Manual do kit artus HCV QS-RGQ

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1 Setembro de 2010 Manual do kit artus HCV QS-RGQ Versão 1 24 (catálogo n.º ) 72 (catálogo n.º ) Diagnóstico in vitro quantitativo Para utilização com os instrumentos QIAsymphony SP/AS e Rotor-Gene , PT QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, D Hilden R PT Sample & Assay Technologies

2 Tecnologias de amostragem e ensaio da QIAGEN A QIAGEN é o principal fornecedor de tecnologias inovadoras de amostragem e ensaio, permitindo o isolamento e a detecção do conteúdo de qualquer amostra biológica. Os produtos e serviços avançados e de elevada qualidade da nossa empresa são garantia de sucesso, desde a amostra ao resultado. A QIAGEN é uma empresa de referência em matéria de: Purificação de ADN, ARN e proteínas Ensaios de ácidos nucleicos e proteínas Investigação em microarn e ARNi Automatização de tecnologias de amostragem e ensaio A nossa missão permitir-lhe-á alcançar o sucesso, bem como resultados notáveis. Para mais informações, visite

3 Índice Conteúdo do kit 5 Símbolos 5 Armazenamento 6 Utilização prevista 6 Limitações de utilização do produto 6 Assistência Técnica 7 Informações sobre segurança 7 Controlo de qualidade 8 Introdução 9 Fundamento 9 Informação sobre o patogénio 9 Características de desempenho 10 Etapas do procedimento 17 Equipamento e reagentes a serem fornecidos pelo utilizador 22 Notas importantes 24 Precauções gerais 24 Colheita, armazenamento e transporte de amostras 24 Preparação dos instrumentos QIAsymphony SP/AS para utilização 26 Preparação do material de amostra 29 Preparação das misturas de ARN portador (CARRIER)-tampão AVE (AVE) 29 Utilização de um controlo interno 30 Conjuntos de controlo de ensaio e conjuntos de parâmetros de ensaio 31 Retornos de ácidos nucleicos 31 Armazenamento de ácidos nucleicos 31 Quantificação 31 Protocolos Isolamento de ARN no QIAsymphony SP 33 Configuração do ensaio no QIAsymphony AS 41 RT-PCR e Análise de Dados no Rotor-Gene Q 52 Guia de resolução de problemas 60 Referências 66 Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/2010 3

4 Informações para encomenda 67 4 Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/2010

5 Conteúdo do kit Kit artus HCV QS-RGQ (24) (72) N.º de catálogo Número de reacções Azul Hep. C Virus RG Master A 4 x 144 μl 8 x 144 μl Violeta Hep. C Virus RG Master B 4 x 216 μl 8 x 216 μl Vermelha Hep. C Virus RG QS 1* (10 4 IU/μl) 200 μl 200 μl Vermelha Hep. C Virus RG QS 2* (10 3 IU/μl) 200 μl 200 μl Vermelha Hep. C Virus RG QS 3* (10 2 IU/μl) 200 μl 200 μl Vermelha Hep. C Virus RG QS 4* (10 1 IU/μl) 200 μl 200 μl Verde Hep. C Virus RG IC 1000 μl 2 x 1000 μl Branca Água (grau PCR) 1000 μl 1000 μl Manual 1 1 * Standard de quantificação Controlo interno. Símbolos <N> Contém reagentes suficientes para <N> testes Prazo de validade Dispositivo médico para diagnóstico in vitro Número de catálogo Número de lote Número do material Componentes Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/2010 5

6 Contém Número Limitação de temperatura Fabricante legal Consulte as instruções de utilização Nota importante Armazenamento Os componentes do kit artus HCV QS-RGQ devem ser armazenados a 20ºC e são estáveis até ao prazo de validade impresso no rótulo. Deve evitar-se repetir o processo de descongelamento e congelamento (>2 vezes), uma vez que pode reduzir a sensibilidade do ensaio. Utilização prevista O kit artus HCV QS-RGQ é um teste de amplificação de ácidos nucleicos in vitro, para a quantificação de ARN do vírus da hepatite C (HCV) no plasma humano. Este kit de teste diagnóstico utiliza reacção em cadeia da polimerase de transcrição reversa (RT-PCR) e está configurado para ser utilizado com os instrumentos QIAsymphony SP/AS e Rotor-Gene Q. O kit artus HCV QS-RGQ foi concebido para utilização em conjunto com o quadro clínico e outros marcadores laboratoriais para prognóstico da doença e para utilização como auxiliar na avaliação da resposta viral ao tratamento antiviral, quantificada com base nos níveis de ARN do HCV em plasma tratado com EDTA. O kit artus HCV QS-RGQ não foi concebido para utilização como teste de despistagem do HCV ou como um teste diagnóstico para confirmar a presença de infecção pelo HCV. Limitações de utilização do produto Todos os reagentes podem ser exclusivamente utilizados em diagnóstico in vitro. 6 Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/2010

7 O produto deve apenas ser utilizado por pessoal com formação específica em procedimentos de diagnóstico in vitro (EN375) e devidamente instruído para o efeito. Para resultados de PCR óptimos, é necessário que as instruções do manual de utilizador sejam rigorosamente observadas. Deve prestar-se atenção aos prazos de validade impressos na caixa e nas etiquetas de todos os componentes. Não utilize componentes cujo prazo de validade tenha expirado. Embora rara, a ocorrência de mutações nas regiões altamente conservadas do genoma viral cobertas pelos iniciadores (primers) e/ou sonda do kit pode resultar em sub-quantificação ou falha em detectar a presença do vírus. A validade e o desempenho do ensaio são revistos regularmente. Assistência Técnica Na QIAGEN, orgulhamo-nos da qualidade e da disponibilidade da nossa assistência técnica. Os nossos departamentos de assistência técnica são compostos por cientistas experientes com conhecimentos práticos e teóricos abrangentes em tecnologias de amostragem e ensaio e utilização dos produtos QIAGEN. Se tiver alguma dúvida ou dificuldade em relação ao kit artus HCV QS-RGQ ou aos produtos QIAGEN de um modo geral, não hesite em contactar-nos. Os clientes da QIAGEN são a principal fonte de informação no que diz respeito às utilizações avançadas ou especializadas dos nossos produtos. Estas informações são úteis a outros cientistas, bem como aos investigadores da QIAGEN. Por conseguinte, incentivamo-lo a contactar-nos caso tenha alguma sugestão acerca do desempenho dos produtos ou de novas aplicações e técnicas. Para obter assistência técnica e mais informações, consulte o nosso Centro de Suporte Técnico em ou contacte um dos Departamentos da Assistência Técnica ou distribuidores locais da QIAGEN (consulte o verso do manual ou visite Informações sobre segurança Quando trabalhar com substâncias químicas, use sempre um avental de laboratório adequado, luvas descartáveis e óculos de protecção. Para mais informações, por favor consulte as folhas adequadas de dados de segurança do material (MSDSs). Estas estão disponíveis online no formato PDF, prático e compacto, no endereço onde poderá encontrar, visualizar e imprimir as MSDSs para cada kit da QIAGEN e respectivos componentes. Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/2010 7

8 Para informações de segurança sobre o kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi, consulte o Manual QIAsymphony DSP Virus/Pathogen. Para informações de segurança relativas aos instrumentos, consulte o manual do utilizador dos instrumentos relevantes. Elimine as amostras e os resíduos do ensaio de acordo com os regulamentos de segurança locais. Informações de emergência 24 horas Poderão ser obtidas informações de emergência médica em inglês, francês e alemão 24 horas por dia junto de: Centro de Informações sobre Venenos de Mainz, Alemanha Tel.: Controlo de qualidade De acordo com o Sistema de Gestão da Qualidade Total da QIAGEN certificado pela norma ISO, todos os lotes do kit artus HCV QS-RGQ são testados face a especificações predeterminadas, para garantir uma qualidade constante do produto. 8 Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/2010

9 Introdução O kit artus HCV QS-RGQ é um sistema pronto a usar para a detecção de ARN do HCV, com recurso a reacção em cadeia da polimerase (PCR) nos Instrumentos Rotor-Gene Q, com preparação da amostra e procedimento de ensaio utilizando os instrumentos QIAsymphony SP/AS. Os Hep. C Virus RG Master A e B contêm reagentes e enzimas para a amplificação específica de uma região de 240 pb do genoma do HCV e para a detecção directa do amplicon específico no canal de fluorescência Cycling Green do Rotor-Gene Q. Além disso, o kit artus HCV QS-RGQ contém um segundo sistema de amplificação heterólogo para identificar possível inibição da PCR. Esta inibição é detectada como um controlo interno (IC) no canal de fluorescência Cycling Orange do Rotor-Gene Q. O limite de detecção da PCR do HCV analítica não é reduzido. São fornecidos controlos positivos externos (Hep. C Virus RG QS 1 4) que permitem a determinação da quantidade de ARN viral. Para mais informações, consulte Quantificação, na página 31. Fundamento A detecção de patogénios pela reacção em cadeia da polimerase (PCR) baseiase na amplificação de regiões específicas do genoma do patogénio. Através da PCR em tempo real, o produto amplificado é detectado com recurso a corantes fluorescentes. Estes estão habitualmente aglutinados a sondas de oligonucleotídeos que se ligam especificamente ao produto amplificado. A monitorização das intensidades de fluorescência durante o ensaio de PCR (ou seja, em tempo real) permite e detecção e quantificação do produto que se acumula sem ter de reabrir os tubos de reacção após o ensaio de PCR.* Informação sobre o patogénio A hepatite C é uma inflamação do fígado causada pelo vírus com o mesmo nome. Ao contrário dos outros vírus da hepatite A, B, D, ou E, a infecção com o vírus da hepatite C (HCV) leva, num grande número de casos, a doença crónica do fígado. Muitas vezes, uma infecção com HCV não produz sintomas durante um período de tempo relativamente longo. Por este motivo, a maior parte dos doentes nem sabe que está infectada com HCV. Mas é precisamente nas fases iniciais da doença que a terapia é mais eficaz. Actualmente, o interferão α (em combinação com ribavirina) é o único tratamento comprovadamente eficaz. No entanto, também se sabe que apenas alguns doentes com hepatite C crónica respondem à terapia com interferão. Daí que, em determinadas circunstâncias, este tratamento caro do doente possa ser desfavorável e ter efeitos secundários graves, como seja a debilitação * Mackay, I.M. (2004) Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin. Microbiol. Infect. 10, 190. Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/2010 9

10 do sistema imunitário, levando a exacerbações (por ex., herpes labial, herpes zóster/zona). Características de desempenho Sensibilidade analítica O limite de detecção analítica relativo à purificação (limite de sensibilidade) foi avaliado para o kit artus HCV QS-RGQ utilizando amostras clínicas positivas para HCV em combinação com a extracção no QIAsymphony SP. A sensibilidade analítica relativa à purificação do kit artus HCV QS-RGQ foi determinada utilizando amostras de plasma clínicas contaminadas com uma série de diluições de material do HCV standard de Acrometix de 200 ao valor nominal de 2,5 HCV IU/ml. Estas foram sujeitas a extracção de ARN usando o kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen, em conjunto com o protocolo Cellfree1000 (volume de extracção: 1 ml, volume de eluição: 60 μl). Cada uma das 8 diluições foi analisada com o kit artus HCV QS-RGQ em 4 dias diferentes, em 4 ensaios com 11 modelos de replicação cada. Os resultados foram determinados por análise de probit. A figura 1. representa uma ilustração gráfica da análise de probit. O limite de detecção analítica relativa à purificação do kit artus HCV QS-RGQ em combinação com o Rotor-Gene Q é de 36,2 IU/ml (p = 0,05). Isto significa que existe uma probabilidade de 95% de o limite 36,2 IU/ml ser detectado % Proporções Proportions , ~ 36, IU/ml (27,4 52,5 ( IU/ml) log (dose) Figura 1. Análise de probit: HCV (Rotor-Gene Q). Sensibilidade analítica relativa à purificação (kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen) do kit artus HCV QS-RGQ no Rotor-Gene Q. 10 Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/2010

11 Especificidade A especificidade do kit artus HCV QS-RGQ é, antes de mais, assegurada pela selecção dos primers e sondas, bem como pela selecção de condições de reacção rigorosas. Os primers e as sondas foram verificados em termos de possível homologia com todas as sequências publicadas nos bancos de genes, por análise comparativa de sequências. A detectabilidade de todos os genótipos relevantes foi assim assegurada por um alinhamento da base de dados e por um ensaio de PCR nos instrumentos Rotor-Gene com os seguintes genótipos (ver Tabela 1). Tabela 1. Testes de especificidade dos genótipos relevantes Vírus Genótipo Fonte Vírus da hepatite C 1 NIBSC, HemaCare, Universidade de Essen HCV (Cycling Green) Controlo Interno (Cycling Orange) + + Vírus da hepatite C 2 NIBSC, HemaCare, Universidade de Essen + + Vírus da hepatite C 3 NIBSC, HemaCare, Universidade de Essen + + Vírus da hepatite C 4 NIBSC, HemaCare, Universidade de Essen + + Vírus da hepatite C 5 NIBSC, HemaCare, Universidade de Essen + + Vírus da hepatite C 6 NIBSC, HemaCare, Universidade de Essen + + Além disso, a especificidade foi validada com 100 amostras diferentes de plasma negativo para HCV. Estas não geraram quaisquer sinais com os primers e sondas específicos do HCV que estão incluídos nos Hep. C Virus RG Masters. Foi também testada a possibilidade de reacções cruzadas do kit artus HCV QS- RGQ, usando o grupo de controlo elencado na Tabela 2 (página 12). Nenhum dos patogénios testados demonstrou reactividade. Não ocorreram reacções cruzadas com infecções mistas. Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/

12 Tabela 2. Testes de especificidade do kit com patogénios com potencial de reacção cruzada Grupo de controlo Vírus da imunodeficiência humana 1 HCV (Cycling Green) Controlo interno (Cycling Orange) + Vírus da hepatite A + Vírus da hepatite B + Vírus herpes humano 1 (vírus herpes simplex 1) Vírus herpes humano 2 (vírus herpes simplex 2) Vírus herpes humano 3 (vírus varicela-zoster) Vírus herpes humano 5 (citomegalovírus) Vírus da leucemia de células T humano tipo 1 e tipo Vírus herpes humano 6A + Vírus herpes humano 6B + Vírus do herpes humano tipo 8 (vírus do herpes do sarcoma de Kaposi) + Enterovírus + Parvovírus B19 + Dengue + Febre amarela + Aspergillus flavus + Aspergillus fumigatus + A tabela continua na página seguinte 12 Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/2010

13 Tabela 2. Continuação Grupo de controlo HCV (Cycling Green) Controlo interno (Cycling Orange) Candida albican + Chlamydia trachomatis + Cryptosporidium parvum + Filobasidiella neoformans + Mycoplasma pneumoniae + Pneumocystis cariniie + Staphylococcus sp. + Streptococcus agalactiae + Staphylococcus aureus + Streptococcus pyogenes + Intervalo linear O intervalo linear relativo à purificação do kit artus HCV QS-RGQ foi determinado por análise de uma série de diluições do material de referência HCV Acrometrix, variando entre 1,77 x 10 7 IU/ml e 5,00 x 10 1 IU/ml. A purificação foi efectuada em modelos de replicação (n = 4 para concentrações 2,00 x 10 6 IU/ml; n = 8 para concentrações <2,00 x 10 6 IU/ml) usando o kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen em combinação com o protocolo Cellfree1000 (volume de extracção: 1 ml, volume de eluição: 60 μl). Cada uma das amostras foi analisada usando o kit artus HCV QS-RGQ. O intervalo linear relativo à purificação do kit artus HCV QS-RGQ foi determinado para abranger as concentrações de 6,76 x 10 1 IU/ml a 1,77 x 10 7 IU/ml (Figura 2). Precisão Os dados de precisão do kit artus HCV QS-RGQ permitem a determinação da variância total do ensaio. A variância total consiste na variabilidade intraensaio (variabilidade de múltiplos resultados de amostras da mesma concentração dentro de um ensaio), na variabilidade entre ensaios (variabilidade de resultados múltiplos do ensaio gerados nos diversos instrumentos do mesmo tipo, por diferentes operadores num laboratório) e a na variabilidade entre lotes (variabilidade de resultados múltiplos do ensaio utilizando diversos lotes). Os dados obtidos foram utilizados para determinar o Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/

14 desvio-padrão, a variância e o coeficiente de variação para o patogénio específico e a PCR de controlo interno. log log estimated Concentração concentration estimada (IU/ml) (IU/ml) y = 0.967x 0,967x ,5567 R 2 = 0, log 10 Concentração nominal concentration nominal (IU/ml) Figura 2. Intervalo linear para o kit artus HCV QS-RGQ. Cálculo do intervalo linear. A linha recta foi determinada por uma regressão linear das concentrações calculadas de log 10 com as concentrações nominais de log 10. A equação da linha de regressão está incluída na figura. Os dados de precisão analítica do kit artus HCV QS-RGQ (sem considerar a purificação) foram recolhidos usando os standards de quantificação de concentração mais baixos (QS 4; 10 IU/μl). Os testes foram efectuados em 8 modelos de replicação. Os dados de precisão foram calculados com base nos valores de C T das curvas de amplificação (C T : ciclo limite, ver Tabela 3). Além disso, foram determinados dados de precisão para resultados quantitativos em IU/μl, utilizando os valores de C T correspondentes (Tabela 4). Tendo por base estes resultados, a dispersão estatística global de uma dada amostra com a concentração referida é de 1,52% (C T ) ou 25,71% (concentração), e 0,75% (C T ) para a detecção do controlo interno. Estes valores baseiam-se na totalidade de todos os valores individuais das variabilidades determinadas. 14 Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/2010

15 Tabela 3. Dados de precisão em função dos valores de C T Variabilidade intraensaio: Hep. C Virus RG QS 4 Variabilidade intraensaio: Hep. C Virus RG IC Variabilidade entre ensaios: Hep. C Virus RG QS 4 Variabilidade entre ensaios: Hep. C Virus RG IC Variabilidade entre lotes: Hep. C Virus RG QS 4 Variabilidade entre lotes: Hep. C Virus RG IC Variância total: Hep. C Virus RG QS 4 Variância total: Hep. C Virus RG IC Valor de C T Desviopadrão Coeficiente de variação (%) 32,81 0,09 0,28 30,04 0,08 0,27 32,14 0,5 1,57 30,23 0,22 0,71 32,56 0,48 1,46 30,28 0,24 0,78 32,41 0,49 1,52 30,29 0,29 0,75 Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/

16 Tabela 4. Dados de precisão com base nos resultados quantitativos (em IU/μl) Variabilidade intraensaio: Hep. C Virus RG QS 4 Variabilidade entre ensaios: Hep. C Virus RG QS 4 Variabilidade entre lotes: Hep. C Virus RG QS 4 Variância total: Hep. C Virus RG QS 4 Desviopadrão Variância Coeficiente de variação (%) 0,64 0,41 6,34 1,00 1,00 9,93 3,92 15,34 37,35 2,63 6,93 25,71 Os dados de precisão relativos à purificação do kit artus HCV QS-RGQ foram recolhidos usando material de referência de HCV Acrometrix com uma concentração de 1,00 x 10 3 IU/ml introduzido nas amostras clínicas de plasma. Os testes foram efectuados usando o kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen, em conjunto com o protocolo Cellfree1000 (volume de extracção: 1 ml, volume de eluição: 60 μl). Os testes foram efectuados em 36 modelos de replicação, utilizando uma matriz de vários lotes do kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen e o kit artus HCV QS-RGQ. Tendo por base estes resultados, a dispersão estatística global de uma dada amostra com a concentração referida é de 0,95% (C T ) ou 20,07% (concentração), e 1,26% (C T ) para a detecção do controlo interno (Tabelas 5 e 6). Estes valores baseiam-se na totalidade de todos os valores individuais das variabilidades determinadas para a purificação. Tabela 5. Dados de precisão (variância total) em função dos valores de C T Standard HCV Acrometrix (1,00 x 10 3 IU/ml) Controlo interno (HCV, 1,00 x 10 3 IU/ml) Desviopadrão Variância Coeficiente de variação (%) 0,30 0,09 0,95 0,43 0,18 1,26 16 Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/2010

17 Tabela 6. Dados de precisão (variância total) com base nos resultados quantitativos (em IU/ml) Standard HCV Acrometrix (1,00 x 10 3 IU/ml) Média Desviopadrão Coeficiente de variação (%) 2,37 x ,76 x ,07 Robustez A verificação da robustez permite a determinação da taxa de insucesso total do kit artus HCV QS-RGQ. Para verificação da robustez, 100 amostras negativas para HCV foram contaminadas com 110 IU/ml de ARN de HCV de controlo (uma concentração aproximadamente três vezes superior ao limite de sensibilidade analítica). Após extracção usando o kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen, em conjunto com o protocolo Cellfree1000_DSP (volume de extracção: 1 ml, volume de eluição: 60 μl), estas amostras foram analisadas com o kit artus HCV QS-RGQ. Adicionalmente, a robustez do controlo interno foi avaliada por purificação e análise das 100 amostras de plasma contaminadas. Não foram observadas inibições. A robustez do kit artus HCV QS-RGQ é, assim, 99%. Reprodutibilidade Os dados de reprodutibilidade permitem uma avaliação regular do desempenho do kit artus HCV QS-RGQ, bem como uma comparação de eficiência com outros produtos. Estes dados foram obtidos pela participação nos programas de competência estabelecidos. Contaminação cruzada A ausência de contaminação cruzada entre amostras para a totalidade do processo foi comprovada pela detecção correcta de todas as amostras positivas e negativas conhecidas, em posições alternadas (padrão xadrez) para os sistemas artus QS-RGQ seleccionados. Etapas do procedimento O procedimento QIAsymphony RGQ começa com a purificação dos ácidos nucleicos das amostras de plasma humano no instrumento QIAsymphony SP. Os eluatos, contendo ácidos nucleicos purificados do procedimento de preparação da amostra, são transferidos para o módulo QIAsymphony AS que Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/

18 efectua então a configuração do ensaio (Figura 3) Os ensaios são depois transferidos para o Rotor-Gene Q para PCR e análise de dados (Figura 4). Uma perspectiva geral das etapas do procedimento é apresentada nas páginas Para mais informações, consulte os protocolos completos neste manual (páginas 33, 41 e 52). Figura 3. Automatização do tipo walkaway nos instrumentos QIAsymphony SP/AS. As amostras, reagentes e consumíveis são introduzidos nas bandejas relevantes. A preparação da amostra e a configuração do ensaio são, então, totalmente automatizados nos instrumentos QIAsymphony SP/AS. 18 Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/2010

19 Figura 4. Transferência das amostras para o Rotor-Gene Q. Após preparação da amostra e configuração do ensaio, as reacções são transferidas para o rotor de 72 poços do Rotor-Gene Q para análise por PCR em tempo real. Resumo das etapas do procedimento QIAsymphony RGQ QIAsymphony SP Defina um ensaio/lote usando a interface do utilizador para preparação da amostra. Carregue as bandejas com as amostras, reagentes e consumíveis adequados. Coloque o suporte de eluição na bandeja Eluate (eluato). Operação independente Operação integrada Coloque o suporte de eluição em qualquer ranhura de eluição (isto é, ranhuras 1 4) Dê início ao protocolo. Coloque na ranhura 1 o suporte de eluição com adaptador, incluindo a estrutura de transferência Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/

20 Quando o processamento da amostra estiver completo, remova manualmente o suporte de eluição da bandeja Eluate (operação independente) ou efectue transferência directa do suporte de eluição para o QIAsymphony AS, através do módulo de transferência (operação integrada). Operação independente Operação integrada Remova o suporte de eluição da ranhura no ecrã táctil, abra depois a bandeja Eluate e remova manualmente o suporte de eluição. Prima Transfer para transferir o suporte de eluição da ranhura 1 do QIAsymphony SP para a ranhura 2 do QIAsymphony AS. Efectue a transferência do ficheiro de resultados do QIAsymphony SP. QIAsymphony AS Mude para a interface do utilizador para configuração do ensaio no ecrã táctil. Dê início ao processo de definição do ensaio. Operação independente Operação integrada Prima New (novo) e seleccione o ficheiro do suporte do ensaio respectivo no QIAsymphony SP. Aparecerá uma mensagem a perguntar se pretende utilizar o suporte de eluição como um suporte de amostras. Prima Yes (sim) para confirmar. Defina um procedimento de ensaio. Os ecrãs que serão visualizados no ecrã táctil permitirão um acompanhamento passo-a-passo do processo de definição do ensaio. Carregue a bandeja Eluate and Reagents (eluato e reagentes) e Assays (ensaios) com as amostras, reagentes e consumíveis adequados. 20 Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/2010

21 Para informação detalhada sobre este processo, consulte o ecrã Loading Information (Informações de carregamento) Em alternativa, prima Queue (Fila) e efectue a transferência do ficheiro de informação de carregamento. Dê início ao procedimento de ensaio. Remova os ensaios. Para tal, prima Remove e remova depois manualmente o(s) suporte(s) de ensaio da bandeja "Assays". Transfira o(s) suporte(s) para o Rotor-Gene Q. Efectue a transferência do ficheiro de resultados do QIAsymphony AS e o ficheiro do ciclador. Transfira o ficheiro do ciclador para o Rotor-Gene Q. Rotor-Gene Q Seleccione ou crie um perfil de temperatura Clique em Start Run (iniciar ensaio). Após completar o ensaio, analise os resultados. Manutenção Efectue os procedimentos de manutenção adequados para o QIAsymphony SP/AS e o Rotor-Gene Q, de acordo com os manuais de utilizador dos instrumentos. Consulte a Secção 8 do Manual do Utilizador do QIAsymphony SP/AS Descrição geral e a Secção 9 do Manual do Utilizador do Rotor-Gene Q, para mais informações sobre os procedimentos habituais diários e semanais de manutenção. Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/

22 Equipamento e reagentes a serem fornecidos pelo utilizador Quando trabalhar com substâncias químicas, use sempre um avental de laboratório adequado, luvas descartáveis e óculos de protecção. Para mais informações, consulte as Folhas adequadas de dados de segurança do material (MSDSs), disponíveis junto do fornecedor do produto. Pipetas (ajustáveis)* e pontas de pipetas estéreis com filtros Misturador vórtex* Centrifugadora de bancada* com rotor para tubos de ensaio de 2 ml, com capacidade para centrifugação a 6800 x g Para preparação de amostras Instrumento QIAsymphony SP (n.º cat )* Kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi (n.º cat ) Adaptadores para o QIAsymphony SP: Suporte de microtubos de eluição QS (adaptador de arrefecimento, EMT, v2, Qsym, n.º cat ) Introdutor de tubos 3B (Introdutor, 2,0 ml v2, samplecarr. (24), Qsym, n.º cat ) Consumíveis para o QIAsymphony SP: Cartuchos de prep. da amostra, 8 poços (n.º cat ) Mangas para 8 barras (n.º cat ) Pontas com Filtro, 1500 μl (n.º cat ) Pontas com Filtro, 200 μl (n.º cat ) Microtubos de eluição CL (n.º cat ) Sacos para eliminação de pontas (n.º cat ) Microtubos 2,0 ml Tipo I (Sarstedt, n.º cat , para usar com amostras e controlos internos Para configuração do ensaio Instrumento QIAsymphony AS (n.º cat )* Suportes de adaptadores e reagentes para o QIAsymphony AS: * Assegure-se de que os instrumentos foram verificados e calibrados de acordo com as recomendações do fabricante. 22 Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/2010

23 Suporte de reagente 1QS (Adaptador de arrefecimento, Suporte de Reagente 1, Qsym, n.º cat ) Suporte de reagente 2QS (Adaptador de arrefecimento, Suporte de Reagente 2, Qsym, n.º cat ) Tubos em tira RG 72 QS (Adaptador de arrefecimento, Tubos em tira RG 72, Qsym, n.º cat ) Consumíveis para o QIAsymphony AS: Tiras de tubos e tampas, 0,1 ml (n.º cat ) Tubos, cónicos, 2 ml, Qsym AS (n.º cat )* ou Microtubos 2,0 ml Tipo I (Sarstedt, n.º cat , Tubo, cónico, 5 ml, Qsym AS (n.º cat )* ou Tubos com base plana de PP (Sarstedt, n.º cat , Frascos de reagente, 30 ml, QSym AS (n.º cat ) Microtubos de eluição CL (n.º cat ) Pontas com Filtro, 1500 μl (n.º cat ) Pontas com Filtro, 200 μl (n.º cat ) Pontas com Filtro, 50 μl (n.º cat ) Sacos para eliminação de pontas (n.º cat ) Para PCR Instrumento Rotor-Gene Q 5plex HRM Software para Rotor-Gene Q, versão 2.02 ou superior * Verifique a disponibilidade de stocks. Assegure-se de que os instrumentos foram verificados e calibrados de acordo com as recomendações do fabricante. Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/

24 Notas importantes Precauções gerais O utilizador deve ter em atenção as seguintes recomendações: Utilize pontas de pipetas estéreis com filtros. Durante as etapas manuais, mantenha os tubos fechados sempre que possível e evite contaminação. Descongele completamente todos os componentes à temperatura ambiente (15 25ºC) antes de dar início ao ensaio. Assim que estiverem descongelados, misture os componentes (pipetando repetidamente para cima e para baixo ou aplicando impulsos no vórtex) e centrifugue brevemente. Assegure-se de que não há espuma ou bolhas nos tubos de ensaio. Certifique-se de que os adaptadores necessários são pré-arrefecidos a 2 8ºC. Trabalhe com rapidez e mantenha os reagentes de PCR em gelo ou no bloco de arrefecimento antes de proceder ao seu carregamento Proceda continuamente entre etapas do procedimento. Não exceda 30 minutos de tempo de transferência entre cada módulo (QIAsymphony SP para QIAsymphony AS para Rotor-Gene Q). Colheita, armazenamento e transporte de amostras Todas as amostras têm de ser tratadas como material potencialmente infeccioso. São apenas permitidos os seguintes materiais de amostra, para os quais têm de ser rigorosamente observadas as seguintes regras e instruções relativas à colheita, transporte e armazenamento. Os estudos actuais apontam o plasma tratado com EDTA como o material de amostra mais adequado para detecção de HCV. Recomendamos, por isso, a utilização deste material com o kit artus HCV QS-RGQ. A validação interna do kit artus HCV QS-RGQ foi efectuada usando amostras de plasma humano tratado com EDTA. Não existem outros materiais de amostra validados. Utilize apenas o kit de isolamento de ARN recomendado (consulte Protocolo: Isolamento de ARN no QIAsymphony SP, na página 33) para a preparação das amostras. O uso de determinados materiais tem de ser rigorosamente observado, bem como as instruções relativas a transporte e armazenamento. 24 Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/2010

25 Colheita de amostras Cada colheita de sangue induz lesões dos vasos sanguíneos (artérias, veias, capilares). Devem apenas ser usados materiais inócuos e estéreis. Estão disponíveis luvas descartáveis para colheita de sangue. Para punções venosas não devem ser empregues agulhas capilares demasiado finas. A colheita de sangue venoso deve ser efectuada nas partes adequadas da flexura do cotovelo, no antebraço ou no dorso da mão. O sangue tem de ser colhido com tubos de colheita de amostras standard (tampa vermelha, Sarstedt ou tubo equivalente de outro fabricante). Deve ser colhido um volume de 5 10 ml de sangue tratado com EDTA. Inverter os tubos 8 vezes directamente após colheita da amostra para correcta homogeneização (não agitar). Não devem ser usadas amostras de indivíduos tratados com heparina (consulte Substâncias interferentes, na página 26). Armazenamento de amostras O sangue total deve ser separado em plasma e componentes celulares para centrifugação durante 20 minutos a x g no prazo de 6 horas. O plasma isolado tem de ser transferido para tubos de polipropileno estéreis. A sensibilidade do ensaio pode ser reduzida se as amostras forem congeladas de forma rotineira ou armazenadas por um período de tempo mais alargado. O ARN de vírus encapsulados apresenta estabilidade durante dias, se armazenado a 4ºC, durante semanas se armazenado a 20ºC e durante meses a anos quando armazenado a 70ºC.* Transporte de amostras O material de amostra deve ser transportado num contentor de transporte à prova de estilhaço. O perigo potencial de infecção devido a fuga da amostra pode, assim, ser evitado. As amostras devem ser transportadas de acordo com as instruções locais e nacionais para o transporte de material patogénico. As amostras devem ser enviadas no prazo de 6 horas. Não se recomenda o armazenamento das amostras onde estas foram colhidas. É possível enviar as amostras por correio, de acordo com as instruções legais para o transporte de material patogénico. Recomenda-se o transporte da amostra por serviços de correio expresso. As amostras de sangue devem ser enviadas refrigeradas (2 8ºC), enquanto que o plasma separado deve ser enviado congelado ( 15 a 30 C). * Arbeitskreis Blut, V17 ( ), Bundesgesundheitsblatt 11/1997, p International Air Transport Association (IATA). Dangerous Goods Regulations. (Associação Internacional de Transporte Aéreo. Regulamentos para Mercadorias Perigosas). Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/

26 Substâncias interferentes Elevados níveis de albumina ( 6 g/dl), bilirrubina ( 30 mg/dl) e lípidos ( 1 g/dl triglicerídeos) e amostras hemolizadas ( 2 g/dl hemoglobina) não influenciam o sistema. A heparina ( 10 IU/ml) afecta a PCR. As amostras que tenham sido colhidas em tubos heparinizados não devem ser utilizadas. As amostras de doentes tratados com heparina também não devem ser usadas. Preparação dos instrumentos QIAsymphony SP/AS para utilização Feche todas as bandejas e coberturas. Ligue os instrumentos QIAsymphony SP/AS e aguarde até que o ecrã Sample Preparation (preparação de amostras) apareça e o procedimento de inicialização fique completo. Aceda ao instrumento (as bandejas serão desbloqueadas). Carregamento dos cartuchos de reagentes (RC) para a bandeja de Reagents and Consumables (reagentes e consumíveis) Os reagentes para a purificação de ácidos nucleicos estão contidos num cartucho de reagentes (RC) inovador (ver Figura 5). Cada cavidade do cartucho de reagente (RC) contém um reagente específico, como por exemplo partículas magnéticas, tampão de lise, tampão de lavagem ou tampão de eluição. Os cartuchos de reagentes (RC) parcialmente utilizados podem voltar a ser fechados com tiras vedantes reutilizáveis, evitando a geração de resíduos por reagentes sobrantes no fim do procedimento de purificação. Cobertura perfurável (PL) Suporte de enzimas (ER) Tira vedante reutilizável Cavidade para partículas magnéticas Ranhuras para as tampas roscadas dos tubos enzimáticos Estrutura com cavidades para reagentes Suporte de cartucho de reagentes Figura 5. Cartucho de reagente (RC) para QIAsymphony. O cartucho de reagentes (RC) contém todos os reagentes necessários para o procedimento de purificação. 26 Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/2010

27 Antes de iniciar o procedimento, certifique-se de as partículas magnéticas estão completamente em suspensão. Remova a cavidade das partículas magnéticas da estrutura do cartucho de reagentes, agite vigorosamente no vórtex durante pelo menos 3 minutos e coloque novamente na estrutura do cartucho de reagente, antes da primeira utilização. Coloque o cartucho de reagente (RC) no respectivo suporte. Coloque o suporte de enzimas (ER) no suporte de cartuchos de reagente. Antes de usar um cartucho de reagente (RC) pela primeira vez, coloque a cobertura perfurável (PL) por cima do cartucho de reagente (RC) (Figura 6). A cobertura perfurável (PL) tem bordos afiados. Tome cuidado ao colocála no cartucho de reagente (RC). Assegure-se de que a cobertura perfurável (PL) é colocada sobre o cartucho de reagente (RC) na orientação correcta. Após remoção da cobertura da cavidade das partículas magnéticas e do suporte de enzimas, os tubos são abertos (as tampas de rosca podem ser armazenadas em ranhuras especiais para o efeito, ver Figura 5), o cartucho de reagente (RC) é subsequentemente carregado na bandeja de Reagents and Consumables. Cobertura perfurável (PL) Figura 6. Configuração fácil de bancada com cartuchos de reagentes (RC). Os cartuchos de reagentes (RC) parcialmente utilizados podem ser armazenados até voltarem a ser necessários; consultar Storage (Armazenamento) no Manual do QIAsymphony DSP Virus/Pathogen. Carregamento de utensílios de plástico na bandeja de Reagents and Consumables Os cartuchos de preparação das amostras, as mangas de 8 barras (ambas pré-embaladas nas caixas de unidades) e as pontas com filtros descartáveis Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/

28 (pontas de 200 μl fornecidas em suportes azuis, pontas de 1500 μl fornecidas em suportes pretos) são carregados na bandeja Reagents and Consumables Certifique-se de que as coberturas das caixas de unidades são removidas antes de carregar as caixas na bandeja Reagents and Consumables. As pontas têm filtros para prevenir contaminação cruzada. As ranhuras do suporte de pontas no QIAsymphony SP de bancada podem ser preenchidas com qualquer tipo de suporte de pontas. O QIAsymphony SP identificará o tipo de pontas carregadas durante o inventório. Não reponha manualmente os suportes de pontas ou caixas de unidades para cartuchos de preparação de amostras ou mangas de 8 barras antes de dar início a outro protocolo. O QIAsymphony SP pode utilizar suportes de pontas e caixas de unidades parcialmente usadas. Carregamento da bandeja Waste (resíduos) Os cartuchos de preparação de amostras e as mangas de 8 barras usados durante o ensaio são recolocados no suporte em caixas de unidades vazias na bandeja Waste Assegure-se de que a bandeja Waste tem caixas de unidades vazias suficientes para os resíduos plásticos gerados durante a execução do protocolo. Certifique-se de que as coberturas das caixas de unidades são removidas antes de carregar as caixas de unidades na bandeja Waste. Se estiver a utilizar caixas de mangas de 8 barras para recolher os cartuchos de preparação de amostras e as mangas de 8 barras usadas, certifique-se de que o espaçador da caixa foi removido. Deve fixar-se à parte frontal da bandeja Waste um saco para pontas com filtros usadas. A presença de um saco para eliminação de pontas não é verificada pelo sistema. Certifique-se de que o saco de eliminação de pontas está devidamente fixado, antes de dar início ao protocolo. Para mais informações, consulte os manuais do utilizador que acompanham o instrumento. Esvazie o saco de pontas após um máximo de 96 amostras terem sido processadas para evitar o encravamento do sistema com pontas. Um contentor para resíduos recolhe os resíduos líquidos gerados durante o procedimento de purificação. A bandeja Waste apenas pode ser fechada se o contentor de resíduos estiver devidamente posicionado. Elimine os resíduos líquidos, de acordo com os regulamentos ambientais e de segurança locais. Não coloque o frasco de resíduos cheio em autoclave. Esvazie o frasco de resíduos após o processamento de um máximo de 96 amostras. 28 Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/2010

29 Carregamento da bandeja Eluate (eluato) Coloque o suporte de eluição necessário na bandeja "Eluate". Utilize a Elution slot 1 (ranhura de eluição 1) com o respectivo adaptador de arrefecimento Para uma operação integrada, coloque na posição 1 o suporte de eluição com adaptador, incluindo a estrutura de transferência. Inventariação Antes de iniciar um ensaio, o instrumento verifica se foram carregados nas respectivas bandejas consumíveis suficientes para o(s) lote(s) em espera. Preparação do material de amostra O kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi é adequado para uso em amostras de plasma humano. Previna a formação de espuma nas amostras. As amostras devem ser equilibradas à temperatura ambiente (15 25 C) antes de dar início ao ensaio. Preparação das misturas de ARN portador (CARRIER)- tampão AVE (AVE) Recomendamos veementemente o uso de ARN portador (CARRIER). Se o ARN portador (CARRIER) não for adicionado, a recuperação dos ácidos nucleicos pode ser significativamente reduzida. Para preparar a solução de stock de ARN portador (CARRIER), adicione 1350 μl de tampão AVE (AVE) (fornecido em ampolas de 2 ml) ao tubo contendo 1350 μg de ARN portador (CARRIER) liofilizado para obter uma solução de 1 μg/μl. Dissolva completamente o ARN portador (CARRIER), divida-o em alíquotas de dimensões convenientes e armazene a 2 8ºC, até um máximo de 2 semanas. Cálculo do volume da mistura de ARN portador (CARRIER) por tubo O volume mínimo da mistura ARN portador (CARRIER)-tampão AVE (AVE) deve incluir volume adicional suficiente para ter em consideração perdas de líquido por pipetagem ou evaporação. Consulte a tabela 7 para informação sobre os volumes a usar com o kit artus HCV QS-RGQ. Os tubos com misturas de ARN portador (CARRIER)-tampão AVE (AVE) (e controlo interno opcional) são colocados no porta-tubos. O porta-tubos contendo mistura(s) de ARN portador (CARRIER)-tampão AVE (AVE) deve ser colocado na ranhura A na bandeja de amostras. Podem ser usados até 8 tubos da mistura por lote e até 24 tubos por ensaio de 4 lotes. Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/

30 Utilização de um controlo interno É fornecido um controlo interno (Hep. C Virus RG IC) com o kit artus HCV QS- RGQ. Isto permite ao utilizador controlar o procedimento de isolamento de ARN e verificar a possível inibição da PCR. Utilizando o kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi em conjunto com o kit artus HCV QS-RGQ requer a introdução de um controlo interno (Hep. C Virus RG IC) no procedimento de purificação para monitorizar a eficiência da preparação da amostra e ensaios a jusante. Os controlos internos devem ser adicionados com a mistura ARN portador (CARRIER)-tampão AVE (AVE) e o volume total da mistura de controlo internomistura ARN portador (CARRIER)-tampão AVE (AVE) mantém-se em 120 μl. Para esta aplicação, adicione o controlo interno para isolamento, conforme demonstrado na Tabela 7. Isto representa a adição de um controlo interno para o isolamento a um rácio de 0,1 μl por 1 μl de volume de eluição. Durante o cálculo da quantidade de controlo interno a utilizar bem como do título da amostra processada, é necessário ter em consideração o volume exacto da solução de eluição que é usada em cada amostra. Uma vez que se perdem pequenas quantidades de líquido durante a transferência e contacto com as partículas magnéticas, o volume inicial da solução de eluição deve ser superior ao volume seleccionado para garantir que o eluato final apresenta o volume correcto. Recomendamos a preparação de misturas novas para cada ensaio, imediatamente antes de usar. Utilize o calculador de IC para determinar o volume total necessário, incluindo volume morto, para o número de amostras a serem testadas. Tabela 7. Preparação do controlo interno ARN portador (CARRIER) Componente Volume (μl) ARN portador de stock (CARRIER) 5 Controlo interno* 9 Tampão AVE 106 Volume final por amostra 120 * O cálculo da quantidade de controlo interno baseia-se nos volumes de eluição iniciais (90 μl). O volume morto adicional depende do tipo de tubo de amostra utilizado. Utilize o calculador de IC para determinar o volume total necessário, incluindo volume morto, para o número de amostras a serem testadas. 30 Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/2010

31 Conjuntos de controlo de ensaio e conjuntos de parâmetros de ensaio Os conjuntos de controlo do ensaio são uma combinação de um protocolo com parâmetros adicionais, tais como o controlo interno, para purificação da amostra no QIAsymphony SP. Um conjunto de controlo do ensaio predefinido é pré-instalado para cada protocolo. Os conjuntos de parâmetros de ensaio são a combinação de uma definição de ensaio com parâmetros adicionais definidos, tais como modelos de replicação e número de standards de ensaio, para configuração de ensaio no QIAsymphony AS. Retornos de ácidos nucleicos Os eluatos preparadas com ARN portador (CARRIER) podem conter mais ARN portador (CARRIER) que ácidos nucleicos alvo. Recomendamos a utilização de métodos de amplificação quantitativos para determinar os retornos. Armazenamento de ácidos nucleicos Para períodos de curta duração até 24 horas, recomendamos o armazenamento de ácidos nucleicos purificados a 2 8ºC. Para períodos de armazenamento de longa duração, superiores a 24 horas, recomendamos o armazenamento a 20ºC. Quantificação Os standards de quantificação (Hep. C Virus RG QS 1 4) do kit artus HCV QS- RGQ são tratados como amostras previamente purificadas, sendo utilizado o mesmo volume (20 μl). Para gerar uma curva standard nos instrumentos Rotor- Gene Q, todos os 4 standards de quantificação devem ser usados e definidos na caixa de diálogo Edit Samples (editar amostras) no instrumento Rotor- Gene Q como standards com as concentrações especificadas (consultar manual do utilizador do instrumento). Os standards de quantificação são definidos como IU/μl.* A seguinte equação tem de ser aplicada para converter os valores determinados usando a curva standard para IU/ml de material de amostra. Resultado (IU/ml) = Resultado (IU/μl) x Volume de Eluição Inicial (90 μl) Volume de amostra (ml) * O standard foi calibrado utilizando o Standard de HCV Internacional (OMS). O cálculo é baseado nos volumes de eluição iniciais (90 μl). Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/

32 Como regra geral, o volume de amostra inicial deve ser introduzido na equação acima representada. Isto tem de ser considerado quando o volume da amostra tiver sido alterado antes da extracção do ácido nucleico (ex.: reduzir o volume por centrifugação ou aumentar o volume adicionando ao volume necessário para o isolamento). Os Serviços Técnicos da QIAGEN disponibilizam uma norma orientadora para a análise quantitativa dos sistemas de detecção de patogénios nos instrumentos Rotor-Gene ( Technical Note for quantitation on Rotor-Gene Instruments Nota Técnica para quantificação nos instrumentos Rotor-Gene) 32 Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/2010

33 Protocolo: Isolamento de ARN no QIAsymphony SP O kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi (QIAGEN, n.º cat ) está validado para purificação de ARN viral obtido de plasma humano para utilização com o kit artus HCV QS-RGQ. A tabela 8 mostra informações gerais sobre o protocolo. Tabela 8. Informações gerais sobre o protocolo Kit Material para amostra Volume da amostra (incluindo volume excedente) Nome do protocolo Conjunto de controlo do ensaio predefinido Volume de eluição Versão de software necessária Kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Plasma tratado com EDTA 1200 μl Cellfree1000_V4_DSP Cellfree1000_V4_DSP artus HCV 60 μl Versão 3.1 ou superior Aspectos importantes antes do início do procedimento Certifique-se de que está familiarizado com o modo de funcionamento dos instrumentos QIAsymphony SP/AS. Consulte os manuais de utilizador que acompanham os instrumentos para obter as instruções de funcionamento. Antes de dar início ao procedimento, leia Notas importantes, nas páginas Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/

34 Antes de utilizar um cartucho de reagente (RC) pela primeira vez, verifique se os tampões QSL2 e QSB1 não contêm um precipitado. Se necessário, remova as cavidades contendo os Tampões QSL2 e QSB1 do cartucho de reagente (RC) e incube durante 30 minutos a 37ºC, com agitação ocasional para dissolver o precipitado. Assegure-se que coloca novamente as cavidades nas posições correctas. Se o cartucho de reagente (RC) já estiver perfurado, assegure-se de que as cavidades são seladas com tiras vedantes reutilizáveis e proceda à incubação do cartucho de reagente completo (RC), durante 30 minutos a 37ºC com agitação ocasional em banho-maria.* Tente evitar a agitação vigorosa do cartucho de reagente (RC), caso contrário poderá formar-se espuma que pode levar a problemas de detecção do nível líquido. Todos os componentes do kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi têm estabilidade demonstrada no interior dos instrumentos QIAsymphony SP/AS, durante pelo menos o tempo normal necessário para processar 96 amostras. Outros aspectos importantes antes de iniciar o procedimento Prepare todas as misturas necessárias, incluindo misturas contendo o ARN portador (CARRIER) e os controlos internos imediatamente antes de iniciar o procedimento. Para mais informações, consulte Preparação das misturas de ARN portador (CARRIER)-tampão AVE (AVE), na página 29 e Utilização de um controlo interno, na página 30. Assegure-se de que cobertura perfurável (PL) é colocada no cartucho de reagente (RC) e a cobertura da cavidade das partículas magnéticas foi removida, ou se for utilizado um cartucho de reagente (RC) parcialmente usado, assegure-se de que a tira vedante reutilizável foi removida. Antes de iniciar o procedimento, certifique-se de as partículas magnéticas estão completamente em suspensão. Agite vigorosamente no vórtex a cavidade contendo as partículas magnéticas, durante pelo menos 3 minutos antes da primeira utilização. Antes de carregar o cartucho do reagente (RC), remova a cobertura da cavidade contendo as partículas magnéticas e abra os tubos de enzimas. Assegure-se de que o suporte de enzimas foi equilibrado à temperatura ambiente (15 25ºC). Assegure-se de que a cobertura perfurável (PL) é colocada no cartucho do reagente (RC) ou, se utilizar um cartucho de reagente parcialmente usado, certifique-se de que a tira vedante reutilizável foi removida. * Assegure-se de que os instrumentos foram objecto de verificação, manutenção e calibração regulares, de acordo com as recomendações do fabricante. 34 Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/2010

35 Caso as amostras tenham códigos de barras, oriente as amostras no porta-tubos, de forma a que os códigos de barras fiquem virados na bandeja Sample (amostra) para o lado esquerdo do QIAsymphony SP, onde se situa o leitor de códigos de barras. Procedimento 1. Feche todas as bandejas e coberturas dos instrumentos QIAsymphony SP/AS. 2. Ligue os instrumentos QIAsymphony SP/AS e aguarde até que o ecrã Sample Preparation apareça e o procedimento de inicialização fique completo. O interruptor de alimentação está localizado no canto inferior esquerdo do QIAsymphony SP. 3. Aceda aos instrumentos. 4. Assegure-se de que a bandeja Waste está devidamente preparada (ver Tabela 9) e efectue uma inventariação da mesma, incluindo o colector de pontas e resíduos líquidos. Substitua o saco de eliminação de pontas, se necessário. Tabela 9. Preparação da bandeja Waste Suporte de caixa de unidades 1 4 Suporte de saco de resíduos Suporte do frasco de resíduos líquidos Esvazie as caixas de unidades Aplique o saco de resíduos Esvazie e instale o frasco de resíduos líquidos 5. Coloque o suporte de eluição necessário na bandeja "Eluate" (eluato). Use apenas a Elution slot 1 (ranhura de eluição 1) com o adaptador de arrefecimento correspondente (Adaptador de Arrefecimento, EMT, v2, Qsym, n.º cat ). Para uma operação integrada, coloque na posição 1 o suporte de eluição com adaptador, incluindo a estrutura de transferência. 6. Coloque o(s) cartucho(s) de reagentes (RC) e consumíveis necessários na bandeja Reagents and Consumables (ver Tabelas 10 e 11). O número de pontas com filtros fornecido pode diferir dos números visualizados no ecrã táctil, dependendo das definições. Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/

36 Tabela 10. Preparação da bandeja Reagents and Consumables RC Posição 1 e 2 Suporte de pontas posição 1 4 Suporte de pontas posição 5 18 Suporte de caixa de unidades posição 1 3 Suporte de caixa de unidades posição 4 Carregue 1 cartucho de reagente (RC) para um máximo de 48 amostras ou 2 cartuchos de reagentes (RC) novos para um máximo de 96 amostras Carregue suportes de pontas com filtro descartáveis suficientes, 200 μl (ver Tabela 11) Carregue suportes de pontas com filtro descartáveis suficientes, 1500 μl (ver Tabela 11) Carregue 3 caixas de unidades contendo cartuchos de preparação de amostras Carregue 1 caixa de unidades contendo mangas de 8 barras. 36 Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/2010

37 Tabela 11. Material de plástico necessário para lotes de amostras 1 4 Pontas com filtro descartáveis, 200 μl Pontas com filtro descartáveis, 1500 μl Cartuchos de preparação de amostras Mangas de 8 barras Um lote, 24 amostras* Dois lotes, 48 amostras* Três lotes, 72 amostras* Quatro lotes, 96 amostras* * Utilizar mais que um tubo de controlo interno por lote e efectuar mais que uma inventariação, requer pontas com filtro descartáveis adicionais. Estão disponíveis suportes de 32 pontas/pontas com filtros O número de pontas com filtro necessárias inclui pontas com filtro para 1 inventariação por cartucho de reagente. Estão disponíveis 28 cartuchos de preparação de amostras/caixa de unidades. Estão disponíveis doze mangas de 8 barras/caixa de unidades. 7. Efectue uma inventariação da bandeja Reagents and Consumables 8. Coloque as amostras no porta-tubos apropriado e coloque-os na bandeja Sample (consultar tabela 12). Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/

38 Tabela 12. Carregar amostras na bandeja Sample Tipo de amostra Volume da amostra (incluindo volume excedente) Tubos de amostras Introdutor Plasma tratado com EDTA 1200 μl Microtubos 2,0 ml Tipo I (Sarstedt, n.º cat ) Introdutor de tubo 3B (n.º cat ) 9. Coloque o(s) tubo(s) contendo a mistura de ARN portador (CARRIER)-tampão AVE (AVE), incluindo o controlo interno, no portatubos e carregue-o(s) na ranhura A da bandeja Sample. Para obter mais informações sobre a preparação da mistura, consulte Preparação das misturas de ARN portador (CARRIER)-tampão AVE (AVE), na página 29 e Utilização de um controlo interno, na página Utilizando o ecrã táctil, introduza a informação necessária para cada lote de amostras a ser processado Introduza as seguintes informações: Informações da amostra Protocolo a ser executado (escolha o conjunto de controlo de ensaio Cellfree1000_V4_DSP artus HCV da categoria artus QS-RGQ ) Volume de eluição 60 μl (ver Tabela 13) e posição de saída slot 1 Tubo(s) contendo a mistura de ARN portador (CARRIER) tampão AVE (AVE), incluindo o controlo interno (escolha o IC com nome Cellfree1000_V4_DSP artus HCV ) Após a informação sobre o lote ter sido introduzida, o estado muda de LOADED (carregado) para QUEUED (em fila). Assem que o lote é colocado em fila o botão Run (executar) aparece. 38 Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/2010

39 Tabela 13. Volume de eluição pré-seleccionado Volume de eluição préseleccionado (μl)* Volume de eluição inicial (μl) * O volume de eluição pré-seleccionado para o protocolo. Este é o volume acessível mínimo de eluato no tubo de eluição final. O volume inicial da solução de eluição necessário para assegurar que o volume real de eluato é igual ao volume pré-seleccionado. 11. Prima o botão Run (executar) para dar início ao procedimento de purificação. Todas as etapas de processamento são totalmente automatizadas. No final do protocolo, o estado do lote muda de RUNNING (em curso) para COMPLETED (completo). 12. Quando o processamento da amostra estiver completo, remova manualmente o suporte de eluição da gaveta Eluate (operação independente) ou efectue transferência directa do suporte de eluição para o QIAsymphony AS através do módulo de transferência (operação integrada). Para a operação independente, remova o suporte de eluição da ranhura no ecrã táctil, abra depois a bandeja Eluate e remova manualmente o suporte de eluição. Para a operação integrada, prima Transfer para transferir o suporte de eluição da ranhura 1 do QIAsymphony SP para a ranhura 2 do QIAsymphony AS. Recomendamos que prossiga imediatamente para a configuração do ensaio no QIAsymphony AS, após o teste ter terminado. Dependendo da temperatura e da humidade, os eluatos deixados no QIAsymphony SP após o teste terminar podem passar por condensação ou evaporação. Para períodos de armazenamento de curta duração até 24 horas, recomendamos o armazenamento de ácidos nucleicos purificados a 2 8ºC. Para períodos de armazenamento de longa duração, superiores a 24 horas, recomendamos o armazenamento a 20ºC. Os ficheiros de resultados são gerados para cada suporte de eluição. Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/

40 13. Se um cartucho de reagente (RC) for apenas parcialmente usado, efectue a sua selagem com tiras vedantes reutilizáveis e feche os tubos contendo proteinase K com tampas de rosca, imediatamente após o protocolo terminar, para evitar a evaporação. Para mais informações sobre armazenamento de cartuchos de reagentes (RC) parcialmente usados, consulte Storage no Manual do QIAsymphony DSP Virus/Pathogen. 14. Elimine os tubos de amostras usados, placas e resíduos de acordo com os regulamentos de segurança locais. Consulte o Manual do QIAsymphony DSP Virus/Pathogen para obter informações de segurança. 15. Feche as bandejas do instrumento e prossiga com a configuração do ensaio no QIAsymphony AS (página 41). 16. Limpe o QIAsymphony SP durante ou após a configuração do ensaio no QIAsymphony AS. Para a operação integrada, limpe todos os instrumentos no final do processo. Siga as instruções de manutenção no Manual do Utilizador do QIAsymphony SP/AS Descrição Geral. Certifique-se de que efectua regularmente a manutenção, de forma a minimizar o risco de contaminação cruzada. 40 Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/2010

41 Protocolo: Configuração do ensaio no QIAsymphony AS O QIAsymphony AS efectua a configuração de ensaio para 6 72 reacções. As amostras processadas no QIAsymphony SP podem ser transferidas automaticamente para o QIAsymphony AS (operação integrada). Para maior flexibilidade, o QIAsymphony SP e AS também podem ser operados de forma independente.* Os pormenores do ensaio são apresentados na Tabela 14. Tabela 14. Parâmetros de ensaio usando o kit artus HCV QS-RGQ Informação do processo Material de entrada da amostra Volume de mistura padrão Volume modelo Detalhes Eluato 30 μl 20 μl Número de reacções 6 24 ou 6 72 Tempo de teste Versão de software necessária Para 6 reacções: aproximadamente 9 minutos Para 72 reacções: aproximadamente 35 minutos Versão 3.1 ou superior Ao realizar execuções múltiplas de ensaios, assegure-se de que o limite de 72 reacções e 1 adaptador de suporte de ensaio não é excedido. Evite alargar o tempo de incubação entre a conclusão da execução do ensaio e a transferência para o Rotor-Gene Q. Os ensaios foram realizados com cada reacção única (sem replicações) e a mistura padrão foi preparada pelo instrumento. Aspectos importantes antes do início do procedimento Antes de dar início ao procedimento, leia Notas importantes, nas páginas Os volumes de reagentes estão optimizados para 24 ou 72 reacções (n.º cat e , respectivamente). Com outros números de reacções, os reagentes em excesso devem ser eliminados após o ensaio. * Os QIAsymphony SP e AS permanecem fisicamente ligados durante a operação independente. Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/

42 Antes de cada utilização, todos os reagentes têm de ser completamente descongelados, misturados (por pipetagem repetida para cima e para baixo ou por acção rápida do vórtex) e centrifugados durante, pelo menos, 3 s a 6800 x g. Evite a formação de espuma nos reagentes. Os eluatos da preparação da amostra e todos os componentes do kit artus HCV QS-RSG comprovaram estabilidade no interior do instrumento, durante pelo menos o tempo necessário para purificação da amostra para 96 amostras e configuração de 72 ensaios, incluindo um tempo máximo de transferência do QIAsymphony SP para o QIAsymphony AS de uma hora e até 30 minutos de tempo de transferência do QIAsymphony AS para o Rotor-Gene Q. Trabalhe com rapidez e mantenha os reagentes de PCR em gelo ou no bloco de arrefecimento antes de proceder ao seu carregamento Outros aspectos importantes antes de iniciar o procedimento Combine todos os tubos de Hep. C Virus RG Master A num único kit para um tubo antes da utilização. Combine todos os tubos de Hep. C Virus RG Master B num único kit para um tubo antes da utilização. Procedimento 1. Insira o colector de pontas 2. Elimine o saco de resíduos de pontas. 3. Instale um saco vazio de resíduos de pontas. 4. Mude para a interface do utilizador de configuração do ensaio, premindo o botão Switch na barra de estado. 5. Dê início ao processo de definição do ensaio. Para a operação independente, prima New. Aparecerá uma mensagem a perguntar se pretende utilizar o suporte de eluição como um suporte de amostras. Prima Yes para confirmar. As janelas no ecrã táctil guiam o utilizador, passo-a-passo, ao longo do processo de definição do ensaio. 6. Atribua o suporte de amostras a uma ranhura Sample, seleccionando o ficheiro do suporte a partir do respectivo ensaio no QIAsymphony SP. Se o suporte de eluição tiver sido automaticamente transferido para o QIAsymphony AS, o ficheiro do suporte será automaticamente atribuído e o ecrã Sample Rack(s) (suporte(s) de amostras) da interface do utilizador de configuração do ensaio será automaticamente preenchido. 42 Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/2010

43 7. Verifique as posições EC+ e EC da amostra, ID e volumes das amostras no suporte de amostras. 8. Seleccione o conjunto de parâmetros do ensaio para utilizar no teste (consulte a tabela 15). Tabela 15. Informações de ensaio usando o kit artus HCV QS-RGQ Informações de lançamento Categoria Conjunto de parâmetros de ensaio Detalhes artus QS-RGQ artus HCV QS-RGQ_V1 9. Atribua o conjunto de parâmetros de ensaio às amostras. O conjunto de parâmetros de ensaio define os parâmetros de configuração do ensaio, conforme descrito na tabela 16. Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/

44 Tabela 16. Parâmetros de ensaio Parâmetro Master mix (Mistura padrão) Use ready-to-use master mix? (Utilizar a mistura padrão pronta a usar?) Sample input (Introdução da amostra) Number of sample replicates (Número de replicados da amostra) Do samples contain an assay specific control? (As amostras contêm um controlo específico de ensaio?) Number of EC+ replicates (Número de replicados EC+) Number of EC replicates (Número de replicados EC ) Assay standards (Standards de ensaio) Number of assay standards replicates (Número de replicados de standards de ensaio) Selected assay standards (Standards de ensaio seleccionados) Assay standards on all output racks? (Standards de ensaio em todos os suportes de saída?) Assay controls (Controlos de ensaio) Number of positive assay controls (Número de controlos de ensaio positivos) Predefinição No (Não) 1 Yes (Sim) QS1: 10,000 IU/μl QS2: 1000 IU/μl QS3: 100 IU/μl QS4: 10 IU/μl All (Todos) 0 A tabela continua na página seguinte. 44 Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/2010

45 Tabela 16. Continuação Parâmetro Number of positive control replicates? (Número de replicados de controlo positivos?) Number of NTC with IC replicates (Número de NTC com replicados de IC) Number of NTC without IC replicates (Número de NTC sem replicados de IC) Concentration (Concentração) Unit (Unidade) Assay controls on all assay racks? (Controlos de ensaio em todos os suportes de ensaio?) Assay output (Saída do ensaio) Assay rack (Suporte de ensaio) Cycler file format (Formato do ficheiro do ciclador) Dyes (Corantes) Additional information (Informações adicionais) Read only (Só para leitura) Comment (Comentário) Unique ID (ID exclusiva) APS name (Nome APS) APS filename (Nome do ficheiro APS) Panels (Painéis) Predefinição Sem predefinição Sem predefinição Não seleccionado QIA# *StripTubes 0.1 Rotor-Gene Q Sem predefinição As misturas padrão contêm corante. Seleccionado Sem comentários Sem ID artus HCV QS-RGQ_V1 APS_artus_HCV_QS- RGQ_V1.xml Sem painéis Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/

46 10. Defina o(s) suporte(s) de ensaio. Nesta fase, o(s) suporte(s) pode(m) ser carregado(s) na(s) ranhura(s) Assay (consulte a Tabela 19). 11. Verifique a temperatura das posições de arrefecimento. Quando as temperaturas-alvo de arrefecimento são atingidas, as ranhuras aparecerão a verde. 12. Encha cada tubo de ensaio com o volume necessário de cada reagente, de acordo com a informação de carregamento fornecida pelo software do instrumento (consulte a Tabela 17 para exemplos de volumes de reagente). Antes de cada utilização, todos os reagentes têm de ser completamente descongelados, misturados (por pipetagem repetida para cima e para baixo ou por acção rápida do vórtex) e centrifugados durante, pelo menos, 3 s a 6800 x g. Evite a formação de bolhas ou espuma, que poderão causar erros de detecção. Trabalhe com rapidez e mantenha os componentes de PCR em gelo ou no bloco de arrefecimento antes de proceder ao seu carregamento. 46 Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/2010

47 Tabela 17. Exemplos de volumes de reagentes* Reagente Volume (μl) para 24 reacções Volume (μl) para 72 reacções Hep. C Virus RG Master A Hep. C Virus RG Master B Hep. C Virus RG QS 1 (1x 10 4 IU/μl) Hep. C Virus RG QS 2 (1x 10 3 IU/μl) Hep. C Virus RG QS 3 (1x 10 2 IU/μl) Hep. C Virus RG QS 4 (1x 10 1 IU/μl) Hep. C Virus RG IC NTC * Esta tabela fornece exemplos de volumes de reagentes para um teste de ensaio com as seguintes especificações: 19 ou 67 modelos, 4 standards de ensaio, um controlo sem modelo (NTC), amostras com controlo interno (IC), mistura padrão preparada pelo instrumento. Utilize os volumes de reagentes apropriados, de acordo com a informação de carregamento fornecida pelo software do instrumento. Combine todos os tubos de Hep. C Virus RG Master A num único kit para um tubo antes da utilização. Combine todos os tubos de Hep. C Virus RG Master B num único kit para um tubo antes da utilização 13. Coloque os tubos de reagentes, sem tampas, nas posições adequadas dos adaptadores pré-arrefecidos para reagentes (consulte a Tabela 18). Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/

48 Tabela 18. Consumíveis Consumíveis Tiras de tubos e tampas, 0,1 ml (250) Tubos, cónicos, 2 ml, Qsym AS (500)* Tubo, cónico, 5 ml, Qsym AS (500)* Frascos de reagente, 30 ml, QSym AS (50)* Microtubos de eluição CL (24 x 96) Nome no ecrã táctil QIA# *StripTubes 0.1 QIA# *T2.0 ScrewSkirt QIA# *T5.0 ScrewSkirt QIA# *Bottle 30ml QIA#19588 * EMTR Para uso com adaptador/suporte de reagente Tiras de tubos RG 72 QS Suporte de reagente 1 QS Suporte de reagente 2 QS Suporte de reagente 1 QS Suporte de reagente 2 QS Suporte de reagente 2 QS Suporte de microtubos de eluição QS * Para componentes da mistura padrão, mistura padrão preparada pelo sistema, standards de ensaio e controlos de ensaio. Alternativamente, podem ser usados os tubos Sarstedt descritos na página 23. O sufixo (m) indica que a detecção de nível líquido foi optimizada para reagentes viscosos. 14. Abra as bandejas Eluate and Reagents e Assays. 15. Carregue o adaptador de reagente preparado na respectiva ranhura. Introduza um código de barras de kit para o ensaio através da List view (visualização em lista) do ecrã Loading Reagents (a carregar reagentes). 16. Se ainda não o tiver feito, coloque os tubos em tira no adaptador pré-arrefecido RG Strip Tubes 72 QS (ver Tabela 19) e coloque-os na(s) ranhura(s) apropriada(s). 48 Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/2010

49 Tabela 19. Adaptadores e suportes de reagentes Suporte/Suporte de reagentes Suporte de amostras Suportes de reagentes Nome Suporte de microtubos de eluição QS Suporte de reagente 1 QS Suporte de reagente 2 QS Número necessário Suportes de ensaio Tiras de tubos RG 72 QS 1 Calculado para um teste de ensaio com 72 reacções. 17. Se o suporte de eluição não tiver já sido transferido para o QIAsymphony AS (ver etapa 12 do protocolo de purificação, página 39), coloque os Microtubos de Eluição CL no adaptador préarrefecido de Suporte de Microtubos de Eluição QS (ver Tabela 19) e coloque o adaptador preparado na ranhura indicada. Para a operação independente, remova o suporte de eluição da ranhura no ecrã táctil, abra depois a bandeja Eluate do QIAsymphony SP e remova manualmente o suporte de eluição. Para a operação integrada, prima Transfer para transferir o suporte de eluição da ranhura 1 do QIAsymphony SP para a ranhura indicada do QIAsymphony AS. 18. Carregue as bandejas Eluate and Reagents e Assays com pontas com filtros descartáveis, de acordo com o número necessário para cada tipo de ponta (ver Tabelas 20 e 21). Carrege a bandeja Eluate and Reagents com suportes de pontas a começar pelas ranhuras de pontas 1, 2 e 3 e carregue depois a bandeja Assays com suportes de pontas, nomeadamente as ranhuras de pontas 7, 8 e 9. Tabela 20. Pontas com filtros Consumíveis Filter-Tips, 1500 μl (1024) Filter-Tips, 200 μl (1024) Filter-Tips, 50 μl (1024) Nome no ecrã táctil 1500 μl 200 μl 50 μl Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/

50 Tabela 21. Consumo de consumíveis* Número para Número para 72 Consumível 24 reacções reacções Pontas com filtro, 1500 μl 5 6 Pontas com filtro, 200 μl Pontas com filtro, 50 μl Sacos de eliminação de pontas 1 1 * Esta tabela fornece exemplos de consumo de consumíveis para um teste de ensaio com as seguintes especificações: 19 ou 67 modelos, 4 standards de ensaio, um controlo sem modelo (NTC), amostras com controlo interno (IC), mistura padrão preparada pelo instrumento. O consumo de pontas com filtro pode ser afectado por alguns processos no QIAsymphony AS (ex.: detecção de nível líquido). 19. Feche as bandejas Eluate and Reagents e Assays 20. Ao fechar cada bandeja, prima Yes para dar início à inventariação de cada bandeja. A inventariação verifica as ranhuras, adaptadores, pontas com filtro e colector de pontas. Se necessário, corrija quaisquer erros. 21. Prima Queue. É dado início à monitorização do arrefecimento. 22. Aguarde até que as temperaturas-alvo de arrefecimento sejam alcançadas. Quando as temperaturas-alvo de arrefecimento são atingidas, as ranhuras aparecerão a verde. 23. Prima Run para iniciar o ensaio. 24. Após finalizar o ensaio, prima Remove (remover) no ecrã Overview (perspectiva geral) da configuração do ensaio. Abra a bandeja Assays e descarregue o(s) suporte(s) de ensaio. 25. Efectue a transferência dos ficheiros de resultados e do ciclador. 26. Prossiga para Protocolo: RT-PCR e Análise de Dados no Rotor- Gene Q, na página Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/2010

51 27. Efectue a manutenção regular do QIAsymphony AS durante ou após o ensaio de PCR no Rotor-Gene Q. Para a operação integrada, limpe todos os instrumentos no final do processo. Siga as instruções de manutenção no Manual do Utilizador do QIAsymphony SP/AS Descrição Geral. Certifique-se de que efectua regularmente a manutenção, de forma a minimizar o risco de contaminação cruzada. Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/

52 Protocolo: RT-PCR e Análise de Dados no Rotor- Gene Q Aspectos importantes antes do início do procedimento Antes de dar início ao procedimento, leia Notas importantes, nas páginas Familiarize-se com o Rotor-Gene Q antes de dar início ao protocolo. Consulte o manual do utilizador do instrumento. Assegure-se de que todos os 4 standards de quantificação, bem como pelo menos um controlo negativo (Água, grau de PCR) são incluídos por cada ensaio de PCR. Para gerar uma curva standard, utilize todos os 4 standards de quantificação fornecidos (Hep. C Virus QS 1 4) para cada ensaio de PCR. Procedimento 1. Feche os tubos de PCR e coloque-os no rotor de 72 poços do Rotor-Gene Q. Assegure-se de que transfere as tiras de 4 tubos Rotor-Gene Q com a orientação correcta, por forma a respeitar a correspondência entre os índices das posições do adaptador de arrefecimento e do rotor. Assegure-se de que o anel de bloqueio (acessório do Instrumento Rotor-Gene) é colocado no topo do rotor para evitar a abertura acidental dos tubos durante o ensaio. 2. Transfira o ficheiro do ciclador do QIAsymphony AS para o Rotor-Gene Q. 3. Para detecção de ARN do HCV, seleccione o perfil de temperatura predefinido artus HCV QS-RGQ_V1, ou crie um perfil de temperatura de acordo com os passos seguintes. Definição dos parâmetros de ensaio gerais Figuras 7, 8, 9 Transcrição reversa do ARN Figura 10 Activação inicial da enzima hot-start Figura 11 Amplificação do ADNc Figura 12 Ajustamento da sensibilidade do canal de fluorescência Figura 13 Iniciar o ensaio Figura Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/2010

53 Todas as especificações são referentes ao Rotor-Gene Q com software versão Pode encontrar mais informações sobre a programação dos instrumentos Rotor-Gene Q no manual do utilizador do instrumento. Estas definições estão enquadradas a negrito, nas ilustrações que se seguem. 4. Comece por abrir a caixa de diálogo New Run Wizard (Assistente de novo ensaio) (figura 7). Assinale a caixa Locking Ring Attached (Anel bloqueador conectado) e clique em Next (Seguinte). Figura 7. A caixa de diálogo New Run Wizard. 5. Seleccione 50 para o volume de reacção da PCR e clique em Next (figura 8). Figura 8. Definição dos parâmetros de ensaio gerais. Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/

54 6. Clique no botão Edit Profile (editar perfil) na caixa de diálogo seguinte do New Run Wizard (Figura 9) e programe o perfil de temperatura conforme se mostra nas figuras Figura 9. Editar o perfil. Figura 10. Transcrição reversa do ARN. 54 Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/2010

55 Figura 11. Activação inicial da enzima hot-start. Figura 12. Amplificação do ADNc. 7. O intervalo de detecção dos canais de fluorescência tem de ser determinado de acordo com as intensidades de fluorescência nos tubos de PCR. Clique em Gain Optimisation (optimização de ganho) na caixa de diálogo New Run Wizard (ver figura 9) para abrir a caixa de diálogo Auto-Gain Optimisation Setup (Configuração da optimização automática de ganho). Defina a Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/

56 temperatura de calibração para 50 para igualar a temperatura de hibridização do programa de amplificação (figura 13). Figura 13. Ajuste da sensibilidade dos canais de fluorescência 56 Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/2010

57 8. Os valores de ganho determinados pela calibração de canais são guardados automaticamente e são enumerados na última janela do menu do procedimento de programação (Figura 14). Clique em Start Run. Figura 14. Dar início ao ensaio. 9. Após dar início ao ensaio, edite as amostras. Importe a informação do ficheiro do ciclador, clicando no botão (abrir). 10. Após completar o ensaio, analise os dados. Os seguintes resultados (10a, 10b e 10c) são possíveis. A Figura 15 e a Figura 16 apresentam exemplos de reacções de PCR positivas e negativas. A Tabela 22 mostra as directrizes para a interpretação dos resultados quantitativos. 10a. É detectado um sinal no canal de fluorescência Cycling Green. O resultado da análise é positivo: a amostra contém ARN do HCV. Neste caso, a detecção de um sinal no canal Cycling Orange é dispensável, uma vez que as concentrações iniciais elevadas de ARN de HCV (sinal positivo no canal Cycling Green) podem levar a um sinal de fluorescência reduzido ou ausente do controlo interno no canal Cycling Orange (competição). Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/

58 10b. Não é detectado sinal no canal de fluorescência Cycling Green. Ao mesmo tempo, aparece um sinal do controlo interno no canal Cycling Orange. Não é detectável ARN de HCV na amostra. Pode ser considerada negativa. No caso de uma RT-PCR negativa para HCV, o sinal detectado do controlo interno exclui a possibilidade de inibição da RT-PCR. No entanto, se o valor C T para o controlo interno de uma amostra negativa for superior em mais de 3 ciclos ao valor C T para o controlo interno do controlo sem modelo do ensaio (C T IC Amostra C T IC NTC >3), então a amostra deve ser tratada como inválida. Não pode inferir-se qualquer resultado. 10c. Não é detectado sinal nos canais Cycling Green ou Cycling Orange. Não pode inferir-se qualquer resultado. Pode encontrar informações sobre as origens de erros e respectiva resolução no Guia de resolução de problemas, na página 60. Figura 15. Detecção dos standards de quantificação (Hep. C Virus QS 1 4) no canal de fluorescência Cycling Green. NTC: No template control (controlo sem modelo) (controlo negativo). 58 Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/2010

59 Figura 16. Detecção do controlo interno (IC) no canal de fluorescência Cycling Orange com amplificação simultânea dos standards de quantificação (Hep. C Virus QS 1 4). NTC: No template control (controlo sem modelo) (controlo negativo). Tabela 22. Interpretação dos resultados quantitativos Resultado ARN de HCV >36,2 IU/ml* ARN de HCV <36,2 IU/ml* ARN de HCV negativo Interpretação O resultado está dentro do intervalo de teste determinado. A probabilidade de detecção do ARN de HCV é de >95%. O resultado de teste positivo está assegurado estatisticamente. O resultado está fora do intervalo de teste determinado. A reprodutibilidade do resultado positivo não está assegurada. Não foi detectado ARN de HCV. * Limite de detecção. Consulte o Sensibilidade analítica, page 10. Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/

60 Guia de resolução de problemas Este guia de resolução de problemas pode ser útil para resolver qualquer problema que possa surgir. Para obter mais informações, consulte também a página de perguntas frequentes no nosso Centro de Suporte Técnico: Os cientistas da Assistência Técnica da QIAGEN estão sempre prontos a responder a qualquer questão que possa ter sobre as informações e protocolos constantes neste manual ou sobre as tecnologias de amostragem e ensaio (para os dados de contacto, consulte o verso do manual ou visite Manuseamento geral Mensagem de erro visualizada no ecrã táctil Comentários e sugestões Se for visualizada uma mensagem de erro durante um ensaio do protocolo, consulte os manuais do utilizador que acompanham os instrumentos. Precipitado na cavidade de reagente de cartucho aberto do kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi a) Evaporação do tampão A evaporação excessiva pode levar ao aumento da concentração salina ou à diminuição das concentrações de álcool em tampões. Elimine o cartucho de reagente (RC). Assegure-se de que sela as cavidades do tampão de um cartucho de reagente (RC) parcialmente usado, com tiras vedantes reutilizáveis, quando não estiver a ser usado para purificação. 60 Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/2010

61 b) Armazenamento do cartucho de reagente Comentários e sugestões O armazenamento do cartucho de reagentes (RC) a temperaturas inferiores a 15ºC pode conduzir à formação de precipitados. Se necessário, remova as cavidades contendo os Tampões QSL2 e QSB1 do cartucho de reagente (RC) e incube em banho-maria* durante 30 minutos a 37ºC, com agitação ocasional para dissolver o precipitado. Assegure-se que coloca novamente as cavidades nas posições correctas. Se o cartucho de reagente (RC) já estiver perfurado, assegure-se de que as cavidades são seladas com tiras vedantes reutilizáveis e proceda à incubação do cartucho de reagente completo (RC), em banho-maria* durante 30 minutos a 37ºC com agitação ocasional. Baixo retorno de ácidos nucleicos a) As partículas magnéticas não foram completamente suspensas Antes de iniciar o procedimento, certifiquese de as partículas magnéticas estão completamente em suspensão. Agite no vórtex, durante pelo menos 3 min antes de usar. b) As amostras congeladas não foram devidamente misturadas após descongelamento c) ARN portador (CARRIER) não adicionado Descongele as amostras congeladas com agitação ligeira para assegurar a correcta homogeneização. Reconstitua o ARN portador (CARRIER) em tampão AVE (AVE) e misture com um volume adequado de tampão AVE (AVE), conforme se descreve na secção Preparação das misturas de ARN portador (CARRIER)-tampão AVE (AVE), a partir da página 29. Repita o procedimento de purificação com novas amostras. * Assegure-se de que os instrumentos foram objecto de verificação, manutenção e calibração regulares, de acordo com as recomendações do fabricante. Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/

62 d) Ácidos nucleicos degradados e) Lise incompleta da amostra f) Entupimento da ponta da pipeta devido a material insolúvel Comentários e sugestões As amostras foram armazenadas incorrectamente ou sujeitas a demasiados ciclos de congelamento-descongelamento. Repita o procedimento de purificação com novas amostras. Antes de usar, verifique se o tampão QSL2 e QSB1 não contêm precipitados. Se necessário, remova as cavidades contendo os Tampões QSL2 e QSB1 do cartucho de reagentes (RC) e incube durante 30 minutos a 37ºC, com agitação ocasional para dissolver o precipitado. Se o cartucho de reagentes (RC) já estiver perfurado, assegure-se de que as cavidades são seladas com tiras vedantes reutilizáveis e proceda à incubação do cartucho de reagentes completo (RC), durante 30 minutos a 37ºC com agitação ocasional, em banho-maria*. O material insolúvel não foi removido da amostra antes de iniciar o procedimento de purificação no QIAsymphony. Para remover o material insolúvel para aplicações de vírus, centrifugue a amostra a 3000 x g durante 1 min e transfira o sobrenadante para um novo tubo de amostra. Ausência de sinal com controlos positivos (Hep. C Virus RG QS 1 4) no canal de fluorescência Cycling Green a) O canal de fluorescência seleccionado para análise dos dados de PCR não cumpre o protocolo Para análise de dados, seleccione o canal de fluorescência Cycling Green para a PCR de HCV analítica e o canal de fluorescência Cycling Orange para a PCR do controlo interno. * Assegure-se de que os instrumentos foram objecto de verificação, manutenção e calibração regulares, de acordo com as recomendações do fabricante. 62 Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/2010

63 b) Programação incorrecta do perfil de temperatura do instrumento Rotor-Gene c) Configuração incorrecta da PCR d) As condições de armazenamento para um ou mais componentes do kit não cumprem as instruções fornecidas em Armazenamento (página 6) e) O prazo de validade do kit artus HCV QS-RGQ expirou Comentários e sugestões Compare o perfil de temperatura com o protocolo. Consulte o Protocolo: RT-PCR e Análise de Dados no Rotor-Gene Q, na página 52. Assegure-se de que a configuração do ensaio foi efectuada correctamente e que utilizou o conjunto de parâmetros correcto. Repita a PCR, se necessário. Consulte o Protocolo: Configuração do ensaio no QIAsymphony AS, na página 41. Verifique as condições de armazenamento e a data de validade (ver etiqueta do kit) dos reagentes e use um novo kit, caso seja necessário. Verifique as condições de armazenamento e a data de validade (ver etiqueta do kit) dos reagentes e use um novo kit, caso seja necessário. Sinal fraco ou ausente do controlo interno de uma amostra de plasma negativa, sujeita a purificação usando o kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi no canal de fluorescência Cycling Orange e ausência simultânea de sinal no canal Cycling Green a) As condições de PCR não cumprem os requisitos do protocolo b) A PCR foi inibida Verifique as condições da PCR (ver acima) e repita a PCR com as definições corrigidas, caso seja necessário. Assegure-se de que utiliza o método de isolamento validado (consulte Protocolo: Isolamento de ARN no QIAsymphony SP, na página 33) e siga rigorosamente as instruções. Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/

64 c) ARN foi perdido durante a extracção Comentários e sugestões Se o controlo interno tiver sido adicionado à extracção, a ausência de um sinal de controlo interno pode indicar a perda de ARN durante a extracção. Assegure-se de que utiliza o método de isolamento validado (consulte Protocolo: Isolamento de ARN no QIAsymphony SP, na página 33) e siga rigorosamente as instruções. Consulte também acima Baixo retorno de ácidos nucleicos. d) As condições de armazenamento para um ou mais componentes do kit não cumprem as instruções fornecidas em Armazenamento (página 6) e) O prazo de validade do kit artus HCV QS-RGQ expirou Verifique as condições de armazenamento e a data de validade (ver etiqueta do kit) dos reagentes e use um novo kit, caso seja necessário. Verifique as condições de armazenamento e a data de validade (ver etiqueta do kit) dos reagentes e use um novo kit, caso seja necessário. Sinais com controlos negativos no canal de fluorescência Cycling Green da PCR analítica a) Contaminação ocorrida durante a preparação da PCR Repita a PCR com novos reagentes nos replicados. Se possível, feche os tubos de PCR directamente após adicionar a amostra a ser testada. Assegure-se de que o espaço de trabalho e instrumentos são regularmente descontaminados. 64 Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/2010

65 b) Contaminação ocorrida durante a extracção Comentários e sugestões Repita a extracção e PCR da amostra a ser testada usando novos reagentes. Assegure-se de que o espaço de trabalho e instrumentos são regularmente descontaminados. Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/

66 Referências A QIAGEN mantém uma abrangente base de dados online actualizada de publicações científicas que utilizam produtos QIAGEN. As opções de pesquisa avançada permitem localizar os artigos de que necessita, quer através da pesquisa por uma única palavra-chave, quer especificando a aplicação, área de investigação, título, etc. Para obter uma lista completa de referências, visite a base de dados de referências da QIAGEN online em ou contacte a Assistência Técnica ou o distribuidor local da QIAGEN. 66 Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/2010

67 Informações para encomenda Produto Conteúdos N.º cat. artus HCV QS-RGQ Kit (24) Para 24 reacções: 2 misturas padrão, 4 standards de quantificação, controlo interno, água (grau PCR) artus HCV QS-RGQ Kit (72) Para 72 reacções: 2 misturas padrão, 4 standards de quantificação, controlo interno, água (grau PCR) Kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi para purificação automática de ácidos nucleicos virais ou ADN patogénico a partir de 1-96 amostras QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit (96) Sistema QIAsymphony RGQ QIAsymphony RGQ, System Para um máx. de 96 preparações de 1000 μl cada: inclui 2 cartuchos de reagentes e suportes e acessórios de enzimas QIAsymphony SP, QIAsymphony AS, Rotor-Gene Q 5plex HRM, acessórios e consumíveis necessários, instalação e formação Instrumentos e acessórios QIAsymphony SP/AS QIAsymphony SP Módulo de prep. de amostras QIAsymphony, 1 ano de garantia em componentes e mão-de-obra técnica QIAsymphony AS Sample Prep Cartridges, 8-well (336) Módulo de configuração de ensaio QIAsymphony, 1 ano de garantia em componentes e mão-de-obra técnica Cartuchos de 8 poços para prep. de amostras, para uso com o QIAsymphony SP Rod Covers (144) Cooling Adapter, EMT, v2, Qsym Mangas de 8 barras para uso com o QIAsymphony SP Adaptador de arrefecimento para suportes EMT; para uso com os instrumentos QIAsymphony SP/AS (software versão 3.1 ou superior) Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/

68 Produto Conteúdos N.º cat. Reuse Seal Set (20) Conjuntos de vedantes reutilizáveis para selar cartuchos de reagentes QIAsymphony parcialmente usados Insert, 2.0ml v2, samplecarr. (24), Qsym Elution Microtubes CL (24 x 96) Cooling Adapter, Reagent Holder 1, Qsym Cooling Adapter, Reagent Holder 2, Qsym Cooling Adapter, RG Strip Tubes 72, Qsym Tubes, conical, 2 ml, Qsym AS (500) Tube, conical, 5 ml, Qsym AS (500) Reagent Bottles, 30 ml, QSym AS (50) Filter-Tips, 1500 μl (1024) Adaptador de tubo secundário (para tubos com tampa de rosca de 2 ml, introdutor do tubo 3b) para uso com o porta-tubos QIAsymphony SP Tubos de polipropileno não-estéreis (capacidade máxima de 0,85 ml, menos de 0,7 ml de capacidade de armazenamento, 0,4 ml de capacidade de eluição); 2304 em suportes de 96; inclui tiras de tampas Adaptador para tubos cónicos 18 x 2 ml e tubos cónicos 6 x 5 ml; para uso com os instrumentos QIAsymphony SP/AS (software versão 3.1 ou superior) Adaptador para tubos cónicos 18 x 2 ml, tubos cónicos 2 x 5 ml e 2 x frascos de reagentes de 30 ml; para uso com os instrumentos QIAsymphony SP/AS (software versão 3.1 ou superior) Adaptador de 18 tiras de 4 tubos; para uso com os instrumentos QIAsymphony SP/AS (software versão 3.1 ou superior) Tubos cónicos (2 ml) para reagente; para uso com o QIAsymphony AS Tubos cónicos (2 ml) para reagente; para uso com o QIAsymphony AS Frascos de reagentes (30 ml) com tampas; para uso com o QIAsymphony AS Pontas com filtro descartáveis, em suporte; (8 x 128). Para uso com o QIAsymphony SP * * * Verifique a disponibilidade de stocks. 68 Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/2010

69 Produto Conteúdos N.º cat. Filter-Tips, 200 μl (1024) Pontas com filtro descartáveis, em suporte; (8 x 128). Para uso com o QIAcube e o QIAsymphony SP Filter-Tips, 50 μl (1024) Pontas com filtro descartáveis, em suporte (8 x 128). Para uso com o QIAsymphony AS Tip Disposal Bags (15) Rotor-Gene Q e acessórios Rotor-Gene Q 5plex HRM System Sacos de eliminação de pontas para uso com os instrumentos QIAsymphony SP/AS Ciclador de PCR em tempo real e analisador de alta resolução de melting com 5 canais (verde, amarelo, laranja, vermelho, carmim) mais canal HRM, computador portátil, software, acessórios, 1 ano de garantia em componentes e mão-de-obra técnica Rotor-Gene Q 5plex HRM Platform Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (250) Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (2500) Ciclador de PCR em tempo real e analisador de alta resolução de melting com 5 canais (verde, amarelo, laranja, vermelho, carmim) mais canal HRM, computador portátil, software, acessórios, 1 ano de garantia em componentes e mão-de-obra técnica; inclui instalação e formação 250 tiras de 4 tubos e tampas para 1000 reacções 10 x 250 tiras de 4 tubos e tampas para reacções Para informações actualizadas sobre licenciamento e limitações de responsabilidade específicas do produto, consulte o respectivo manual do kit QIAGEN ou do utilizador. Os manuais do kit QIAGEN e do utilizador estão disponíveis em ou podem ser pedidos à Assistência Técnica ou ao distribuidor local da QIAGEN. Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/

70 Esta página foi intencionalmente deixada em branco 70 Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/2010

71 Esta página foi intencionalmente deixada em branco Manual do kit artus HCV QS-RGQ 09/

72 A aquisição deste produto permite ao comprador o seu uso para efectuar serviços de diagnóstico em processos de diagnóstico humano in vitro. Não é aqui concedida patente geral ou outra licença de qualquer tipo além deste direito de utilização específico a partir da compra. Marcas registadas: QIAGEN, QIAsymphony, artus (QIAGEN Group); Rotor-Gene (Corbett Research Pty Ltd). O kit artus HCV QS-RGQ é um kit de diagnóstico com a marca CE, de acordo com a Directiva Europeia 98/79/EC para Diagnóstico In Vitro. Não disponível em todos os países. Acordo de licença limitada A utilização deste produto implica a concordância por parte de qualquer comprador ou utilizador do kit artus HCV QS-RGQ com os seguintes termos: 1. O kit artus HCV QS-RGQ pode ser usado somente de acordo com o Manual do kit artus HCV QS-RGQ e apenas para utilização com os componentes contidos no kit. A QIAGEN não concede qualquer licença ao abrigo de sua propriedade intelectual para usar ou incorporar os componentes englobados neste kit com qualquer componente não incluído neste kit, excepto conforme descrito no Manual do kit artus HCV QS-RGQ e em quaisquer protocolos adicionais disponíveis em 2. À excepção de licenças expressamente declaradas, a QIAGEN não emite qualquer garantia de que este kit e/ou a sua utilização ou utilizações não infrinjam os direitos de terceiros. 3. Este kit e os seus componentes estão licenciados para uma única utilização e não podem ser reutilizados, renovados ou objecto de revenda. 4. A QIAGEN recusa especificamente qualquer outra licença, expressa ou implícita, à excepção das expressamente declaradas. 5. O comprador e utilizador do kit concorda em não tomar nem permitir que qualquer outro tome medidas que possam conduzir ou facilitar qualquer dos actos acima proibidos. A QIAGEN pode fazer cumprir as proibições deste Acordo de licença limitada em qualquer Tribunal e irá recuperar todos os seus custos legais e de investigação, incluindo honorários de advogados, em qualquer processo destinado a fazer cumprir este Acordo de licença limitada ou qualquer dos seus direitos de propriedade intelectual relativos ao kit e/ou seus componentes. Para obter os termos de licença actualizados, visite QIAGEN. Todos os direitos reservados

73 Australia Orders Fax Technical Austria Orders Fax Technical Belgium Orders Fax Technical Brazil Orders Fax Technical Canada Orders Fax Technical 800-DNA-PREP ( ) China Orders Fax Technical Denmark Orders Fax Technical Finland Orders Fax Technical France Orders Fax Technical Offers Germany Orders Fax Technical Hong Kong Orders Fax Technical Ireland Orders Fax Technical Italy Orders Fax Technical Japan Telephone Fax Technical Korea (South) Orders Fax Technical Luxembourg Orders Fax Technical Mexico Orders Fax Technical The Netherlands Orders Fax Technical Norway Orders Fax Technical Singapore Orders Fax Technical Spain Orders Fax Technical Sweden Orders Fax Technical Switzerland Orders Fax Technical UK Orders Fax Technical USA Orders Fax Technical 800-DNA-PREP ( ) PT Sample & Assay Technologies