TÍTULO: IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE VÍRUS DETECTADO EMAMOSTRAS FECAIS DE CRIANÇAS DE GUARULHOS

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1 TÍTULO: IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE VÍRUS DETECTADO EMAMOSTRAS FECAIS DE CRIANÇAS DE GUARULHOS CATEGORIA: CONCLUÍDO ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE SUBÁREA: BIOMEDICINA INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE CIDADE DE SÃO PAULO AUTOR(ES): LETICIA APARECIDA ALVES MOREIRA ORIENTADOR(ES): MARIA CLARA DUARTE FREGOLENTE ALVES

2 UNIVERSIDADE CIDADE DE SÃO PAULO NÚCLEO DE PESQUISA EM NEUROCIÊNCIAS PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA PIBIC PROJETO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE VÍRUS DETECTADO EM AMOSTRAS FECAIS DE CRIANÇAS DE GUARULHOS PROJETO DE PESQUISA IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA DE ROTAVÍRUS CIRCULANTES EM CRIANÇAS DE SÃO PAULO, SÃO PAULO. Aluna: Leticia Aparecida Alves Moreira Curso: Biomedicina Orientadora: Profa. Maria Clara Duarte Fregolente Alves São Paulo 2014

3 Introdução A diarreia é a segunda doença que mais mata crianças com idade inferior a cinco anos, no mundo todo (WHO, 2010). No Brasil, em 2008, estima-se que crianças nessa faixa etária tenham morrido por doenças diarreicas (WHO, 2008). A etiologia das diarreias pode envolver vários agentes, como vírus, bactérias e parasitas (MORILLO & TIMENETSKY, 2011), dentre estes, a gastroenterite viral é a mais comum (IDMED, 2012). A gastroenterite viral ocorre como duas formas epidemiológicas distintas: doença esporádica, que geralmente afeta crianças, causada principalmente por rotavírus do grupo C (JAWETZ, MELNICK & ADELBERG, 2012), calicevírus humanos e saporovírus; e doença epidêmica, que afeta tanto criança como adultos, frequentemente causadas por norovírus (MEDICINANET, 2012), adenovírus entéricos e rotavírus do grupo A (JAWETZ, MELNICK & ADELBERG, 2012). Dos agentes virais que causam gastroenterite, cujo genoma é composto de RNA fita dupla (RNAds), destacam-se os reovírus-like (ESPEJO, GONZALEZ et al., 1977), os picobirnavírus (GANESH, KOBAYASH et al., 2012) e os rotavírus. Desses agentes virais, os rotavírus são responsáveis por 20 a 60% dos casos de hospitalização devido à diarreia (NESTI & GOLDBAUM, 2007) e no Brasil esses vírus são encontrados principalmente em locais onde há grande contato humano, como escolas, creches e hospitais (LINHARES, 2000). Os Reovírus (REO) pertencem à família Reoviridae, e as partículas virais, não envelopadas, possuem aproximadamente 70 a 85 nm de diâmetro e densidade de 1,36 a 1,37g/cm³ em gradiente de cloreto de césio. O capsídeo duplo, de simetria icosaédrica, envolve o genoma composto por 10 segmentos, de RNAds. De acordo com a distribuição das massas moleculares dos dez segmentos o genoma do REO pode ser subdividido em três classes distintas. As classes denominadas L (large) M (medium) e S (small) codificam as proteínas l (lambda) m (mu) e s (sigma), respectivamente (WHITE & FANNER, 1994). Os Picobirnavírus (PBV) pertencem à família Picobirnaviridae, gênero Picobirnavírus e têm como espécies tipo o Human picobirnavirus e o Rabbit picobirnavirus. Estes pequenos vírus não envelopados, de dois segmentos genômicos de RNAds, são encontrados em amostras de fezes diarreicas ou não de diferentes hospedeiros mamíferos, incluindo o homem, aves e répteis. (FREGOLENTE, 2010). 2

4 Em humanos os PBV têm sido identificados em porcentagens menores que 10%, associados ou não a quadros de diarreia (GROHMANN et al., 1993). Rotavírus são membros da família Reoviridae, gênero Rotavírus, e apresentam-se como partículas esféricas de simetria icosaédrica, não envelopadas, com 100nm de diâmetro com três camadas proteicas concêntricas. A camada mais interna - core viral- é constituída por quatro proteínas, que têm a elas associadas uma proteína que constitui o capsídeo intermediário. Essa proteína, denominada VP6, é bastante imunogênica e induz a formação de anticorpos diferentes conforme a espécie de Rotavírus. A terceira camada, ou capsídeo externo, é constituída por duas proteínas: VP7 e a VP4, que corresponde às espículas da partícula viral. O genoma dos Rotavírus é constituído por 11 segmentos de RNAds, com tamanhos que variam de 3302 a 663 pares de bases. Cada segmento genômico codifica para pelo menos uma proteína, sendo seis estruturais e seis não estruturais (GREENBERG & ESTES, 2009). Atualmente as cinco espécies de Rotavírus (A, B, C, D, E) são definidas em função da VP6 (ICTV). De acordo com a proposta de nomenclatura binária para os sorotipos de Rotavírus, a especificidade antigênica da VP7 é designada pela letra G, de glicoproteína, e a especificidade antigênica da proteína VP4 é dada pela letra P, dado esta proteína ser sensível a proteases. Segundo estudos realizados os genótipos mais comuns de Rotavírus são: G1, G2, G3, G4 e P[4], P[6] e P[8] (GREENBERG & ESTES, 2009). Até o momento não existem vacinas de prevenção para reovírus e picobirnavírus destinadas a humanos, porém em 2006 a imunização de crianças contra os rotavírus foi incluída no Programa Nacional de Vacinação, sendo o Brasil o primeiro país do mundo a adotar tal conduta. Para tanto, uma vacina atenuada de genotipo G1P[8] (Rotarix) é utilizada (CORREIA et al., 2010) e como consequência verifica-se um acentuado declínio no número de casos de gastroenterite e/ou de hospitalizações ou mortalidade associadas a essa enfermidade, principalmente entre crianças entre 1 a 4 anos de idade (GURGEL et al., 2009). Apesar da quantidade de estudos epidemiológicos presentes na literatura, estes se justificam pelas peculiaridades acerca das gastroenterites por Rotavírus, ainda mais após o início do programa de vacinação. Dentro deste contexto, os estudos de acompanhamento se justificam pela detecção de episódios diarreicos leves ou 3

5 moderados, que não implicam em hospitalização, além da pesquisa de reinfecções (LINHARES, 2000). Dessa maneira, a existência de uma rede laboratorial que atue na vigilância sistemática dos genótipos circulantes se faz necessária (LINHARES, 2000). Dada essa importância, este projeto tem como objetivo principal a identificação de vírus entéricos circulantes na população infantil da cidade de Guarulhos. Objetivos Identificação de vírus entéricos em amostras de fezes de crianças de 0 a 5 anos da cidade de Guarulhos, através das técnicas de extração de RNAds e sua visualização no Núcleo de Pesquisa em Neurociência (NUPEN). Material e métodos Serão utilizadas amostras de fezes de crianças, de 0 a 5 anos, da Unidade Básica de Saúde Jardim Rosa de França, da cidade de Guarulhos. Amostras de Rotavírus de símio (SA-11) obtidos a partir de cultura celular serão utilizadas como controle positivo nas reações. A partir das amostras de fezes, serão preparadas suspensões a 10% em tampão fosfato salina (PBS) 0,01 M ph 7,4, após centrifugação a rpm por 10 minutos. As amostras de fezes e suspensões serão armazenadas a 4 C durante todo o período do estudo. A extração do dsrna viral será feita por fenol-clorofórmio segundo Herring e colaboradores (1982) com modificações. Partindo de 500 μl da suspensão fecal, serão adicionados 50 μl de SDS a 10% e seguir-se-á uma incubação a 37 C por 30 minutos. Serão então acrescidos 500 μl de fenol-clorofórmio (v/v) e a suspensão será agitada em Vortex por 1 a 2 minutos. Após centrifugação a rpm por 10 minutos, a fase aquosa será removida e a ela serão adicionados 50 μl de NaCl a 20% e μl de etanol a 4 C. A reação será incubada a -20 C por 18 horas e então se seguirá com a centrifugação a rpm por 10 minutos. O sobrenadante será descartado e ao precitado serão adicionados 20 μl de mistura dissociante. Antes da eletroforese os extratos serão incubados a 56 C por 15 minutos e então serão aplicados em um gel de poliacrilamida a 7,5% (HERRING et al., 1982). A 4

6 eletroforese será realizada a uma corrente constante de 145 V, amperagem de 25 ma durante 1h45min, seguida por coloração por nitrato de prata (SAMMONS et al., 1981). A caracterização molecular dos vírus identificados durante o período de desenvolvimento do projeto será realizada em colaboração com o Laboratório de Virologia Animal do Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Esta caracterização contará com a técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) específica para cada vírus detectado. Cronograma de execução Atividade 1º Trimestre 2º Trimestre 3º Trimestre 4º Trimestre Coleta de amostras XX XX XX Extração do dsrna XX XX XX Visualização em Gel de Poliacrilamida XX XX XX Análise molecular XX XX XX Análise dos resultados XX XX XX Redação de relatórios XX XX Redação de manuscritos XX XX Referências Correia, JB; Patel, MM; Nakagomi, O; Montenegro, FM; Germano, EM; Correia, NB; Cuevas, LE; Parashar, UD; Cunliffe, NA; Nakagomi, T. Effectiveness of monovalent rotavirus vaccine (Rotarix) against severe diarrhea caused by serotypically unrelated G2P[4] strains in Brazil. J Infect Dis 201: , Espejo, R.T.; Gonzales N.; Calderon, E.; Distinct Reovirus-Like Agents Associated with Acute Infantile Gastroenteritis. Journal of Clinical Microbiology, 1977, p Fregolente, M.C.D.; Caracterização Genética de Picobirnavírus detectados em amostras fecais de diferentes hospedeiros. Universidade Estadual de Campinas, Ganesh1, Krisztián Bányai, Vito Martella, Ferenc Jakab,Gisela Masachessi and Nobumichi Kobayashi. Picobirnavirus infections: viral persistence and zoonotic potential. Balasubramanian. Article first published online: 7 FEB DOI: /rmv.1707 Greenberg, HB and Estes, MK. Rotaviruses: From Pathogenesis to Vaccination. Gastroenteroly 136: ,

7 Grohmann, G S; Glass, R I; Pereira, H G; Monroe, S S; Hightower, A W; Weber, R; Bryan, R T. Enteric viruses and diarrhea in HIV-infected patients. N Engl J Med, n.329 (1), p.14-20, 1993 Gurgel, RG; Bohland, AK; Vieira, SC; Oliveira, DM; Fontes, PB; Barros, VF; et al. Incidence of rotavirus and all-cause diarrhea in Northeast Brazil following the introduction of a national vaccination program. Gastroenterol. 137: , Herring, AJ; Inglis, NF; Ojeh, CK; Snodgrass, DR; Menzies, JD. Rapid diagnosis of rotavirus infection by direct detection of viral nucleic acid in silver stained polyacrylamide gels. J Clin Microbiol, 16 (3): , International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) Identidade Médica (IDMED) 2012, acessado em 05 de Junho de Linhares, AC. Rotavirus infection in Brazil: epidemiology and challenges for control. Cad Saúde Púb 16: , Jawetz, Melnick & Adelberg.Microbiologia Médica Editado por Geo. F. Brooks; Janet S. Butel; Stephen A. Morse - 25ª ed., McGraw-Hill Interamericana, Medicina Net (MEDICINANET) 2012, acessado em 05 de Junho de _parashar.htm Morillo, Simone Guadagnucci and TIMENETSKY, Maria do Carmo Sampaio Tavares.Norovírus: uma visão geral. Rev. Assoc. Med. Bras. [online]. 2011, vol.57, n.4, pp ISSN Nesti, MMM and Goldbaum, M. Infectious diseases and daycare and preschool education. J Pediatr 83: , Sammons, D.W; Adams, L.D; E.E. Silver staining in page. Electrophoresis, v.2. p , White, D.O.; Fenner, F.J. Reoviridae. In: Medical Virology, 4. ed. San Diego: Academic Press, 1994, p World Health Organization (WHO) 2008, acessado em 12 de junho de World Health Organization (WHO) 2010, acessado em 12 de junho de