DETERMINAÇÃO DE AFLATOXINAS EM SEMENTES DE AMENDOIM, ARMAZENADAS EM CONDIÇÕES AMBIENTE E EM CÂMARA FRIA 1, 2

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1 1009 DETERMINAÇÃO DE AFLATOXINAS EM SEMENTES DE AMENDOIM, ARMAZENADAS EM CONDIÇÕES AMBIENTE E EM CÂMARA FRIA 1, 2 MARIA DO SOCORRO RAMOS DE QUEIROZ 3, NARENDRA NARAIN 4, ROSA MARIA MENDES FREIRE 5, SANDRA REIS DE FARIAS 3 e ROSEANE CAVALCANTI DOS SANTOS 6 RESUMO: Determinou-se a concentração de aflatoxinas em sementes de amendoim obtidas a partir de plantas cultivadas em regime de sequeiro e armazenadas durante seis meses em dois tipos de ambientes. A quantificação e a identificação das aflatoxinas foram realizadas por Cromatografia em Camada Delgada, através da comparação visual a 366 nm, com padrões e figuras de concentrações conhecidas. O limite de detecção para aflatoxina foi de 1,94 µg/kg. Os quatro genótipos armazenados em condições ambientais (26,9 C e 53% UR- umidade relativa) e em câmara fria (11,9 C e 26% UR) não apresentaram aflatoxinas durante todo o período de armazenamento. Termos para indexação: Arachis hypogaea L, micotoxinas, armazenamento, Aspergillus sp DETERMINATION OF AFLATOXIN IN PEANUT SEEDS STORED IN ROOM TEMPERATURE AND COLD CHAMBER ABSTRACT: Peanut seeds obtained from in non irrigated plants and stored in natural and cold chamber conditions during six months were evaluated to aflatoxins concentration. The aflatoxins quantification was accomplished by Thin Layer Chromatography through visual comparison to 366 nm, with known patterns of illustration and concentrations. The lower detection of aflatoxin was 1.94 mg/kg. The genotypes stored in environmental (26.9 C and 53% UR- relative humidity) and in cold chamber conditions (11.9 C and 26% UR) did not show aflatoxins during the whole storage period. Index terms: Arachis hypogaea L, micotoxins, storage, Aspergillus sp INTRODUÇÃO O amendoim (Arachis hupogaea L.) é uma oleaginosa de grande valor nutricional e seus grãos são largamente utilizados em escala industrial e na fabricação de produtos para consumo in natura e em preparações caseiras. Em virtude de sua importância nutricional na dieta alimentar, a obtenção deste produto dentro dos padrões de qualidade é imprescindível, uma 1,2?????? 3 CCBS/UEPB, CP 781/791, CEP ,Campina Grande, PB. 4 CCET/UFS, CEP , São Cristóvão, SE. narendra@ufs.br 5 Embrapa Algodão, Rua Osvaldo Cruz, 1143, Centenário, Campina Grande, PB, rosa@cnpa.embrapa.br; caval@cnpa.embrapa.br vez que a semente é um substrato vital para o desenvolvimento de fungos toxigênicos, que além de causar degradação dos nutrientes, produzem metabólitos secundários tóxicos aos homens e animais (SABINO et al., 1989). Dentre as micotoxinas encontradas em alimentos e que causam danos a saúde humana, as aflatoxinas são as mais importantes. Produzidas principalmente pelos fungos Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus, as aflatoxinas apresentam potente atividade carcinogênica, mutagênica e teratogênica (WHO, 1979; TOLEDO et al., 1997; STROKA et al., 2000; HORN et al., 2001; MCALPIN et al., 2002).

2 1010 M. S. R. de QUEIROZ, et al. No grupo das aflatoxinas, especial atenção deve ser dada à, por ser a de maior incidência e a mais tóxica, provocando alterações orgânicas que levam a hemorragias através da inibição dos fatores II e VII da coagulação sangüínea, além de lesões no hematócrito. A ingestão de baixas quantidades por um longo período determina baixa conversão alimentar nos animais, imunodepressão e câncer hepático (BALDISSERA et al., 1993, LUZ, 2001). Seus efeitos no homem são verificados através da ingestão direta de alimentos contaminados ou pelo consumo de carne e leite de animais que receberam ração contaminada. Quando no organismo dos animais as aflatoxinas passam por um processo de biotransformação, recebendo a denominação de M 1. O problema das aflatoxinas torna-se mais grave porque a sua inativação nos alimentos não é eficaz, reduzindo apenas pequena parte de sua concentração, e causando alterações indesejáveis, como perda de substâncias nutritivas e mudança no aroma e no sabor dos alimentos (SCUSSEL et al., 1986; PRADO et al., 1996). No Brasil, a RDC nº 274 de 15/10/2002, da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa), determina que o somatório das aflatoxinas B1, B2, G1 e G2, nos grãos de milho e amendoim não exceda a taxa de 20 µg/kg. Dentre os problemas socioeconômicos que influenciaram a redução da área cultivada de amendoim no Brasil, cita-se a substancial presença de aflatoxinas nos grãos, o que afeta a comercialização dos grãos nos mercados interno e externo (GODOY et al. 1999). Embora as condições climáticas das áreas produtoras de amendoim sejam favoráveis ao desenvolvimento e à proliferação desse fungo, o número de trabalhos realizados no Brasil sobre aflatoxinas em amendoim ainda é pequeno. Assim, no presente trabalho, avaliou-se a produção de aflatoxinas em sementes de amendoim armazenadas em condições de temperatura ambiente e de câmara fria por cromatografia em camada delgada. MATERIAL E MÉTODOS A parcela experimental foi composta por 130 g de grãos de amendoim de cada um dos genótipos testados. O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, em arranjo fatorial de 4x4x2 e três repetições, sendo os fatores em estudo: os quatro genótipos (BR 1, BRS 151 L 7, BRS Havana e ), quatro períodos de coleta para análise (0, 60, 120 e 180 dias) e dois ambientes (condições naturais e câmara fria). Foram utilizados para os testes de recuperação, repetibilidade e confirmação da presença de aflatoxinas, os padrões de aflatoxinas, B 2, G 1 e G 2. A metodologia utilizada para o preparo das soluções padrão foi a de AOAC (1995). A concentração dos padrões foi estimada de acordo com a fórmula: Onde: A- Absorbância CF - Fator de calibração do aparelho PM - Peso molecular da micotoxina E - Absortividade molar da micotoxina O trabalho foi dividido em duas etapas; sendo que na primeira, procedeu-se a padronização da metodologia, através dos testes de recuperação e repetibilidade, realizados no Laboratório de Bioquímica da Universidade Estadual da Paraíba, em Campina Grande. Na segunda, conduzida na Embrapa Algodão, as sementes foram armazenadas em temperatura ambiente e na câmara fria durante seis meses (Tabela 1) e analisadas para avaliar a produção de aflatoxinas.

3 DETERMINAÇÃO DE AFLATOXINAS EM SEMENTES DE AMENDOIM 1011 TABELA 1. Dados de temperatura (T) e umidade relativa do ar (UR) durante o período de armazenamento, em condições naturais (CN) e câmara fria (CF) Período CN CF (dias) T 0C UR (%) T 0C UR (%) 0 28,8 54, , ,5 62, ,3 58,22 12,7 21, ,4 49,53 10,5 20, ,71 11,5 21, ,9 44,82 12,1 21, ,4 50,38 12,8 21, ,5 52,69 12,1 20, ,9 53,31 11,2 19, ,3 59,4 11,4 19, ,1 58,04 11,1 21, ,3 48,42 12,2 21, ,62 10,7 21,16 Média 26,9 53,03 11,9 25,94 Determinou-se a umidade na farinha integral pelo método de AOAC (1995). A extração e a purificação das amostras para determinação dos níveis de aflatoxinas foram realizadas de acordo com o método descrito em Soares e Rodrigues- Amaya (1989). A identificação e a quantificação das amostras foi feita por Cromatografia de Camada Delgada e a detecção por comparação visual a 366 nm, com padrões de concentrações conhecidos, preparados de acordo com a metodologia de AOAC (1995). A exatidão do método foi determinada através do teste de recuperação, através da contaminação de uma farinha de amendoim isenta de aflatoxinas com quantidades crescentes da solução do padrão (1,62; 1,94; 3,90; 7,80; 15,60 e 31,10 mg/kg). O teste de repetibilidade foi conduzido de acordo com a mesma metodologia do teste anterior, porém em cinco amostras contaminadas apenas com 31,10 mg/kg do padrão. As amostras, consideradas presuntivamente positivas, foram submetidas aos testes de confirmação um, com ácido sulfúrico e outro de derivação química (Figura 1), com ácido trifluoracético (TFA), para os tipos de aflatoxina e G 1, utilizando-se a metodologia descrita por Scott (1990) FIG. 1. Modelo da placa do teste de derivação química. 1: Amostra; 2: Spot do Padrão ; 3: Amostra + Ácido Trifluoracético (TFA) e 4: Spot do Padrão + Ácido Trifluoracético (TFA). RESULTADOS E DISCUSSÃO Os teores de umidade nas sementes, de 0 (zero) a 180 dias de estocagem em temperatura ambiente, estão apresentados na Figura 2. As sementes dos genótipos de amendoim apresentaram umidade inicial de 6,0% (cultivar BR 1) até 7,3% (cultivar ). Todas as sementes tiveram aumento inicial no teor de umidade, no período de 0 a 60 dias de estocagem, sendo que a BR 1 apresentou o maior aumento, ou seja, 2,8%. Os genótipos armazenados em câmara fria, no período de 0 a 60 dias, também apresentaram pequeno acréscimo no teor de umidade (Figura 3). Almeida (1981) comenta que o aumento do teor de umidade das sementes é influenciado

4 1012 M. S. R. de QUEIROZ, et al. Teor de Unidade (%) BR 1 BRS 151 L 7 BRS HAVANA Período de Armazenamento (dias) FIG. 2. Variação da umidade das sementes de amendoim em condições ambientais. Teor de umidade (%) BR 1 BRS 151 L 7 BRS HAVANA Período de armazenamento (dias) FIG. 3. Variação da umidade das sementes de amendoim em câmara fria pela umidade relativa do ar; contudo, essa elevação não afeta a qualidade das sementes. Lazzari (1993) afirma que a taxa de umidade das sementes de amendoim de até 8%, no prazo máximo de um ano, não promove a deterioração do mesmo. Nos resultados de recuperação da aflatoxina B1 (Tabela 2), observa-se que o valor médio de recuperação da aflatoxina variou de 89,7% a 117,8%, com média geral de 106,8%. O coeficiente de variação do método trabalhado (13,09%) foi aceitável, pois segundo Soares (1987), para o caso de micotoxinas TABELA 2. Valores adicionados, recuperados e coeficiente de variação de recuperação para a aflatoxina Valor adicionado Valor recuperado % recuperado (µg/kg) (µg/kg) (%) Coeficiente de variação (%) 1,94 2, ,37 3,9 3,87 103,3 3,43 7,8 8,64 112,2 21,65 15,6 13,94 89,7 12,92 31,1 36,66 117,8 10,07 Média 106,8 13,09

5 DETERMINAÇÃO DE AFLATOXINAS EM SEMENTES DE AMENDOIM 1013 contaminantes, este pode variar de 0 a 27%. O limite de detecção para a aflatoxina foi de 1,94 mg/kg, similar ao valor obtido por Soares (1987), que observou taxas médias de 2,3 mg/ kg. Este fato pode ser justificado pela utilização de placas de alumínio, enquanto Soares (1987) usou placas preparadas no próprio laboratório. No teste de repetibilidade, o valor médio de cinco determinações recuperadas da quantidade inicial foi de 36,24 ± 3,5 mg/kg, resultando em 116,40% de recuperação, com coeficiente de variação 9,67%. Esses resultados encontramîse dentro dos limites de variabilidade aceitáveis (HORWITZ et al., 1980; THOMPSON, 2000). Com relação à análise das amostras armazenadas em temperatura ambiente e em câmara fria, constatou-se que a maior parte (93 amostras) não apresentaram nenhum tipo de aflatoxina (Figura 5); entretanto três amostras da cultivar BR 1 apresentaram fluorescência, FIG 5. Placa cromatográfica com extrato de amostra de amendoim e uma mistura de padrões. A 1 - spot do extrato do branco; A 2 - spot do extrato de BR 1 ; A 3 - spot do extrato de BRS 151 L 7 ; A 4 - spot do extrato de BRS Havana ; A 5 - spot do extrato de ; P - spot da mistura de padrões, B 2, G 1, G 2. R fs - = 8,5; B 2 = 8,0; G 1 = 7,6 e G 2 = 7,0 com valor do R f (8,8 cm) muito próximo do padrão (8,5 cm). No teste de confirmação através da derivação química, apenas o padrão apresentou esta propriedade, comprovando-se, então, que as três amostras presuntivas positivas também foram negativas. FIG. 4. Placa cromatográfica com extrato de amostras artificialmente contaminadas com 1,94; 3,90; 7,80; 15,60 e 31,10 mg/kg de aflatoxina. A 1 a 4 : spots de amostras artificialmente contaminadas com aflatoxina ; P B1 : spot do padrão Embora o amendoim seja muito susceptível a contaminação por aflatoxinas, observou-se no presente estudo que, nas condições de armazenamento e períodos testados, a contaminação por micotoxinas não foi favorecida. Acredita-se que isso decorra da umidade das sementes e do ambiente, uma vez que a amplitude desta variável não foi favorável ao desenvolvimento do fungo. Prado et al. (1995) estudaram o efeito da temperatura em sementes de milho (Zea mays, Rev. bras. ol. fibros., Campina Grande, v.10, n.1/2, p , jan./ago. 2006

6 1014 M. S. R. de QUEIROZ, et al. L) armazenadas em diversos níveis de umidade e verificaram que a concentração de aflatoxinas diminuía quando a temperatura ambiente se situava entre 18 0 C e 20 0 C. Neste contexto, Criseo et al. (1990) afirmam que a faixa de temperatura ideal para a produção de aflatoxina é de 25 0 C a 40 0 C. Quanto à umidade, Sebunya e Yourtee (1990) reportaram que a UR ideal é de 86% a 87%. Esses autores reforçam que a interação entre a temperatura e a umidade relativa é o fator mais significativo para impedir a produção de aflatoxinas. CONCLUSÕES 1. A concentração mínima de detecção de aflatoxina foi de 1,94 mg/kg; 2. As sementes dos quatro genótipos de amendoim, armazenadas em condições naturais e em câmara fria, não apresentaram contaminação por aflatoxinas durante o período estudado. REFERÊNCIAS ALMEIDA, F. de A. C. Efeito da temperatura e umidade relativa do ar sobre a germinação, vigor e grau de umidade de sementes armazenadas de algodão (Gossypium hirsutum L.r. latifolium HUTCH) f. Dissertação (Mestrado) Universidade Federal da Paraiba, Areia,1981. AOAC. Official methods of analysis of the Association of Official Analitycal Chemists. 16 ed. Virgínia, 1995, 1094p. BALDISSERA, M.A.; SANTURIO, J.M.; CANTO, S.H.; PRANKE, P.H.; ALMEIDA, C.A.A.; SCHIMIDT, C. Aflatoxinas, ocratoxina A, zearalenona em alimentos para consumo animal no sul do Brasil - Parte II. Revista do Instituto Adolfo Lutz, v.53, n.42, p.6, BRASIL. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Resolução - RDC Nº 274 de 15/10/2002.Dispõe sobre os limites máximos de aflatoxinas admissíveis no leite, amendoim e milho. Diário Oficial [da] Republica República Federativa do Brasil, Brasília, DF, 16 de out CRISEO, G.; URZI, C.; PERNICE, I.; MEDICI, M.A. Growth aflatoxin production by Aspergillus flavus under cicling temperatures. Journal of Food Science, n.1, p , GODOY, I.J.; MORAES, S.A.; ZANOTTO, M.D.; SANTOS, R.C.. Melhoramento do Amendoim. In: BORÉM, A. ed. Melhoramento de espécies cultivadas, Viçosa, MG: Universidade Federal de Viçosa, p HORN, B.W.; GREENE, R.L.; SORENSEN, R.B.; BLANKENSHIP, P.D.; DORNER, J.W. Conidial movement of nontoxigenic Aspergillus flavus and A. parasiticus in peanut fields following application to soil. Mycopathologia, v.151, p , HORWITZ, W.; KAMPS, R.L.; BOYER, W. Quality control: quality assurance in the analysis of foods for traces constituents. Journal of the Association Analytical Chemists, Washington, v.63, n.6, p , LAZZARI, F.A. Umidade, fungos e micotoxinas na qualidade de sementes, grãos e rações. Curitiba, p. LUZ, C.A.S. Aflatoxina: esse mal tem cura. Cultivar, v.3, n.33, p.30-31, MCALPIN, C.E.; WICKLOW, D.T.; HORN, B.W. DNA fingerprinting analysis of vegetative compatibility groups in Aspergillus flavus from a peanut field in Georgia. Plant Disease, v.86, n.3, p , PRADO, G.; PINTO, A.; JANSSEN, N.; OLIVEIRA, M.S. de. Incidência de aflatoxinas em milho (Zea mays, L). Revista Instituto Adolfo Lutz, v.55, n.2, p.79-84, 1995.

7 DETERMINAÇÃO DE AFLATOXINAS EM SEMENTES DE AMENDOIM 1015 PRADO, G.; GODOY, I.J. de; OLIVEIRA, M.S. de; GAZZINELLI-MADEIRA, J.E.; JUNQUEIRA, R.G.; FERREIRA, S.O. Teste preliminar de resistência de genótipo de amendoim 2117 e Tatu Vermelho, com relação à produção de aflatoxina por uma espécie toxigênica de Aspergillus flavus Link. Revista Instituto Adolfo Lutz, v.56, n.2, p. 71, SABINO, M.; ZORBETT, M.A. P.; PEDROSO, M.O.; MILANEZ, T.V. Incidência de aflatoxinas em amendoim e produtos derivados consumidos na cidade de São Paulo, no período de 1980 a Revista do Instituto Adolfo Lutz, v.49, n.1, p.41-44, SCOTT, P.M. Natural poisons. In: HELRICH, K. In: ASSOCIATION ON THE OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official methods of analysis. 15. ed. Arlington, cap.49, p SCUSSEL, V.M.; RODRIGUEZ-AMAYA, D.B.; SILVA, W.J. da. Incidência de aflatoxina em milho (Zea mays, L.) e em seus produtos derivados comercializados na região de Campinas, Estado de São Paulo. Ciência e Tecnologia de Alimentos, v.6, n.1, p.75-85, SEBUNYA, T.K.; YOURTEE, D.M. Aflatoxigenic Aspergilli in food and feed in Uganda. Journal of Food Quality, v.13, p , SOARES, L.M.V. Micotoxinas: um método para análise simultânea e incidência em alimentos comercializados na região de Campinas f. Tese (Doutorado) UNICAMP, Campinas, SP, SOARES, L.M.V.; RODRIGUES-AMAYA, D. Survey of aflatoxin ochratoxin A, zearalenone and sterigmatocystin in some Brasilian foods by using multi-toxin thin-layer chromatographic method. Journal Association of Official Analytical Chemists, v.72, n.1, p , STROKA, J.; PETZ, M.; ANKLAM, E. Analytical methods for the determination of aflatoxins in various food matrices at concentrations regarding the limits set in European Regulations: development, characteristics, limits. Mycotoxin Research, v.16, n.1, p , THOMPSON, M. Recent trends in interlaboratory precision at ppb and sub-ppb concentrations in relation to fitness for purpose criteria in proficiency Testing. The Analyst, p , TOLEDO, P.M.E.; FONSECA, H.; OETTERER, M. Contaminação e distribuição de aflatoxinas nos produtos e subprodutos do processamento via seca e via úmida do milho. Boletim da Sociedade Brasileira de Ciência e Tecnologia de Alimentos, v.31, n.1, p.77-80, WHO- WORLD HEALTH ORGANIZATION. Mycotoxins. Genovea, p (Environmental Health Criteria, 11).