto no colostro de animais infectados (ALKAN & TAN, 1998) Reação de imunofluorescência Indireta (IFA) As reações de imunofluorescência indireta possibilitam a visualização da interação antígeno/anticorpo, através de uma antiimunoglobulina marcada com fluorocromos. Estas substâncias são capazes de absorver energia luminosa tornando-se excitadas por um curto espaço de tempo, e para retornarem ao seu estado normal tais substâncias passam a liberar energia na forma de fluorescência. Os fluorocromos mais comuns são os do grupo da rodamina e isotiocianato de fluoresceína (SCHADE, 1995). São poucos os trabalhos empregando IFA no diagnóstico do MVV. No Brasil, REISCHAK (2000) desenvolveu IFA utilizando três vírus brasileiros de caprinos e um de ovino e comparou com o teste do IDGA usando antígeno do MVV, verificou que a IFA detectou mais animais soropositivos do que o IDGA, sendo que foram observados resultados diferentes de acordo com as cepas virais e os tipos celulares empregados ELISA Devido à técnica do ELISA ter alto nível de sensibilidade, reprodutibilidade e permitir automação, tornou-se o método de eleição para exame de um grande número de amostras. Existem vários tipos de ELISA, como o direto, indireto, duplo sanduíche direto. Dentre outras vantagens do ELISA, estão 92

5 a estabilidade e o pequeno volume de reagentes, resultados de natureza quantitativa, possibilidade de rápida execução diagnóstica, baixo nível de risco biológico, também pode ser usada em estudos epidemiológicos (TIZARD,1998). Segundo KNOWLES (1997) diversos teste de ELISA foram desenvolvidos para a detecção de anticorpos para lentivirus de pequenos ruminantes onde são empregados tanto antígenos nativos como recombinantes. HOUWERS et al. (1982) desenvolveram ELISA para detecção de anticorpos para MVV de fixação com um antígeno parcialmente purificado, compararam com o IDGA e o teste de fixação de complemento (FC) e verificaram que todas as amostras positivas no IDGA, FC ou ambas também foram positivas pelo ELISA. Em adição, o ELISA detectou mais 11,5% de soropositivos. Na década passada, o uso de proteínas recombinantes e/ou peptídeos sintéticos em diferentes ELISAs aumentaram o diagnóstico sorológico da infecção. Um ELISA desenvolvido recentemente é baseado na proteína recombinante de MVV do capsídeo (p25) e uma proteína transmembranária sintética (TM) (De MARTINI et al, 1999). FEVEREIRO et al. (1999) desenvolveram ELISA com anticorpos monoclonais (ELISA blocking) que comparado ao ELISA indireto comercial, provou que o ELISA blocking foi especifico, sensível e apresentou alta reprodutividade e baixa variabilidade. PINHEIRO (2001) desenvolveu ELISA indireto para diagnóstico da artrite encefalite caprina com antígeno completo e DANTAS (2004) ELISA para diagnóstico de Maedi-Visna também com antígeno completo e ambos encontraram resultados superiores ao IDGA com relação a sensibilidade do teste, detectando maior número de animais soropositivos para as respectivas doenças. Um largo número de ELISAs indiretos baseados em antígenos recombinante ou peptídeos têm sido descritos. Os antígenos usados incluem gag recombinante p55, p25, p16, proteína central p14, proteína transmenbranar gp 46 ou proteína purificada gp 135. Peptídeos sintéticos derivados de p25 ou transmembranar também tem sido usado. A sensibilidade desses métodos variam consideravelmente entre < 40% a 100%, enquanto a especificidade varia de 80% a 100% (ANDRÉS et al., 2005) Dot-Blot (DB) O DB pode ser usado como método qualitativo para um grande número de amostras classificando-as em positivo e negativo ou como uma técnica quantitativa para determinação da concentração de antígeno (PINHEIRO, 2001). O DB vem sendo utilizado no estudo e diagnóstico de enfermidades tanto humanas como animais em diferentes áreas, como parasitologia, bacteriologia e virologia. Na virologia desenvolveu-se DB para dengue (BRANCH & LEVETT, 1999), sarampo (VAZ DE LIMA et al., 1994), varicela (LEONARDI et al., 1990), caxumba (LEONARDI et al., 1990), newcastle (ROY & VENUGOPALAN, 1999), raiva ( JAYAKUMAR et al., 1996), língua azul (AFSHAR et al., 1992) e artrite encefalite caprina (PINHEIRO, 2001 e OZYORUK et al., 2001) Western-Blot (WB) WB ou imunoblot não é usado como teste de eleição porque é laborioso e demorado. Entretanto, é utilizado frequentemente como teste padrão para o diagnóstico de MVV (TORFASON et al., 1992). De MARTINI et al. (1999) mostraram que WB detectou anticorpos em 31 soros de 33 ovinos infectados (94%) e de 0/5 (0%) de negativos. Em outros estudos, a sensibilidade do teste de WB comparada com o IDGA foi 76,9% e 75,4%, respectivamente (HECKERT et al., 1992; BRODIE et al., 1992). Mostrando que o WB é mais sensível do que o teste de IDGA. Outros pesquisadores mostraram que WB é igualmente sensível ou mais sensível do que ELISA (BRODIE et al., 1992; HOUWERS & NAUTA, 1989). Porém como a técnica é demorada e laboriosa, vem sendo usada para lentivirus de pequenos ruminantes somente para esclarecer resultados divergentes e no estudo da composição das proteínas virais dos LVPR 93

6 (PINHEIRO, 2001). CONSIDERAÇÕES FINAIS A principal forma de detecção de animais infectados pelo MV é o uso de testes sorológicos como IDGA, que devido sua alta especificidade e praticidade é o teste indicado pela OIE para o diagnóstico da MV. Entretanto, possui um valor limitado na identificação de animais em fase inicial da infecção, constituindo um grande problema quando na aquisição de animais. Assim o diagnóstico precoce, técnicas moleculares de detecção viral são mais indicadas, dentre elas a PCR, que detecta a presença do material genético do agente causador da doença, não necessitando de nenhuma resposta do organismo. Considerando o exposto a associação de testes sorológicos e moleculares, provém um diagnóstico confiável e precoce. AGRADECIMENTOS A Fundação Cearense de apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico (FUNCAP) pelo apoio financeiro em forma de bolsa de estudos. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AFSHAR, A.; DULAC, G.C.; RIVA, J. Comparison of blocking dot ELISA and competitive ELISA, using a monoclonalantibody for detection of bluetongue virus antibodies in cattle. Veterinary microbiology, v. 31, p , ALKAN, F.; TAN, M. T. A. A comparative study on the diagnosis of Maedi-Visna infection in serum and colostrum samples using agar gel immunodiffusion (AGID) technique. Deutsch Tierarztl wochenschr, v. 105, p , ALMEIDA, N. C. Isolamento e identificação do vírus Maedi-Visna através de microscopia eletrônica de transmissão de animal comprovadamente soropositivo pelo IDGA p. Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias) Faculdade de Veterinária, Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza, ANDRÉS, A.; KLEIN, D.; WATT, N. J.; BERRIATUA, E.; TORSTEINSDOTTIR, S.; BLACKLAWS, B. A.; HARKISS, G. D. Diagnostic tests for small ruminant lentiviruses. Veterinary microbiology, v. 107, p , 2005 ARAÚJO, S. A. C.; DANTAS, T. V. M.; SILVA, J. B. A.; RIBEIRO, A. L.; RICARTE, A. R. F.; TEIXEIRA, M. F. S. Identificação do Maedi-visna vírus em pulmão de ovinos infectados naturalmente. Arquivos do Instituto Biológico, v. 71, p , BANKS, K. L.; ADAMS, D. L.; McGUIRE, T. C.; JAM, N.; CARLSON, B. S. Experimental infection of sheep by caprine arthritis-encephalitis virus and goats by progressive pneumonia virus. American Journal Veterinary Research, v. 44, p , BARLOUGH, J.; EAST, N.; ROWE, J. D.; VANHOOSEAR, K.; DEROCK, E.; BIGORNIA, L.; RIMSTAD, E. Double-nested polymerase chain reaction for detection of caprine arthritisencephalitis virus proviral DNA in blood, milk and tissues of infected goats. Journal Virological Methods, v. 50, p , BLACKLAWS, B. A.; BERRIATUA, E.; TORSTEINSDOTTIR, S.; WATT, N. J.; DEANDRES, D.; KLEIN, D.; HARKISS, G. D. Transmission of small ruminant lentivirose. Veterinary Microbiology, v. 101, p , BRANCH, S. L.; LEVETT, P.N. Evaluation of four methods for detection of immunoglobulin M antibodies to dengue virus. Clinical Diagnostic laboratory Immunology, v. 6, p , BRODIE, S. J., PEARSON, L. D., SNOWDER, G. D., DEMARTINI, J. C. Host-virus interaction as defined by amplification of viral DNA and serology in lentivirus-infected sheep. Archives of Virology, v.130, p , BROWN, C. In situ hybridization with riboprobes: an overview for veterinary pathologists. Veterinary Pathology, v. 35, p , CAREY, N.; DALZIEL, R. G. The biology of Maedivisna virus. An overview. Brazilian Veterinary Journal, v. 149, p , CARROZZA, M. L.; MAZZEI, M.; BANDECCHI, P.; ARISPICI, M.; TOLARI, F. In situ PCRassociated immunohistochemistry identifies cell types harbouring the Maedi-Visna virus genome in tissue sections of sheep infected naturally. Journal of Virological Methods, v. 107, p , CASTRO, R. S.; LEITE, R. C.; RESENDE, M.; MARTINS, A.; GOUVEIA, A. M. G. Isolamento e identificação pela Imunofluorescência direta e reação em cadeia de polimerase do vírus da Artrite- Encefalite caprina. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v. 51, p ,

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