UNIVERSIDADE TUIUTI DO PARANÁ MEDICINA VETERINÁRIA BRUNA ANDRADE SILVA

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1 UNIVERSIDADE TUIUTI DO PARANÁ MEDICINA VETERINÁRIA BRUNA ANDRADE SILVA USO DE CÉLULAS TRONCO MESENQUIM AIS NO TRATAMENTO DE HEMORRAGIA PULMONAR INDUZIDA PELO EXERCÍCIO GRAU V EM EQUINO RELATO DE CASO. CURITIBA PR 2016

2 2 BRUNA ANDRADE SILVA USO DE CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS NO TRATAMENTO DE HEMORRAGIA PULMONAR INDUZIDA PELO EXERCÍCIO GRAU V EM EQUINO RELATO DE CASO. Trabalho de conclusão de curso apresentado ao curso de Medicina Veterinária da Universidade Tuiuti do Paraná, como requisito parcial para obtenção Orientadora Acadêmica: Prof. Dra. Silvana Maris Cirio. Orientadora Profissional: Dra. Michele Andrade de Barros.

3 3 CURITIBA - PR 2016 UNIVERSIDADE TUIUTI DO PARANÁ REITOR Prof. Luiz Guilherme Rangel Santos PRÓ-REITOR ADMINISTRATIVO Carlos Eduardo Rangel Santos PRÓ-REITORA ACADÊMICA Prof. Dra. Carmen Luiza da Silva DIRETOR DE GRADUAÇÃO Prof. Dr. João Henrique Faryniuk COORDENADOR DO CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA Prof. Dr. Welington Hartmann COORDENADOR DE ESTÁGIO CURRICULAR Prof. Dr. Welington Hartmann

4 4 TERMO DE APROVAÇÃO BRUNA ANDRADE SILVA USO DE CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS NO TRATAMENTO DE HEMORRAGIA PULMONAR INDUZIDA PELO EXERCÍCIO GRAU V EM EQUINO RELATO DE CASO. Este Trabalho de Conclusão de Curso foi julgado e aprovado para obtenção do título de Médica Veterinária pela Comissão Examinadora do Curso de Medicina Veterinária da Universidade Tuiuti do Paraná. Curitiba, 06 de junho de 2016 Prof. Orientadora Silvana M. Cirio UTP Universidade Tuiuti do Paraná Dra. Michelle de Barros Andrade Regenera Medicina Veterinária Avançada

5 5 Dedico este trabalho de conclusão de curso Primeiramente, a Deus que sempre esteve ao meu lado, não me deixando cair em momentos em que não fui forte o suficiente. A minha mãe e meu padrasto, que tornaram possível a realização de todos os meus sonhos e sonharam comigo, fortalecendo sempre desejo de me tornar uma profissional melhor a cada dia. Aos meus tios e primos, por toda a amizade, companheirismo e votos de cofiança dados à minha sabedoria. E aos grandes mestres envolvidos em minha graduação, os quais sempre lecionaram com total sabedoria e deram suporte em momentos de indecisões.

6 6 AGRADECIMENTOS Foi uma longa jornada para conquistar o título de médica veterinária. Em primeiro lugar, o meu agradecimentos é à Deus, que nunca me deixou caminhar sozinha, e por muitas vezes me carregou no colo quando falhei. Muito obrigada a minha mãe, meu maior tesouro! Muito obrigada por ter me ensinado a nunca desistir dos meus objetivos, e ter lutado comigo! Seu amor com os animais é o maior ensinamento que eu tenho na vida, dar amor a quem não tem como retribuir, dar amor sem receber algo em troca. Ao meu padrasto, que assumiu o papel de pai em minha vida, sempre e estimulando a aprender coisas novas, exigir mais de mim mesma! Muito obrigada por sonhar este sonho comigo, muito obrigada pelo incentivo e investimento em minha carreira. Aos meus tios Juscelino e Marlene, que desde pequena sempre estiveram muito próximos a mim, me aconselhando e me incentivando a sempre buscar o algo a mais em minha vida. Ao meu primo Arnon, meu irmão de consideração, nós prometemos desde crianças que nossos objetivos seriam alcançados, e que chegaríamos ao topo juntos! Um sendo o orgulho do outro! A minha orientadora Silvana Maris Cirio, por todo tempo dedicado a mim, por toda paciência para me explicar ou questionar alguma questão. Sempre foi um exemplo para mim como profissional. Ao professor Wellington Hartmann por ter nos acolhido na Tuiuti e por se tornar um amigo para mim. A professora Jessea de Fátima França e a professora Ana Laura D Amico pelo tempo dedicado a este trabalho de conclusão de curso, muito obrigada por toda atenção e auxílio em minha vida acadêmica. Agradeço imensamente a equipe da Regenera Medicina Veterinária Avançada pela oportunidade de aprendizado e ensinamentos passados a mim. Especialmente a Dra. Michele, Dr. Joffre, a Bruna, Paula e Alana, muito obrigada por toda atenção e tempo gasto comigo!

7 7 RESUMO A HPIE é caracterizada pelo sangramento pulmonar após a realização de exercícios, ocorrendo com frequência em equinos atletas. A causa da doença é multifatorial, porém acredita-se que o aumento da pressão vascular ocasione falência dos capilares, gerando epistaxe. Não há tratamento efetivo para a hemorragia pulmonar induzida pelo exercício, porém o tratamento com a terapia de células tronco mesenquimais (CTM) vem se mostrando promissora, por realizar reparação tecidual, redução de inflamação e por não apresentar efeitos adversos. Foram correlacionadas revisões bibliográficas abrangendo a HPIE, e foi feito o acompanhamento de um paciente, que fez o uso de duas terapias com células tronco mesenquimais para tal doença. O quadro clínico do animal teve regressão de grau cinco para grau zero, mostrando a terapia com CTM promissora para doenças respiratórias em equinos. Palavras-chave: doenças respiratórias. epistaxe. falência vascular.

8 8 ABSTRACT The EIPH is characterized by pulmonary bleeding after performing exercises, occurring frequently in equine athletes. The cause of the disease is multifactorial, but it is believed that the increased vascular pressure entailing failure of capillaries, generating epistaxis. There is no effective treatment for exercise-induced pulmonary hemorrhage, but treatment with the mesenchymal stem cell therapy (CTM) is proving promising for performing tissue repair, reducing inflammation and not have adverse effects. literature reviews were correlated covering EIPH, and was made the monitoring of a patient, which made the use of two therapies with mesenchymal stem cells for this disease. The clinical picture of the animal had five degree of regression to zero level, showing promising therapy CTM for respiratory diseases in horses. Key-words: epistaxis. respiratory diseases. vascular failure.

9 9 ABREVIATURAS % - Porcentagem CTA Células Tronco Adultas CTM Células Tronco Mesenquimais CTS Células Tronco Somáticas EIPH do inglês Exercise-induced pulmonary hemorrhage HPIE - Hemorragia Pulmonar Induzida por Exercício LBA Lavado Broncoalveolar LT Lavado Traqueal mmhg - Milímetros de mercúrio MSC do inglês Mesenchymal Stem Cell ORVA Obstrução Recorrente das Vias Aéreas PSI Puro Sangue Inglês

10 10 LISTA DE ILUSTRAÇÕES FIGURA 1 EQUIPAMENTOS UTILIZADOS NA CRIOPRESERVAÇÃO DE CÉLULAS TRONCO (REGENERA, CAMPINAS-SP, 2016)...18 FIGURA 2 EQUIPAMENTOS UTILIZADOS PARA INCUBAÇÃO E CULTIVO CELULAR (REGENERA, CAMPINAS-SP, 2016)...19 FIGURA 3 SISTEMA DE INTERTRAVAMENTO (REGENERA, CAMPINAS-SP, 2016)...20 FIGURA 4 BOTIJÃO DE NITROGÊNIO...35 FIGURA 5 CRIOTUBOS UTILIZADOS NA TERAPIA CELULAR...36 FIGURA 6 TUBOS CONTENDO TERAPIA CELULAR...37

11 11 LISTA DE QUADROS QUADRO 1 PRINCIPAIS TEORIAS PARA A PLASTICIDADE DAS CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS...26 QUADRO 2 - CRITÉRIO DA VARIAÇÃO DE CLASSIFICAÇÃO DA HEMORRAGIA PULMONAR INDUZIDA POR EXERCÍCIO...30

12 12 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO OBJETIVO GERAL DESCRIÇÃO DA UNIDADE CONCEDENTE DE ESTÁGIO DESCRIÇÃO DAS ATIVIDADES DESENVOLVIDAS CASUÍSTICA REVISÃO DE LITERATURA CÉLULAS TRONCO Obtenção Ação Aplicação HEMORRAGIA PULMONAR INDUZIDA PELO EXERCÍCIO Fisiopatologia Diagnóstico Ocorrência Classificação Tratamento DESCRIÇÃO DO CASO CLÍNICO RESULTADOS E DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS... 40

13 13 1. INTRODUÇÃO A hemorragia pulmonar induzida por exercício (HPIE) é caracterizada pelo sangramento pulmonar após a realização de exercícios de intensidade. Esse processo patológico ocorre com alta frequência em equinos atletas, com realizações de diversas modalidades esportivas, não tendo predisposição exata para raça. Segundo Raphael e Soma, 1982; Pascoe et al., 1981, 40 a 90% dos cavalos de corrida apresentam esta doença. Esse fator pode ocorrer por diversos motivos, entretanto a teoria de que o aumento da pressão da vasculatura pulmonar gere falência por estresse dos capilares, ocasionando casos de epistaxe, é atualmente a mais aceita. O diagnóstico é feito rotineiramente com o auxílio de endoscópio, contudo o exame confirmatório com lavado bronquioalveolar não deve ser descartado. A classificação da HPIE é feita no momento do diagnóstico, em graus variando de zero a cinco, é levado em conta a ausência de sangue visível, epistaxe e a presença de sangue na traqueia e carina. Não há tratamento efetivo para a hemorragia pulmonar induzida por exercício, porém a redução da severidade da hemorragia e suas sequelas são essenciais para que o animal tenha uma melhor sobrevida. Apesar de haver poucos estudos sobre o uso das células tronco no tratamento de doenças que acometem o sistema respiratório dos equinos, seu mecanismo de ação as submete como um promissor tratamento para essas afecções. Essa terapia torna-se então, uma alternativa viável para a diminuição da ocorrência de sangramentos induzidos por exercícios, bem como o agravamento que essa situação pode trazer de maneira crônica. Recentemente foi mostrado que as células tronco mesenquimais realizam a reparação tecidual através de fatores parácrinos, pois estes favorecem o crescimento e desenvolvimento celular, além de intervir na inflamação de tecidos lesionados.

14 14 Em contra partida, ainda não se sabem os reais mecanismos de ação e efeitos biológicos e cada fase dessa reparação ou até mesmo da cicatrização. O tecido adiposo é a principal e mais disponível fonte de células tronco mesenquimais (CTM), contendo o maior numero de células viáveis e com altas taxas de migração, proliferação e diferenciação. Não há relatos científicos do uso de células tronco mesenquimais no tratamento de sangramento pulmonar induzido por exercício, por isso ainda não se sabem exatamente os reais mecanismos de ação e efeitos biológicos em cada fase dessa reparação ou cicatrização, o que torna necessária a realização de novas pesquisas e publicações para estudos. Contudo, vale ressaltar que já é sabido que não há efeitos adversos com o uso destas terapias (ZUK., 2010), o que as torna um método promissor.

15 15 2. OBJETIVO GERAL Acompanhar a utilização da terapia com células tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo em um equino de 15 anos acometido por sangramento pulmonar pós-exercício grau V, bem como avaliar os resultados e discutir possíveis desdobramentos do tratamento.

16 16 3. DESCRIÇÃO DA UNIDADE CONCEDENTE DE ESTÁGIO A Regenera é uma empresa de biotecnologia que atua na área de medicina veterinária regenerativa, trabalhando com pesquisas e desenvolvimento de protocolos terapêuticos envolvendo células tronco mesenquimais para cães, gatos e cavalos. A empresa tem a patente requerida no Brasil e em processo nos EUA e Canadá de seus processos biotecnológicos e terapêuticos envolvendo diferentes linhagens celulares estabelecidas a partir de tecido adiposo, polpa dentária e cordão umbilical. A estrutura física da Regenera pode ser desmembrada em área administrativa e área laboratorial. O primeiro setor citado, conta com uma sala destinada aos profissionais que cuidam da administração da empresa e uma sala de reuniões. O setor laboratorial é separado por de sistema de portas intertravadas e possui monitoramento de temperatura e qualidade do ar, além de contar com gerador de energia independente, seguindo todas as normas e quesitos preconizados pelo CRMV-SP e alcançando nível de certificação requerido pelo MAPA (Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento). A antessala é o primeiro ambiente ao entrar na área laboratorial, ela é destinada exclusivamente para procedimentos de lavagem das mãos e paramentação. Em seguida há um ambiente específico para controle de qualidade celular e outro designado para cultivo e expansão das células, ambos possuem classificação ISO 7. Estas salas são equipadas com: microscópio invertido, refrigeradores, duas incubadoras com temperatura e concentração de CO2 controlados, duas centrífugas, um fluxo de ar unidirecional vertical e outro horizontal, como mostra a figura 2, e são integradas através do pass thru, onde é realizada a passagem de material de uma para outra, como mostra a figura 3. A criopreservação das células tronco é realizada em outro ambiente individual, com climatização constante de 17ºC. O ultrafreezer utilizado para esta função alcança uma temperatura média de -80ºC, como mostra a figura 1. A empresa ainda conta com uma sala designada à esterilização de vidrarias e materiais cirúrgicos. Nela está localizada a autoclave, estufa de secagem e estufa

17 17 bacteriológica, onde são realizados procedimentos periódicos para maior controle de patógenos. Para adquirir a terapia com células tronco mesenquimais, o médico veterinário deve realizar um curso de capacitação e credenciamento disponibilizado pela própria empresa. Posteriormente deve ser feito o contato entre o requerente da terapia e os profissionais da Regenera, com os dados do paciente a ser atendido (raça, idade, peso, doença a ser tratada, e se houver, o grau de acometimento em que a mesma se encontra). Em seguida é calculada a quantidade total de células necessárias e a quantidade de vezes que a terapia deve ser aplicada em tal período de tempo. O horário de atendimento da Regenera é de segunda à sexta feira, das 08h00 às 18h00.

18 Figura 1 Equipamentos utilizados na criopreservação de células tronco (Regenera, Campinas-SP, 2016) (A) Ultrafreezer com marcador de temperatura (B) Gaveteiro do ultrafreezer, mostrando a disposição dos criotubos. 18

19 Figura 2 Equipamentos utilizados para incubação e cultivo celular (Regenera, Campinas-SP, 2016) (A) Fluxo de ar unidirecional vertical (B) Microscópio invertido (C) Incubadora com marcador de temperatura e concentração de CO2. 19

20 Figura 3 Sistema de intertravamentos (Regenera, Campinas-SP, 2016). (A) Pass Thru diferenciando a passagem de material limpo e contaminado (B) Pass Thru interligando sala de controle de qualidade e área de cultivo e expansão celular (C) Sistema de portas intertravadas. 20

21 21 4. DESCRIÇÃO DAS ATIVIDADES DESENVOLVIDAS O estágio obrigatório foi realizado no período de 15 de fevereiro de 2016 a 23 de maio 2016 (das 09h00 as 12h00 e das 14h00 as 17h00), na Regenera Medicina Veterinária Avançada, situada na Rua Baguaçu, 26, no município de Campinas, estado de São Paulo. Sob a responsabilidade da médica veterinária Michele Andrade de Barros e da biomédica Bruna Pereira de Morais. O estágio abrangeu a rotina de preparação, cultivo e congelamento de células tronco de origem mesenquimal, totalizando a carga horária de 400h. O enfoque principal deste estágio foi na área laboratorial e no acompanhamento de um caso clínico atendido por um médico veterinário credenciado. A parte laboratorial envolveu o acompanhamento da preparação, cultivo e congelamento de células tronco mesenquimais. Os estagiários eram responsáveis pelo procedimento de lavagem e esterilização de vidrarias e materiais cirúrgicos, preparo e montagem de kits de terapias celulares, organização laboratorial, controle de estoque, preparo de soluções requisitadas e posteriormente, limpeza de equipamentos. No acompanhamento do caso do equino com sangramento pulmonar pósexercício grau V, a função era de auxílio na preparação da terapia celular, lavagem do endoscópio, antes e depois de ser utilizado no animal em tratamento, e sua contenção.

22 22 5. CASUÍSTICA O estágio obrigatório foi realizado na Regenera Medicina Veterinária Avançada, uma empresa laboratorial que tem como foco a pesquisa abrangendo o cultivo, expansão, congelamento e aplicação de terapias com células tronco mesenquimais. A empresa possui médicos veterinários credenciados que realizam as aplicações destas terapias celulares, contudo apenas um caso clínico de estudo e equino foi acompanhado.

23 23 6. REVISÃO DE LITERATURA 6.1 CÉLULAS TRONCO As células tronco (CT) possuem duas características que as diferem das demais células do organismo: a capacidade de realizar a autorrenovação, pelo processo de divisão e formação de uma nova célula, e a diferenciação em novas células maduras em um órgão no qual elas se encontram (AL-HAJJ e CLARKE 2004). O processo de divisão das células tronco pode ser realizado de duas maneiras distintas: na chamada divisão simétrica, a célula tronco nomeada como mãe, dá origem à duas células idênticas a ela. Já na divisão assimétrica a célula tronco originará uma célula tronco idêntica à célula mãe (autorrenovação) e outra célula especializada (WEBSTER et al., 2012). Outro fator interessantemente relevável, é que essas células não apresentam uma função específica até que a mesma seja notificada pelo ambiente em que se encontra, se diferenciando então, em uma célula especializada (VALENTINI et al., 2010). Dada a facilidade das células tronco se dividirem e se proliferarem, elas se tornam as responsáveis pela manutenção e renovação dos tecidos adultos. Além do mais, são consideradas como um potencial tratamento para as mais variadas doenças rotineiras na clínica equídea, por sua capacidade de diferenciação celular e integração em tecidos lesionados (DESANDO et al., 2013). Devido a sua capacidade de secretar fatores de crescimento (VOSWINKEL et al., 2013), destaca-se então, algumas habilidades das CT, dentre elas: a capacidade de regulação de inflamações, a promoção da regeneração de tecidos e a prevenção da formação de novas lesões (BORJESSON e PERONI., 2011). As CT, de acordo com sua origem, podem ser classificadas em dois grupos distintos: as células tronco embrionárias (CTE), que são células pluripotentes, ou seja, possuem a capacidade de darem origem à células das três camadas germinativas (endoderme, ectoderme e mesoderme) e as células tronco somáticas ou também denominadas células tronco adultas (CTA), encontradas em diversos tecidos e responsáveis basicamente pela homeostase dos tecidos (GAZIT et al., 2011).

24 24 Tanto as CTE quanto as CTA são usadas como terapias celulares, contudo a grande vantagem das células tronco adultas é sua obtenção, pois as CTE são obtidas a partir da massa celular interna do blastocisto, e, portanto, envolvem questões éticas, legais e religiosas em torno da sua utilização Obtenção As CTA podem ser obtidas de várias fontes e possuem a capacidade de originar diversos tipos celulares, sendo classificadas então como células multipotentes. As células tronco mesenquimais (CTM) são células tronco adultas, que podem ser progenitoras da mesoderme como osso, cartilagem e gordura (MINGRONI-NETTO e DESSEN, 2006). As fontes mais comuns de células tronco mesenquimais são o tecido adiposo e a medula óssea. Estas são rotineiramente utilizadas em terapias envolvendo a regeneração de diversos tecidos. Além do mais, são facilmente obtidas para isolamento e cultivo na espécie equina (MAIA et al. 2013). Com menor frequência, as CTM também podem ser obtidas a partir de outros órgãos do organismo, dentre eles se destacam: membrana sinovial, músculos, derme, dente decíduo, cordão umbilical e respectivas veias (ZUCCONI et al., 2010), bem como placenta, fígado, baço e timo (MEIRELLES et al., 2006; CAPLAN, 2007). Amostras do liquido amniótico dos equinos, colhidas durante o parto, também são relatas para obtenção de células, entretanto a identificação destas foi descrita apenas por Lovati et al. (2010), Park et al. (2011) e Lacono et al. (2012). O método de isolamento das mesmas não segue devidamente um padrão, podendo ser utilizados diferentes reagentes e/ou quantidades dos mesmos. Renzi et al. (2012) ressalta a importância do aperfeiçoamento em procedimentos laboratoriais, não apenas para sua produção, mas sim para que a mesma seja mantida integralmente como quando foi retirada de um organismo vivo. A criopreservação das células deve se manter em temperaturas inferiores a 80 C negativos e, muitas vezes, abaixo de 140 C negativos, contudo pouco se sabe sobre os efeitos dessa alteração de temperatura sobre a viabilidade da célula e questão. Em uma análise das diversas fontes de CTM, Burk (2012) e Hong (2006), descreveram que o tecido adiposo apresenta um maior número de células viáveis

25 25 com elevadas taxas de migração, e com melhor potencial de proliferação e diferenciação, tornando-a assim uma conveniente fonte de células progenitoras. Além disso, a obtenção de CTM se torna ainda mais favorável pela disponibilidade em que esse tecido se encontra no corpo do animal, fator vantajoso para isolamentos celulares para preparações de terapias (ZUK., 2010). O tecido adiposo pode ser facilmente obtido em cavalos a partir de uma pequena incisão cirúrgica na base da cauda, sem apresentar grandes danos ao animal (VIDAL et al., 2007; MAMBELLI et al., 2009). Adicionalmente, Lubis e Lubis (2012) ressaltam que independentemente de onde as CT sejam extraídas, as mesmas são evidenciadas pela desenvoltura que induzem à diferenciação em diversas linhagens de tecidos. Barussi et al., 2015 preconizaram, em experimentos realizados, a utilização de células mononucleares autólogas, administrado via intratraqueal, na melhora do quadro inflamatório da obstrução recorrente das vias aéreas (ORVA) de forma semelhante a dexametasona. Adicionalmente, Zuk (2010) enfatiza que não há efeitos contrários ao uso dessa terapia, fator importante para se acreditar que é uma questão de tempo para que novas publicações e estudos nesta área sejam realizados Ação Um estudo realizado por Yamada et al., (2013), descreveu várias competências positivas à respeito das CT, como sua capacidade de expansão, efeito quimiotáxico e a possibilidade de realizarem imunomodulação local. Reposição celular e potencial de diferenciação sempre foram os pontos mais ressaltados sobre a importância das CTM, porém suas ações autócrinas e parácrinas hoje também são amplamente descritas (DESANDO et al., 2013). Na ação autócrina, as células tronco residentes daquele tecido recebem estímulos através da liberação de interleucinas pelas células de defesa e se tornam capazes de substituir células antigas e as repor com células novas, fazendo deste modo, a reparação tecidual. Esse processo é promovido pela capacidade de autorrenovação e plasticidade das CTM (CAPLAN, 1991; CAPLAN e DENNIS 2006). O quadro 1 a seguir descreve as principais teorias para a plasticidade das CTM:

26 26 Quadro 1 - Principais teorias para a plasticidade das células tronco mesenquimais. TEORIA AÇÃO EXPLICAÇÃO DIFERENCIAÇÃO CT indiferenciadas, sob determinado estímulo, originam células especializadas e funcionais (TAKAHASHI et al., 2006). Através de estímulos bioquímicos, mediante secreção de fatores de crescimento produzidos pelas células intrínsecas do organismo ou in vitro por suplementações e condicionamentos específicos as células indiferenciadas adquirem função de algum tecido específico (TAKAHASHI et al., 2006). TRANSDIFERENCIAÇÃO Capacidade das CTM de se diferenciarem em tipos celulares diferentes do tecido embrionário que as originaram (RYU et al., 2009). Ocorre espontaneamente em resposta a algum tipo de lesão. Isso se deve a habilidade que uma CT oriunda de uma linhagem embrionária tem de se alterar para a formação de outra (HERZOG et al., 2003). FUSÃO Capacidade da CTM em se fundir a uma célula alvo, assumindo a expressão gênica desta célula (ACQUISTAPACE et al., 2011) A fusão celular é um fenômeno biológico que ocorre principalmente em células com dois ou mais conjuntos de cromossomos (DA SILVA MEIRELLES et al., 2006).

27 27 Lai et al, (2011) relataram que as CT produzem e secretam fatores parácrinos e moléculas bioativas, as quais estimulam o crescimento e o desenvolvimento das células locais. Isso confere às CTM a capacidade de influenciar e incitar a ação de outras CT e outros tecidos celulares (KAMIHATA et al., 2001). Através desta ação, as CTM do organismo respondem às células inflamatórias nas fases iniciais da regeneração tecidual, conferindo suporte fisiológico para o restante do processo de resposta imune (CAPLAN e DENNIS, 2006; TAKAHASHI et al., 2006) Aplicação A terapia celular pode ser feita com células tronco autólogas, ou com células tronco alogênicas. No uso das células tronco alogênicas, as células são obtidas de um individuo para aplicação em outro. Gala et al (2013) e Freitas (2012) avaliaram o uso destas células, as transplantando em pacientes saudáveis e não obtiveram alterações sugestivas de quadro inflamatório, garantindo uma boa vantagem para seu uso. Na aplicação com células autólogas, se utilizam células do próprio indivíduo que receberá a terapia. Ambas as células alogênicas e autólogas não resultam em nenhum efeito prejudicial durante a implantação, como o aparecimento de tumores locais (RICHARDSON et al., 2007). Contudo, o uso das células autólogas é mais favorável para lesões crônicas, pois a expansão das CTM pela cultura, demora de 10 a 21 dias (CARRADE et al., 2011a). Anderson e Bluestone (2005); Seo et al., (2006) e Frassoni et al., (2008) descreveram o uso da terapia com células tronco mesenquimais em pacientes portadores de doenças auto-imunes e notaram que estas células proporcionam imunossupressão local e incitam os mecanismos de regeneração através da ação parácrina, através de moléculas antiinflamatórias, imunorreguladoras e fatores de crescimento angiogênicos. É inevitável a ampliação de conhecimentos na correlação do uso das células tronco mesenquimais com as mais relevantes afecções que acometem os equinos, como a HPIE, por exemplo. A terapia com células tronco, seja ela efetivamente para doença ou suas sequelas, vêm se mostrando favorável para doenças em equinos. Porém, esse

28 28 tratamento ainda necessita de pesquisas mais abrangentes sobre as propriedades e características destas células (PIGOTT et al., 2013). Conclui-se então que o aprofundamento do estudo geral abrangendo as células tronco mesenquimais obtidas a partir de tecido adiposo é necessário e promissor, bem como sua aplicação em doenças pouco estudadas na clinica de equinos, fator que abriria um novo leque de opções para afecções que não possuem um tratamento único e efetivo, principalmente pelo fato de não apresentarem efeitos adversos. 6.2 HEMORRAGIA PULMONAR INDUZIDA PELO EXERCÍCIO A respiração de equídeos é obrigatoriamente nasal. Indiferentemente se o animal se encontra em alguma ação que demande de muitas trocas respiratórias, este não consegue de forma alguma executar respiração oral (FRANKLIN, 2008; ROBINSON, 2012a). A hemorragia pulmonar induzida por exercício é descrita principalmente pelo sangramento, como o próprio nome diz, de origem pulmonar. Este é evidenciado após esforços realizados em atividades físicas intensas (BIAVA et al., 2011). A principal característica desta doença é a presença de sangue na árvore traqueobrônquica, podendo ocorrer em maior quantidade, chegando às cavidades nasais e ocasionando epistaxe (TAKAHASI et al., 2001; DOUCET e VIEL, 2002a) Fisiopatologia Não existe uma causa principal para o acontecimento da HPIE, contudo acredita-se na morte capilar, gerada pelo aumento da pressão da vasculatura pósexercício. A pressão da artéria pulmonar de equinos varia de 28 mmhg em situações de descanso, 84 mmhg em galope rápido e ultrapassa os 120 mmhg em situações de intensidade de exercício (ART et al., 2001; ERICKSON e POOLE, 2007). Contudo, não se é sabida a pressão arterial necessária para causar ruptura destes capilares pulmonares por hipertensão (BIRKS et al., 1997; MOORE, 1996). O deslocamento dorsal do palato é outra questão de predisponência para a HPIE, por interromper o fluxo de ar das vias aéreas (COOK, 2002). Pascoe (2000)

29 29 também relatou a influência que as enfermidades alérgicas têm principalmente a Obstrução Recorrente das Vias Aéreas (ORVA) na ocorrência desta doença. A principal teoria aceita da ocorrência de HPIE em equinos é a falência dos capilares pulmonares por estresse (BIRKS et al., 2003; SCHROTER et al., 1998). A ação de agentes vasoconstritores no momento da realização de exercícios está diretamente ligada ao aumento da pressão da vasculatura pulmonar. A principal consequência do estresse dos capilares pulmonares é a sua falência, resultando no extravasamento sanguíneo para o espaço alveolar, gerando resposta inflamatória, podendo deixar sequelas crônicas ou até mesmo levar o animal ao óbito (BIAVA et al., 2011) Diagnóstico O exame com o auxílio do endoscópio é o principal método de diagnóstico para a HPIE (COSTA, 2004; NEWTON, et al., 2005). Com ele é possível visualizar da presença de sangue ou de qualquer outro tipo de secreção, desde as narinas até a traqueia e carina. A realização deste procedimento deve ser feito prioritariamente de 30 a 120 minutos após a execução de atividade intensa, pois este é o tempo ideal para o conteúdo sanguíneo ser eliminado das vias aéreas distais (BIAVA et al., 2011) Ocorrência A hemorragia pulmonar induzida por exercício acontece rotineiramente na clínica médica de equinos atletas, sem predisposição exata para raças. Tal doença já foi discorrida em diversas intensidades de provas realizadas por cavalos (PASCOE, 1996; BIRKS et al., 2003). Os estudos realizados por Pascoe et al. (1981) e Raphael & Soma (1982), revelaram que cerca de 40 a 90% dos cavalos de corrida (Puro Sangue Inglês) foram confirmatórios para a HPIE. Biava et al. (2007) mostraram a incidência dessa doença em duas provas realizadas por equinos da raça Quarto de Milha: cerca de 40% dos animais participantes de competições de seis balizas e uma média de 75% foi demonstrada aos cavalos que praticam provas de três tambores. Moran et al. (2003), demonstraram que cerca de 46% dos equinos praticantes de pólo no Chile apresentam quadro de hemorragia pulmonar induzida por exercício. No Brasil são

30 30 poucos os estudos científicos sobre o episódio desta doença em equinos atletas (COSTA, 2004), contudo é ressaltado que se existe uma relação com a idade do equino atleta, diminuindo então a incidência dessa doença em animais jovens (ROBINSON, 1987; BIRKS et al., 2003) Classificação A classificação da hemorragia pulmonar induzida por exercício é feita no momento da realização do diagnóstico, na visualização direta das narinas e da traqueia, com o auxílio de endoscópio. O grau de graduação dessa doença pode variar de zero a cinco, e leva-se em conta a ausência de sangue visível até a presença de epistaxe (THOMASSIAN, 2005). O critério da variação de classificação da doença está descrito no quadro 2 a seguir, segundo a descrição do trabalho de Pascoe et al. (1981): Quadro 2 - Critério da variação de classificação da hemorragia pulmonar induzida por exercício. GRAU Grau 0 Grau 1 Grau 2 Grau 3 Grau 4 Grau 5 DESCRIÇÃO Não há a presença de sangue na traqueia É notado traço de sangue na traqueia É notada a presença de filete de sangue na traqueia Presença de pouco sangue na traqueia Acúmulo de sangue na traqueia Epistaxe e/ou sangue acumulado da traqueia a orofaringe. O lavado broncoalveolar (LBA) ou a citologia do lavado traqueal são métodos de confirmação para a hemorragia pulmonar induzida por exercício por conferirem maior especificidade e sensibilidade do que apenas o exame endoscópio, já que a presença de hemácias ainda pode ser evidenciada uma semana depois do quadro hemorrágico, e os produtos da quebra dessa hemoglobina ainda podem ser observados cerca de três semanas ou mais da ocorrência da doença (MCKANE et al. 1993).

31 Tratamento Não há uma confirmação científica do que cause a HPIE, logo, não há um tratamento único e efetivo para esta doença (PIOTTO, 2006). A redução da severidade do sangramento pulmonar torna-se o principal objetivo para uma maior sobrevida com qualidade do animal, bem como a minimização da inflamação e fibrose intersticial e de vias aéreas, exemplos de consequências que essa doença apresenta (BACCARIN, 2005). A restrição de exercícios que requerem esforços é indicada por Thomassian (2005), em animais que apresentam quadros de HPIE em graus acima do III ou com piora gradativa da clínica, como começo essencial para o tratamento, contudo, ainda o considera inconsistente. Por isso Piotto (2006) descreve a existência de tratamentos alternativos e menos específicos, baseando-se em afecções concomitantes que podem agravar e/ou induzir a doença em questão. A furosemida é o diurético rotineiramente utilizado em quadros de hipertensão no ser humano (PIOTTO, 2006). O uso da furosemida é recomendado como terapia para casos de equinos acometidos pela hemorragia pulmonar induzida por exercícios, pela queda de pressão sanguínea pulmonar e a liberação de E- prostaglandina (broncodilatadora) pelos rins (ROBINSON, 1979). Contudo não há comprovação científica de que há o impedimento ou atraso da evolução da doença (PIOTTO, 2006). Baccarin (2005) ressalta a falta de estudos que expliquem o papel da furosemida em casos de HPIE, apesar de um estudo realizado por Costa & Thomassian (2003) ter demonstrado dados de diminuição de 20% na severidade da hemorragia com o uso deste fármaco. Esse medicamento vem se mostrando eficaz na redução da gravidade de HPIE principalmente em animais com graus de hemorragia entre IV e V (OSELIERO & PIOTTO, 2003). Não se é sabido ao certo a ocorrência da inflamação das pequenas vias aéreas, bem como a broncoconstrição na hemorragia pulmonar induzida pelo exercício. Contudo, é rotineiro o uso de terapias que reduzem essa inflamação das vias posteriores e aliviam a broncoconstrição em equinos atletas.

32 32 Broncodilatadores beta adrenérgicos como o clembuterol e albuterol são eficazes na broncodilatação, porém sua eficácia em prevenir a HPIE não é conhecida (MANOHAR et al. 2000). O resultado do uso da terapia com células tronco mesenquimais vem se mostrando promissor para o tratamento de doenças em tecidos de origem não mesodérmica, como o pulmão. O principal objetivo da associação desta terapia com sangramento pulmonar induzido por exercício é a redução da inflamação causada pelo extravasamento de sangue nos pulmões e a prevenção da formação de lesões futuras. Adicionalmente, por não apresentarem efeitos adversos, as CTM seriam uma nova alternativa para afecções que não possuem tratamento único e efetivo, como a doença em questão. Contudo, não se é sabido o exato número de células necessárias para o tratamento do sangramento pulmonar induzido por exercício, qual a célula tronco de predileção, a melhor via de administração e o número de vezes que a terapia deve ser aplicada. Igualmente, não se tem certeza dos reais mecanismos de ação e efeitos das CTM, principalmente na reparação tecidual (MAIA et al. 2013). Há a carência de estudo abrangendo a associação das células tronco mesenquimais obtidas a partir de tecido adiposo, com doenças que afetam o trato respiratório dos equinos. A associação da terapia com fármacos já utilizados no tratamento da hemorragia pulmonar induzida por exercício garantiria ao animal a redução de sequelas adquiridas com a cronicidade, consequentemente uma melhor qualidade de vida seria proposta para o animal.

33 33 7. DESCRIÇÃO DO CASO CLÍNICO Foi atendido no Rancho Icaraí no município de Ibiúna São Paulo, um cavalo da raça Quarto de Milha. Macho, não castrado, 15 anos de idade, pesando 370 kg e atleta realizador de prova de tambores. O equino reside em um rancho com piso de terra compactada, possui água à vontade, sua alimentação é balanceada com ração e feno e seu treinamento era realizado rotineiramente. O responsável do animal relatou sangramento em ambas às narinas após ser submetido à esforços em exercícios de intensidade. O animal foi atendido por um médico veterinário da região, que indicou a administração do diurético Furosemida antecedente aos esforços (para evitar a ocorrência de epistaxe) e indicou suplementação com ômega 3, suplemento de óleo de alho fitoterápico e vitamina C. Concomitante à esses fármacos, também foi indicado o uso do broncodilatador Pulmonil, na quantidade de 20 ml, sendo administrado uma vez de manhã e outra à noite. Após não se mostrar responsivo ao tratamento convencional indicado, o equino foi atendido pela Dra. Flavia Guerra e pelo Dr. José Joffre Bayeux. Após reavaliação com auxílio de endoscópio, o diagnóstico foi de Sangramento Pulmonar pós Exercício em Grau V, e lhe foi indicado o tratamento com células tronco mesenquimais. O animal foi submetido à tratamento profilático com o antibiótico Ceftiofur, na dose de 2,2 mg/kg, duas vezes ao dia, pelo período de 10 dias (antecessores ao dia da aplicação da terapia celular). As aplicações foram agendadas em duas etapas, com intervalo de aproximadamente 30 dias entre elas, nas datas de 20/04/2016 e 23/05/2016. Para ambas as aplicações o animal foi submetido a jejum alimentar e permaneceu estabulado durante todo o período. Para cada fase do tratamento foram utilizados cinco criotubos contendo células tronco mesenquimais, como mostra a imagem 5. Os criotubos estavam armazenados em botijão de nitrogênio a uma temperatura aproximada de 196ºC negativos.

34 34 Após a retirada dos criotubos do botijão de nitrogênio, como mostra a imagem 4, os mesmos foram colocados imediatamente em banho maria, à temperatura de 37ºC, por dois minutos. Em seguida o conteúdo dos criotubos foi aspirado e duplamente lavados com o auxílio de pipeta Pasteur, como mostra a imagem 6. Após esse procedimento, as células foram diluídas em solução fisiológica, com o auxílio de uma seringa estéril de 20 ml. Concomitante a essa preparação, foi realizada a desinfecção do endoscópio com solução de glutaraldeído. O equino foi contido com o auxílio de um cachimbo e então foi realizada a passagem do endoscópio através da narina esquerda. Não foi notada a presença de secreções muco purulentas na traqueia do animal. Localizada a carina, foi aplicado um conteúdo de 10 ml, de células tronco mesenquimais diluídas, no brônquio esquerdo e em seguida, o mesmo foi realizado no brônquio direito. Terminado todo o procedimento de aplicação, foi retirado o endoscópio e fornecido feno ao animal. Manteve-se o uso de suplementações e o uso do bronquiodilatador, até a finalização de todas as aplicações da terapia celular. Foi indicado também que o animal realizasse apenas exercícios leves, podendo ser exercício a passo (guiado ou não), até o final do tratamento. A segunda fase do tratamento com CTM seguiu exatamente os mesmos protocolos da primeira. Após esta fase foi suspendido o uso de broncodilatador e o animal retoma seus exercícios de maneira gradativa, com o uso de glicose a 50%.

35 Figura 4 Botijão de nitrogênio. (A) Botijão de nitrogênio utilizado para o armazenamento temporário da terapia celular (B) Botijão de nitrogênio expondo armazenador de criotubos. 35

36 Figura 5 Criotubos utilizados terapia celular. 36

37 Figura 6 Tubos contendo terapia celular. (C) Tubo de 15 ml contendo células tronco e solução de descongelamento (D) Tubo de 15 ml contendo células tronco em solução de lavagem. 37

38 38 8 RESULTADOS E DISCUSSÃO Um mês após a primeira fase do tratamento, o animal não apresentava mais quadro de epistaxe. Borjesson e Peroni (2011) descrevem algumas habilidades das células tronco, dentre elas a regulação de inflamações. O repouso do animal juntamente com a redução da inflamação pelas CTM foram essenciais para que a epistaxe presente anteriormente cessasse. Sabe-se que as células tronco mesenquimais atuam na manutenção e renovação de tecidos lesionados (através de ação parácrina), além de auxiliarem na prevenção da formação de novas lesões. Quinze dias após a segunda aplicação das CTM no equino, não era possível visualizar secreções sanguinolentas na traqueia e Carina. Acredita-se na redução de lesões bronquiais junto à diminuição prévia da inflamação. Os principais sinais clínicos da hemorragia pulmonar induzida por exercício foram interrompidos com as duas aplicações de células tronco mesenquimais impostas ao paciente. O efeito antiinflamatório e a capacidade de regeneração tecidual impostos por estas células reduziram a severidade da doença, diminuindo cronicidade da HPIE para o equino. O animal segue trabalhando leve e não apresentou mais quadros de sangramento. O prognóstico do tratamento se mostrou favorável, apesar da cronicidade que a doença apresentava no início do tratamento e da idade do animal, que interfere diretamente no tempo de reação pelo sistema do animal. O uso da terapia de células tronco mesenquimais para o tratamento de hemorragia pulmonar induzida por exercício, regrediu a cronicidade da doença de grau 5 (epistaxe) para grau 0, ou seja, não foi notado nem mesmo a presença de traços de sangue na traqueia do paciente, fornecendo ao animal qualidade de vida.

39 39 9 CONCLUSÃO As células tronco mesenquimais vem atuando como uma terapia alternativa para diversas doenças, principalmente para aquelas que não possuem um tratamento efetivo e suas possíveis sequelas. Diversos pesquisadores relatam seu uso nos mais diferentes tecidos e lesões, conferindo a essas células, um caráter promissor na medicina veterinária. O resultado favorável obtido no relato de caso do paciente mostra a vantagem do uso das CTM em uma doença respiratória da clínica de equinos. Mostrando que o ramo de aplicação dessas células se estendem às doenças que ainda não foram completamente estudadas, como o sangramento pulmonar induzido por exercício. Contudo vale ressaltar que o aprofundamento dos conhecimentos sobre a ação das CTM abrangeria também a aplicação clínica desta terapia para diversas outras afecções sem tratamento.

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