artus C. trachomatis Plus PCR Kit Manual de Instruções

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1 Octubre de 2016 artus C. trachomatis Plus PCR Kit Manual de Instruções Versão 1 24 (Catálogo Nr ) 96 (Catálogo Nr ) Diagnóstico in vitro qualitativo Para utilização com os equipamentos Rotor-Gene Q , QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, Hilden, ALEMANHA R PT Sample & Assay Technologies

2 QIAGEN Sample and Assay Technologies QIAGEN é o principal fornecedor de tecnologias inovativas de amostras e testes, possibilitando a isolação e análise de conteúdos de qualquer amostra biológica. Os nossos produtos e serviços avançados e de alta qualidade asseguram o sucesso da preparação da amostra até o resultado. QIAGEN estabelece padrões para: Purificação do ADN, ARN e proteínas Sistema de análise para ácido nucleico e proteínas Pesquisa de microarn e ARNi Automação de tecnologias de amostras e análises Nós colocamos as mais novas tecnologias à sua disposição, para que você possa obter, de maneira rápida e segura, os melhores resultados. Para mais informaçães, visite

3 Índice Conteúdo do Kit 4 Explicação dos Símbolos 4 Conservação 5 Função prevista 5 Indicações especiais sobre a utilização do produto 5 Avisos e precauções 6 Controle de qualidade 6 Introdução 7 Princípio 7 Informações acerca do agente patogénico 7 Características de Performance 8 Materiais e aparelhos necessários adicionalmente 19 Notas Importantes 20 Precauções Gerais 20 Colheita, conservação e transporte de amostras 20 Isolamento de ADN 23 Controle Interno 30 Protocolo: PCR e Análise dos Dados 32 Guia de Resolução de Problemas 42 Informações para Encomenda 45 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Manual de Instruções 10/2016 3

4 Conteúdo do Kit artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit (24) (96) Catálogo Nr Número de preparações Azul C. trachomatis Plus RG Master 2 x 12 reacções 8 x 12 reacções Amarelo C. trachomatis Plus LC/RG Mg-Sol* 400 µl 400 µl Vermelho C. trachomatis Plus LC/RG Positive Control 200 µl 200 µl Verde C. trachomatis Plus RG IC 1000 µl 2 x 1000 µl Branco Água (Grau de PCR) 1000 µl 1000 µl Manual de Instruções Kit artus C. trachomatis Plus RG PCR (Inglês) 1 1 * Solução de magnésio. Controle interno. Explicação dos Símbolos <N> Contém reagentes suficientes para <N> testes Prazo de Validade Produto médico para diagnóstico in vitro Número de catálogo Número do Lote Número do material Componentes 4 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Manual de Instruções 10/2016

5 Conteúdo Número Número do item de comércio mundial Limite de temperatura Fabricante Consulte as instruções de utilização Cuidado Conservação Os componentes do o artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit são conservados a 15 to 30 C e devem ser utilizados antes do fim da data de validade indicada no rótulo. A repetida descongelação e congelação (> 2 x) deve ser evitada, pois, devido a isto, a sensibilidade pode ser reduzida. No caso de utilização irregular, os reagentes devem, por isso, ser divididos em alíquotas. Se houver a necessidade de conservar os componentes a 2 8 C, não se deve ultrapassar um período de cinco horas. Função prevista O kit artus C. trachomatis Plus RG PCR é um teste de amplificação de ácidos nucleicos in vitro para a deteção de ADN de Chlamydia trachomatis em amostras humanas de urina, exsudados (oculares, endocervicais ou uretrais) ou sémen. Este kit de teste de diagnóstico utiliza a reação em cadeia da polimerase (PCR) e está configurado para ser utilizado com instrumentos Rotor-Gene Q. Indicações especiais sobre a utilização do produto Todos os reagentes devem ser utilizados exclusivamente para o diagnóstico in vitro. A utilização deve ser efectuada por funcionários que tenham sido especialmente formados e instruídos nos processos de diagnóstico in vitro. artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Manual de Instruções 10/2016 5

6 A observância exata do protocolo é impreterivelmente necessária para se optimizar o resultado da PCR. Ter em atenção a data de validade indicada na embalagem e nas etiquetas de cada componente. Não utilizar reagentes com prazo de validade expirado. Embora rara, a ocorrência de mutações nas regiões altamente conservadas do genoma bacteriano cobertas pelos primers e/ou sonda do kit pode resultar em subquantificação ou falha em detetar a presença da bactéria. A validade e o desempenho do ensaio são revistos regularmente. O kit artus C. trachomatis Plus RG PCR é capaz de detetar estirpes que possuem o plasmídeo críptico assim como novas estirpes da variante sueca que apresentam uma eliminação do plasmídeo críptico. O kit não deteta as variantes sem plasmídeo críptico de C. trachomatis. Um resultado de teste negativo não exclui a possibilidade de infeção, uma vez que os resultados dos testes podem ser comprometidos por uma colheita incorreta de amostras, erro técnico, mistura de amostras ou por um número de organismos presentes na amostra inferior ao valor de sensibilidade do teste. Avisos e precauções Quando trabalhando com produtos químicos, sempre vista um avental, luvas descartáveis e óculos de proteção. Para maiores informações, por favor, consultar a apropriadas fichas de segurança (SDS). Elas estão disponíveis on line e em pdf, formatadas no site onde pode encontrar, visualizar e imprimir a SDS para cada kit ou componente da QIAGEN. Para informações de segurança sobre o kit de purificação utilizado, consulte o manual do kit relevante. Para informações de segurança sobre instrumentos, consulte o manual do utilizador do instrumento relevante. Descarte amostras e resíduos do ensaio conforme a regulação de segurança local. Controle de qualidade De acordo com o Sistema de Administração de Qualidade certificado pelos ISO da QIAGEN, cada lote dos artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit foi testado de acordo com as especificações anteriormente apresentadas a fim de garantir a qualidade do produto. 6 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Manual de Instruções 10/2016

7 Introdução O kit artus C. trachomatis Plus RG PCR é um sistema pronto a utilizar para a deteção de ADN de C. trachomatis através da reação em cadeia da polimerase (PCR) em instrumentos Rotor-Gene Q. O C. trachomatis Plus RG Master contém reagentes e enzimas para a amplificação específica de uma região de 111 pb do plasmídeo críptico de C. trachomatis. Os reagentes permitem também a deteção específica do fragmento amplificado no canal de fluorescência Cycling Green do Rotor-Gene Q MDx, do Rotor-Gene Q e do Rotor-Gene 6000, ou Cycling A.FAM do Rotor-Gene Ao mesmo tempo, o artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit contém um segundo sistema heterólogo de amplificação para a comprovação de uma possível inibição da PCR. Este é detectado como um controlo interno (IC) no canal de fluorescência Cycling Yellow do Rotor-Gene Q MDx, Rotor-Gene Q e Rotor-Gene 6000 ou Cycling A.JOE do Rotor-Gene O limite de detecção da PCR analítica da C. trachomatis não é reduzido (ver capítulo Sensibilidade analítica ). É fornecido um controle positivo externo (C. trachomatis Plus LC/ RG Positive Control). Princípio A deteção de agentes patogénicos pela PCR baseia-se na amplificação de regiões específicas do genoma do agente patogénico. A detecção do material amplificado efectua-se com a ajuda de corantes fluorescentes na PCR em Tempo Real. Estes estão acoplados geralmente a sondas oligonucleotídicas, que se ligam especificamente ao material amplificado pela PCR. A detecção das intensidades de fluorescência no decorrer da PCR em Tempo Real possibilita a detecção e a quantificação dos produtos sem ter que se voltar a abrir os tubos das amostras depois de concluída a PCR.* Informações acerca do agente patogénico As bactérias do género Chlamydia (C.) são de grande importância epidemiológica. A C. trachomatis (serotipos D L) é uma das causas mais frequentes de infeções sexualmente transmissíveis (IST) em todo o mundo. Os 16 serotipos da C. trachomatis provocam diferentes doenças. Os serotipos A C provocam o tracoma, uma doença recidivante crónica das conjuntivas e da córnea propagada nas regiões trópicas. Os serotipos D - K causam infecções urogenitais sexualmente transmissíveis e infecções dos olhos, assim como infecções em recém-nascidos após transmissão perinatal. Os serotipos LGV I - III causam o linfogranuloma venéreo, uma doença sexualmente transmissível que aparece principalmente nas regiões trópicas. * Mackay, I.M. (2004) Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin. Microbiol. Infect. 10, 190. artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Manual de Instruções 10/2016 7

8 O tracoma aparece quase exclusivamente em países tropicais com condições de higiene precárias. Ele representa a doença ocular mais frequente a nível mundial e é, depois das cataratas, a segunda causa mais frequente da cegueira. Supõe-se que cerca de 150 milhões de pessoas estejam infectadas. Em cerca de seis milhões dos infectados, a doença provocou cegueira. Nos países industrializados, as clamídias são os agentes patogénicos bacterianos mais frequentes das infecções urogenitais. Na Alemanha, estima-se o número de novas infecções genitais em cerca de por ano. A incidência do linfogranuloma venéreo (linfogranuloma inguinal, doença de Durand-Nicolas- Favre) diminui mundialmente. Esta doença sexualmente transmissível ainda é endémica na Ásia, África, América do Sul e em partes do Caribe. Características de Performance Sensibilidade analítica Para o artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit, foram determinados tanto o limite de detecção analítica quanto o limite de detecção analítica de acordo com a purificação (limite de sensibilidade). O limite de detecção analítica de acordo com a purificação foi determinado através de amostras clínicas positivas para o C. trachomatis e de acordo com o método de purificação utilizado. O limite de detecção analítica, por sua vez, é determinado sem amostras clínicas e independente do método de purificação relacionado com o serotipo com uma concentração determinada. Para determinar a sensibilidade analítica do artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit sob a utilização do instrumento Rotor-Gene 6000 e Rotor-Gene 3000, foi criada uma série de diluições padrão do C. trachomatis serotipo E de 10 a e de 6,6 a 0,00066 cópias de equivalentes de genoma bacteriano do C. trachomatis/µl (egb/µl) e esta foi analisada com o artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit. As análises foram efectuadas em três dias diferentes, contendo cada uma delas oito determinações. O resultado foi apurado com a ajuda de uma análise de probit. A sua avaliação gráfica está representada na Figura 1. O limite de detecção do kit artus C. trachomatis RG PCR em combinação com o Rotor-Gene Q MDx/Q/6000 e Rotor-Gene 3000 é de 0,04 be/µl (p = 0,05) ou 0,2 be/µl (p = 0,05). Respetivamente. Isto significa que existe uma probabilidade de 95 % de serem detectadas 0,04 egb/µl ou 0,2 egb/µl. 8 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Manual de Instruções 10/2016

9 Figura 1. Análise de probit: C. trachomatis (Rotor-Gene 6000). Sensibilidade analítica do artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit no Rotor-Gene O limite de detecção analítica de acordo com a purificação (QIAamp DNA Mini Kit) do artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit sob a utilização dos equipamentos Rotor-Gene foi determinada com uma série de diluições padrão de serotipo E C. trachomatis de 6,6 a 0,00066 nominais C. trachomatis-egb/µl em amostras clínicas de raspagem. Estas foram submetidas a uma purificação com o QIAamp DNA Mini Kit (volume de extração: 200 µl, volume de eluição: 100 µl). Cada uma das no total oito fases de diluição foi analisada em três dias diferentes na forma de oito determinações sob utilização do artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit. O resultado foi apurado com a ajuda de uma análise de probit. A sua avaliação gráfica está representada na Figura 2. O limite de detecção analítica de acordo com a purificação (p = 0,05) do artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit utilizado em combinação com o equipamento Rotor-Gene 3000 está, desta forma, estabelecido em 300 egb/ml. Isto significa que existe uma probabilidade de 95 % de serem detectados 300 egb/ml. artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Manual de Instruções 10/2016 9

10 Figura 2. Análise de probit: C. trachomatis (Rotor-Gene 3000). Sensibilidade analítica de acordo com a purificação (QIAamp DSP Virus Kit, QIAGEN) do o artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit no Rotor-Gene Para se obter a sensibilidade analítica levando-se em consideração a purificação com o QIAamp Viral RNA Mini Kit (QIAGEN) do artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit sob a utilização dos instrumentos Rotor- Gene, pode-se utilizar uma sensibilidade comparável, como a utilizada para o instrumento em questão com o QIAamp DNA Mini Kit, pois os valores médios de perda pela purificação em ambos os métodos de extração utilizados estão entre 0,3 e 1,8 %. Especificidade A especificidade do artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit é, em primeiro lugar, garantida através da selecção dos iniciadores (primers) e das sondas, assim como da selecção de condições de reacção optimizadas. Os iniciadores (primers) e as sondas foram verificados mediante uma análise de comparação de sequência quanto a eventuais homologias com todas as sequências publicadas em bancos de genes. A detecção de todos os serotipos foi assegurada tanto através do alinhamento do banco de dados quanto através de uma PCR no Rotor-Gene (ver Tabela 1). Adicionalmente, a validação da especificidade foi realizada com 30 diferentes amostras de urina, 100 de raspagem e 30 de esperma, todas elas negativas para a C. trachomatis, que não geraram sinal com os iniciadores (primers) e sondas específicas para a C. trachomatis contidos na C. trachomatis Plus RG Master. 10 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Manual de Instruções 10/2016

11 Tabela 1: Teste da especificidade dos serotipos relevantes Chlamydia Serotipo C. trachomatis A C. trachomatis B C. trachomatis Ba C. trachomatis C C. trachomatis D C. trachomatis E C. trachomatis F C. trachomatis G C. trachomatis H C. trachomatis I C. trachomatis J C. trachomatis K Fonte de referência ATCC* (VR-571B) ATCC (VR-573) ATCC (VR-347, prep 1) ATCC (VR-572) ATCC (VR-885) ATCC (VR-348B) ATCC (VR-346) ATCC (VR-878) ATCC (VR-879) ATCC (VR-880) ATCC (VR-886) ATCC (VR-887) C. trachomatis (Cycling Green ou A.FAM) Controle interno (Cycling Yellow ou A.JOE)) * American Type Culture Collection. A tabela continua na próxima página artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Manual de Instruções 10/

12 Tabela 1. Continuação Chlamydia Serotipo C. trachomatis LGV I C. trachomatis LGV II C. trachomatis LGV II C. trachomatis LGV III Fonte de referência ATCC (VR-901B) ATCC (VR-902B) ATCC (VR-577) ATCC (VR-903) C. trachomatis (Cycling Green ou A.FAM) Controle interno (Cycling Yellow ou A.JOE)) Para a determinação da especificidade do artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit, foi examinado o grupo de controle, citado na Tabela 2, em relação à existência de reacções cruzadas. Nenhum dos agentes patogénicos testados era reactivo. Tabela 2. Teste da especificidade dos kits com possíveis agentes patogénicos inter-reactivos Grupo de controle C. trachomatis (Cycling Green ou Cycling A.FAM) Controle interno (Cycling Yellow ou Cycling A.JOE) Acinetobacter spp. + Bordetella pertussis + Candida albicans + Candida glabrata + Chlamydia pneumoniae + Chlamydia psittaci + Enterobacter cloacea + 12 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Manual de Instruções 10/2016

13 Enterococus faecalis + Escherichia coli + Gardnerella vaginalis + A tabela continua na próxima página Tabela 2. Continuação Grupo de controle C. trachomatis (Cycling Green ou Cycling A.FAM) Controle interno (Cycling Yellow ou Cycling A.JOE) Haemophilus parainfluenzae + Klebsiella pneumoniae + Neisseria gonorrhoeae + Proteus mirabilis + Proteus vulgaris + Salmonella enteritides + Salmonella typhimurium + Staphylococcus aureus + Streptococcus pneumoniae + Streptococcus pyogenes + Vírus da herpes simples 1 e 2 + Precisão Os dados de precisão foram levantados para o artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit sob utilização dos instrumentos Rotor-Gene e possibilitam a averiguação da variância total (flutuação estatística) do sistema de teste. Esta variância total compõe-se da Variabilidade Intra-Ensaio (variabilidade de amostras com a mesma concentração em um ensaio), da Variabilidade Inter- Ensaio (variabilidade devida à utilização de diversos aparelhos do mesmo tipo, por pessoas diferentes do mesmo laboratório) e da Variabilidade Inter-Lote (variabilidade devida à utilização de diferentes lotes). Para este fim, apuram-se o desvio padrão, a variância e o coeficiente de variação tanto para a PCR específica do agente patogénico, como também para a de controle interno. artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Manual de Instruções 10/

14 Estes dados foram apurados para o artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit com serotipo E do C. trachomatis na concentração mais próxima do triplo do valor de limite de sensibilidade (2,1 egb/µl com purificação, 0,66 egb/µl sem purificação). As análises foram efectuadas contendo oito determinações. Os resultados do teste de precisão estão representados nos valores do Ct da curva de amplificação (C T : threshold cycle, ver Tabela 3). De acordo com estes resultados, a flutuação estatística de uma amostra qualquer com a concentração determinada é de 2,45 % (C T ) e 1,87 % (C T ) com a purificação com o QIAamp DNA Mini Kit; para a detecção do Controle interno é de 3,34 % (C T ) e 2,13 % (C T ) com a purificação com o QIAamp DNA Mini Kit. Estes valores baseiam-se na totalidade de cada um dos valores apurados nas variabilidades. Tabela 3. Dados de precisão com base no valor C T Variabilidade Intra-Ensaio: Serotipo E C. trachomatis (0,66 egb/µl) Variabilidade Intra-Ensaio: Controle interno Variabilidade Inter-Ensaio: C. trachomatis serovar E (0,66 egb/µl) Variabilidade Inter-Ensaio: Controle interno Variabilidade Inter-Lote: C. trachomatis serovar E (0,66 egb/µl) Variabilidade Inter-Lote: Controle interno Variância Total: C. trachomatis serovar E (0,66 egb/µl) Variância Total: Controle interno Desvio Padrão Variância Coeficiente de variação (%) 0,38 0,14 1,23 0,05 0,01 0,36 0,58 0,33 1,90 1,08 1,18 4,80 0,46 0,21 1,47 0,39 0,15 1,74 0,64 0,41 2,45 0,85 0,72 3,34 14 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Manual de Instruções 10/2016

15 Tabela 4. Dados de precisão com base nos valores Ct com a purificação com o QIAamp DNA Mini Kit Variabilidade Intra-Ensaio: Serotipo E C. trachomatis (2,1 egb/µl) Variabilidade Intra-Ensaio: Controle interno Variabilidade Inter-Ensaio: C. trachomatis serovar E (2,1 egb/µl) Variabilidade Inter-Ensaio: Controle interno Variabilidade Inter-Lote: C. trachomatis serovar E (2,1 egb/µl) Variabilidade Inter-Lote: Controle interno Variância Total: C. trachomatis serovar E (2,1 egb/µl) Variância Total: Controle interno Desvio Padrão Variância Coeficiente de variação (%) 0,33 0,11 1,06 0,27 0,07 1,12 0,49 0,11 1,09 0,49 0,24 2,07 0,58 0,34 1,83 0,31 0,09 1,33 0,58 0,34 1,87 0,50 0,25 2,13 Robustez A verificação da robustez serve para apurar a taxa total de erro do artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit. Para este efeito, foram misturadas 30 amostras de urina, 100 de raspagem e 30 de esperma negativas para o C. trachomatis com 2,1 egb/µl do volume de eluição do ADN de controle do C. trachomatis (cerca de três vezes a concentração dos limites de sensibilidade analíticos) purificadas com o QIAamp DNA Mini Kit (esperma e amostras de raspagem) e o QIAamp Viral RNA Mini Kit (amostras de urina) e analisadas com o artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit. A taxa de erro para o C. trachomatis foi de 0 % para a totalidade das amostras. A robustez do controle interno foi verificada adicionalmente através da purificação e da análise de 30 amostras de urina, 100 de raspagem e 30 de esperma negativas artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Manual de Instruções 10/

16 para o C. trachomatis. A taxa total de erro foi de 0 %. Não foram observadas inibições. Deste modo, a robustez do artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit é 99 %. Reprodutibilidade Os dados da reprodutibilidade permitem avaliar regularmente o desempenho do artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit, assim como para compará-lo com o desempenho de outros produtos. Estes dados são obtidos através da participação em programas de proficiência estabelecidos. Avaliação diagnóstica O artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit está a ser avaliado em 4 estudos. Avaliação diagnóstica 1: Comparação de amostras de urina e raspagem com o COBAS Amplicor CT/NG Assay Na comparação do artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit com o COBAS Amplicor CT/NG Assay, foram analisadas 107 amostras retrospectivas de raspagem e urina. No estudo, a sensibilidade com o artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit foi de 98 %. Não foram observadas inibições. A especificidade diagnóstica do artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit é de 100 %. A amostra discrepante (ver Tabela 5) foi analisada como positiva durante um teste paralelo realizado anteriormente no instrumento LightCycler 2.0 e no COBAS Amplicor com dois sistemas de detecção do C. trachomatis (artus versus COBAS Amplicor). A perda de concentração das amostras a serem analisadas devida ao armazenamento causa um deslocamento destas em direção ao limite de detecção dos dois ensaios. Assim, os resultados discordantes das duas amostras não representa nenhuma amplificação ou detecção não-específica, nem para o artus nem para o COBAS Amplicor Assay. Tabela 5. Resultados dos estudos de validação comparativos 1 COBAS Amplicor CT/NG Assay + Total artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Manual de Instruções 10/2016

17 Avaliação diagnóstica 2: Comparação de amostras de esperma com o COBAS Amplicor CT/NG Assay Em uma comparação do artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit com o COBAS Amplicor CT/NG Assay, foram analisadas 65 amostras de esperma prospectivamente. Para as 65 amostras retrospectivas de esperma testadas, foi observada uma correlação do artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit de 100 % com o COBAS Amplicor Assay. A taxa de inibição está em torno de 0 %. A especificidade diagnóstica do artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit foi de 100 % (Tabela 6). Tabela 6. Resultados dos estudos de validação comparativos 2 COBAS Amplicor CT/NG Assay + Total artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Avaliação diagnóstica 3: Comparação de amostras de urina e raspagem com o LCx e Aptima Combo 2 Assay Na comparação do artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit com kit de reacção em cadeia de ligase (LCx CT Assay) e o TMA (transcription mediated amplification [APTIMA Combo 2 Assay]), foram analisadas 234 amostras retrospectivas de raspagem e de urina. No estudo, a correlação da reacção em cadeia de ligase (LCx CT Assay) e do Aptima Combo 2 Assay com o artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit foi de 98 % para amostras retrospectivas de raspagem e de urina. A especificidade diagnóstica do artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit foi de 99 % (Tabela 7). Tabela 7. Resultados dos estudos de validação comparativos 3 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Manual de Instruções 10/

18 LCx/Aptima Combo 2 + Total artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Avaliação diagnóstica 4: Exame de amostras clínicas de raspagem do olho Cem amostras clínicas de raspagem do olho previamente testadas foram analisadas retrospectivamente com o artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit. Para as 100 amostras de raspagem do olho previamente testadas, a sensibilidade do artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit foi de 100 %. A especificidade diagnóstica do artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit foi de 100 % (Tabela 8). Tabela 8. Resultados dos estudos de validação comparativos 4 Resultado esperado + Total artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Manual de Instruções 10/2016

19 Materiais e aparelhos necessários adicionalmente Quando trabalhar com substâncias químicas, use sempre um avental de laboratório adequada, luvas descartáveis e óculos de protecção. Para mais informações, consulte as fichas de dados de segurança (SDSs) adequadas, disponíveis junto do fornecedor do produto. Kit de isolamento de ADN (ver Isolamento de ADN, página 23) Pipetas (reguláveis)* Pontas de pipetas estéreis com filtros Misturador vórtex* Centrífuga de mesa com rotor para tubos de reacção de 2 ml Rotor-Gene Q MDx, Rotor-Gene Q or Rotor-Gene Instrument* com canais de fluorescência para Cycling Green e Cycling Yellow ou com canais de fluorescência para Cycling A.FAM e Cycling A.JOE Software Rotor-Gene Q MDx/Rotor-Gene Q versão ou superior (software Rotor-Gene 6000 versões , , ; software Rotor-Gene 3000 versão ) Strip Tubes and Caps, 0.1 ml, para uso com 72-well rotor (cat. no or ) O kit artus C. trachomatis Plus RG PCR não está valaidado para utilização com o Rotor-Gene 36-well rotor Bloco de refrigeração (Loading Block 72 x 0.1 ml Tubes, cat. no , ou Loading Block 96 x 0.2 ml Tubes, cat. no ) * Assegure-se de que os instrumentos foram verificados e calibrados regularmente de acordo com as recomendações do fabricante. artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Manual de Instruções 10/

20 Notas Importantes Precauções Gerais O utilizador deve ter sempre em atenção o seguinte: Utilizar pontas de pipetas estéreis com filtros. Purificar, armazenar e acrescentar à reacção os materiais positivos (amostras, controles, produtos de amplificação) separados fisicamente dos restantes reagentes. Antes de iniciar o teste, descongelar totalmente todos os componentes à temperatura ambiente (15 a 25 C). Em seguida, misturar completamente e centrifugar brevemente os componentes. Trabalhar rapidamente em gelo ou num bloco de refrigeração (72/96 well loading block). Colheita, conservação e transporte de amostras Nota: Todas as amostras devem ser manuseadas como potencialmente infecciosas. Só é permitida a utilização de materiais de amostras que respeitem imprescindivelmente as seguintes regras e regulamentos relativos à colheita, conservação e transporte: Urina Raspagens oculares, endocervicais e uretrais Esperma Para garantir uma elevada qualidade de amostras, o transporte das mesmas para o laboratório de pesquisa deve ser efectuado o mais rapidamente possível. As amostras devem ser transportadas de acordo com as condições de temperatura indicadas. Amostras de urina Nota: O paciente deve ser aconselhado a não urinar por pelo menos 2 horas antes da coleta da amostra. Colher 5 a 30 ml do primeiro jacto de urina num recipiente de propileno limpo sem conservantes. Fechar e etiquetar o recipiente da amostra. Nota: Não utilizar amostras de urina que tenham sido colhidas em recipientes com conservantes. 20 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Manual de Instruções 10/2016

21 Se a realização de testes a amostras de urina puder ser feita no prazo de 24 horas, as amostras podem ser armazenadas à temperatura ambiente (15 a 25 C). Para um armazenamento mais prolongado, as amostras têm de ser armazenadas a uma temperatura entre 2 e 8 C num frigorífico, se os testes forem efetuados no prazo de 7 dias. Caso não seja possível processar as amostras de urina no prazo de 7 dias, estas têm de ser armazenadas a uma temperatura entre 15 e 30 C ou mais baixa durante um período máximo de 30 dias. As amostras de urina têm de ser armazenadas a uma temperatura entre 2 e 8 C num frigorífico até serem enviadas e têm de ser transportadas seguindo instruções locais e nacionais relativas ao transporte de material patogénico.* Amostras de raspagem Nota: Para colher amostras de raspagem oculares, endocervicais e uretrais, utilizar os seguintes materiais: Nota: Utilizar exclusivamente zaragatoas de raspagem com extremidades de Dacron, raiom ou alginato de cálcio, com hastes de plástico ou de outro material sem alumínio. Não utilizar zaragatoa de raspagem com haste de alumínio ou de madeira. Amostras de raspagem do olho, endocervicais e uretrais podem ser colhidas e transportadas em 1 a 3 ml dos seguintes médiuns: digene Female Swab Specimen Collection Kit (QIAGEN, cat. no ) digene Cervical Sampler (QIAGEN, cat. no ) AMPLICOR STM (Specimen transport medium, Roche, Inc.) STD Swab Specimen Collection and Transport Kit (Roche, Inc.) M4 CTM (MicroTest, Thermo Fischer Scientific) 2SP CTM (Bartels, Inc.) Bartels ChlamTrans CTM (Bartels, Trinity Biotech) Mastazyme Chlamydia Swab Set (MAST DIAGNOSTICA) Mastazyme Chlamydia Transport Medium (MAST DIAGNOSTICA) IDEIA Chlamydia Specimen Collection Kit (DakoCytomation) MicroTrak II Chlamydia EIA Specimen Collection Kit (Trinity Biotech) * International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations. artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Manual de Instruções 10/

22 Deixar a zaragatoa no meio de transporte da cultura. Fechar e etiquetar o recipiente da amostra. Seguir os regulamentos relativos à conservação e ao transporte. * As amostras devem ser conservadas a uma temperatura de 2 a 8 C (se as amostras de raspagem tiverem que ser enviadas para um laboratório de pesquisa, elas devem ser despachadas o mais rápido possível após a colheita, de acordo com as instruções do laboratório para o transporte de amostras de clamídia). Amostras de raspagem que não forem directamente testadas após a entrada no laboratório devem ser conservadas a uma temperatura de 2 a 8 C e analisadas num período de sete dias. Amostras de raspagem que não puderem ser analisadas num período de sete dias após a colheita devem ser conservadas a uma teperatura de 15 a 30 C, ou menos, e testadas num período de 30 dias após a data de colheita. As amostras devem ser transportadas refrigeradas. Se as amostras de raspagem tiverem que ser enviadas para um laboratório, elas devem ser despachadas o mais rápido possível após a colheita, de acordo com as instruções do laboratório para o transporte refrigerado. As amostras devem ser enviadas de acordo com os regulamentos locais e estatais relativos ao transporte de materiais infecciosos. Amostras de esperma Nota: Deve er feito um período de abstinência sexual de 2 a 4 dias para coleta de semem. Nota: A amostra de esperma deve ser colhida no mesmo dia do envio para o laboratório. Sob utilização de procedimentos rotineiros de laboratório, a amostra de esperma pode ser colhida de um dos seguintes modos: através da masturbação directamente para um recipiente estéril, limpo e seco. Certifique-se de que toda a amostra alcance directamente o recipiente. Caso se perca um pouco de amostra, deve ser feita uma anotação no protocolo de colheita. através da masturbação sob utilização de um preservativo. Retire o preservativo após a ejaculação. É importante que ele seja seguramente fechado com um elástico para que a amostra de esperma fique nele retida. Logo após, coloque o preservativo em um recipiente de transporte. * Biosafety in Microbiological Laboratories Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 4th Edition. HHS Publication Number (CDC) International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations. 22 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Manual de Instruções 10/2016

23 Nota: Somente utilize recipientes de amostra sem conservante ou preservativo sem espermicida e sem aditivos artificiais (por exemplo: corante). Coloque a amostra de esperma durante 30 a 45 minutos no escuro (por exemplo, em uma gaveta ou um armário de parede) até que ela se torne liquefeita. Directamente após a liquefação, congele a amostra em um tubo criogénico a uma teperatura de 15 a 30 C. Amostras de esperma que não forem testadas directamente após a entrada no laboratório devem ser conservadas a uma teperatura de 15 a 30 C ou temperaturas abaixo desta e testadas num período de 30 dias após a data de colheita. Se as amostras de esperma tiverem que ser enviadas para um laboratório de pesquisa, elas devem ser despachadas no mesmo dia após a colheita, de acordo com as instruções do laboratório para o transporte de amostras de clamídia. Além disso, considere que as amostras de esperma devem ser enviadas refrigeradas. As amostras devem ser enviadas de acordo com os regulamentos locais e estatais relativos ao transporte de materiais infecciosos *. Isolamento de ADN Os kits da QIAGEN mostrados na Tabela 9 são validados para purificação de DNA de amostras humanas utilizando artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit. Faça a extração de DNA de acordo com as instruções abaixo, que em alguns casos diferem dos protocolos dos manuais dos kits. Tabela 9. Kits de Purificação validados para o uso com o artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Material de Amostra Urina Esperma, raspagens Kit de Purificação QIAamp Viral RNA Mini Kit (50) QIAamp DNA Mini Kit (50) Número de Catálogo (QIAGEN) Carrier-ARN contém não contém Nota: O artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit não deverá ser utilizado em conjunto com procedimentos de purificação que utilizam fenol como base. * International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations. artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Manual de Instruções 10/

24 Utilize o QIAamp Viral RNA Mini Kit para amostras de urina. Nota: A adição de Carrier-ARN é de grande importância para a eficiência e, com isso, para o rendimento do ADN/ARN. Adicionar a quantidade adequada de Carrier ARN para cada extração seguindo as instruções do kit QIAamp Viral RNA Mini Handbook. Nota: O controle interno do artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit pode ser adicionado directamente na fase de purificação (ver capítulo Controle interno, página 30). O tampão AVL, contido no QIAamp Viral RNA Mini Kit, foi desenvolvido especialmente para inactivar o grande número de inibidores presentes na urina. Por isso, recomendamos expressamente a utilização do protocolo do Protocolo QIAamp Viral RNA Mini Spin para a extracção de ADN celular, bacteriano ou viral da urina. Equilibre as amostras à temperatura ambiente (15 a 25 C). Muitas vezes, na urina, está contida apenas uma pequena quantidade de bactérias e, por isto, deve ser feita a concentração do material de análise. Para este fim, as amostras de urina (5 a 30 ml) a serem analisadas são centrifugadas durante 15 a 20 min com a capacidade máxima ( x g) do aparelho (alternativa: 30 minutos a x g). O sobrenadante é decantado e o precipitado é totalmente ressuspenso através da mistura no vórtex em intervalos de 15 a 30 segundos em 1200 µl de 1 x PBS. 140 µl da amostra desta forma preparada devem ser adicionados para o isolamento de ADN. Siga o protocolo QIAamp Viral RNA Mini Spin (Manual QIAamp Viral RNA Mini, 3ª Ediçao, abril de 2010, página 23) desde o início. Seguir o protocolo do kit QIAamp Viral RNA Mini Spin (QIAamp Viral RNA Mini Handbook, Terceira Edição, Dezembro de 2007, página 23) desde o começo. Nota: Aconselha-se vivamente a realização do passo 10 de centrifugação recomendado no protocolo para remover quaisquer resíduos de etanol. Recomenda-se também o aumento do tempo desta centrifugação para 3 minutos. Sugere-se a utilização de um volume de eluição de 60 µl. Utilizando o QIAamp DNA Mini Kit para amostras de swab ou coletas de semem. Nota: A adição de Carrier-ARN (RNA-Homopolymer Poly(rA) *, não incluso no QIAamp DNA Mini Kit) é de grande importância para a eficiência e, com isso, para o rendimento do ADN/ARN. Caso o kit de isolamento utilizado não * Quando trabalhando com produtos químicos, sempre vista um avental, luvas descartáveis e óculos de proteção. Para maiores informações, por favor, consultar a apropriada ficha de segurança do produto (MSDS). 24 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Manual de Instruções 10/2016

25 contenha Carrier-ARN, recomenda-se, imprescindivelmente, a adição de Carrier-ARN para a extracção dos ácidos nucleicos de líquidos biológicos sem células ou de materiais com pequena quantidade de ADN/ARN (p. ex. líquido céfalo-raquidiano). Nestes casos, preparar o RNA carrier como segue. Para isso, ressuspenda o Carrier-ARN (RNA-Homopolymer Poly(rA), não incluso no QIAamp DNA Mini Kit) liofilizado em tampão de eluição (não em tampão de lise) do kit de isolamento (tampão AE do QIAamp DNA Mini Kit) e crie uma diluição com uma concentração de 1 µg/µl. De acordo com a quantidade exigida, divida a solução de Carrier-ARN em alíquotas que devem ser armazenadas a 15 a 30 C. Evite a repetida descongelação (> 2 x) de uma alíquota de Carrier-ARN. Por purificação, deve ser adicionado 1 µg de Carrier-ARN por 100 µl de tampão de lise. Se o protocolo de extracção prevê, por exemplo, 200 µl de tampão de lise por amostra purificada, então adicione 2 µl do Carrier- ARN (1 µg/µl) diretamente ao tampão de lise (tampão AL do QIAamp DNA Mini Kit). Antes de iniciar qualquer purificação, deve ser feita uma mistura nova de tampão de lise e Carrier-ARN (e, se for o caso controle interno, ver capítulo Controle Interno, página 30) de acordo com o seguinte esquema de pipetagem no Tabela 10. artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Manual de Instruções 10/

26 Tabela 10. Pipetando para utilizaçaõ com o sistema QIAamp DNA Mini Kit Número de amostras 1 12 Buffer AL (tampão de lise)* p. ex. 200 µl p. ex µl Carrier-ARN (1 µg/µl) 2 µl 24 µl Volume Total 202 µl 2424 µl Volume para a purificação 200 µl cada 200 µl * Contém cloridrato de guanidina; veja o manual do produto com as informações de segurança. Nota: Utilize a mistura de tampão de lise e Carrier-ARN para a purificação logo após a preparação. Não é possível conservar a mistura. Nota: O controle interno do artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit pode ser adicionado directamente na fase de purificação (ver capítulo Controle Interno, página 30). Realize a purificação com o QIAamp DNA Mini Kit de acordo com passos a seguir, que diferem do protocolo dos produtos QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook. Deixar as amostras atingir a temperatura ambiente (15 a 25 C). Amostras de raspagem que são conservadas num meio para transporte devem ser bem misturadas no vórtex. Retire com cuidado a tampa do tubo de amostra e certifique-se de que as luvas não foram contaminadas. Luvas contaminadas devem ser trocadas antes que a próxima amostra seja manuseada. Pressione a zaragatoa contra a parede do tubo de reacção para retirar o excesso de líquido. Retire, com a zaragatoa, os possíveis restos de secreção contidos na amostra e pressione a mesma novamente contra a parede do tubo de reacção para retirar o excesso de líquido contido na secreção. Retire e elimine a zaragatoa com os restos de secreção. Pipete 200 µl do meio de transporte juntamente com 180 µl de tampão ATL em um tubo de reacção da microcentrífuga de 1,5 ml e misture bem no vórtex. As zaragatoas são transferidas directamente para tubos de reacção da microcentrífuga de 1,5 ml e misturadas no vórtex com 180 µl de tampão ATL durante 15 a 30 segundos. Como alternativa, ponha 200 µl de tampão ATL no tubo para transporte e misture a zaragatoa no vórtex por 15 a 30 segundos no tubo. Logo após, transfira 180 µl em um tubo de reacção da microcentrífuga de 1,5 ml. Pressione a zaragatoa contra a 26 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Manual de Instruções 10/2016

27 parede do tubo de reacção para retirar o líquido nela contido. Por fim, retire e elimine a zaragatoa. Para a extracção de ADN das amostras de esperma, dilua 60 µl de material de amostra com 140 µl de 1 x PBS em um tubo de reacção da microcentrífuga de 1,5 ml. Depois de misturar cuidadosamente no vórtex, pipete 100 µl da diluição para 180 µl de tampão ATL. Misture-os em intervalos de vórtex de 15 a 30 segundos. Adicione por amostra 20 µl de proteinase K, misture a mesma no vórtex e incube-a a 56 C durante 15 minutos (raspagem) ou 1 a 12 horas (esperma). Misture ocasionalmente a amostra no vórtex ou coloque-a num misturador térmico. Nota: Lembre-se de que deve ser utilizada a proteinase K. A protease da QIAGEN tem uma actividade reduzida na presença do tampão ATL. Centrifugue rapidamente o tubo de reacção de 1,5 ml para evitar contaminações cruzadas por respingamento do líquido da amostra contido na parte interior da tampa ao abrir o tubo. Acrescente 200 µl de tampão AL (com RNA carrier e opcionalmente com o controle interno; ver acima e Controle Interno, pagina 30) à amostra, misture intensamente por 15 segundos no vórtex ou incube a amostra por 10 minutos a 70 C. Centrifugue rapidamente os tubos de reacção de 1,5 ml para evitar contaminações cruzadas através de respingos do líquido da amostra contido na parte interior da tampa ao abrir o tubo. É muito importante misturar intensamente a amostra e o tampão AL a fim de se obter uma solução homogénea. Adicione 200 µl de etanol ( %) à amostra e misture-a novamente no vórtex por 15 segundos. Centrifugue rapidamente, por fim, os tubos de reacção para evitar contaminações cruzadas. Adicione 500 µl da mistura (inclusive o precipitado) cuidadosamente sem molhar a borda do recipiente na coluna QIAamp Mini (em um Collection Tube de 2 ml). Feche a tampa com cuidado e centrifugue por um minuto a x g (8.000 rpm). Coloque a coluna QIAamp Mini em um Collection Tube de 2 ml como recipiente de coleta e elimine o recipiente usado junto com o filtrado. * Feche todas as colunas para evitar a formação de aerossóis durante a centrifugação. Repita o último passo colocando toda o resto da mistura de amostra na coluna QIAamp Mini. * O conteúdo centrifugado contém tampão AL ou AW1 e não é então compatível com água sanitária. Veja o manual do produto QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook para informações de segurança. artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Manual de Instruções 10/

28 Abra cuidadosamente a coluna QIAamp Mini e acrescente 500 µl de tampão AW1 sem molhar a borda. Feche a tampa com cuidado e centrifugue por um minuto a x g (8.000 rpm). Coloque a coluna QIAamp Mini em um Collection Tube de 2 ml como recipiente de coleta e elimine o recipiente usado junto com o filtrado.* Abra cuidadosamente a coluna QIAamp Mini e acrescente 500 µl de tampão AW2 sem molhar a borda. Feche a tampa com cuidado e centrifugue por três minutos na intensidade máxima (p. ex x g). Elimine o Collection Tube usado junto com a descarga e coloque a coluna QIAamp Mini em um Collection Tube de 2 ml como recipiente de coleta. Centrifugue por três minutos na intensidade máxima (p. ex x g). Coloque, por fim, a coluna QIAamp Mini em um Collection Tube limpo de 1,5 ml como recipiente de coleta e elimine o recipiente usado junto com o filtrado. Abra cuidadosamente a coluna QIAamp Mini e acrescente 50 µl de tampão AE na coluna QIAamp. Incube a temperatura ambiente (15 a 25 C) por um minuto e centrifugue, por fim, a coluna por um minuto a x g (8.000 rpm). Usando o QIAamp DNA Mini Kit para amostras liofilizadas e secascongeladas. Nota: A adição de Carrier-ARN é de grande importância para a eficiência e, com isso, para o rendimento do ADN/ARN. Caso o kit de isolamento utilizado não contenha Carrier-ARN, recomenda-se, imprescindivelmente, a adição de Carrier-ARN (RNA-Homopolymer Poly(rA), não incluído no QIAamp DNA Mini Kit) para a extracção dos ácidos nucleicos de líquidos biológicos sem células ou de materiais com pequena quantidade de ADN/ARN (p. ex. líquido céfaloraquidiano). Nestes casos, preparar RNA carrier como a seguir. Para isso, ressuspenda o Carrier-ARN (RNA-Homopolymer Poly(rA), não incluído no QIAamp DNA Mini Kit) liofilizado em tampão de eluição (não em tampão de lise) do kit de isolamento (tampão AE do QIAamp DNA Mini Kit) e crie uma diluição com uma concentração de 1 µg/µl. De acordo com a quantidade exigida, divida a solução de Carrier-ARN em alíquotas que devem ser armazenadas a 15 a 30 C. Evite a repetida descongelação (> 2 x) de uma alíquota de Carrier-ARN. Por purificação, deve ser adicionado 1 µg de Carrier-ARN por 100 µl de tampão de lise. Se o protocolo de extracção prevê, por exemplo, 200 µl de tampão de lise por amostra purificada, então adicione 2 µl do Carrier- ARN (1 µg/µl) diretamente ao tampão de lise (tampão AL do QIAamp DNA Mini Kit). Antes de iniciar qualquer purificação, deve ser feita uma mistura nova de tampão de lise e Carrier-ARN (e, se for o caso controle 28 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Manual de Instruções 10/2016

29 interno, ver capítulo Controle Interno, página 30) de acordo com o seguinte esquema de pipetagem no Tabela 11. Tabela 11. Pipetando para utilização com o sistema QIAamp DNA Mini Kit Number of samples 1 12 Buffer AL (tampão de lise)* p. ex., 200 µl p. ex., 2400 µl Carrier-ARN (1 µg/µl) 2 µl 24 µl Volume Total 202 µl 2424 µl Volume para a purificação 200 µl cada 200 µl * Contém cloridrato de guanidina; veja o manual do produto com as informações de segurança. Nota: Utilize a mistura de tampão de lise e Carrier-ARN para a purificação logo após a preparação. Não é possível conservar a mistura. Nota: O controle interno do artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit pode ser adicionado directamente na fase de purificação (ver capítulo Controle Interno, página 30). Realize a purificação com o QIAamp DNA Mini Kit de acordo com passos a seguir, que diferem do protocolo dos produtos QIAamp DNA Min e Blood Mini Handbook. Equilibre as amostras à temperatura ambiente (15 a 25 C). Ressuspenda cuidadosamente a amostra liofilizada em 500 µl de 1 x PBS através de leves movimentos com a mão. Depois agite a amostra durante pelo menos 30 minutos à temperatura ambiente (15 25 C) para que ela se dissolva completamente. Use para isto um misturador (p. ex. misturador térmico). Pipete 200 µl da amostra dissolvida para 360 µl de tampão ATL em um tubo de reacção da microcentrífuga de 1,5 ml e misture cuidadosamente no vórtex. Adicione à amostra 20 µl de proteinase K, misture a mesma no vórtex e incube-a a 56 C durante 1 a 12 horas. Misture ocasionalmente a amostra no vórtex ou coloque-a num misturador térmico. Nota: Lembre-se de que deve ser utilizada a proteinase K. A protease da QIAGEN tem uma actividade reduzida na presença do tampão ATL. artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Manual de Instruções 10/

30 Centrifugue brevemente os tubos de reação de 1,5 ml para evitar contaminações cruzadas através do derramamento de líquidos de amostra na parte interna da tampa ao abrir o tubo. Adicione 400 µl de tampão AL (com carrier RNA e opcionalmente, controle interno; veja acima e Controle Interno, página 30) à amostra, misture fortemente durante 15 segundos no vórtex e incube a amostra durante 10 minutos a 70 C. Adicione 400 µl de etanol (96 a 100 %) à amostra e misture novamente no vórtex durante 15 segundos. Coloque cuidadosamente 700 µl da mistura (inclusive o precipitado) na coluna QIAamp Mini sem deixar molhar a borda superior. Feche a tampa e centrifugue durante um minuto a x g (8.000 rpm). Logo após, coloque a coluna QIAamp Mini em um Collection Tube de 2 ml limpo (contido no kit) e exclua o Collection Tube utilizado juntamente com o filtrado.* Repita este passo ao colocar o resto da solução da mistura da amostra na coluna. Siga o Tissue Protocol (QIAamp DNA Mini Blood Mini Handbook, Second Edition, junho de 2012, página 36) inicie com a adição do Buffer AW1 no passo 8. Nota: Nós recomendamos a realização da centrifugação para realizar o passo 10 do protocolo para remover qualquer resíduo de etanol. Nós recomendamos que o tempo de centrifugação seja aumentado para 3 minutos. É recomendado um volume de eluição de 50 µl do tampão AE. Controle Interno É fornecido um controle interno (C. trachomatis Plus RG IC) com o qual se tem a possibilidade de controlar não só a purificação do ADN como também uma possível inibição da PCR. Para este fim, adicione o controle interno numa relação de 0,1 µl por 1 µl do volume de eluição na purificação. Se utilizar, por exemplo, o QIAamp DNA Mini Kit e eluir o ADN em 200 µl de tampão AE, então acrescentar 20 µl de controle interno. Se, p. ex., eluir em 100 µl, então acrescentar respectivamente 10 µl. A quantidade de controle interno acrescentada depende apenas do volume de eluição. * O conteúdo centrifugado contém tampão AL ou AW1 e não é então compatível com água sanitária. Veja o manual do produto QIAamp DNA Mini and Blood Mini Handbook para informações de segurança. 30 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Manual de Instruções 10/2016

31 O controle interno e o Carrier-ARN (ver capítulo Isolamento de ADN, acima) deve ser adicionado somente para a mistura de lise e para amostra de material ou diretamente para o tampão de lise. Não pipetar o controle interno directamente na amostra. Caso adicione o tampão de lise ter em atenção que a mistura do controle interno com o tampão de lise/carrier-arn deverá ser utilizada ainda fresca e imediatamente após ser preparada (a conservação da mistura à temperatura ambiente ou no frigorífico pode em poucas horas desactivar o controle interno e diminuir a eficiência da purificação). Nota: Não pipetar o controle interno e o Carrier-ARN directamente na amostra. Para a purificação ser considerada eficaz, o valor Ct do controle interno tem que ser Ct = 24 ± 3 (threshold: 0,02) sob a utilização dos instrumentos Rotor- Gene Q. O desvio declarado de até 3 valores de C T é baseado na variancia do instrumento e na purificação. Um desvio maior aponta para problemas na purificação. Neste caso, ela tem que ser analisada e eventualmente revalidada. Se houver dúvidas ou problemas, contacte o nosso suporte técnico QIAGEN Technical Service. O controle interno pode opcionalmente ser usado exclusivamente para checar a possibilidade de inibição da PCR. Para esta aplicação, adicional o controle interno diretamente na mistura de C. trachomatis Plus RG Master and C. trachomatis Plus LC/RG Mg-Sol, como descrito no passo 2b do protocolo (página 33). artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Manual de Instruções 10/

32 Protocolo: PCR e Análise dos Dados Importantes pontos antes de iniciar Antes de começar o procedimento, ler Notas Importantes, página Tenha tempo para você se familializar com o instrumento Rotor-Gene Q antes de iniciar o protocolo. Ver o manual do equipamento. Certifique-se de que sejam introduzidos, por ensaio de PCR, no mínimo um controle positivo, assim como um controle negativo (Water, PCR grade). Coisas para fazer antes de iniciar Certifique-se de que o bloco de refrigeração (acessório do Rotor-Gene Q) tenha sido pré-refrigerado a uma tepreratura aproximadamente de 2 a 8 C. Todos os reagentes devem ser totalmente descongelados à temperatura ambiente, bem misturados (pipetando para cima e para baixo várias vezes ou misturando brevemente no vórtex) e em seguida centrifugados antes do início do teste. Procedimento 1. Coloque o número desejado de tubos de PCR nos adaptadores do bloco de resfriamento. 2. Se você estiver usando o controle interno para acompanhar o monitoramento do procedimento de extração do ADN e checar a possibilidade de uma possível inibição de PCR, seguir o passo 2a. Se você estiver usando o controle interno exclusivamente para checar uma inibição de PCR, seguir o passo 2b. 2a. O controle interno já foi adicionado na extração (ver Controle Interno, página 30). Neste caso, prepara a master mix de acordo com a Tabela 12. A reação de master mix contém todos os componentes necessários para PCR exceto a amostra. 32 artus C. trachomatis Plus RG PCR Kit Manual de Instruções 10/2016