UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS ROSIVALDO QUIRINO BEZERRA JÚNIOR INFLUÊNCIA DA ARTRITE ENCEFALITE CAPRINA (CAE) NAS CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICA E MICROBIOLÓGICA DO LEITE E ANÁLISE HISTOLÓGICA DA GLÂNDULA MAMÁRIA FORTALEZA

2 ROSIVALDO QUIRINO BEZERRA JÚNIOR INFLUÊNCIA DA ARTRITE ENCEFALITE CAPRINA (CAE) NAS CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICA E MICROBIOLÓGICA DO LEITE E ANÁLISE HISTOLÓGICA DA GLÂNDULA MAMÁRIA Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Linha de Pesquisa: Sanidade de pequenos ruminantes. Orientador (a): Profa./Dra. Maria Fátima da Silva Teixeira. FORTALEZA

3 FICHA CATALOGRÁFICA A ficha catalográfica deve ser digitada no verso da folha de rosto. (Consulte a bibliotecária da UECE) 3

4 ROSIVALDO QUIRINO BEZERRA JÚNIOR INFLUÊNCIA DA ARTRITE ENCEFALITE CAPRINA (CAE) NAS CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICA E MICROBIOLÓGICA DO LEITE E ANÁLISE HISTOLÓGICA DA GLÂNDULA MAMÁRIA Aprovada em / / Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias. BANCA EXAMINADORA Profa. Dra. Maria Fátima da Silva Teixeira Universidade Estadual do Ceará Orientador (a) Prof. Dr. Jean Berg Alves da Silva Universidade Federal Rural do Semiárido Examinador Profa. Dra. Janaína Serra Azul Monteiro Evangelista Universidade Estadual do Ceará Examinadora Dra. Maria Gorete Flores Salles Médica Veterinária Examinadora 4

5 A MILTON JOSÉ DOS RAMOS, meu avô e grande amigo, que sempre amou cada planta, grão de areia, animal, cada beleza deste mundo em uma intensidade imensurável, única. (...) Que me mostrou o quanto os animais têm a dizer. Aos meus pais Rosivaldo Quirino Bezerra e Antonieta Guilherme dos Ramos Bezerra que com amor, carinho e dedicação me apoiaram em todas as etapas de minha vida. A minha família e amigos pelo carinho, apoio na minha formação acadêmica e pela credibilidade a mim dada. 5

6 AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus, eterno e todo poderoso pelo seu imenso amor por nós e sua infinita misericórdia. Aos meus pais, Rosivaldo e Antonieta, e irmãos, pelo amor, pela minha formação pessoal, e por sempre me ensinarem que o mais importante valor que se tem na vida é a família. A Teresa D ávila, minha melhor amiga nesses dois anos em Fortaleza, que me ajudou a passar pelos problemas difíceis dando apoio, dividindo alegrias e tristeza, e o mais importante, sempre mudando os meus dias com um simples sorriso. Aos meus amigos Carlos Alberto, Luís Antônio, Gabrielle e Igor, pela amizade e confiança dadas a mim. Ao meu amigo Ronaldo, parceria no violão, sempre disponível a conversar e discutir sobre as coisas da vida e sobre Deus. Aos demais amigos de laboratório de virologia pela colaboração, amizade e convívio. A todos os meus colegas de pós-graduação pelos momentos de descontração e amizade. A Profa. Dra. Maria Fátima da Silva Teixeira por ter me orientado e me mostrado a importância que devemos dar na buscar de nossos sonhos e objetivos, agindo sempre de forma concisa e ética... E por também mostrar que todos nós podemos fazer parte de uma família onde quer que estejamos. Ao Prof. Dr. Jean Berg Alves Silva, pela orientação na dissertação e por mostrar que há sempre possibilidades, soluções diante dos momentos difíceis na vida. A Profa. Dra. Janaína Serra Azul Monteiro Evangelista pela orientação na dissertação e pela amizade, sempre mostrando que podemos ver a vida de uma forma mais positiva e divertida. A Dra. Maria Gorete Flores Salles, Médica Veterinária do Lar Antônio de Pádua, sempre prestativa e disposta a nos ajudar com seu jeito calmo e acolhedor. A Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico (FUNCAP) pelo apoio financeiro. A UECE e UFERSA, por terem disponibilizado as condições técnica e pessoal. Aos funcionários e professores do Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias pelo incentivo, convívio e opiniões compartilhadas. 6

7 RESUMO A artrite encefalite caprina (CAE) é uma doença de caráter crônico e debilitante, ocasionada por um vírus pertencente à família Retroviridae, subfamília Orthoretrovirinae e gênero lentivirus. Na transmissão, observa-se o leite e colostro de cabras infectadas como importante material de veiculação do vírus da artrite encefalite caprina (CAEV), porém trabalhos referentes às alterações no leite de cabras infectadas são escassos. Com o objetivo de avaliar a influência do vírus da CAE na produção leiteira foram coletadas amostras da glândula mamária de cabras soropositivas e soronegativas para a CAE, sendo realizados exame histopatológico e imunohistoquímica; os parâmetros físico-químicos do leite (gordura, extrato seco, proteínas, lactose e densidade) foram obtidos pela análise ultrassônica de amostras de leite de 54 cabras, sem predileção racial, sendo estas divididas em dois grupos: cabras positivas e negativas para o teste de Imunodifusão em Gel de Agarose (IDGA). Destes animais, 30 amostras de leite foram utilizadas para contagem padrão em placa (CCP) para presença de mesófilas (UFC/mL). Nas amostras de leite avaliadas para a análise físico-química não houve diferença significativa dos parâmetros avaliados entre os dois grupos; no microbiológico, não houve relação direta da presença de mesófilas associada à infecção pelo CAEV. No histopatológico, observaram-se áreas com infiltrado celular de monócitos, polimorfonucleares, plasmócitos, fibrose, ausência de morfologia normal do parênquima mamário, denotando processo inflamatório crônico; sendo confirmada a presença do vírus na glândula pela imunohistoquímica. Concluiu-se que no histopatológico a glândula mamária apresentou lesões características da doença, processo inflamatório crônico, tendo sua presença confirmada pela imunohistoquímica, porém não houve relação direta da incidência da CAE no rebanho como fator negativo nas características do leite. Há então a necessidade de maiores estudos voltados a avaliar as alterações da glândula mamária em cabras naturalmente infectadas com CAEV, e trabalhos mais aprofundados quanto às alterações na produção leiteira como do leite propriamente dito, tomando-se intervalo maior de tempo e avaliando em diferentes estágios da doença. PALAVRAS-CHAVES: CAE. Lentivírus. Leite. Análise físico-química. Histopatológico. 7

8 ABSTRACT The caprine arthritis encephalitis (CAE) is a disease of chronic and debilitating condition caused by a virus belonging to the family Retroviridae, subfamily lentivirus and Orthoretrovirinae gender. In transmission, the milk and colostrum from goats infected serving as an important means of virus carrier, but work on the changes in the milk of infected goats are scarce. In order to evaluate the influence of CAE virus in dairy production, samples of the mammary gland of goats seropositive and seronegative for the CAE, and performed histopathology and immunohistochemistry, the physicochemical composition (fat, dry matter, protein, lactose and density) were obtained by analyzing ultrasonic milk samples from 54 goats, no racial predilection, which are divided into two groups: positive and negative goats to the test in agarose gel immunodiffusion (AGID); and 30 samples of milk were used for standard plate count (SPC) for the presence of mesophilic (CFU / ml). The results of physical-chemical analysis showed no significant difference between the milk samples of two groups. In the microbiological analysis showed the presence of aerobic mesophilic bacteria, but this change is not associated with the presence of CAEV infection. On histopathology, there were areas with infiltration of mononuclear-leukocyte and polymorph nuclear, plasma cells, fibrosis and absence of normal morphology of the mammary tissue, indicating a chronic inflammatory process; and confirmed the presence of virus, in the gland, by immunohistochemistry. It has the necessity of bigger directed studies to evaluate the changes of the mammary gland in goats naturally infected with CAEV and further work on the changes in milk production as milk itself, taking longer interval of time and at different stages of evaluating disease. KEYWORDS: CAE. Lentivirus. Milk. Physical-chemical analysis. Histopathology. 8

9 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Fotomicrografia de glândula mamária. Presença agregado de plasmócitos (A, 400X; H.E.); área de fibrose (B, 100X; H.E.); epitélio transformado, ausência de morfologia normal dos alvéolos mamários (C, 40X; H.E.); parênquima mamário normal (D, 100X; H.E.); marcação multifocal do citoplasma da célula em marrom caracterizando reação positiva na imunohistoquímica (E, 400X; F, 200X). 9

10 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Média dos valores físico-químicos encontrados na analise do leite de animais soropositivos e soronegativos para CAE...40 Tabela 2. Contagem padrão em placas para mesófilos aeróbios

11 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS % - Percentagem AIEV Vírus da Anemia Infecciosa Equina BIV Vírus da Imunodeficiência Bovina CA - Capsídeo CAE Artrite Encefalite Caprina CAEV Vírus da Artrite Encefalite Caprina DNA Ácido desoxirribonucleico ELISA Ensaio Imunoenzimático env Gene que codifica as proteínas do envelope viral FAO Food and Agriculture Organization of United Nations FIV Vírus da Imunodeficiência Felina G Unidade da força centrífuga relativa g - gramas gag gene viral que codifica as proteínas internas do vírus gp Glicoproteína H Graus Hortvet HIS Hibridização in situ HIV Vírus da Imunodeficiência Humana IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística IDGA Imunodifusão em Gel de Agarose IN Integrase LVPR Lentivírus de Pequenos Ruminantes m/m massa por massa MA Matriz MAPA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento Mg² + - Íon Magnésio 11

12 MVV Maedi-Visna Vírus nm Nanômetro OIE - Organização Internacional das Epizootias p - Proteína PCR Reação em cadeia polimerase pol Gene que codifica as enzimas virais PR - Protease rev Gene de regulação viral RIFI - Reação de Imunofluorescência Indireta RIPA - Radioimunoprecipitação RNA Ácido ribonucleico RT Transcriptase reversa SNC Sistema Nervoso Central SIV - Vírus da Imunodeficiência Símia SU - superfície tat Gene de regulação viral TM Transmembranar UHT Ultra-high temperature vif Gene de regulação viral 12

13 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA ARTRITE ENCEFALITE CAPRINA (CAE) Histórico Agente Etiológico, Estrutura e Genoma do vírus Epidemiologia Patogenia Resposta Imunológica Sinais Clínicos Diagnóstico Prevenção e Controle CAPRINOCULTURA E PRODUÇÃO LEITEIRA Importância da Caprinocultura na produção leiteira Caracterização do leite caprino HIPÓTESE CIENTÍFICA OBJETIVOS OBJETIVO GERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS CAPÍTULO CONCLUSÕES PERSPECTIVAS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

14 1. INTRODUÇÃO A caprinocultura no Brasil, principalmente na região nordeste, tem se caracterizado como uma atividade empreendedora, em ascensão, responsável por gerar renda fixa e empregos. Com isso temos uma mudança no quadro nacional, onde, antes um cenário marcado pelo êxodo rural, agora apresenta um contexto de fixação do pequeno criador nessas áreas. Com o desenvolvimento do setor há a necessidade por mudanças visando melhoria das condições de criação, como: estrutura, mão-de-obra especializada, melhoramento genético dos animais, nutrição animal de boa qualidade, dentre outros. Porém, todo esse crescimento não tem valia sem a realização de manejo sanitário adequado, ou seja, práticas adequadas de prevenção e controle. A Artrite Encefalite Caprina conhecida como CAE, abreviação do nome inglês caprine arthritis-encephalitis, foi descrita pela primeira vez pela pesquisadora Linda Cork (1974) e somente alguns anos depois foi identificado o seu agente etiológico. A CAE é uma doença de caráter crônico que ocasiona prejuízos econômicos na ovinocaprinocultura. Uma vez presente no rebanho haverá queda da produção principalmente quando associamos às infecções secundárias como o aparecimento de mastite. A falta de uma vacina eficaz contra o vírus faz com que se adote um conjunto de medidas preventivas para controlar a disseminação da desta enfermidade, instituindo-se um Plano de Saneamento da CAE o qual tem como meta a formação de rebanhos livres da doença. Esse Plano é baseado em exames sorológicos de todos os caprinos da propriedade, realizados a cada seis meses sob o acompanhamento de um médico veterinário. A transmissão pode ocorrer de forma direta, através da ingestão de colostro e leite da própria mãe ou do leite misturado de várias cabras, do contato direto entre animais através dos líquidos corporais (aerossóis, saliva, etc.); e indireta, por meio de objetos contaminados (fômites), pelo homem (iatrogênica). Cabras naturalmente infectadas com o vírus expressam o DNA proviral em diversos tecidos do seu trato genital, tais como útero, ovidutos, além da glândula mamária. A presença dos lentivírus nestes tecidos pode contribuir para a transmissão vertical da enfermidade (Fieni et al., 2002). 14

15 A glândula mamária e seu produto, o leite, têm importante participação no processo de disseminação do patógeno, porém trabalhos relacionados às características físico-químicas e microbiologia do leite de cabras infectadas pelo CAEV e a realização de exame histopatológico e imunohistoquímica são escassos havendo a necessidade de maiores pesquisas nesta área. 15

16 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. ARTRITE ENCEFALITE CAPRINA (CAE) Histórico A artrite-encefalite caprina é conhecida internacionalmente como CAE que é a abreviação do termo em inglês: caprine arthritis-encephalitis (Franke, 1998). Caracteriza-se como uma enfermidade infecciosa, multissistêmica, incurável e de caráter crônico que afeta caprinos em várias fases do desenvolvimento etário, independente do sexo, raça e produção (Cork et al., 1974; Klevjer-Anderson et al., 1984; Lara et al., 2005). O vírus da artrite encefalite caprina (CAEV) foi descrito clinicamente pela primeira vez em 1959 na Suíça, quando caprinos adultos apresentaram artrite crônica (Stünzi et al., 1964), sendo isolado posteriormente de amostras oriundas de caprinos (Cork et al.,1974). Em 1980 essa enfermidade, artrite encefalite caprina, foi reconhecida como virose e, seu agente foi incluso na família Retroviridae (Crawford et al.,1980) Agente Etiológico, Estrutura e Genoma do vírus. O vírus da CAE é um RNA vírus, não oncogênico, que pertence à família Retroviridae e subfamília Orthoretrovirinae, gênero Lentivirus. No gênero Lentivírus estão inclusos, além do CAEV o Maedi-Visna vírus (MVV), os vírus das imunodeficiências felina (FIV), bovina (BIV), símia (SIV) e humana (HIV-1, HIV-2). Neste gênero, encontramos também os vírus da anemia infecciosa equina (AIEV) e Lentivirus puma (ICTV, 2011). Os lentivírus são partículas esféricas, envelopadas com aproximadamente 100 nm de diâmetro com núcleo cônico e denso, no qual estão inseridas moléculas idênticas de RNA fita simples, uma molécula de transcriptase reversa dependente de Mg 2+ e proteínas do nucleocapsídeo (Gonda et al., 1986). O envelope está associado covalentemente com as glicoproteínas transmembranárias e de superfície. Outra estrutura presente na partícula viral é a matriz que está situada entre o capsídeo e o envelope (Pepin et al., 1998). O genoma viral do CAEV e formado por duas fitas simples de RNA sentido + (Cheevers et al., 1981), contendo os genes gag, env e pol, 16

17 típicos da família Retroviridae, e os genes regulatórios tat, rev e vif. O gene gag codifica as proteínas estruturais que constituem o vírion (MA-matriz e CA-capsídeo), o gene pol codifica as varias enzimas responsáveis pelo processo de transcrição reversa e integração proviral (RT-transcriptase reversa, PR-protease e IN-integrase) e o gene env codifica glicoproteínas presentes na superfície do vírion (SU-superfície e TMtransmembranar) com a capacidade de se ligar e fundir com as células alvo. A proteína vif esta associada com a infectividade viral e com o controle da produção das partículas virais infecciosas, enquanto que as proteínas tat e env estão envolvidas com a regulação da expressão viral (Clements & Payne, 1994; Joag, 1996) Epidemiologia No Brasil, a primeira descrição de lentivírus de pequenos ruminantes em caprinos ocorreu no Rio Grande do Sul (Moojen et al., 1986). Estudos realizados na região Nordeste, no Ceará, mostram que a ocorrência de caprinos soropositivos para o CAEV era de 40,73% (Melo & Franke, 1997). Nesse mesmo Estado, foi de 9,2% com 66,7% das propriedades localizadas na região metropolitana de Fortaleza apresentando animais positivos para CAE. Esses mesmos autores verificaram que o regime de criação intensivo foi estatisticamente mais acometido pela doença e deduziram que práticas tais como confinamento e mamadeira coletiva, muito usadas no regime intensivo facilitam a transmissão da CAE. Do mesmo modo, propriedades que criam animais de raças puras leiteiras foram mais afetadas (Pinheiro et al., 2004). Em 2008, um levantamento sorológico para CAEV na região metropolitana do Ceará apresentou 12,8% de soroprevalência dos 125 caprinos testados (Caminha et al, 2008). Nos outros estados da região Nordeste, a prevalência encontrada foi de 13,40%; 0,73% e 26,1% na Bahia (Almeida et al., 2001; Oliveira et al., 2006; Tigre et al., 2006), de 4,4% e 2,5% no Piauí (Pinheiro et al., 1996; Batista et al., 2004), de 2,2% e 8,2% na Paraíba (Castro et al., 2002; Bandeira et al., 2009), de 11,0% no Rio Grande do Norte (Silva et al., 2005), de 50,6% no Maranhão (Alves & Pinheiro, 1997), de 17,7% e 3,9% em Pernambuco (Castro et al., 1994; Castro et al., 2002) e de 4,25% em Sergipe (Melo et al., 2003). 17

18 2.1.4 Patogenia A principal via de infecção das lentiviroses é a digestiva, através da ingestão de colostro ou leite pelas crias de mães infectadas (Adams et al., 1983, Rowe et al., 1992), porém a transmissão pode ocorrer, também, por outras vias onde há contato direto entre os animais, ou indiretamente por materiais contaminados com sangue ou leite de animais infectados (Al-Ani & Vestweber, 1984). A idade, raça e o sexo dos animais parecem não intervir na sua suscetibilidade frente ao CAEV (Rowe & East, 1997), porém outros fatores como estresse, infecções bacterianas e virais concomitantes podem aumentar o risco da infecção (Zink et al., 1987), existindo a possibilidade de alguns animais infectados poderem expressar mais o vírus do que outros (Adams et al., 1983). O agente etiológico da CAE tem tropismo por monócitos e macrófagos, que funcionam como replicação viral e meio de distribuição. A replicação restrita permite que o vírus permaneça latente nos monócitos do hospedeiro e não seja detectável pelo sistema imune (Pugh, 2004). Os mecanismos desenvolvidos pelos lentivírus para persistência da infecção frente a resposta imune incluem: capacidade dos monócitos de conter provírus integrado em seu genoma sem ser detectado pelo sistema imune, pois a expressão do gene viral só é ativada quando os monócitos maturam para macrófagos (Brodie et al., 1995); capacidade de infectar persistentemente macrófagos, sem causar lise celular, podendo disseminar o vírus no próprio hospedeiro, sem a produção de partículas virais, através do contato com outras células (Narayan et al., 1984); interrupção do ciclo viral pelo processamento incompleto da SU (Chebloune et al.,1996); replicação de variantes antigênicos na presença de anticorpos neutralizantes e produção de interferon, que diminui o índice de replicação e favorece a persistência do estímulo antigênico (Klevjer-Anderson & McGuire 1982; Narayan et al., 1984; Zink et al., 1987; Bertoni et al., 1994; Cheevers et al., 1993). A alta mutabilidade do agente que pode resultar em variantes antigênicas funciona como mecanismo de escape da resposta celular e humoral (Knowles et al., 1990; Cheevers et al., 1993; Lichtensteiger et al., 1993). O vírus, quando presente no hospedeiro, consegue chegar ao cérebro, pulmões, articulações e outros órgãos através dos monócitos, onde ocorre posteriormente a maturação destes em macrófagos. A diferenciação em macrófagos ativa a expressão do gene viral e os vírus são então produzidos nestes órgãos (Clements & Payne, 1994). As principais alterações patológicas causadas pelo CAEV encontram-se no sistema nervoso central (SNC), articulações, pulmão e glândula mamaria (Al-Ani & 18

19 Vestweber, 1984 ; Haase, 1986). Cabras naturalmente infectadas com o vírus CAE expressam o DNA proviral em diversos tecidos do seu trato genital, tais como útero, ovidutos, além da glândula mamária. A presença dos lentivírus nestes tecidos pode contribuir para a transmissão vertical da enfermidade (Fieni et al., 2002) Resposta Imunológica A capacidade de estimular dado organismo a produzir uma resposta imune consiste em imunogenicidade (Tizard, 2002). Os LVPR induzem tanto a resposta humoral quanto celular, de diferentes intensidades, mas não protegem contra a infecção (Bertoni et al.,1994; Cheevers et al., 1993). A primeira resposta imunológica dirigida para a proteína do capsídeo (CA), a qual é detectada por volta da 1 semana pósinfecção e por volta da 3 semana pós-infecção; na 5 semana são elaborados anticorpos contra as demais proteínas do nucleocapsídeo (NC), matriz (MA), glicoproteínas transmembranária (TM) e de superfície (SU) (Concha-Bermejillo, 1997), para está última produzidos tardiamente, apresentando baixa afinidade por seu antígeno homólogo e presentes em quantidade insuficiente de forma que não interrompem o ciclo de replicação viral (Bertoni et al.,1994; Cheevers et al., 1993; Kennedy-Stoskopf & Narayan, 1986; Narayan et al., 1984). Em infecções pelo CAEV a indução a produção imediata de anticorpos não ocorre como acontece com o Vírus Maedi-Visna (MVV) (Narayan et al., 1997) Sinais Clínicos A manifestação clínica, segundo Franke (1998), pode ocorrer por meio de cinco quadros clínicos, sendo eles: a artrite, encefalite, mamite, pneumonia e emagrecimento crônico. Geralmente, temos as articulações acometidas, sendo a forma clínica mais observada, manifestando-se em animais com mais de oito meses de idade (Crawford & Adams, 1981; Gonzalez et al., 1987). A articulação do carpo é a mais afetada, aonde se observa aumento na consistência e no volume, sendo o 1 sinal clínico a poliartrite crônica com sinovite e bursite (Crawford & Adams, 1981; Cutlip et al., 1988; Gonzalez et al., 1987; Oliver et al., 1981), porém todas as articulações têm evidência microscópica de infecção. No estado do Ceará, animais soropositivos para a CAE 19

20 apresentavam aumento significativo das articulações carpometacarpianas (Pinheiro et al., 2001, 2005). A forma mamária é frequente, e com grande significado econômico em face do comprometimento da produção leiteira e predisposição a infecções secundárias da glândula mamária (Lerondelle, 1988; Simard & Briscoe, 1990). Na glândula mamária de cabras infectadas, observa-se endurecimento gradativo com a presença de vários nódulos de consistência dura, que confluem para determinar um endurecimento difuso do parênquima mamário, resultando em assimetria das metades do úbere (Gonzalez et al., 1987; Kennedy-Stoskopf et al., 1985; Cheevers & McGuire 1988; Perk,1988). A leucoencefalomielite constitui a forma clínica nervosa da CAE, e sua ocorrência é predominante em cabritos com idades que variam de um a quatro meses de idade. Os sintomas da leucoencefalomielite são: fraqueza muscular, paresia ou ataxia dos membros posteriores, andar em círculo, cegueira, nistagmo, tremores e inclinação da cabeça (Cork et al., 1974; Lara et al., 2005) Diagnóstico O diagnóstico clínico não é suficiente para determinar a doença, pois os sinais clínicos da CAE podem ser confundidos com os de outras enfermidades (Oliveira, 2006). No diagnóstico da CAE existe uma série de técnicas empregadas (Franke, 1998), estando divididas em técnicas imunológicas, análises indiretas, e de detecção do vírus ou seu isolamento, análises diretas. Para o diagnóstico sorológico, o teste de Imunodifusão em Gel de Agarose (IDGA) é o recomendado pela OIE (2004), por ser de fácil aplicabilidade e não exigir equipamentos nem instalações sofisticadas. Este método é a forma diagnóstica mais utilizada em todo mundo, principalmente em programas de controle da doença que já são empregados em vários países (Moojen, 2001). Além da fácil aplicabilidade, o IDGA tem alta especificidade o que acaba credenciando-o para a realização dos diagnósticos de triagem nos programas de controle da enfermidade (Varea et al., 2001). Outros métodos podem ser utilizados para diagnose, sendo eles: Ensaio Imunoenzimático (ELISA), Reação em cadeia da polimerase (PCR), Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), Hibridização in situ (HIS), Radioimunoprecipitação (RIPA), Western Blot (WB) e Isolamento Viral. 20

21 O IDGA utiliza a partícula viral íntegra concentrada a partir de sobrenadantes de cultura ou parte do vírion (proteínas virais) adquiridas pela ação de detergentes ou outros tratamentos. O IDGA detecta anticorpos contra a proteína p25 do capsídeo do MVV (p28 em CAEV) e contra a glicoproteína de superfície gp135. Um estudo relatou ao testar 218 amostras de campo, uma sensibilidade e especificidade diagnóstica de 91% e 100%, respectivamente, obtidas por IDGA confrontadas com o RIPA (Knowles et al., 1994); outro trabalho mais recente examinou soros de 693 ovelhas em sequência, no período de 3-4 anos e encontraram sensibilidade e especificidade para 76,3% e 98,3%, respectivamente, em relação aos escores consenso obtido pelo Teste Imunoenzimático (ELISA) e Western Blot (WB) (Varea et al. 2001). Apesar de apresentar alta especificidade, o IDGA não é um teste recomendado para diagnóstico precoce da doença devido a sua baixa sensibilidade, despertando, assim, o interesse pelo desenvolvimento dos ensaios imunoenzimáticos (ELISA), mais sensíveis. Nesse teste as reações antígeno-anticorpo são detectadas por meio da conjugação de um destes componentes com uma enzima, que posteriormente age sobre o substrato, produzindo uma coloração, que pode ser detectada visualmente ou mensurada por espectrofotometria (Madruga et al., 2001). Em condições experimentais, a imunofluorescência indireta (IFI) tem apresentando um potencial como teste alternativo e complementar para o diagnóstico dos LVPR. Esse ensaio consiste em tornar visível a reação antígeno-anticorpo por meio de uma anti-imunoglobulina marcada com fluorocromos. Estes são substâncias que têm a capacidade de absorver energia luminosa, tornando-se excitadas por um curto espaço de tempo (10-9 a 10-7 segundos), para em seguida emiti-la em forma de fluorescência ao retornarem ao seu estado normal. Os fluorocromos mais comumente empregados são derivados da rodamina, que emitem fluorescência vermelha, e o isotiocionato de fluoresceína que emite fluorescência verde (Madruga et al., 2001). A IFI é recomendada pela OIE, e tem sido utilizada no diagnóstico de infecção em ovinos e caprinos, utilizando-se como antígeno os isolados brasileiros de lentivírus, porém neste exame a exposição à fonte de luz ultravioleta é desgastante, tornando o técnico mais susceptível a erros e, consequentemente na precisão do teste, assim o IDGA permanece como teste de escolha para o diagnóstico da CAE, devido à maior facilidade de execução e leitura e, por requerer infraestrutura laboratorial mínima (Reischak, 2000). 21

22 O isolamento e identificação do vírus por meio do cultivo de tecido, incluindo a explantação de tecidos articulares, pulmonares, do sistema nervoso e de glândula mamária; e o co-cultivo em células de membrana sinovial de cultivo primário caprino com células sanguíneas, colostro, leite, lavado brônquio-alveolar e líquido cerebrospinal representa um diagnóstico determinante (Cork & Narayan, 1980; Hötzel et al., 1993; Callado, 1999), sendo as culturas primárias de células de membrana sinovial as mais usadas para o isolamento e caracterização biológica do CAEV (Crawford et al., 1980; Narayan et al., 1980). Porém, por ser uma técnica demorada, dispendiosa, e que requer a implantação e manutenção de cultivos celulares especiais não é utilizada rotineiramente para o diagnóstico dessa doença (Knowles, 1997). Outra técnica utilizada é a imunohistoquímica, voltando-se para a identificação de partículas virais em tecidos infectados, podendo esta ser utilizada tanto para testes de susceptibilidade in vitro quanto para identificação do vírus em tecidos de animais naturalmente infectados. Carroza et al. (2003) utilizando o PCR in situ associado à imunohistoquímica em células de tecido pulmonar e glândulas mamárias, identificaram vários tipos celulares carreando o ácido nucléico viral Prevenção e Controle Entre os grandes problemas no controle e prevenção da CAE está o diagnóstico realizado de forma tardia, principalmente por não ser uma medida comum ao programa sanitário das propriedades, seja decorrente de desconhecimento, questão cultural ou mesmo por falta de condição do produtor. As medidas sanitárias adotadas para o controle e a erradicação da infecção pelo CAEV estão diretamente relacionadas com o tamanho, o tipo de exploração, o manejo e o grau de infecção dos rebanhos. Estas incluem medidas como a aplicação de testes sorológicos sensíveis e específicos a serem realizados semestralmente em todos os caprinos. Não há tratamento especifico para a CAE (East, 1993). A maioria dos animais que apresentam sintomatologia clínica são descartados ou sacrificados devido à claudicação, decúbito, perda de peso e redução da produção (Reilly et al., 2002), sendo que a única forma de evitar sua transmissão é estabelecer medidas de controle e 22

23 prevenção da doença. A maneira mais efetiva de controlar a infecção consiste em se proceder à remoção dos animais infectados e interromper a difusão do agente. 2.2 CAPRINOCULTURA E PRODUÇÃO LEITEIRA Importância da Caprinocultura na produção leiteira A cabra foi o primeiro animal a ser domesticado para subsistência, desde a produção de leite assim como a produção da carne e obtenção da pele. A cabra doméstica de hoje é a Capra hircus. Provavelmente os ancestrais mais antigos dessa cabra sejam dois: a Capra sivalencis e Capra perimensis, conhecidos apenas em forma de fósseis. Os ancestrais que ainda são encontrados vivos e que formaram as nossas cabras são: a Capra aegagrus, da qual descende a maioria das raças (Alpina, Angorá, etc.), da região da Pérsia e da Ásia Menor; e a Capra falconezi que resultou nas cabras de cachemira, da região do Egito. No Brasil os caprinos foram introduzidos com os colonizadores portugueses, franceses e holandeses. Porém, somente em 1910 é que figuram importações de animais com maior potencial de produção (Cria & Plantar, 2008). No Brasil a Região Nordeste é detentora de grande parte do rebanho caprino do país, aproximadamente 91,4% dos 9,164 milhões de caprinos existentes segundo dados do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE, 2009), correspondente a 1,1 % do rebanho mundial (FAO, 2008). Em 2007 o Brasil ocupou a 19º posição na produção de leite de cabra mundial, segundo a FAO (Food and Agriculture Organization of United Nations). A Bahia é o grande estado produtor de caprinos no Brasil, detendo 33,7% do efetivo nacional. Não por coincidência, dos dez principais municípios produtores, sete são da Bahia. A criação deste rebanho é direcionada economicamente para a produção de pele e carne, mas a produção de leite tem sua taxa de participação neste processo, mesmo que ínfima (apenas 1,3% da produção total de leite produzida no mundo, aproximadamente 141 toneladas). Muito dos produtores têm a produção de leite como uma atividade secundária, mas que de certa forma tem alcançado uma 23

24 participação importante na economia do país, sendo considerada em algumas áreas a atividade principal. A criação de caprinos na Região Nordeste visando à produção leiteira tem gerado emprego e renda no setor rural, com alto impacto social e econômico para o crescimento da região. Explica Costa (2005) que a produção nacional diária de leite de cabra é de litros, sendo a produção mensal de litros e a produção anual de litros. O potencial de demanda, mesmo se considerando que a clientela para o leite de cabra é formada por um público diferenciado é, com certeza, o dobro destes valores de produção, havendo, portanto, um déficit de oferta de litros de leite por dia e litros de leite por mês. A região Nordeste produz diariamente litros de leite de cabra, 45.4% da produção nacional. O Estado do Rio Grande do Norte é o principal produtor, com litros/dia. No Estado do Ceará, a produção de leite diária chega aos litros, sendo que a região Norte do Estado apresenta um potencial de produção de 400 litros de leite por dia. A produção do Sudeste é de litros, 54.6% de todo o leite de cabra que é produzido no País, e por apresentar uma cadeia produtiva organizada, com processamento industrial e a garantia de comercialização do leite e de seus derivados, o que assegura a evolução do setor. O mercado está subdividido em venda de leite fluído (93%), venda de leite em pó (4%) e venda de queijos, doces e iogurtes (3%). O preço médio do leite in natura adquirido aos produtores é de R$ 0,70 e o leite pasteurizado chega aos varejistas com o preço médio de R$ 1,30 e estes repassam aos consumidores a um preço médio de R$ 1,80. O leite de cabra apresenta em média na sua composição físico-química (em 100 ml): 86,6g de água; 4,7g de carboidratos (lactose); 3,3g de proteínas (caseína, Lactoalbumina, β-lactoglobulina, etc.); 4,1g lipídeos (vários ácidos graxos, fosfolipídeos, etc.); 130mg de Cálcio; 159mg de Cloro; 16mg de Magnésio; 106mg de Fósforo; 181mg de Potássio; 41mg de Sódio; 16mg de Enxofre; 0,27μg de Ácido fólico; 134UI de vitamina A; 48μg de vitamina B1; 114μg de vitamina B2; 0,02μg de vitamina B12; 1,4mg de vitamina C e 273μg de ácido nicotínico (HAFEZ, 1988; BACILA, 2003). O leite trata-se de um alimento de grande importância no contexto mundial por conter elementos necessários a nutrição humana, como o açúcar (lactose), Proteínas, Gorduras, Vitaminas, Minerais (ferro, cálcio, fósforo etc.). As partículas de gordura do leite de cabra são de tamanho reduzido em relação ao leite de vaca. Com isso, o leite é 24

25 rapidamente absorvido, em cerca de 40 minutos, enquanto o leite de vaca demora, em média, de 2 horas, deixando menos resíduos no intestino, evitando assim fermentação, formação de gases, má digestão, constipação, etc. Também possui capacidade tamponante; é uma excelente fonte de cálcio e vitaminas, possuindo 130 mg de cálcio para cada 100 ml de leite, ou seja, 20% mais que o leite de vaca, sendo muito utilizado na ação preventiva e curativa de osteoporose. Para quem precisa de uma rápida reposição e aquisição de nutrientes, o leite de cabra é uma ótima alternativa (Revista o Berro, 2004). É importante que esse leite tenha boa precedência, ou seja, proveniente de um rebanho livre de doenças, entre elas principalmente a CAE (Brasil, 2000). A CAE quando presente no rebanho se deve a não realização de medidas de prevenção e controle. Em algumas propriedades chega a atingir mais de 60% das cabras, provocando uma grave perda econômica pela redução ou mesmo supressão da produção de leite (Franke, 1998) Caracterização do leite caprino O leite de cabra pode ser classificado, quanto ao teor de gordura em: leite de cabra integral: quando não houver qualquer alteração do teor de gordura contido na matéria-prima; leite de cabra padronizado: quando o teor de gordura, expresso em % m/m, for acertado para 3%; leite de cabra semidesnatado: quando o teor de gordura, expresso em % m/m, for acertado para o intervalo entre 0,6 e 2,9 %; leite de cabra desnatado: quando o teor de gordura, expresso em % m/m, não superar o limite máximo de 0,5%. É importante salientar que esta classificação deverá ser seguida para o leite beneficiado e comercializado sob as formas fluída e congelada, independentemente do tipo de processamento térmico. Com relação à denominação de venda este é classificado em: leite de Cabra Pasteurizado Integral, ou Padronizado, ou Semidesnatado ou Desnatado devendo ser adicionada a expressão "Congelado" no final da denominação de venda descrita acima, quando for o caso; leite de Cabra Esterilizado, seguindo-se a classificação quanto ao teor de gordura; e leite de Cabra UHT (UAT), seguindo-se a classificação quanto ao teor de gordura (Brasil, 2000). 25

26 Quantos as características físico-químicas, o leite caprino foi avaliado por diversos pesquisadores no intuito de entender sua normalidade (Barros & Leitão, 1992; Prata et al., 1998; Queiroga et al., 1998; Tonin & Nader Filho, 2002; Gomes et al., 2004; Pereira et al., 2005; Fonseca et al., 2006; Queiroga et al., 2007; Silva, 2007; Andrade et al., 2008; Silva, 2010). A composição pode variar conforme a raça, idade, ciclo estral, estágio da lactação, alimentação, condições ambientais, manejo, estado de saúde, quantidade de leite produzido e a fisiologia individual do animal (Furtado & Wolfschoon-Pombo, 1978; Guimarães, 1989; Alves & Pinheiro, 2004). O Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento - MAPA, pela Instrução Normativa N 37 de 31 de Outubro de 2000 (Brasil, 2000), estabeleceu requisitos mínimos de qualidade do leite destinado ao consumo humano, fixados no Regulamento Técnico de Produção, Identidade e Qualidade do Leite de Cabra: 13 a 18 D para acidez; 2,9%, gordura; 4,3%, lactose; 8,2%, de sólidos não gordurosos e 1.028,0 a 1.034,0 para densidade a 15 C; índice crioscópico, H, -0,550 0 H a -0,585 para todas as variedades. Os elementos nutricionais, sobretudo proteínas, carboidratos, vitaminas e minerais contidos no leite, transformam-no em um excelente substrato para o crescimento de microrganismos. Por este motivo, o leite deve ser obtido com máxima higiene e mantido em baixa temperatura, desde a ordenha até a ocasião de seu beneficiamento, visando garantir as características físicas, químicas e nutricionais do produto final (Oliveira, 2008). Os principais microrganismos envolvidos com a contaminação do leite são as bactérias, visto que os vírus, fungos e leveduras têm participação reduzida em termos de contaminação. Com relação à faixa de temperatura ótima para multiplicação, as bactérias podem ser classificadas em três categorias distintas: psicrófilas, mesófilas e termófilas. A faixa ótima de crescimento da microbiota psicrófila encontra-se entre 0ºC e 15º C; a das mesófilas, entre 20ºC e 40ºC; e das termófilas entre, 44ºC e 55ºC. Além dessas, duas outras categorias de microrganismos são importantes: as bactérias psicrotróficas e as termodúricas (Fonseca & Santos, 2007). De acordo com a Instrução normativa n 37 do MAPA o leite de cabra, quando cru, deverá apresentar Contagem Padrão em Placas (CPP) de, no máximo, UFC/mL (quinhentas mil Unidades Formadoras de Colônias por mililitro) (Brasil, 2000). 26

27 Glândula Mamária As glândulas mamárias, explica Dellmann & Brown (1982), são órgãos especializados da pele originados embriologicamente pela invaginação de brotos ectodérmicos para o interior do mesoderma subjacente. Seu desenvolvimento começa no embrião e continua de modo muito lento, durante o período pré-puberal. Na fêmea, o seu crescimento aumenta, após a puberdade, como resultado da estimulação hormonal cíclica. A glândula mamária consiste em glândula túbulo-alveolar composta. A unidade secretora consiste em um alvéolo e um ducto, ambos com estrutura semelhante (Dellmann & Brown, 1982). As porções secretoras túbulos-alveolares da glândula mamária são constituídas por um epitélio glandular que varia de cúbico a cilíndrico, e células mioepiteliais. O lúmen apresenta até 1 mm de largura. As células epiteliais apresentam um abaulamento apical que se projeta para dentro da luz, qual se dispõem gotículas lipídicas de até 5 µm de diâmetro, secretadas de modo apócrino. No lúmen encontram-se frequentemente glóbulos de gordura de leite e material basófilo finamente floculado (proteínas do leite). O citoplasma é basófilo (rico em RE granular, onde são produzidas a proteínas do leite) (Welsch, 2003). Na glândula mamária de cabras infectadas, observa-se endurecimento gradativo com a presença de vários nódulos de consistência dura, que confluem para determinar um endurecimento difuso do parênquima mamário, resultando em assimetria das metades do úbere (Gonzalez et al., 1987; Kennedy-Stoskopf et al., 1985; Cheevers & McGuire 1988; Perk,1988). As lesões histológicas observadas na glândula mamária dos animais clinicamente afetados pela CAE consistem em extensiva infiltração intralobular de linfócitos e marcada hiperplasia linfóide adjacente aos ductos lactíferos (Al-Ani E Vestweber, 1984). Lerondelle et al. (1989) em seus resultados encontrou infiltrado moderado de linfócitos e macrófagos, abundância de tecido conjuntivo e linfoadenopatia subaguda ou crônica. 27

28 3. HIPÓTESE CIENTÍFICA O CAEV é responsável por causar alterações na glândula mamária em cabras naturalmente infectadas que podem levar a alterações na composição do leite. 28

29 4. OBJETIVOS 4.2. OBJETIVO GERAL Avaliar a influência do vírus da artrite encefalite caprina (CAEV) na glândula mamária de cabras naturalmente infectadas e possível alteração nas características do leite OBJETIVOS ESPECÍFICOS Realização de triagem sorológica do rebanho visando a aplicação de medidas de controle e prevenção na propriedade; Realizar exame histopatológico e Imunohistoquímica da glândula mamária de animais soropositivos e soronegativos para CAE; Executar análises físico-química (temperatura, ph, gordura, extrato seco desengordurado, densidade, proteína, lactose, ponto de congelação, teor de água, condutibilidade) e microbiológica das amostras de leite de cabras positivas para CAE em comparação a amostras de leite de cabras soronegativas para CAE. 29

30 5. CAPÍTULO 1 ALTERAÇÕES HISTOPATOLÓGICAS DA GLÂNDULA MAMÁRIA E QUALIDADE DO LEITE DE CABRAS NATURALMENTE INFECTADAS COM O CAEV (Histopathological changes in the mammary gland and quality milk goats naturally infected with CAEV) Periódico: Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia (submetido em junho de 2011). 30

31 Resumo Alterações histopatológicas da glândula mamária e qualidade do leite de cabras naturalmente infectadas com o CAEV R. Q. Bezerra Júnior¹, ², M. F. S. Teixeira 2,3, G. R. Martins², M. R. Abrantes 4, R. P. Dias², T. D. F. Aguiar 2, L. A. O. Alves², C. A. F. Lopes Júnior², J. B. A. Silva 4, J. S. A. M. Evangelista², M. G. F. Salles 5. ¹. Aluno de pós-graduação - UECE - Bolsista FUNCAP Fortaleza, CE ². Programa de pós-graduação em ciências veterinárias UECE Av. Paranjana, 1700 Itaperi CEP Fortaleza, CE. 3. Bolsista de produtividade em pesquisa do CNPq nível 2 4. Laboratório de Inspeção de Produtos de origem animal da UFERSA Mossoró, RN. 5. Médica veterinária do Lar Antônio de Pádua. Com o objetivo de avaliar a influência do vírus da CAE nas características físicoquímicas do leite foram coletadas amostras de leite de 54 cabras, sem predileção racial, sendo estas divididas em dois grupos: cabras positivas e negativas para o teste de Imunodifusão em Gel de Agarose (IDGA). As amostras de leite foram submetidas à análise ultrassônica para obtenção de parâmetros físico-químicos (gordura, extrato seco, proteínas, lactose e densidade); realização de microbiologia (bactérias mesófilas UCF/mL); e das cabras em estudo foram coletadas amostras de tecido mamário para exame histopatológico e imunohistoquímica. Nas amostras de leite avaliadas para a análise físico-química não houve diferença significativa dos parâmetros avaliados entre os dois grupos; no microbiológico, não houve relação direta da presença de mesófilas associada a infecção pelo CAEV. No histopatológico, observaram-se áreas com infiltração celular de monócitos, polimorfonucleares, plasmócitos, fibrose, ausência de morfologia normal do parênquima mamário, denotando processo inflamatório crônico; sendo confirmada a presença do vírus na glândula pela imunohistoquímica. Os resultados apresentados não mostraram relação direta da incidência da CAE no rebanho como fator negativo no desenvolvimento deste, porém é de conhecimento que a enfermidade, em sua cronicidade, ocasiona redução das características produtivas do rebanho. Palavras-chaves: CAE, Lentivírus, Análise físico-química, Leite. 31

32 Abstract Aiming to evaluate the influence of CAE viruses in the chemical and physical characteristics of milk, the samples were collected from 54 goats, without racial predilection, these were divided into two groups: goats positive and negative according results of test Agarose Gel Immunodiffusion (AGID). Milk samples were ultrasonic analyzed to obtain physicochemical parameters (fat, solids, protein, lactose and density); performance microbiology (mesophilic bacteria UFC/ ml) and mammary gland samples were collected for evaluation histopathology and immunohistochemistry. The results of physical-chemical analysis showed no significant difference between the milk samples of two groups. In the microbiological analysis showed the presence of aerobic mesophilic bacteria, but this change is not associated with the presence of CAEV infection. On histopathology, there were areas with infiltration of mononuclearleukocyte and polymorph nuclear, plasma cells, fibrosis and absence of normal morphology of the mammary tissue, indicating a chronic inflammatory process; and confirmed the presence of virus, in the gland, by immunohistochemistry. The results showed no direct relationship between incidence of CAE in the herd as a negative factor for its development, however it is known that the disease in its chronic nature, causes reduction in the productivity of the herd. Keywords: CAE, lentiviruses, Physical-chemical analysis, Milk. INTRODUÇÃO A Artrite Encefalite Caprina (CAE) é uma enfermidade multissistêmica, de caráter crônico e debilitante, apresentando como principais formas clínicas: artrite, pneumonia e mastite, observadas em animais adultos e mais raramente a leucoencefalomielite em caprinos jovens (Pugh, 2004). É ocasionada pelo Vírus da Artrite Encefalite Caprina CAEV, pertencente à família Retroviridae, subfamília Orthoretrovirinae e gênero Lentivirus (ICTV, 2009). A transmissão pode ocorrer de forma direta, através da ingestão de colostro e leite da própria mãe ou do leite misturado de várias cabras, do contato direto entre 32

33 animais através dos líquidos corporais (aerossóis, saliva, etc.); e indireta, por meio de objetos contaminados (fômites), pelo homem (iatrogênica). A idade, raça e o sexo dos animais parecem não intervir na sua suscetibilidade frente ao CAEV (Rowe e East, 1997), porém outros fatores como estresse, infecções bacterianas e virais concomitantes podem aumentar o risco da infecção (Zink et al., 1987), existindo a possibilidade de alguns animais infectados poderem expressar mais o vírus do que outros (Adams et al., 1983). Cabras naturalmente infectadas com o vírus CAE expressam o DNA proviral em diversos tecidos do seu trato genital, tais como útero, ovidutos, além da glândula mamária. A presença dos lentivírus nestes tecidos pode contribuir para a transmissão vertical da enfermidade (Fieni et al., 2002). A influência da infecção pelo vírus da CAE na constituição físico-química do leite de caprinos foi estudada por pesquisadores como Nord e Adnoy (1997), os quais observaram que os valores de lactose, gordura e proteína não sofreram variações significativas que pudessem ser creditadas à infecção pelo vírus; Birgel Júnior et al. (2007), através da análise do leite de cabras das raças Saanen e Pardo Alpina frente ao CAEV, confirmou ser evidente e significativa a influência da enfermidade na composição físico-química e celular do leite, observada, por exemplo, em valores de eletrocondutividade, teores de cloretos e a contagem de células somáticas que foram maiores nas cabras infectadas pelo CAEV com ou sem sinais de endurecimento difuso da mama. O leite atua como importante veiculador e disseminador da enfermidade quando existente a presença do patógeno, e, consequentemente, espera-se que haja alguma alteração evidente no mesmo quanto as suas características organolépticas e físicoquímicas. Porém, a falta de trabalhos referentes, bem como a ausência de informações sobre a influência da doença nos valores físico-químicos, faz com que seja necessária a realização de pesquisas neste sentido. Assim, o presente trabalho objetivou avaliar a influência da CAE nas características físico-químicas e microbiológicas do leite de cabras naturalmente infectadas e estudar histopatologicamente a glândula mamária. MATERIAL E MÉTODOS As coletas foram realizadas em um capril situado na zona metropolitana de Fortaleza/CE (Pacatuba). O experimento foi realizado no período de novembro a dezembro de Esse projeto de pesquisa foi avaliado pela Comissão de Ética para o 33

34 Uso de Animais em Pesquisa da Universidade Estadual do Ceará (CEUA UECE), sendo aprovado sob o número de protocolo /32. Animais A escolha dos animais foi independente de raça, sendo selecionadas cabras com idade entre 2-3 anos. Foram coletadas amostras de sangue de 62 animais para sorologia, porém para a análise físico-química e microbiológica, realizou-se escolha aleatória de 54 cabras dentro do grupo de animais considerado soropositivos (28 animais) e soronegativos (26 animais) para o IDGA. Esse n amostral para a análise físicoquímica foi estabelecido adotando-se um nível de confiança de 95%, com erro amostral de 5%. Coleta das amostras (sangue e leite) As coletas foram divididas em duas etapas distintas: na primeira, a coleta de sangue dos caprinos por venopunção da jugular para posterior realização de exame sorológico, IDGA; e na segunda, a coleta de amostras de leite de cabras soropositivas e soronegativas no IDGA para realização de análises físico-química e microbiológica. A sorologia foi realizada no Laboratório de Virologia (LABOVIR), Universidade Estadual do Ceará (UECE); as análises físico-química e microbiológica no Laboratório de Inspeção de Produtos de Origem Animal (LIPOA), Universidade Federal do Semiárido (UFERSA). Imunodifusão em gel de agarose Na coleta foram obtidas amostras de 10 ml de sangue, acondicionadas em recipiente refrigerado e levadas ao laboratório para processamento. As amostras foram centrifugadas a 3000 rpm durante 10 minutos para obtenção do soro e posterior realização do IDGA. O kit diagnóstico utilizado foi o BIOVETECH, sendo realizada a análise conforme instruções do fabricante. 34

35 A primeira leitura foi realizada com 24 horas após incubação e a leitura definitiva ocorreu após 48 horas de incubação. As reações foram avaliadas pela presença de linhas identidade com a linha de precipitação, obtidas entre antígeno e soro dos animais e soro controle. Análise físico-química das amostras do leite Durante a ordenha, depois de desprezado os primeiros jatos de leite, amostras foram coletadas em tubos Falcon estéreis de 50 ml, acondicionadas em recipiente refrigerado e levadas ao LIPOA para posterior análise ultrassônica. As amostras foram avaliadas em duplicata, realizando-se em seguida cálculo da média dos resultados. A avaliação das características físico químicas do leite foi realizada através do analisador de leite ultrassônico (Ekomilk Total, CAP-LAB ), sendo avaliados os seguintes parâmetros: densidade, temperatura, proteína, lactose, gordura, extrato seco desengordurado, ph e condutividade. Através dos valores da gordura e ESD pode-se calcular o EST, e com os valores da temperatura e densidade, pode-se obter o resultado da densidade a 15 C. Seguiram-se as normas estabelecidas pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), segundo a Instrução Normativa N 37 de 31 de Outubro de 2000 (Brasil, 2000). Exame microbiológico (contagem padrão em placas - CPP) De cada amostra de leite (n=29) preparou-se diluições sucessivas 10 - ¹, 10 - ², 10 - ³ e 10 - ⁴, sendo utilizada a partir da 10 - ². Foi transferido 1 ml de cada diluição para placas de Petri, esterilizadas, em duplicata. Adicionou-se 20 ml de ágar padrão para contagem. As placas foram homogeneizadas através de realização de movimentos circulares e deixadas em repouso até a solidificação do ágar. Após a solidificação as placas foram incubadas em estufa a 37ºC por 48 horas. Procedeu-se então a contagem, cujo resultado foi expresso em unidade formadora de colônia por ml (UFC/mL). O exame microbiológico seguiu protocolo estabelecido pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento - MAPA, segundo a Instrução Normativa N 62 de 26 de Agosto de 2003 (Brasil, 2003). 35

36 Exame histopatológico Após o abate das cabras, amostras de tecido mamário de animais soropositivos e soronegativos para CAE foram coletadas. Realizaram-se cortes histológicos de tecido mamário, 5µm cada, para posterior preparação das lâminas histológicas. Os fragmentos foram fixados em formol e corados por hematoxilina-eosina. Imunohistoquímica A análise imunohistoquímica seguiu metodologia descrita por Ricarte (2009), objetivando a localização topográfica da proteína p28 do CAEV no tecido mamário. Foram realizados cortes histológicos de tecido mamário, 5µm cada, para posterior recuperação de antígenos. Para isto, as lâminas foram incubadas em tampão citrato 10 mm (ph 6,0) com o auxílio de um forno microondas em potência máxima (700 watts). A atividade da peroxidase endógena foi bloqueada utilizando-se 3% de peróxido de hidrogênio (H 2 O 2 ) em água, com duas trocas de cinco minutos cada. Para bloquear as ligações inespecíficas, as amostras foram incubadas em soro contendo anticorpos específicos de espécie diferente dos anticorpos primário (soro positivo para CAE) e secundário (coelho anti-caprino) durante o período de cinco minutos. Em seguida, após lavagem em PBS, foi colocado o anticorpo primário, diluído em PBS, por um período de 10 a temperatura ambiente. Em seguida, foram lavadas em PBS e incubadas com IgG anti-caprino conjugada a peroxidase por 30 minutos a 37 C a uma diluição de 1:1000. A reação foi revelada pela adição da diaminobenzidina tetrahidroclorídeo por 8-10 minutos. As lâminas foram contracoradas com hematoxilina de Mayer por 1 minuto, montadas e analisadas em um microscópio óptico. Estatística Os dados das amostras foram organizados em tabela do Excel, sendo calculadas médias aritméticas, desvios padrão das médias e coeficiente de variação dos resultados obtidos para físico-química. Os resultados foram submetidos a teste estatístico t de Student. 36

37 RESULTADOS E DISCUSSÃO Análise físico-química e microbiológica do leite A tabela 1 apresenta os valores médios obtidos da análise físico-química das 55 amostras coletadas de cabras soropositivas e soronegativas para CAE. Todas as amostras apresentaram valores médios (parâmetros) acima do padrão estabelecido pelo MAPA (2000), e comparando-se os parâmetros dos dois grupos não foi observada diferença significativa entre as amostras. Esses valores acima do padrão podem ser decorrentes do tipo de manejo alimentar aplicado, conforme explica Linn (1989), a alimentação é o fator que mais influencia a composição do leite, onde dietas com poucas fibras resultam em uma produção de leite com baixa porcentagem de gordura. Esses dados corroboram com os achados de Nord e Adnoy (1997), Martínez Navalón et al. (2002) quando avaliados os valores de extrato seco desengordurado, lactose e proteína, e diferem dos encontrados por Birgel Júnior (2007), onde em seus resultados evidenciou a significativa influência da infecção pelo CAEV na composição físicoquímica e celular do leite caprino, e Brito (2009) a qual concluiu que o CAEV contribuiu para um comprometimento na produção leiteira e na qualidade do leite, principalmente nos níveis de gordura do leite, sólidos totais do mesmo e aumento da contagem de células somáticas. Tabela 1 Média dos valores físico-químicos encontrados na analise do leite de animais soropositivos e soronegativos para CAE. PARÂMETROS SOROPOSITIVOS SORONEGATIVOS BRASIL (2000) GORDURA 3,8 3,7 2,9 ESD* 9,4 9,2 8,2 PROTEÍNA 3,3 3,2 2,8 LACTOSE 5,4 5,2 4,3 Estrato Seco Desengordurado* 37

38 Na tabela 2, observam-se os resultados referentes a contagem padrão em placas para mesófilos aeróbios, onde do total de amostras analisadas, 27 (93,1%), amostras de leite encontraram-se em conformidade com o limite estabelecido pela IN37 até o ano de 2010, que é de 1,0 x 10 6 UFC/mL e que 6,9% destas amostras encontram-se fora do critério estabelecido pela IN37. A incidência da CAE não teve relação direta com a presença de bactérias mesófilas uma vez que dentro deste grupo de 27 animais o número de animais positivos e negativos foi aproximado, sem diferença significativa. Tabela 2. Contagem padrão de placas para mesófilos aeróbios. Mesófilos aeróbios (UFC/mL) Níveis de contaminação N % > 0-10² 17 58,6 > 10² - 10³ 6 20,7 > 10³ ,9 > ,9 > ,9 > Total A baixa contaminação presente no leite para mesófilas aeróbias, não significa dizer que o CAEV não tem relação com a presença de patógenos alterando a microbiologia normal do leite, como também a ocorrência de mastite nos animais; como foi mostrado por Birgel Júnior et al. (2005), sobre a ocorrência de mastite indurativa, sendo que das 97 glândulas avaliadas por palpação, endurecimento difuso foi diagnosticado em 19,68% dos animais infectados pelo CAEV. Lara et al. (2005), estudando as formas clínicas da CAE, encontrou a mastite indurativa presente em 6,6% dos caprinos sororreagentes. Os animais aqui trabalhados não apresentaram evidências ao exame clínico de mastite, porém alguns deles apresentavam-se com artrite. 38

39 Exame histopatológico e Imunohistoquímica No tecido mamário de cabras que foram submetidas a exame histológico constatou-se mastite subclínica, caracterizada por infusão linfocitária, denotando a ocorrência de processo inflamatório, sendo as principais mudanças observadas: ácinos mononucleares com fibrose e atrofia; mastite difusa com presença de monócitos e plasmócitos (indicativo de inflamação crônica), infusão monoleucocítica; por todo parênquima mamário extensas áreas com fibrocolágeno (Fig. 1). Achados similares foram encontrados por Gregory et al. (2009). As lesões histológicas observadas na glândula mamária dos animais clinicamente afetados pela CAE consistem em extensiva infiltração intralobular de linfócitos e marcada hiperplasia linfóide adjacente aos ductos lactíferos (Al-Ani E Vestweber, 1984). Lerondelle et al. (1989) em seus resultados encontrou infiltrado moderado de linfócitos e macrófagos, abundância de tecido conjuntivo e linfoadenopatia subaguda ou crônica. Figura 1. Fotomicrografia de glândula mamária. Presença agregado de plasmócitos (A, 400X; H.E.); área de fibrose (B, 100X; H.E.); epitélio transformado, ausência de morfologia normal dos alvéolos mamários (C, 40X; H.E.); parênquima mamário normal (D, 100X; H.E.); marcação multifocal do citoplasma da célula em marrom caracterizando reação positiva (imunohistoquímica; E, 400X, F, 200X). 39