UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL

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1 1 UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS CARACTERÍSTICAS MOLECULARES E PERFIL DE SENSIBILIDADE A ANTIFÚNGICOS DE LEVEDURAS DO GÊNERO Candida spp ISOLADAS DE PACIENTE COM CANDIDÍASE VULVOVAGINAL KAROLINE LÔ JIMENEZ MANAUS 2015

2 1 i KAROLINE LÔ JIMENEZ CARACTERÍSTICAS MOLECULARES E PERFIL DE SENSIBILIDADE A ANTIFÚNGICOS DE LEVEDURAS DO GÊNERO Candida spp ISOLADAS DE PACIENTE COM CANDIDÍASE VULVOVAGINAL Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em Convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, para obtenção do grau de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas. Orientador : Prof Dr. João Vicente Braga de Souza Co-orientadora : Profª Drª Maria Zeli Moreira Frota MANAUS 2015

3 ii 2 FICHA CATALOGRÁFICA J61c Jimenez, Karoline Lô. Características moleculares e perfil de sensibilidade a antifúngicos de leveduras do gênero Candida spp isoladas de paciente com candidíase vulvovaginal./karoline Lô Jimenez. -- Manaus : Universidade do Estado do Amazonas, Fundação de Medicina Tropical, xvi, 93f. : il. Dissertação (Mestrado) apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas UEA/FMT, Orientador: Prof. Dr. João Vicente Braga de Souza 1.Candidíase vulvovaginal 2.Candida sp. Genotipagem 3.Antifúngicos. Título. CDU: 616.9(043) Ficha Catalográfica elaborada pela Bibliotecária Maria Eliana N Silva, lotada na Escola Superior de Ciências da Saúde - UEA

4 iii 3 FOLHA DE JULGAMENTO CARACTERÍSTICAS MOLECULARES E PERFIL DE SENSIBILIDADE A ANTIFÚNGICOS DE LEVEDURAS DO GÊNERO Candida spp ISOLADAS DE PACIENTE COM CANDIDÍASE VULVOVAGINAL KAROLINE LÔ JIMENEZ Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado. Banca Julgadora: Dr. João Vicente Braga de Souza Presidente Dra. Maria das Graças Vale Barbosa Guerra Membro Dra.Sônia Maria da Silva Carvalho Membro

5 4 iv AGRADECIMENTOS Agradeço, primeiramente, a Deus pela vida, pelas bênçãos concedidas e por ter colocado em meu caminho pessoas tão especiais, que não mediram esforços em me ajudar durante a realização deste mestrado e desta dissertação. A estas pessoas esterno aqui meus sinceros agradecimentos. Aos meus pais, Erasmo Carlos e Cecília Maria, por todos os esforços para garantir meus estudos, pelo apoio incondicional em todos os momentos e pelo esforço que fizeram para que eu pudesse superar cada obstáculo em meu caminho e chegar até aqui. Às minhas queridas irmãs, Vivian Jimenez e Karla Cecília Jimenez, obrigada por existirem, pelo carinho e por sempre torcerem por mim. A vocês, minha família sou eternamente grata por tudo e dedico não apenas esta, mas todas as conquistas que eu vier a alcançar durante a vida. Ao meu orientador, Dr. João Vicente Braga de Souza, pela oportunidade, sugestões fornecidas e por estar sempre disposto a ajudar. Obrigada por me ter aceitado como sua orientanda e pela chance de compartilhar de sua experiência. À minha co-orientadora, Profª Drª Maria Zeli Moreira Frota, por acompanhar e orientar minha trajetória acadêmica desde a graduação, por acreditar que eu seria capaz de desenvolver esse trabalho, pelo incentivo constante e por todos os ensinamentos a mim transmitidos. Muito obrigada! Aos amigos do Laboratório de Micologia da FUAM, Dona Daura Nila Gama, Jorge Alberto Oliveira, Eleade Falcão, Eugênio Frazão, Débora Fernandes e Eliane Batista pela amizade, pronto auxílio e pelos momentos de descontração. Ao serviço de ginecologia do setor de DST/AIDS da FUAM que, de forma direta ou indireta, na coleta das amostras clínicas, especialmente as Enfermeiras Lucília Jardim e Claudomira Lopes e a Dra Soledad Borborema. Obrigada pela ajuda!

6 v 5 A todos os funcionários e amigos da FUAM, muito obrigado pela ajuda, em especial a gerência de laboratórios, Dra Silvia e Dr. Jorge Everton Sales pela compreensão e disposição e também ao grupo de pesquisa do laboratório de biologia molecular pela parceria e colaboração. Ao grupo de pesquisa do INPA, que torceram pela realização desse trabalho. As minhas queridas amigas, Brigite Stela de Almeida e Cláudia Nogueira, que mesmo distantes se fizeram presentes ao longo deste trabalho, com mensagens de incentivo, carinho e apoio para que eu fosse até o fim com muita determinação. Às pacientes que participaram espontaneamente do estudo. Por causa delas é que esta dissertação se concretizou. Vocês merecem meu eterno agradecimento! Aos colegas do mestrado, que compartilharam as alegrias e angústias de ser um mestrando. Foi uma convivência maravilhosa e enriquecedora. À Universidade do Estado do Amazonas (UEA) e à Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT/HVD) pela excelência no ensino e pela oportunidade de participar deste curso. Por fim, agradeço a todos que contribuíram de alguma forma, direta ou indiretamente, para que esse estudo fosse realizado.

7 6 vi DECLARAÇÃO DAS AGÊNCIAS FINANCIADORAS À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão da bolsa de pesquisa. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) e o Programa de Apoio a Núcleos Emergentes de Pesquisa (PRONEM) pelo financiamento desta pesquisa (EDITAL 009/2011 FAPEAM).

8 vii 7 RESUMO A candidíase vulvovaginal (CVV) é considerada um problema universal que atinge um número elevado de mulheres em todo o mundo. Os objetivos desse estudo foram identificar e caracterizar os fenótipos e genótipos de Candida spp. isoladas de pacientes com CVV atendidas em uma unidade terciária, bem como, determinar a suscetibilidade in vitro dos isolados, a antifúngicos usados na prática clínica. Foram incluídas 128 pacientes com suspeita clínica de candidíase vulvovaginal, que procuraram atendimento especializado no Centro de Referência em Doenças sexualmente transmissíveis, durante o período de junho de 2014 a fevereiro de Dados demográficos, clínicos e fatores predisponentes foram obtidos por meio de questionário padronizado. Amostras de secreções vaginais foram semeadas em ágar Sabouraud e em meio cromogênico CHROMagar Candida. As leveduras foram identificadas de acordo com a metodologia clássica e pelo sistema API 20 AUX. A concentração inibitória mínima (CIM) do fluconazol, itraconazol e anfotericina B foi determinada pelo método comercial Etest. CIMs foram observadas após 24 e 48 h de incubação. A caracterização molecular e identificação genotípica de espécies de Candida foram realizadas por restrição do comprimento do fragmento polimórfico (RFLP) e tipagem sequência multilocus (MLST), esta última, foi usada para caracterizar os perfis genéticos de Candida albicans. A faixa etária da população estudada variou entre 18 e 65 anos de idade, predominando mulheres pardas (81,3%), com escolaridade de nível médio completo (45,3%), solteiras (48,4%) e com vida sexual ativa (97,7%). Corrimento vaginal e prurido foram as principais queixas apresentadas, respectivamente, por 100 e 57,3% das pacientes, seguido de hiperemia (49,3%) e ardência (44,0%). O diagnóstico foi confirmado pela cultura em 75 (58,5%) pacientes, sendo 3 casos de infecção mista. Candida albicans foi à espécie mais frequente representando 62,7% dos casos, seguida por espécies não-albicans: C. glabrata (13,3 %), C. tropicalis (8,0 %), C. parapsilosis (6,7%), C. krusei (5,3 %). CIM variou de 0,016 a 256 µg/ml para o fluconazol, 0,004 a 32 µg/ml para o itraconazol e 0,023 a 1,0 µg/ml para anfotericina B. Todos os isolados foram sensíveis à anfotericina B e apenas duas amostras de Candida albicans foram resistentes ao fluconazol.entre espécies Candida não-albicans, 17,9 % dos isolados foram considerados sensíveis dose- dependentes e 7,6% foram resistentes ao itraconazol. Não houve correlação entre genótipos encontrados com o perfil de suscetibilidade e dados clínicos. As espécies não- albicans isoladas foram menos suscetíveis ao itraconazol do que a maioria C. albicans, mostrando a importância da realização dos testes de identificação e sensibilidade a antifúngicos de candidíase vulvovaginal. Palavras-chave: Candidíase vulvovaginal, Candida sp.; genotipagem, antifúngicos.

9 8 viii ABSTRACT Vulvovaginal candidiasis (VVC) is considered a universal problem that affects a great number of women throughout the world. The aim of this study were to identify and characterize the phenotypes and genotypes of Candida spp isolated from patients with VVC treated in a tertiary healthcare center, and to determine the in vitro susceptibility profile of isolates to the most commonly antifungal agents used in clinical practice. A total of 128 patients were included with suspected vulvovaginal candidiasis, attending a referral center in the city of Manaus, between june 2014 and february Demographic and clinical data were obtained with a questionnaire. Vaginal swab samples was seeded on agar Sabouraud and CHROMagar Candida.The yeasts were identified by classic method and commercial system API 20 C AUX. The Minimal Inhibitory Concentration (MIC) of fluconazole, itraconazole, and amphotericin B were determined by E-test. MICs were noted after 24 and 48 h of incubation. Molecular characterization and genotypic identification of Candida species were performed by Restriction fragment length polymorphic (RFLP) and Multilocus sequence typing (MLST), this last one, was used to characterize the genetic profiles of Candida albicans. The age of the study population ranged between 18 and 65 years old, predominantly mixed skin color women ( 81.3 %), with complete secondary education level (45.3%), single ( 48.4 %) and sexually active (97.7%).Vaginal discharge and itching were the main complaints, respectively, by 100 and 57.3 % of patients, followed by hyperemia (49.3%) and burning ( 44.0 %). The diagnosis was confirmed by culture in 75 (58.5 %) patients, with 3 cases of mixed infection. Candida albicans was the predominant species (62, 7%), followed by non-albicans species: C. glabrata (13,3 %), C. tropicalis (8,0%), C. parapsilosis (6,7%) and C. krusei (5,3 %). The MIC ranges were 0, µg/ml for fluconazole, 0,004-32µg/mL for itraconazole, and 0,023-1,0 µg/ ml for amphotericin B.All the isolates were susceptible to amphotericin B and only two samples of C. albicans strains were resistance to fluconazole. Among the nonalbicans species,17.9% of the isolates were considered susceptible-dose dependent and 7,6% resistant to itraconazol. No correlation was found between the genotype with susceptibility and clinical data. The non-albicans species isolated were less susceptible to itraconazole than most C. albicans, showing the importance of the performance of the identification tests and susceptibility to antifungal agents of vulvovaginal candidiasis. Keywords: Vulvovaginal candidiasis, Candida spp, genotyping, antifungal drugs.

10 ix 9 RESUMO LEIGO A candidíase vulvovaginal (CVV) é uma micose muito comum em todo o mundo, que acomete as mulheres causando uma série de desconfortos, tais como corrimento vaginal esbranquiçado, coceira, ardor, dentre outros. É um dos diagnósticos mais frequente na área da ginecologia, acometendo especialmente mulheres após a puberdade, com vida sexual ativa ou no terceiro trimestre da gravidez. Esta micose é causada por um fungo denominado de Candida sp., e muitas vezes a doença persiste com até três ou mais ocorrências, mesmo após o tratamento específico. A Candida albicans é o principal agente etiológico, podendo ser encontrada em até mais de 80% dos casos, no entanto, estudos recentes tem apontado para um aumento de outras espécies Candida não-albicans, possivelmente, devido ao uso indiscriminado de medicamentos antifúngicos, considerando-se que o autodiagnóstico e a auto-medicação são práticas muito comuns entre as portadoras da doença. Os fatores envolvidos na ocorrência desta micose e da sua persistência precisam ser mais estudados para um melhor entendimento da doença, e para orientar futuras ações na área da prevenção, acompanhamento das pacientes e tratamentos mais adequados. Estudos epidemiológicos considerando os aspectos clínicos, etiológicos e moleculares, bem como o perfil de susceptibilidade dos isolados fúngicos às principais drogas usadas na terapêutica da CVV, revestem-se de fundamental importância para um maior entendimento a respeito dos casos de insucesso terapêutico, e para o monitoramento do impacto do uso dessas drogas em uma possível resistência adquirida pelo fungo. O objetivo desse estudo é identificar e caracterizar os fenótipos e genótipos de Candida spp. isoladas de pacientes com CVV atendidas em uma unidade terciária, bem como, determinar a suscetibilidade in vitro dos isolados, a antifúngicos usados na prática clínica. A faixa etária da população estudada variou entre 18 e 65 anos de idade, predominando mulheres pardas (81,3%), com escolaridade de nível médio completo (45,3%), solteiras (48,4%) e com vida sexual ativa (97,7%). Corrimento vaginal e coceira foram as principais queixas apresentadas.dentre as leveduras isoladas, a Candida albicans foi à espécie mais frequente representando 62,7% (47) dos casos, seguida por espécies não-albicans: C. glabrata 13,3 % (10), C. tropicalis 8,0 % (6), C. parapsilosis 6,7% (5), C. krusei 5,3 % (4). Quanto ao perfil de sensibilidade, a concentração inibitória mínima para fluconazol variou de 0,016 a 256 µg/ml, para o itraconazol de 0,004 a 32 µg/ml e para anfotericina B de 0,023 a 1,0 µg/ml. Todos os isolados foram sensíveis à anfotericina B e apenas duas amostras de Candida albicans foram resistentes ao fluconazol. Entre espécies Candida não-albicans, 17,9 % dos isolados foram considerados sensíveis dose- dependentes e 7,6% foram resistentes ao itraconazol. Não houve correlação entre genótipos encontrados com o perfil de suscetibilidade e dados clínicos.

11 10 x LISTA DE TABELAS Tabela 1. Características dos fragmentos dos genes utilizados na reação de MLST Tabela 2. Distribuição dos fatores demográficos e características socioeconômicas da população estudada, Estado do Amazonas, Brasil...37 Tabela 3. Associação entre a espécies de Candida isolada na secreção vaginal e a sintomatologia apresentada pelas 75 mulheres atendidas em um centro de referência em DST de Manaus Tabela 4. Quantidade de sinais e sintomas apresentados pelas pacientes do estudo quando as mesmas apresentaram cultura de secreção vaginal positiva para Candida spp...41 Tabela 5. Número de sinais e sintomas e estruturas evidenciadas ao exame direto das amostras clínicas de secreção vaginal...41 Tabela 6. Associação entre fatores predisponentes a vulvovaginite (hábitos e antecedentes) com diagnóstico clínico...43 Tabela 7. Perfil de suscetibilidade aos antifúngicos de Candida spp isoladas de secreção vaginal de pacientes atendidas no centro de referência em DST, de Manaus...44 Tabela 8. Distribuição dos alelos encontrados nos isolados de C. albicans estudados pela técnica de MLST nas pacientes que apresentaram episódios de candidíase vulvovaginal e CVVR...49

12 11 xi LISTA DE FIGURAS Figura 1. Aspecto clínico do corrimento de candidíase vulvovaginal...4 Figura 2. Aspectos microscópicos encontradas em Candida albicans Figura 3. Fluxograma da população estudada Figura 4. (A) Coloração verde no meio cromogênico CHROMagar Candida após 72h de incubação, sugestiva de Candida albicans; (B) colônias de cor azul sugestivas de C. tropicalis, (C) colônias apresentando coloração rosa com franjas sugestivas de C. krusei Figura 5. (A) Aspecto micromorfológico de Candida albicans no Ágar Fubá com Tween 80 após incubação a 30ºC, 72h; (B) Identificação bioquímica por sistema API Candida Figura 6. Perfis de RFLP DE 78 isolados vaginais (Primers ITS5-NL4, enzima de restrição DdeI) Figura 7. Cromatograma parcial de um dos isolados para o fragmento ZWF Figura 8. Resultado das reações de amplificação dos 07 genes estudados AAT1, ACC1, ADP,MPIb, SYA1, VPS13 e ZWF1, evidenciando o tamanho dos fragmentos esperados... 48

13 12 xii LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ATCC ASD CEP CIM CLSI CVV CVVR DNA Dntp DST DSTs EDTA EUA FAPEAM FMT-HVD FUAM FCF HCl HIV INPA ITS KCl KOH Mg MgCl2 Min MLST NCCLS PCR PRONEM ph OMS RAPD RFLP Rpm SSCP SDD ST STRs American Type Culture Collection Ágar Sabouraud Dextrose Comitê de Ética em Pesquisa Concentração mínima inibitória Clinical and Laboratory Standards Institute Candidíase vulvovaginal Candidíase vulvovaginal recorrente Ácido Desoxirribonucleico Desoxirribonucleosídeo Trifosfato Doenças Sexualmente Transmissíveis Diploid Sequence Type Ácido Etilenodiaminotetracético Estados Unidos da América Fundação de Amparo à Pesquisa do Amazonas Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado Fundação Alfredo da Matta Faculdade de Ciências Farmacêuticas Ácido Clorídrico Human Immunodeficiency Virus Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia Espaço Interno Transcrito Cloreto de Potássio Hidróxido de Potássio Miligrama Cloreto de Magnésio Minuto Multilocus Sequence Typing National Committee for Clinical Laboratory Standards Polymerase Chain Reaction Programa de Apoio a Núcleos Emergentes de Pesquisa Potencial Hidrogeniônico Organização Mundial de Saúde Random Amplified Polymorphic DNA Restriction Fragment Length Polymorphism Rotações por Minuto Single-strand conformation polymorphism Sensibilidade dependente da dose Sequence type Short tandem repeats

14 13 xiii SUS Tris U UFC UFAM UV V WHO YPD Sistema Único de Saúde 2-amino-2-hidroximetilpropano-1,3-diol Unidade Unidade Formadora de Colônia Universidade Federal do Amazonas Ultravioleta Volts World Health Organization Yeast Peptone Dextrose

15 xiv 14 LISTA DE SÍMBOLOS % percentual + positivo ºC grau Celsius µm micrômetro µl microlitro cm centímetro g grama h hora Kg kilograma nm nanômetro mg miligrama ml mililitro mm milímetro Mm milimolar M molar mm³ milímetro cúbico s segundo

16 xv 15 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO Leveduras do gênero Candida spp Candidíase vulvovaginal Patogênese Formas de Transmissão Fatores predisponentes Espécies de Candida spp envolvidas na candidíase vulvovaginal Tratamento Testes de sensibilidade a antifúngicos Diagnóstico Laboratorial Identificação Tradicional Métodos Moleculares Caracterização genotípica por MLST OBJETIVOS Geral Específicos MATERIAL E MÉTODOS Modelo de Estudo Universo de Estudo Local do Estudo População Critérios de inclusão e Exclusão Aspectos Éticos Financiamento Avaliação clínica e coleta de dados Coleta das Amostras Procedimentos Exame direto Isolamento primário Caracterização fenotípica Estudo morfofisiológico... 26

17 16 xvi Produção de tubo germinativo Microcultivo em lâmina Identificação bioquímica Testes de Susceptibilidade a drogas Antifúngicas Determinação da CIM dos antifúngicos- Etest Caracterização genotípica Extração de DNA Reação em Cadeia da Polimerase e análise de polimorfismos de tamanho dos fragmentos de restrição (PCR-RFLP) Tipagem Molecular por Sequenciamento de Multilocus (MLST) Amplificação dos fragmentos dos 7 genes selecionados para o estudo do MLST de Candida albicans Reação de Sequenciamento e avaliação dos cromatogramas Análise de dados do MLST Análise dos Resultados RESULTADOS Exame direto e Análises Fenotípicas Avaliação dos sinais e sintomas, fatores predisponentes e uso de antifúngicos oPerfil de susceptibilidade obtido pela metodologia comercial Etest Análise molecular dos isolados fúngicos DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS APÊNDICES APÊNDICE A - Fluxograma do Estudo APÊNDICE B - Ficha Clínico-Epidemiológica e Laboratorial de Candidíase vulvovaginal APÊNDICE C - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido APÊNDICE D - Posições dos sítios polimórficos observados nos sete housekeeping genes... 75

18 1 1 INTRODUÇÃO 1.1 Leveduras do gênero Candida spp O gênero Candida está classificado no Reino Fungi, Filo Ascomycota, Classe Saccharomycetes, Ordem Saccharomycetales, Família Saccharomycetaceae (1). Trata-se de micro-organismos eucarióticos, que se reproduzem assexuadamente por brotamento ou gemulação, dando origem a células que se denominam blastoconídios e fazem ciclo sexual incompleto. São unicelulares e pleomórficos assumindo forma ovóide ou esférica. Além de colonizar o homem, podem ser encontrada no solo, água, vegetais, alimentos e em diversos ambientes, inclusive hospitalares. Degradam proteínas e carboidratos para obterem carbono e nitrogênio, elementos essenciais para seu desenvolvimento (2,3). Estão presentes na microbiota da pele e na mucosa do homem e podem ser adquiridas através da passagem do feto via canal vaginal. Logo após o nascimento, são encontradas na cavidade bucal do recém-nascido e duas a três semanas em todo trato gastrointestinal da criança. Posteriormente, habitam comensalmente o organismo do homem, podendo ser encontradas no trato respiratório, intestinal, mucosa vaginal, cavidade oral e pele (4,5). Quando há ruptura do equilíbrio, local ou imunológico, as espécies de Candida passam do estado sapróbio ao patogênico, podendo formar pseudo-hifas e hifas verdadeiras, invadir tecidos e provocar candidíase, ocasionando sintomas indesejáveis em pacientes expostos a uma grande diversidade de fatores de risco (6). Do ponto de vista taxonômico são reconhecidas cerca de 200 espécies diferentes de leveduras do gênero Candida, das quais 10% podem causar infecções em seres humanos. A Candida albicans é a espécie mais frequentemente descrita nos casos de vulvovaginites, seguida por espécies Candida não-albicans, tais como C. glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis e C. krusei que podem igualmente causar infecções graves (6 10). Entre as mulheres, esses micro-organismos são patógenos oportunistas, isolados da secreção vulvovaginal em aproximadamente 30% das mulheres saudáveis e completamente assintomáticas (6).

19 2 1.2 Candidíase vulvovaginal A candidíase vulvovaginal (CVV) é um processo infeccioso e/ou inflamatório da vulva e vagina, causado por várias espécies de Candida, leveduras comensais que podem se tornar patogênicas sob determinadas condições que alterem o ambiente vaginal. Esta enfermidade foi descrita pela primeira vez por JS Wilkinson em 1949, o qual estabeleceu uma relação entre a existência de fungos na vagina e o aparecimento de uma vaginite (11,12). O diagnóstico da CVV é um dos mais frequentes na prática diária na área da ginecologia, tornando-se a segunda maior infecção genital nos Estados Unidos e no Brasil, cuja incidência tem aumentado drasticamente na última década, representando 25% dos corrimentos vaginais de natureza infecciosa (13 18). A microbiota vaginal autóctone é complexa e sua composição varia de acordo com uma multiplicidade de acontecimentos, como fatores hormonais; número de parceiros; uso de contraceptivos orais; uso de antibioticoterapia; diabetes; uso de preservativos e maus hábitos em matéria de higiene. Todos estes são considerados como fatores de risco para o surgimento de infecções genitais (11). A CVV é causada por fungos leveduriformes, tendo como principal etiologia Candida albicans, em 80% a 90% dos casos. No entanto, em 10% a 20%, outras espécies estão envolvidas conhecidas como Candida não- albicans (C. tropicalis, C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis, C. kefyr, C. lusitaniae e C. dubliniensis). Dados recentes destacam C. glabrata como segunda espécie em freqüência nas CVV. Porém, leveduras de outros gêneros também podem causar essa infecção: Saccahromyces cerevisiae, Rhodutorula sp. e Trichosporon sp (11,19 22). Estudos ressaltam ainda que 20 a 25% das mulheres saudáveis e completamente assintomáticas apresentam cultura de secreção vaginal positiva para leveduras (5,23). De modo geral, estima-se que cerca de 75% das mulheres adultas apresentem pelo menos um episódio de CVV em sua vida, sendo que destas, 40 a 50% vivenciarão novas infecções e 5% atingiriam um caráter recorrente (CVVR), definida pela ocorrência de três ou mais episódios de CVV ao ano (24,25).

20 3 O CDC (Center for Disease Control) classifica esta infecção fúngica em duas categorias: simples e recorrente. A infecção denominada de simples tem gravidade leve à moderada, episódios esporádicos, não recorrentes, em uma hospedeira normal, geralmente causada por uma cepa de Candida sp. sensível aos antifúngicos comumente utilizados (25). Entretanto a CVVR é assim considerada pela gravidade, recorrência, acometimento em uma hospedeira imunologicamente comprometida ou ser causada por uma espécie menos sensível, por exemplo, aquelas Candida nãoalbicans (25,26). O quadro clínico clássico da CVV é inespecífico, podendo ocorrer diagnóstico incorreto. Consiste em: prurido vulvar intenso (que pode determinar lesões satélites vulvares, como escoriações e fissuras), eritema vulvovaginal, edema, dispareunia e disúria, além de leucorréia (corrimento branco, grumoso, com aspecto caseoso, levemente aderido à parede vaginal (12,13). A leucorréia ou corrimento branco ou amarelo consiste em uma mescla de células vaginais com polimorfonucleares (11). Este sintoma pode ser acompanhado de intensa coceira na região da entrada da vagina, podendo se espalhar para a virilha e região anal (Figura 1). Alterações de ph não são observadas durante a infecção aguda por Candida spp (27,28). O prurido pode estar associado a reações de hipersensibilidade do hospedeiro ou a mecanismos do sistema imunológico como a liberação de substâncias como as prostanglandinas e bradicininas, que possuem a capacidade de induzir processos inflamatórios locais (14). O exame clínico mostra a presença de eritema difuso ou irregular, na parede vaginal e no colo uterino e, ocasionalmente, pode-se observar a presença de placas de leveduras, na parede vaginal e consequente formação de erosão (13). De acordo com Sobel (14), os sinais e sintomas apresentados não permitem distinguir a infecção por Candida albicans das demais espécies. Contudo, Geiger (29) sustentam que há padrões distintos na infecção causada por C. glabrata. A presença de leucorréia é menos abundante do que nas mulheres com C. albicans. Isto pode ser resultante da não formação de hifas e pseudo-hifas, por essa espécie.

21 4 Figura 1. Aspecto clínico do corrimento de candidíase vulvovaginal Fonte: Health Canada,Sexual health and STI section,clinical Slide Galery, obtida do site A presença de sensação de ardência é relatada em mulheres com C. glabrata, em substituição ao prurido provocado por C. albicans. A presença de eritema difuso é observada ao exame clínico e, não há relatos da presença de placas, na parede vaginal, quando a infecção está associada a C. glabrata. Porém, esses sinais e sintomas variam de acordo com o estágio da infecção e, faz-se necessário a realização de exames laboratoriais que confirmem a espécie envolvida nos quadros de candidíase vulvovaginal (29). Mesmo com avanços terapêuticos, atualmente a CVV vem sendo considerada um importante problema de saúde pública mundial, por acometer milhões de mulheres de todas as camadas sociais, determinando grande desconforto, prejudicando relações sexuais e afetivas, além de comprometer o desempenho laboral de uma grande parcela da população economicamente ativa (14). Apesar da relevância do tema, o número de informações na literatura sobre o assunto é ainda insatisfatório, bem como as autoridades sanitárias e agências de apoio à pesquisa não tem dado a devida atenção ao problema, embora diversos dados epidemiológicos e microbiológicos permaneçam controversos (21).

22 Patogênese Os mecanismos envolvidos na patogênese da CVV, bem como das outras formas de candidíase não estão ainda bem esclarecidos, apesar de todos os esforços na busca de um fator ou de uma característica determinante para a virulência da Candida. Acredita-se que não haja um fator isolado, mas um conjunto de fatores que contribuem para o desequilíbrio na interação desta levedura comensal e o seu hospedeiro e a instalação do processo infeccioso (30,31). O processo de patogênese da Candida segue três etapas, sendo a primeira a adesão. A adesão é muito importante para a sobrevivência dos blastosporos. A capacidade de adesão da C. albicans é maior que das outras espécies, isto poderia explicar a grande freqüência desta espécie neste tipo de infecção. A adesão ocorre pela união de uma proteína transmembrana presente na membrana do fungo ao receptor de membrana da célula (11). Uma vez aderidos, os blastosporos são incapazes de penetrar no epitélio vaginal, sendo necessária a sua germinação, desenvolvendo as pseudo-hifas. Este processo de penetração está diretamente relacionado com a produção de uma série de proteases pelas pseudo-hifas capazes de destruir proteínas com função de defesa em nível de mucosa vaginal. Uma vez formadas, as pseudo-hifas se agrupam, constituindo o pseudo-micélio, capaz de invadir o epitélio vaginal, através da produção de proteases que atuam sobre as proteínas defensivas da mucosa vaginal (11). A invasão epitelial por Candida spp. ocasiona liberação de uma série de substâncias (prostaglandina e bradicininas) com capacidade de induzir um processo inflamatório local, ocasionando edema, eritema e aumento do fluido vaginal (11). Ocorre principalmente em mulheres adultas, em idade fértil e, a sintomatologia parece não ter associação com a concentração de Candida spp. na vagina (18,32). Acredita-se que uma das causas dessa doença esteja relacionada ao sistema imune, e que a recorrência vaginal seja devido a uma disfunção ou deficiência no sistema imunológico (12,33).

23 Formas de Transmissão A maioria das infecções por Candida são de origem endógena decorrentes da proliferação ou da mudança de sítio da levedura, induzidos por algum fator predisponente do hospedeiro ou fatores do patógeno, mas também podem existir a possibilidade de ocorrem infecções exógenas (19). As leveduras podem ser carregadas para a vagina por meio de processo de transmissão endógena, a partir da região perianal, tendo como fonte a microbiota normal do próprio intestino ou a troca com o parceiro por via sexual (12,13). Contudo, a CVV não é tradicionalmente considerada uma doença sexualmente transmissível (DST), visto que acomete mulheres celibatárias e também porque o gênero Candida é sapróbio da microbiota vaginal. Entretanto, a via sexual não pode deixar de ser considerada como uma forma de transmissão, já que a maioria das pacientes acometidas têm vida sexual ativa (13,14,28). Em geral, espécies de Candida permanecem na mucosa vaginal apenas como colonizantes e, uma vez encontrando condições apropriadas, aceleram o processo de multiplicação e expressam fatores de virulência, culminado com a invasão da mucosa e ocasionando a CVV sintomática ou ainda, podendo constituir reservatório para reinfecções posteriores (25,34). A infecção fúngica da genitália externa alcança grande expressão durante a gestação (28), possibilitando a transmissão neonatal durante o parto normal, no caso de a genitora estar colonizada por Candida spp. (28,34). Embora a transmissão intra-uterina não tenha usualmente sido investigada, parece provável que o fungo penetre pelas membranas íntegras, de modo que lesões de cordão umbilical, membranas e placenta já foram descritas. Apesar disso, esta forma de transmissão é incomum, a despeito da alta prevalência na gestação, por determinação de algum mecanismo de proteção ainda desconhecido (35).

24 Fatores predisponentes Tanto fatores locais como sistêmicos podem contribuir para a invasão tecidual por Candida spp. A intensa multiplicação do micro-organismo no canal vaginal é favorecida por uma série de fatores predisponentes (18). O início e aumento da freqüência das relações sexuais e demais práticas, além do contato com mais de um parceiro, aumentam a incidência da infecção. A presença de vários sítios de colonização no parceiro sexual também tem sido referida como associada à CVV por C. albicans (25,36). Na prática, a infecção vaginal por C. albicans geralmente é associada a situações de debilidade do hospedeiro ou aquelas em que o teor de glicogênio do meio vaginal está elevado. A gravidez, o uso de contraceptivos orais de altas doses e a terapia de reposição hormonal, por serem situações de hiperestrogenismo, acarretam altos níveis de glicogênio, também observado no diabetes mellitus não controlado. O aumento dos níveis de glicogênio resulta em maior disponibilidade do substrato nutricional de leveduras e na diminuição do ph local, favorecendo a infecção da mucosa vaginal (11,14,20,28). Os bacilos de Döderlein (lactobacilos) formam ácido láctico a partir do glicogênio, cuja produção e secreção são estimuladas pelos estrogênios. Este mecanismo propicia uma acidez adequada (ph 4,5) do ambiente vaginal, dificultando a infecção pela maioria dos patógenos. As leveduras do gênero Candida são exceções, pois proliferam também em ambiente ácido, conseguindo sobreviver em ambiente considerado hostil para uma gama de outros micro-organismos (36). Além disso, um ambiente hiperestrogênico aumenta a exposição dos complexos epiteliais glicoprotéicos que atuam como receptores, facilitando assim, a aderência da levedura na superfície epitelial (11). Contudo, a expressão dos genes de adesão por cepas de C. albicans, em CVV, parece não estar correlacionada aos níveis de estrogênio (37).

25 8 A presença de ciclos menstruais regulares tem sido identificada como relevante fator de risco para a CVV, com maior incidência de casos a partir do pico de estradiol, especialmente no período pré-menstrual, onde se observa um mecanismo imunossupressor natural da mucosa vaginal induzido pela progesterona, que inibe a imunidade celular local contra C. albicans, sabe-se que a CVV é menos frequente em situações de baixa de estrogênio, como na pré-menarca, pósmenopausa e no período de lactação (20,38). O uso de antibióticos, sistêmicos ou tópicos, parece estar relacionado à destruição da microbiota bacteriana vaginal, particularmente dos bacilos de Döderlein, diminuindo a competição por nutrientes e espaço, favorecendo o crescimento, adesão e posterior germinação dos micro-organismos do gênero Candida (11,13,14). Doenças da tireóide, obesidade, corticoterapia, drogas imunossupressoras e infecção por HIV, parecem aumentar o risco de infecção por constituírem situações de debilidade do hospedeiro, tendo em vista o caráter de patógeno oportunista das espécies gênero Candida (25,36). Entretanto a queda do número de linfócitos T CD 4, tem sido descrita como não estritamente relacionada com a candidíase vulvovaginal (25). Os dispositivos intrauterinos (DIU) têm sido associados a episódios de candidíase vulvovaginal, provavelmente por agirem como reservatório devido ao surgimento do biofilme na sua superfície externa, resultando na proteção das leveduras contra a ação dos antifúngicos (11,20,39). Especula-se ainda, que hábitos inadequados podem ser fatores predisponentes para a contaminação vaginal, dentre eles a higiene anal realizada no sentido do ânus para a vagina, levando resíduos de fezes para as roupas íntimas, favorecendo o desenvolvimento da CVV. Além disso, pequenos traumas como o ato sexual e o uso de roupas íntimas justas e/ou sintéticas, que determinam pouca aeração nos órgãos genitais, aumentando a umidade, também predispõem à CVV (20,21).

26 Espécies de Candida spp envolvidas na candidíase vulvovaginal A distribuição das leveduras do gênero Candida, identificadas em mulheres portadoras assintomáticas e sintomáticas, varia de acordo com a localização geográfica bem como, de acordo com a população estudada (28). Normalmente, apenas uma espécie é encontrada em amostras de conteúdo vaginal. Contudo, aproximadamente de 2 a 5% das mulheres podem apresentar uma ou mais espécies, no conteúdo vaginal. Geralmente, este fato está associado ao desenvolvimento de candidíase recorrente (40). C. albicans é a espécie mais isolada em casos de vulvovaginites por Candida, sendo isolada de 70-90% dos casos. Essa espécie é a melhor estudada e, pode ser encontrada como comensal em várias partes do organismo, como trato gastrointestinal, na mucosa oral e na mucosa vaginal (40,41). Nos últimos anos, tem-se observado um aumento na freqüência das espécies Candida não-albicans, principalmente C. glabrata, C. tropicalis, C. guilliermondii e C. parapsilosis, indicando uma tendência de mudança na etiologia da candidíase,após décadas de predomínio de C. albicans. Outras espécies como C. krusei, C. kefyr, C. lusitaniae e Rhodotorula têm sido também referidas em estudos mais recentes. Entretanto, parece haver diferenças quanto às espécies de leveduras vaginais isoladas,conforme a localização geográfica, sugerindo Ferreza et al que esta variação deve ser considerada entre os fatores epidemiológicos (23). A presença de C. dubliniensis em secreção vaginal de mulheres sem imunodeficiência parece ser inexpressiva. Us e Cengiz coletaram amostras de mulheres gestantes e, 2,43% apresentaram características fenotípicas de C. dubliniensis, porém, os autores não relatam a realização de testes genotípicos que confirmassem esse dado (34). Entre mulheres portadoras de HIV, Badiee et al.(42) relataram que, das 86 amostras de Candida spp provenientes de secreção vaginal, 13,3% foram

27 10 identificadas como C. dubliniensis, comprovando assim, que este patógeno parece estar intimamente relacionado com a presença de HIV (43). Outra espécie de grande importância médica é Candida glabrata (44,45). Dentre as Candida não-albicans, essa é considerada de maior importância, não só em casos de candidíase vulvovaginal, como em outros quadros clínicos, como na colonização da mucosa oral e em infecções sistêmicas (6,46). A presença de Candida glabrata no conteúdo vaginal é bastante expressiva. Mendling (47) relata que 25% das mulheres podem ser portadoras assintomáticas dessa espécie. Essa colonização parece estar associada com a idade. Em um estudo realizado por Qi et al.(48), os autores estudaram 273 jovens saudáveis, com idade inferior a 21 anos. O grupo que apresentou maior colonização por C. glabrata foi o de jovens com idade entre 18 e 21 anos, comprovando essa hipótese. C. tropicalis está associada a infecções por Candida spp na corrente sanguínea, em pacientes com leucemia e com neutropenia, após um longo tempo de hospitalização (49). Em quadros de candidíase vulvovaginal, embora as amostras de C. tropicalis apresentem sensibilidade in vitro às drogas antifúngicas utilizadas, essa espécie está relacionada à casos de candidíase recorrente (49,50). Em isolados de secreção vaginal, C. tropicalis varia bastante. Fan et al. (51) encontraram 0,9% de C. tropicalis na China. No México, C. tropicalis foi a terceira espécie mais isolada em mulheres com e sem sintomas de infecção vaginal (52). O isolamento do complexo C. parapsilosis em amostras oriundas de secreção vaginal é significativo (53). Bulmer et al. (54) encontraram a espécie como a segunda causa mais freqüente de candidíase vulvovaginal, com 17.8% de isolamento. Aproximadamente 20% das mulheres portadoras assintomáticas de leveduras portam C. parapsilosis. Fato esse que levaram Nyirjesy et al. (55) a questionarem se esta presença está ou não associada a produção de sintomas, ou se a levedura estaria apenas colonizando a mucosa vaginal. Os resultados obtidos demonstraram que a presença de C. parapsilosis foi de 8,5% dos isolamentos

28 11 realizados e, 72,5% dessas mulheres apresentaram sintomas de candidíase vulvovaginal. Outras espécies, como C. krusei e C. guilliermondii são leveduras em que o isolamento em casos de candidíase vulvovaginal varia entre 0,2 a 2%. Porém, apresentam características importantes como uma menor sensibilidade in vitro aos antifúngicos, fato que pode contribuir para maior desenvolvimento de recorrência ou falha terapêutica (46) Tratamento Para o tratamento de CVV têm sido empregados os agentes imidazólicos e triazólicos, entre eles fluconazol, miconazol, clotrimazol, itraconazol e cetoconazol, além dos agentes poliênicos (nistatina e algumas formulações contendo anfotericina B). Contudo, não há consenso sobre a superioridade de um em relação ao outro, o que se deve, em parte, às dificuldades de aplicação de uma metodologia padronizada para teste de suscetibilidade in vitro (14). O tratamento das infecções vaginais deve ser realizado de acordo com o histórico individual de cada mulher e a classificação da candidíase vulvovaginal é importante para determinar a duração do mesmo (14,56). De acordo com Sobel (14), o tratamento de mulheres portadoras assintomáticas é controverso, pois, as leveduras poderiam estar em equilíbrio com os demais micro-organismos presentes na microbiota vaginal e, ao inserir a utilização de um fármaco, o mesmo seria rompido. Por outro lado, a presença de leveduras, na mucosa vaginal, poderia ser precursora do desenvolvimento de candidíase sintomática, em período, como na gestação, em que há um aumento da secreção dos hormônios femininos, ou ainda, em casos de parto natural, no momento da passagem do bebê pelo canal vaginal pode ocorrer contaminação da mucosa oral dos recém-nascidos, predispondo-os a infecções secundárias graves como septicemias.

29 12 A conduta terapêutica a ser adotada, nos tratamentos de quadros clínicos de candidíase vulvovaginal deve ser realizada de forma individual e, deve levar em conta o quadro clinico apresentado. Em casos de candidíase vulvovaginal primária, as mulheres podem ser tratadas com doses simples de antifúngicos, como o butoconazol, clotrimazol, miconazol, econazol ou nistatina. Contudo, quando após o fim do tratamento ainda persistem sinais de infecção, faz-se necessário um tratamento mais prolongado, de 5 a 7 dias (14). Os antifúngicos disponíveis para o tratamento de candidíase vulvovaginal podem estar na forma de cremes e pomadas, para uso tópico; na forma de óvulos, que devem ser utilizados como supositórios, ou como cápsulas, para ser administrado por via oral. De acordo com Seidman e Skokos (57) nos Estados Unidos, o tratamento de escolha, para casos mais simples é com tioconazol na forma de creme; com soluções que contenham 6,5% de miconazol, na forma de óvulos ou com dose única de fluconazol, por via oral. De acordo com Sobel (14), o uso dos antifúngicos na forma tópica é bem tolerado, contudo, algumas mulheres relatam a sensação de ardência. Porém, a taxa de cura pode variar de 80 a 90%, em casos menos severos da doença (14). Na literatura, vários trabalhos comparam a eficácia dos cremes com o uso de fluconazol, via oral. Mendling et al. (47) compararam a performance do clotrimazol, sob duas formas de apresentação, com a performance do fluconazol. Os autores concluíram que as terapias tópicas podem ser tão eficazes quanto à dose única de fluconazol. Após 14 dias, as taxas foram de 62% e 60%, respectivamente. Após oito semanas, 50% das mulheres, com histórico de candidíase recorrente relataram o reaparecimento dos sintomas, em ambos os tratamentos. Seidman e Skokos (57) realizaram estudo comparativo com creme a base de butoconazol e fluconazol, via oral. Neste estudo, os autores relatam que houve o desaparecimento dos sintomas clínicos mais rapidamente, nas mulheres que fizeram uso de creme. O tratamento da candidíase vulvovaginal recorrente é mais complicado, pois, é um quadro multifatorial e, necessita de uma atenção mais direta. Nesses casos, faz se necessária a adoção de regimes profiláticos de antifúngicos, durante um período mais prolongado. O uso do cetoconazol, por três meses (100mg/dia) e o uso de supositório a base de clotrimazol ou a prescrição de 150mg de fluconazol, por via

30 13 oral, pelo período de três meses, são os tratamentos indicados. Contudo, o cetoconazol é pouco utilizado, devido à toxicidade (14). O uso de terapias alternativas para o tratamento de candidíase recorrente, como o uso de probióticos é recomendado. Outro caso que merece atenção mais detalhada é quando a mulher apresenta quadros de candidiíase causados por Candida não-albicans. As vulvovaginites causadas por C. glabrata não respondem ao tratamento com fluconazol. Contudo, há atividade moderada com itraconazol, terconazol, cetoconazol e itraconazol (13). Sobel (14) propõe que nesses casos, seja adotada a utilização de 600mg de ácido bórico, em cápsulas de gelatina, por 14 dias ou que sejam utilizados supositórios a base de anfotericina B. Existem casos em que as mulheres não respondem a terapia apenas com ácido bórico, pode se realizar uma terapia combinada de acido bórico com uso de nistatina, na forma de cremes e uso oral de itraconazol (13,14,28). 1.3 Testes de sensibilidade a antifúngicos O surgimento de cepas resistentes, a disponibilidade de novas drogas e a ocorrência de falhas no tratamento das infecções fúngicas levou ao desenvolvimento de métodos para a investigação da susceptibilidade in vitro aos antifúngicos (58,59). A maioria desses métodos emprega técnicas de caldo-diluição e está baseada no cálculo da concentração inibitória mínima (CIM) estimado pela determinação do percentual de inibição em relação a um controle de crescimento. Correlações entre a CIM obtida em laboratório e a evolução clínica do paciente podem ser estabelecidas através dessas provas de susceptibilidade (60). O conceito de CIM tem provado ser extremamente útil na condução da terapia antibacteriana mais adequada, contudo, no contexto da terapia antifúngica, a CIM parece ter um maior valor como preditor de fracasso do que de sucesso (61). Como existem múltiplos fatores interferentes, a padronização laboratorial dos testes de susceptibilidade é uma condição básica para assegurar a compatibilidade das

31 14 informações. Dentre os métodos de referência, distinguem-se aqueles recomendados pelo Clinical and Laboratory Standadards Institute CLSI (anteriormente National Committee for Clinical Laboratory Standards - NCCLS). Em 1992, esse comitê propôs um método de referência (documento M27-P) para a avaliação da susceptibilidade aos antifúngicos em Candida spp. e Cryptococcus neoformans variedade neoformans (62). O método aprovado (documento M27-A) foi publicado em 1997 (63) e versões atualizadas (documentos M27-A2, -A3, M27-S2, - S3) foram apresentadas entre os anos de 2002 a 2008 (64,65). Esse documento estabelece valores de referência para a realização dos testes de sensibilidade in vitro pelos métodos de macro e microdiluição em caldo e define a interpretação da concentração inibitória mínima (CIM) para avaliar a eficácia de alguns antifúngicos (59,65). Outros métodos de aferição da susceptibilidade e métodos comerciais baseados em parâmetros do CLSI têm sido também intensamente investigados. Dentre estes, ETEST, microdiluição colorimétrica, diluição em ágar, determinação da atividade fungicida, citometria de fluxo e quantificação de ergosterol são os que têm apresentado as melhores correlações clínicas (58). De acordo com Sanglard e Odds (59) é importante fazer a distinção entre resistência a uma droga antifúngica e falha no tratamento clínico. Uma pessoa cuja infecção persiste a despeito do tratamento com antifúngico, deve ser considerada como clinicamente resistente. Isto pode ocorrer mesmo quando o agente infeccioso demonstra suscetibilidade normal a este agente in vitro, sendo importante nestes casos levar em consideração, a questão imunológica do paciente e a ação da droga no sítio infeccioso, dentre outros fatores. Entretanto, existem ainda muitas dúvidas quanto à aplicabilidade clínica dos resultados obtidos em testes de suscetibilidade aos antifúngicos realizados in vitro, pois há dificuldade na correlação desses resultados com a eficácia terapêutica (23,59).

32 Diagnóstico Laboratorial Identificação Tradicional A maneira mais simples de coletar amostras de conteúdo vaginal é com auxílio do uso de espéculo, que permite a avaliação de toda a parede vaginal bem como o colo uterino (15,36,47). Em mulheres com sintomas específicos de candidiase vulvovaginal, o conteúdo vaginal pode ser examinado através do exame microscópico direto, ou o mesmo pode ser suspenso em solução salina a 0,85%. Este procedimento pode auxiliar na detecção de elementos, como hifas e blastoconideos, além de permitir a exclusão de diagnóstico de Trichomonas vaginalis e Gardnerella vaginalis (66). Contudo, cerca de 50% das mulheres com sintomas de candidíase apresentam o exame direto negativo. Esse fato pode indicar a presença de espécies que não são formadoras de hifas e pseudo-hifas, como C. glabrata (25). A coloração do esfregaço pelo método de Gram é um teste indicado para o diagnostico de vaginose bacteriana, já que permite a visualização de estreptococos, clue cells (indicadoras de Gardnerella vaginalis), além de permitir a detecção de Trichomonas vaginalis. Apesar de não haver preconização para a utilização desse método para o diagnóstico de Candida spp, essa coloração mostra-se altamente eficaz em melhorar a visualização das estruturas das leveduras, inclusive, facilitando a detecção de blastoconideos, presentes em espécies que não filamentam, como ocorre com C. glabrata (13,24). O exame microscópico direto (à fresco) da candidíase vulvovaginal com solução salina se caracteriza por conter grande número de células epiteliais, blastosporos, pseudo-hifas e leucócitos. Com adição de hidróxido de potássio (KOH) a 10 ou 20%, há facilidade quanto à observação dos elementos fúngicos, clareando o material a ser examinado por dissolução dos grumos de células epiteliais, tornando-os transparentes, dissolvendo piócitos e hemácias, permitindo melhor

33 16 visualização das leveduras e pseudo-hifas que adquirem aspecto intumescido (14,36). A não visualização de leveduras, no exame direto, requer a realização de cultura do conteúdo vaginal. A cultura está indicada também para casos em que a mulher não responde ao tratamento, já que, através da cultura, é possível a identificação da levedura, em nível de espécie. Este fato facilita a conduta terapêutica a ser adotada. É possível, ainda, a monitoração da eficácia terapêutica, já que de sete a dez dias após o termino da medicação, é possível observar se ainda restam micro-organismos viáveis (47,67). A cultura pode ser realizada em vários meios utilizados na microbiologia, como ágar sangue ou ágar Chocolate, ou, ainda, em meios específicos para isolamento de fungos, como ágar Sabouraud dextrose ou CHROMagar Candida (Biomerieux, França), que por conter extratos cromogênicos, permite a detecção de mais de uma espécie em um mesmo isolado clinico (68). Após a obtenção das cepas, a realização de testes bioquímicos, como os testes de assimilação e de fermentação de açúcares permite a identificação das leveduras, em nível de espécie(46). Para a identificação rápida e presuntiva de C. albicans verifica-se, primeiramente, a formação de tubo germinativo de amostra incubada em soro humano 37 C por 3 horas. A identificação das outras espécies é confirmada através de testes bioquímicos, que medem a capacidade de cada espécie de assimilar e fermentar compostos químicos que representam diferentes fontes de carbono e nitrogênio. Há alguns anos estão disponíveis kits comerciais para identificação de leveduras pela técnica de turbidimetria (69). O microcultivo em ágar fubá acrescido de Tween 80, incubado a 28 C por até sete dias, evidencia a presença de clamidoconídeos terminais, quando o isolado é C. albicans (Figura 2). Outras características micromorfológicas, tais como tipo de brotamento, presença ou não de pseudo-hifas e distribuição dos blastoconídeos ao longo destas estruturas, podem definir, para o examinador experiente, outras espécies de leveduras do gênero Candida de interesse médico (2).

34 17 Figura 2. Aspectos microscópicos encontrados em Candida albicans. Clamidoconídeos (A), hifa verdadeira e blastoconídeo (B). Foto extraída do site Métodos moleculares O advento da biologia molecular permitiu o desenvolvimento de técnicas altamente sensíveis e específicas com ampla aplicabilidade, não somente na área do diagnóstico, como também na área epidemiológica, taxonômica, em estudos da diversidade genética de populações, dentre outras (7, 30). Diferentes métodos de tipagem molecular têm sido utilizados nos últimos anos para revelar variabilidade em diferentes alvos da molécula do DNA, para a diferenciação inter-específica, e algumas vezes, até mesmo intra-específica de determinados isolados de fungos. No entanto, estes métodos variam

35 18 consideravelmente quanto à habilidade de detectar diferenças entre os isolados, facilidade de execução, reprodutibilidade e custos (70,71). No caso de infecções fúngicas, nenhuma técnica específica tornou-se o método dominante. De fato, cada método tem suas vantagens e desvantagens (72). C. albicans é uma levedura oportunista que pode causar infecções invasivas graves, especialmente em pacientes imunocomprometidos, tornando essencial o desenvolvimento de metodologias que permitam a diferenciação acurada entre as diversas cepas. O conhecimento do relacionamento genético de cepas envolvidas em infecções é de extrema relevância para o desenvolvimento e a aplicação da correta estratégia terapêutica, assim como para um melhor entendimento da epidemiologia desta levedura. Além disso, algumas cepas são capazes de invadir diferentes localizações anatômicas, podendo ocorrer microevolução como uma resposta adaptativa a novos ambientes (72). Dentre os métodos de tipagem molecular utilizados, destacam-se a eletroforese de enzima multilocus (MLEE), a cariotipagem eletroforética (EK), o DNA polimórfico amplificado ao acaso (RAPD), o polimorfismo do tamanho dos fragmentos de restrição com e sem hibridação (RFLP com e sem hibridação), polimorfismo de conformação de fita simples (SSCP-PCR) e a análise com enzima de restrição (REA). Dois outros métodos baseados na reação em cadeia da polimerase (PCR), e mais recentemente utilizados na investigação de isolados, são a tipagem molecular por sequenciamento de multilocus (MLST) e o polimorfismo de comprimento de microssatélite (MLP). Para C. albicans, um sistema de MLST baseado em sete fragmentos de DNA foi desenvolvido com alta acuidade para a tipagem de subtipos. Esses métodos são aplicados em diferentes estudos, e servem de base para a compreensão dos padrões de distribuição e características dos micro-organismos (7,30,59,73 78) Caracterização genotípica por MLST O MLST é uma técnica de caracterização molecular e investigação epidemiológica proposta por Maiden et al. (1998), a qual também tem sido

36 19 amplamente utilizada para inferência filogenética de espécies fúngicas e bacterianas (79). Esta técnica pode ser considerada uma variação do Multilocus Enzyme Electrophoresis (MLEE), pois também se baseia no estudo de diferentes alelos de housekeeping genes. A principal diferença entre estas duas metodologias, é que o MLEE analisa a mobilidade eletroforética de isoenzimas codificadas pelos housekeeping genes e o MLST analisa diretamente as seqüências destes genes, identificando pontos de mutação que caracterizam alelos distintos (30,79,88). Diferenças de um único nucleotídeo entre seqüências de um mesmo locus são considerados diferentes alelos. O conjunto de alelos dos diferentes loci estudados no MLST determina o perfil alélico ou sequence type (ST) de uma cepa fúngica. Os ST encontrados dentro de uma população fúngica permitem o estudo comparativo de suas cepas, bem como a inferência filogenética de seus membros (30,88). Uma das grandes vantagens do MLST é ser uma técnica baseada na seqüência de DNA e não em métodos eletroforéticos, esta característica permite uma análise de dados mais precisa, e também a troca de dados entre diferentes laboratórios com maior precisão, diferentemente das técnicas baseadas em eletroforese (30,88). Para C. albicans, a maior vantagem do MLST sobre os outros métodos de tipagem é que os dados das sequências podem ser armazenados numa base de dados e facilmente comparados entre os laboratórios, permitindo assim o compartilhamento de dados através da internet num website de epidemiologia global desenvolvido por dois grupos europeus [ (73,79,80). Além disso, esta metodologia pode caracterizar um grande número de isolados rapidamente e isto não requer a interpretação subjetiva do padrão de bandas após a corrida eletroforética (81). Vários autores têm mostrado que o MLST é um importante instrumento molecular utilizado para responder as questões relacionadas à epidemiologia das infecções fúngicas para isolados de C. albicans (30,73,80 83).

37 20 O primeiro estudo testando a metodologia do MLST, com aplicação para leveduras do gênero Candida foi realizado por Bougnoux et al. (2002) no mesmo modelo para bactérias, sendo as informações das sequências disponíveis para comparação numa base de dados. Os autores selecionaram 6 housekeeping genes para o estudo em 40 isolados clínicos de C. albicans, sendo 26 nãorelacionados epidemiologicamente e 14 fortemente relacionados. Foram encontrados 68 sítios polimórficos e 65 deles foram heterozigóticos para ao menos um isolado. Dos 26 isolados não relacionados e 2 cepas controles foi identificado 27 DSTs ( Diploid Sequence Type ) independentes demonstrando o poder discriminatório de 99,7%. Para as 14 cepas relacionadas recuperadas de pacientes internados na mesma unidade hospitalar num período de 3 meses foi observado DSTs específicos onde 73% dos isolados mostraram-se muito semelhantes geneticamente. Neste estudo, o MLST provou ser altamente discriminatório na caracterização de cepas clínicas de C. albicans (73). Odds et al. (2006) aplicaram MLST para 165 isolados sequenciais de C. albicans estocados em um banco de microrganismo desde 1970 de pacientes de diferentes hospitais e origens biológicas tais como sangue, cateter, urina, fezes entre outras. Para um paciente foi evidenciado a substituição de cepas. A microvariação foi observada em alguns isolados pela perda de heterozigosidade em um ou mais fragmentos sequenciados (84). Tavanti et al. (2003) descreveram elevado grau de reprodutibilidade para diferenciar, por MLST, isolados de C. tropicalis através de fragmentos polimórficos de seis genes (MDR1, ICL1, SAPT2, SAPT4, XYR1 e ZWF1a) com poder discriminatório acima de 99%. O método diferenciou 87 tipos de seqüências diplóides DSTs entre o total de 106 isolados testados. O gene XYR1 mostrou alta capacidade de diferenciação, distinguindo três genótipos por polimorfismo para 11 sítios polimórficos (80). A CVV é infecção de ocorrência muito comum acometendo mulheres em todo o mundo, causada por fungos do gênero Candida. Apesar de ser considerada uma infecção endógena na qual, o agente faz parte da microbiota vaginal, pode também

38 21 ser transmitida por meio de relação sexual, sendo por isso considerada uma doença facultativamente venérea (14,28). O clima quente e úmido, característico da região amazônica, constitui fator importante para a elevada prevalência dessas infecções fúngicas. Apesar de ser uma doença comum na nossa região, os dados epidemiológicos sobre a ocorrência da candidíase, considerando os seus aspetos clínicos e aspectos fenotípicos e genotípicos dos isolados fúngicos são escassos. O conhecimento a respeito dos tipos específicos de Candida circulantes e seus padrões de resistência a drogas antifúngicas são importantes para um maior esclarecimento sobre a doença e para o monitoramento da ocorrência de cepas resistentes. O uso de agentes antifúngicos para tratar de infecções causadas por espécies de Candida têm contribuído para o aparecimento da multiresistência. Infecções causadas por isolados de C. albicans multiresistentes a várias drogas se constituem em um obstáculo no tratamento da candidíase, além de representar um importante problema para a saúde pública. Dessa forma, entende-se que esforços no sentido de se elucidar os mecanismos moleculares de controle e interação patógeno/hospedeiro e os mecanismos de desenvolvimento da doença tendem a contribuir de forma crítica para um maior entendimento de sua patogênese, levando ao desenvolvimento de melhores estratégias de diagnóstico, tratamento e prevenção. Ressalta-se ainda que esta pesquisa fez parte de um projeto mais amplo aprovado pelo Programa de Apoio a Núcleos Emergentes de Pesquisa - PRONEM, EDITAL 009/2011 (Decisão 172/2012 do Conselho Diretor, em 13/09/2012)/FAPEAM, intitulado: Doenças Sexualmente Transmissíveis na Fundação Alfredo da Matta AM: Caracterização Molecular dos Agentes Etiológicos dos Usuários do SUS. O referido projeto visa implementar e expandir as análises de detecção e genotipagem dos agentes etiológicos incluindo os agentes de CVV no laboratório, principalmente nos casos de difícil resolução, e contribuirá para a consolidação de

39 22 um grupo de pesquisa em DST e candidíase, contando com a participação de diferentes Instituições de saúde e pesquisa na cidade de Manaus. Além disso, este estudo poderá servir como base para ações em programas de saúde pública, vigilância epidemiológica, no monitoramento da farmacorresistência e fluxo dos genótipos dos diferentes agentes entre diferentes regiões geográficas.

40 23 2 OBJETIVOS 2.1 Geral Estudar os aspectos epidemiológicos, clínicos e moleculares relacionados à candidíase vulvovaginal de pacientes atendidas em um serviço de referência em DST na cidade de Manaus, considerando o perfil de suscetibilidade a drogas antifúngicas das cepas isoladas e sua possível correlação com os dados clínicos e os diferentes genótipos encontrados. 2.2 Específicos Avaliar os aspectos clínicos e possíveis fatores predisponentes associados a CVV de pacientes adultas atendidas na Fundação Alfredo da Matta. Identificar e caracterizar os isolados de Candida spp das amostras clínicas por meio dos aspectos morfológicos e bioquímicos (fenotipagem). Analisar o perfil de suscetibilidade dos isolados de Candida spp. ao fluconazol, itraconazol e anfotericina B empregando a técnica Etest. Investigar os genótipos de Candida albicans e outras espécies não-albicans isoladas de CVV, por meio da análise de polimorfismos genômicos.

41 24 3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Delineamento do Estudo A presente pesquisa trata-se de um estudo descritivo e transversal de investigação clínica e laboratorial da CVV, de pacientes atendidas em um centro de referência em venereologia na cidade de Manaus/AM, no qual foram considerados diversos aspectos, tais como: tempo de evolução da doença, recorrência, recidiva, manifestações clínicas e possíveis fatores predisponentes. Os isolados fúngicos obtidos foram também analisados quanto aos seus aspectos macro e micromorfológicos, aspectos bioquímicos, moleculares e quanto ao perfil de susceptibilidade a drogas antifúngicas (Anexo A). 3.2 Universo de Estudo Local do Estudo: O projeto foi desenvolvido na Fundação de Dermatologia Tropical e Venerologia Alfredo da Matta - FUAM em colaboração com a Faculdade de Ciências Farmacêuticas- FCF/UFAM e Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia- INPA População estudada: O presente estudo foi realizado com pacientes do sexo feminino, residentes na Capital ou no interior do Estado, que procuraram; espontaneamente ou por referenciamento; atendimento no Setor de DST da Fundação de Dermatologia Tropical e Venerologia Alfredo da Matta, durante um período de 09 meses Critérios de inclusão e Exclusão: Foram incluídos no estudo, pacientes que aceitaram participar da pesquisa (por meio da assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido), do gênero feminino, adultas, com suspeita clínica de CVV, que não estiveram fazendo uso de terapia antifúngica nos últimos 20 dias, que não estiveram grávidas até o terceiro trimestre de gestação e que não estejam em período pós-menopausa. Foram excluídas do estudo pacientes com amostra coletada ou conservada de forma inadequada ou ainda pacientes em que o agente etiológico apresentou perda de viabilidade durante os ensaios micológicos.

42 Aspectos Éticos: Este estudo fez parte de um projeto de pesquisa intitulado Caracterização genotípica e perfil de sensibilidade a antifúngicos dos agentes de candidíase vulvovaginal isolados na Fundação Alfredo da Matta-AM, aprovado pelo CEP sob numeração CAAE Financiamento: O estudo recebeu suporte financeiro através do financiamento do projeto intitulado Doenças Sexualmente Transmissíveis na Fundação Alfredo da Matta AM: Caracterização Molecular dos Agentes Etiológicos dos Usuários do SUS, aprovado pelo Programa de Apoio a Núcleos Emergentes de Pesquisa - PRONEM, EDITAL 009/2011-FAPEAM. 3.3 Avaliação clínica e coleta de dados As participantes da pesquisa foram submetidas a uma avaliação clínica, por profissional médico especialista, conforme o protocolo de atendimento de rotina do setor de DST da FUAM. De acordo com a sintomatologia apresentada, os casos positivos foram classificados em assintomáticos e sintomáticos, neste último caso, quando apresentaram dois ou mais sintomas característicos (corrimento esbranquiçado, prurido, ardência, disúria e dispareunia). Dados completos destas pacientes foram obtidos mediante a aplicação de um questionário (Anexo B). O questionário foi respondido com o auxílio da paciente e do ginecologista, no momento da coleta das amostras e após a assinatura do Termo de Consentimento (Anexo C). 3.4 Coleta das Amostras Todas as pacientes com suspeita clínica de CVV e que concordaram em participar do estudo, foram submetidas à coleta de secreção vaginal com o auxílio de um swab esterilizado, conforme o procedimento de rotina no setor de DST da FUAM. O material coletado foi colocado em 1 ml de solução salina estéril, contida em tubo de ensaio, e encaminhado em condições assépticas para o laboratório de Micologia da FUAM para o processamento das amostras. 3.5 Procedimentos

43 Exame direto As amostras foram submetidas aos exames diretos com KOH e Gram a fim de se observar a presença ou ausência de células ovaladas/arredondadas e/ou pseudohifas com características morfológicas sugestivas de leveduras do gênero Candida. No exame direto com KOH foi colocada uma alíquota da amostra biológica em uma lâmina de microscopia contendo uma ou duas gotas de KOH a 20%, cobrindo-se posteriormente com uma lamínula. Uma segunda lâmina foi preparada e submetida à coloração pelo método de Gram. Em seguida foram realizadas as análises das lâminas por microscopia óptica utilizando os aumentos de 400x e 1000x, respectivamente Isolamento primário Todas as amostras clínicas foram semeadas nos seguintes meios de cultura: meio cromogênico e diferencial CHROMagar Candida (Probac, França), com auxílio de swab, a fim de isolar a levedura e detectar a possível presença de mais de uma espécie de Candida (cultura mista) através da coloração das colônias; ágar Sabouraud-dextrose (Difco TM, USA) com cloranfenicol (0,05 mg/ml; Arifenicol, Ariston), semeado por meio da adição de 100 µl da suspensão das amostras (secreção vaginal em solução salina 0,9% de NaCl) obtida a partir da coleta, por meio da técnica de esgotamento utilizando-se alça de platina. As placas foram incubadas a 37 C, durante 96 horas e as culturas que apresentaram crescimento positivo foram repicadas para ágar Yeast Peptone Dextrose-YPD (Difco TM, USA) contido em tubo de ensaio e posteriormente foram submetidas às etapas de caracterização fenotípica e genotípica Caracterização fenotípica Estudo morfofisiológico Após a purificação dos isolados em meio cromogênico CHROMagar Candida (Probac, França), as colônias foram analisadas a fim de se obter uma identificação presuntiva das espécies, conforme os seguintes critérios: colônias de

44 27 coloração verde claro sugestivas de C. albicans, colônias de cor azul sugestivas de C. tropicalis, colônias apresentando coloração rosa em diferentes tonalidades sugestivas de C krusei e coloração creme demais espécies de leveduras do gênero Candida (68). As leveduras crescidas neste meio seletivo diferencial foram também identificadas de acordo com a metodologia clássica de fenotipagem, considerando-se as características macromorfológicas, micromorfologia em ágar fubá, capacidade de produzir tubo germinativo, além de provas bioquímicas e fisiológicas como assimilação e fermentação de carboidratos e de fontes de nitrogênio (2) Produção de tubo germinativo A produção de tubo germinativo foi verificada pela técnica descrita por Taschadjian et al. (1960). Isolados purificados de Candida spp. foram inoculados em 5,0mL de soro humano contido em tubos de ensaio e incubados à 37 ºC por até 3h. A observação em microscópio óptico [marca Olympus (Tokyo, Japão), modelo BX- 41], com objetiva de 40X, de projeções alongadas que surgem nas células de levedura, foi considerado positivo para tubo germinativo e, por isso, sugestivo de C.albicans ou C. dubliniensis e, a ausência, para as demais espécies do gênero Candida (85) Microcultivo em lâmina A formação de micélio verdadeiro, pseudo-micélio e estruturas de resistência foram observadas pela técnica de Dalmau (1929). Cada isolado purificado de Candida spp. foi semeado de maneira a formar 3 estrias paralelas sobre a superfície do ágar fubá (Oxoid, Hampshire, England) com 1% de tween 80 (Isofar, RJ, Brasil) contido em placas de Petri. Estas estrias foram cobertas com lamínulas (24mmX24mm) estéreis e, em seguida, as placas de Petri foram incubadas à temperatura de 37ºC por horas. A leitura foi executada anotando-se a presença de pseudomicélio, arranjo dos blastosporos (ocorrendo em grupos ou cachos, no início da hifa e/ou ao longo desta, isolados ou aos pares nos pontos de constrição ou irregularmente distribuídos no pseudomicélio). A presença de

45 28 clamidósporos foi anotada como diagnóstico presuntivo de C. albicans. As outras espécies do gênero foram avaliadas conforme características morfológicas específicas (2) Identificação bioquímica Quando as leveduras não puderam ser identificadas pelos métodos clássicos citados anteriormente, foi usado o Kit API 20 C (BioMerieux, France), que consiste na assimilação de vários carboidratos. Para a realização deste teste foram utilizadas colônias novas (24 horas) repicadas em ágar Sabouraud dextrose (ASD). Primeiramente foi feita a transferência de uma pequena quantidade da colônia para um tubo contendo cerca de 1 ml de solução fisiológica esterilizada (API NaCl 0,85%) e então a diluição foi ajustada a uma turbidez equivalente ao tubo 2 da escala de McFarland. Em seguida 100 μl desta suspensão foram adicionadas ao meio basal do sistema API 20C Aux (API C Medium) e homogeneizado (Vortex QL- 901/Biomixer). A seguir gotas desta suspensão foram usadas para preencher os 20 poços do painel de identificação, que são formados por 19 carboidratos diferentes (D-glucose, glicerol, cálcio-2- ceto-gluconato, L-arabinose, D-xilose, adonitol, xilitol, D-galactose, inositol, D- sorbitol, Metil-α-D-glucopiranosido, N-acetil-glucosamina, D- celobiose, D-lactose, D-maltose, D-sacarose, D-trealose, D-melezitose e D-rafinose) e um controle negativo. O painel foi incubado em câmara úmida, previamente preparada, a 30ºC, por até 72 horas, com leituras de 24, 48 e 72 horas. Foi considerado como resultado positivo e negativo, respectivamente, a presença ou ausência de opacidade nos poços de cada carboidrato. A interpretação das leituras foi realizada com o auxílio do catálogo analítico API20C AUX. Identificações listadas no index como excelente (%id 99,9 e T 0,75), muito boa (%id 99,0 e T 0,5), ou aceitável (%id 90,0 e T 0,5), foram consideradas corretas (86) Testes de Susceptibilidade a drogas Antifúngicas Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) dos antifúngicos- Etest

46 29 Todas as leveduras isoladas foram estudadas frente a três antifúngicos, para o estabelecimento da concentração inibitória mínima. As fitas de Etest adquiridas comercialmente da biomérieux SA (Marcy-l Etoile, France) apresentaram as seguintes concentrações de antifúngicos: 32 a 0,002 µg/ml para anfotericina B e itraconazol; e 256 a 0,016 µg/ml para fluconazol. Essas fitas foram mantidas a temperatura de -20 C até o momento do teste. Foram utilizadas placas de Petri de 150 mm contendo meio composto por RPMI 1640 com L-glutamina e sem bicarbonato de sódio (Sigma Chemical Corporation, St. Louis, USA) suplementado com 2% de glicose (Sigma Chemical Corporation, St. Louis, USA) e 1,5% de ágar (Difco, Becton-Dickinson and Company, USA) e tamponado com 0,165 M de MOPS [ph 7,0] (3-N- morpholinopropanesulphonic acid) (Sigma Chemical Corporation, St. Louis, USA). O preparo do inóculo foi a partir de uma cultura pura com repique de 24 horas no meio ASD. A seguir, uma suspensão da levedura foi preparada em 3 ml de solução salina estéril a 0,85% de acordo com a escala 0,5 de McFarland que corresponde a um inóculo de aproximadamente UFC/mL. Com auxílio de um swab estéril, a suspensão de levedura foi inoculada em três direções em toda superfície do ágar. Depois que o excesso de umidade foi absorvido e a superfície estava completamente seca, uma fita de cada antifúngico foi aplicada na placa em posições antiparalelas e, em seguida, as placas foram incubadas a 35 C por 24-48h. Após incubação, quando houve crescimento visível, o valor da CIM foi determinado pela interseção da elipse com a fita de Etest. O critério utilizado para interpretação dos resultados para avaliar a sensibilidade antifúngica foi aquele recomendado pelo CLSI (M27A3-2008), que preconiza os valores de concentrações de drogas para avaliar a sensibilidade ou resistência aos antifúngicos. Todos os testes foram realizados empregando-se como cepas controle de qualidade Candida albicans ATCC e Candida krusei ATCC 6258 como organismo-controle, uma vez que as CIM para esses micro-organismos são previamente conhecidas (63).

47 Caracterização genotípica Extração de DNA Para a extração do DNA fúngico foi utilizado o kit comercial (Kit QIAamp Tissue and Blood, Qiagen, Hilden, Germany), incluindo previamente a ruptura celular com pérolas de vidros de 0,5µm. O rendimento e o grau de pureza dos DNAs extraídos foram mensurados por meio de avaliação espectrofotométrica, com base na leitura em comprimentos de onda de 260 e 280 nm e na razão A260/280, utilizando o equipamento UV/VISDrop ASP3700 Spectrophotometer (Advanced Technology & Industrial Co., LTD) Reação em Cadeia da Polimerase e análise de polimorfismos de tamanho dos fragmentos de restrição (PCR-RFLP) A técnica de PCR-RFLP foi realizada de acordo com Santos et al (71), para amplificação da região do espaço intergênico (ITS) do rdna. A PCR foi conduzida com um volume final de 50 µl. Cada reação continha 20 ng de DNA molde, solução tampão (Tris-HCl 10 mm, ph 8,3, KCl 50 mm, MgCl2 1,5 mm), 0,2 mm de cada dntp, e 0,5 µm de cada primer ITS5 (5 - GGAAGTAAAAGTCGTAAC AAGG- 3) e NL4 (5 -GGTCCGTGTTTCAAGACGG- 3) descrito por Irobi (87), 1,5 U de Taq DNA polimerase (Recombinante Invitrogen). A amplificação foi realizada em termociclador Gene Amp PCR Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), a reação consistiu em 6 min de desnaturação inicial (94ºC); 40 ciclos de 1 minuto de desnaturação à 95 C, 1 min de anelamento à 55 C e 2 min de extensão à 72 C; por fim foi realizada uma extensão final de 7 min à 72 C. A identificação do produto amplificado foi realizada pela técnica de eletroforese em gel de agarose 2% corado com SYBR Safe DNA Gel Stain (Life Technologies), usando-se 8 μl de produto de PCR, sendo visualizados e fotografados sob luz UV em um sistema de fotodocumentação. Após confirmação de amplificação, 8,5 µl desses produtos de PCR foram digeridos pela enzima de restrição Ddel (10U/ µl) (New England Biolabs, Beverly, MA, USA), em incubação por 3 h a 37 C.

48 31 Depois da clivagem do DNA através da digestão enzimática, os fragmentos de restrição obtidos foram analisados por eletroforese em gel de agarose a 2%, com tampão TBE 1X, corado com SYBR Safe DNA Gel Stain (Life Technologies) e fotografados sob luz UV, em um sistema de fotodocumentação. O marcador de tamanho molecular utilizado para a estimativa dos fragmentos gerados foi o ladder de 50 bp Tipagem Molecular por Sequenciamento de Multilocus (MLST) Amplificação dos fragmentos dos 7 genes selecionados para o estudo do MLST de Candida albicans. Para a tipagem molecular por sequenciamento de Multilocus foram utilizados seis isolados resistentes e cinco sensíveis de Candida albicans. A extração de DNA foi realizada conforme o item Foram utilizados sete housekeeping genes para análise do MLST de C. albicans descritos previamente por Bougnoux et al. (88): AAT1, ACC1, ADP1, MPIb, SYA1, VPS13 e ZWF1. As sequências dos primers utilizados na amplificação de cada um dos fragmentos e os tamanhos dos produtos da PCR esperados estão listados na Tabela 1. A amplificação dos fragmentos pela PCR foi realizada com volume final de 50μl contendo ~20ng de DNA genômico: 2,5 U de Taq DNA polimerase (Invitrogen, Madison, Wis.); 5 μl solução tampão a 10X sem MgCl2, 200 mm deoxynucleoside triphosphate mix (Promega)e 10mM de cada primer forward e reverse. A reação da PCR ocorreu no termociclador Gene Amp PCR Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). As condições da reação de PCR para todos os genes foram: desnaturação por 10 minutos a 94ºC, seguido de 35 ciclos de desnaturação a 94ºC por 1 minuto, hibridização por 1 minuto a 52ºC, extensão por 1 minuto a 72ºC e extensão final por 10 minutos a 72ºC. Após essa etapa, foi feita a purificação dos produtos da PCR com a utilização de uma solução de Polietileno-glicol (PEG 8000) a 20% e NaCl 2,5M, para remoção de resíduos de nucleotídeos e outras impurezas presentes.

49 32 Tabela 1 - Características dos fragmentos dos genes utilizados na reação de MLST. Fragmento do gene Produto Gênico Primers Fragmentos sequenciad os (pb) 5 sequência inicial 3 sequência incial AAT1 Asparato aminotransferase Fwd 5 -ACTCAAGCTAGATTTTTGGC-3 Rev 5 -CAGCAACATGATTAGCCC ATTGAA CGTTTC ACC1 Acetil coenzima carboxilase A Fwd 5 -GCAAGAGAAATTTTAATTCAATG-3 Rev 5 -TTCATCAACATCATCCAAGTG TTTTGAGGTCA TTCCACAAGA ADP1 Permease ATPdependente Fwd 5 -GAGCCAAGTATGAATGATTTG-3 Rev 5 -TTGATCAACAAACCCGATAAT CACGTTGCAA GGAAATCCAA MPIb MPIb Manose fosfato isomerase Fwd 5 -ACCAGAAATGGCCATTGC-3 Rev 5 -GCAGCCATGCATTCAATTAT TTTAAACC GGGAAGCA SYA1 Alanil-RNA sintetase Fwd 5 -AGAAGAATTGTTGCTGTTACTG-3 Rev 5 -GTTACCTTTACCACCAGCTTT TAAATCTAAA AGCTGTATCA VPS13 Proteína Vacuolar Fwd 5 -TCGTTGAGAGATAATCGACTT-3 Rev 5 -ACGGATGGATCTCCAGTCC CTTGATATG CAAATCATGG ZWF1 Glicose-6-fosfato desidrogenase Fwd 5 -GTTTCATTTGATCCTGAAGC-3 Rev 5 -GCCATTGATAAGTACCTGGAT AAACCAGG TTGAATTAC FONTE: Tabela modificada de Tavanti et al. (80), evidenciando as características dos fragmentos dos genes selecionados para MLST Reação de Seqüenciamento e avaliação dos cromatogramas Para a reação de sequenciamento, foram utilizados os sete fragmentos descritos no item , após a amplificação e purificação dos produtos de PCR. A reação foi conduzida utilizando-se os terminadores de cadeia dideoxinucleotídeos fluorescentes BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA); de acordo com as instruções do fabricante. O volume final da reação foi de 10 μl contendo ~20ng de produto amplificado e as seguintes concentrações finais dos reagentes:1,05 μl do primer especifico a 10mM, 0,31μl de BigDye, 2,1μl de tampão e 0,5-1 μl de produto amplificado. A reação de sequenciamento foi realizada em termociclador Gene Amp PCR Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) e as condições da reação constituiu em: desnaturação por 1 minuto a 95ºC, seguido de 20 ciclos de desnaturação a 95ºC por 10 segundos, hibridização a 55ºC por 15 segundos e extensão a 60ºC por 2 minutos, seguidos de 10 ciclos de desnaturação a 95ºC por 10 segundos; hibridização a 55ºC por 15

50 33 segundos e extensão a 60ºC por 3 minutos, com extensão final a 72ºC por 7minutos. Após esse procedimento foi realizada a purificação da placa de sequenciamento para posterior eletroforese capilar. Os fragmentos foram sequenciados no aparelho automatizado ABI 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) em ambas as orientações forward e reverse, utilizando os oligonucleotídeos iniciadores de PCR originais e o BigDye TerminatorCycle Sequencing Kit v3.1 (Applied Biosystems, EUA) de acordo com as orientações do fabricante. Este procedimento foi realizado no setor de Genômica do Instituto Leônidas e Maria Deane (ILMD/Fiocruz Amazônia). As sequências obtidas foram disponibilizadas na forma de cromatogramas. A análise das sequências foi realizada com o auxílio do programa Geneious v (Genes Codes Corp, Ann Arbor, EUA), onde foi possível avaliar os cromatogramas gerados pelo processo de sequenciamento e fazer todas as correções das sequências quando necessárias Análise de dados do MLST As sequências obtidas na forma de cromatogramas foram alinhadas com o auxílio do programa Bioedit ( e Geneious v6.0.6 (Genes Codes Corp, Ann Arbor, EUA) e cuidadosamente examinadas, visualmente, em busca de heterozigose. Os sítios heterozigóticos foram substituídos pelas letras K, M, S, R, Y e W, de acordo com o sistema de código internacional IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry). Estas letras, segundo este código, correpondem a heterozigose nos SNPs a: K= G+T / M=A+C / S=C+G / R=A+G / Y=C+T / W=A+T. Através do alinhamento das sequências Forward e Reverse foi gerado uma sequência consenso e estas foram submetidas ao endereço eletrônico oficial do MLST C. albicans Database.

51 34 A identificação do provável ancestral comum entre os isolados de C. albicans, foi estudada através do programa eburst, que está disponível no website ( 3.7 Análise dos Resultados Para análise dos dados coletados nos questionários e demais dados obtidos durante a execução deste projeto, foram utilizados os programas estatísticos incluídos no software Epi-Info 6.0, versão Windows. O intervalo de confiança adotado para inferência estatística foi de 95%. Nas investigações de associação que não envolver testes de hipóteses causais, a medida de significância estatística foi o x 2 de Mantel-Haenszel, com o respectivo valor de p.

52 35 4 RESULTADOS Amostras de secreções vaginais foram coletadas de um total de 301 pacientes atendidas no serviço de Ginecologia DST da Fundação Alfredo da Matta- AM, no período compreendido entre junho de 2014 a fevereiro de Deste total, 42,5% (128) pacientes tiveram diagnóstico clínico positivo para CVV, sendo que 87,5% (112) apresentavam sintomatologia característica de CVV e 12,5% (16) eram sintomáticas, porém, sem clínica sugestiva de candidíase. A partir das 128 amostras de secreções vaginais, foram obtidos 75 (58,6%) isolados de leveduras do gênero Candida e 41,4% (53) das pacientes tiveram exames laboratoriais negativos, por meio das análises microbiológicas (Figura 3). A análise sóciodemográfica revelou que 95,3% (122) das pacientes encontravam-se em idade reprodutiva. Em relação à cor/etnia houve o predomínio de pacientes de cor parda (81,3%). Mulheres solteiras com vida sexual ativa representaram 48,4% dos casos. O nível de escolaridade foi representado por 45,3% (61) das pacientes que possuíam o ensino médio completo e quanto à atividade ocupacional, verificou-se que a maioria das participantes pertenciam à categoria de trabalhadoras do lar (34,4%). Os dados referentes à caracterização socioeconômica e demográfica da população estudada estão apresentados na tabela 2. A faixa etária da população variou entre 18 a 65 anos de idade, tendo a maior frequência entre os casos de mulheres jovens com 18 a 25 anos. Os resultados obtidos não evidenciaram associação entre a faixa etária e o tipo clínico de CVV envolvida, se recorrente ou não, sendo o mesmo observado com as demais variáveis estudadas.

53 participantes 128 (42,5%) com diagnostico clínico positivo (n=59; 84.3%) Sintomática com clínica de CVV (n=112) 87,5% Sintomática sem clínica de CVV de (n=16) CVV 12,5% CVV (n=59; 52,7%) CVVR (n=53; 47,3%) CVV (n=11; 68.8%) CVVR (n=5; 31.2%) Cultura positiva (n=67; 89.3%) Cultura positiva (n=8; 10.7%) 75 (58,6%) Cultura positiva Candida spp Candida albicans (n=47; 62,7%) Candida não-albicans (n=28; 37,3%) Figura 3: Fluxograma da população estudada.

54 37 Tabela 2 Distribuição dos fatores demográficos e características socioeconômicas da população estudada, Estado do Amazonas, Brasil. CVV n=70 CVVR n=58 TOTAL n=128 Variáveis Subcategoria n (%) n % n % p* Grupos 18 a 25 anos 40 (58,0) 29 (42,0) 69 53,9 etários 26 a 35 anos 18 (48,6) 19 (51,4) 37 28,9 0, a 45 anos 9 (56,3) 7 (43,8) 16 12,5 >45 anos 3 (50,0) 3 (50,0) 6 4,7 Cor/Raça Branca 12 57,1 9 42, ,4 Parda 57 54, , ,3 Negra 1 33,3 2 66,7 3 2,3 0,7394 Educação Fundamental 13 46, , ,7 Médio incompleto 9 50,0 9 50, ,0 Médio completo 35 57, , ,3 0,4798 Superior incompleto 9 75,0 3 25, ,7 Superior completo 4 44,4 5 55,6 9 5,3 Procedência Capital 46 56, , ,7 Outros municípios 19 57, , ,0 0,4588 Outros estados 5 38,5 8 61,5 13 5,3 Estado civil Solteira 34 54, , ,4 Casada 19 61, , ,2 0,1169 União estável 13 41, , ,2 Separada 4 100,0 0 0,0 4 3,1 Ocupação Do lar 22 50, , ,4 Estudante 13 48, , ,1 Autônoma 12 75,0 4 25, ,5 0,2717 Técnico admin 12 75,0 4 25, ,5 Industriária 3 42,9 4 57,1 7 5,5 Doméstica 5 55,6 4 44,4 9 7,0 Técnico superior Segurança ,5 0, , ,3 0,8

55 Exame direto e Análises Fenotípicas Por meio do exame direto das amostras clínicas foi possível verificar a presença de estruturas fúngicas, correspondentes às morfologias esperadas para o gênero Candida, bem como de leucócitos, células de defesa do sistema imunológico do hospedeiro, indicando a presença de resposta inflamatória. Verificou-se 100% (n=75) de concordância entre o exame direto e a cultura das secreções vaginais, onde sempre que houve crescimento de Candida spp, o exame direto revelou-se positivo, evidenciado pela presença dos achados microscópicos (blastosporos, pseudo-hifas ou hifas verdadeiras). As estruturas fúngicas mais frequentes nas secreções vaginais foram blastosporos e pseudo-hifas, presente em 38 amostras vaginais (50,7%); seguido por blastosporos em brotamento sem pseudo-hifas (n=32 42,7%). Hifas verdadeiras ocorreram em apenas 5 amostras (6,7%). A caracterização fenotípica dos 75 isolados foi realizada por meio de análises de identificação presuntiva, como a utilização de meio cromogênico CHROMagar Candida (Figura 4), teste do tubo germinativo e microcultivo de Dalmau, e por meio das análises bioquímicas, utilizando o sistema API Candida e Candfast, para a identificação confirmatória da espécie (Figura 5). O meio cromogênico não serviu apenas para avaliar a pureza das colônias, mas, contribuiu de forma presuntiva na identificação das mesmas, através da coloração observada: C. albicans colônias verdes (n= 47; 62,7%), C. tropicalis colônias azuis (n= 6; 8%), Candida spp colônias rosas (n=19; 25,3%) e infecção mista (n= 3; 4%). Com relação à triagem fenotípica, os 47 isolados caracterizados, pelos métodos citados anteriormente, como sugestivos de C. albicans, apresentaram tubo germinativo positivo e a presença de clamidoconídeos. Portanto, os mesmos foram identificados presuntivamente como C. albicans (Figura 5 a).

56 39 Dentre as leveduras isoladas, a Candida albicans foi à espécie mais frequente representando 62,7% (47) dos casos, seguida por espécies não-albicans: C. glabrata 13,3 % (10), C. tropicalis 8,0 % (6), C. parapsilosis 6,7% (5), C. krusei 5,3 % (4). A presença de culturas mistas 4,0% foram verificadas em três isolados clínicos com associação de C. albicans e C. glabrata. A B C Figura 4. (A) Coloração verde no meio cromogênico CHROMagar Candida após 72h de incubação, sugestiva de Candida albicans; (B) colônias de cor azul sugestivas de C. tropicalis; (C) colônias apresentando coloração rosa com franjas sugestivas de C krusei. Fonte: Acervo pessoal A B Figura 5. (A) Aspecto micromorfológico de Candida albicans no Ágar Fubá com Tween 80 após incubação a 30ºC, 72h (400 x de magnificação). A seta preta representa um clamidoconídio, a seta verde representa uma hifa verdadeira e a seta branca representa um aglomerado de blastoconídios. (B) Identificação bioquímica por sistema API Candida. Fonte: Acervo pessoal.

57 Avaliação dos sinais e sintomas, fatores predisponentes e uso de antifúngicos A maioria das pacientes participantes com diagnóstico clínico de candidíase vulvovaginal (n=128), apresentaram dois ou mais sinais e sintomas de CVV, bem como um ou mais fatores predisponentes no momento em que foram inclusas no estudo. Dentre manifestações clínicas apresentadas, o corrimento vaginal do tipo branco leitoso, foi encontrado em todos os casos, sendo 52% (n=39) nas pacientes com CVV e 48% (n=36) na CVVR. Prurido foi o segundo sintoma mais comum com 57,3%, seguido da hiperemia, ardor vaginal, odor e dispareunia. Não foi encontrada diferença significativa na frequência dos sinais e sintomas quando comparados os casos de CVV e CVVR. Na maioria dos casos não houve associação entre a espécie envolvida e o tipo de sinais/sintomas apresentados. (Tabela 3). Em relação ao número de sinais/sintomas, as espécies de Candida albicans e Candida parapsilosis revelaram maior percentual entre as pacientes com um maior número de sinais e sintomas (Tabela 4). Tabela 3 Associação entre as espécies de Candida isoladas na secreção vaginal e a sintomatologia apresentada pelas 75 mulheres atendidas em um centro de referência em DST de Manaus. Sintomatologia C. albicans C. glabrata C. tropicalis C. krusei C. parapsilosis Mista Total p Prurido N % Presente ,3 0,0100* Ausente ,7 Hiperemia Presente ,3 0,1123 Ausente ,7 Odor Presente ,3 0,7595 Ausente ,7 Ardor Presente ,0 0,5792 Ausente ,0 Dispareunia Presente ,0 0,6292 Ausente ,0

58 41 Tabela 4. Quantidade de sinais e sintomas apresentados pelas pacientes do estudo quando as mesmas apresentaram cultura de secreção vaginal positiva para Candida spp. Numero de sinais /sintomas 1 a 2 sintomas 3 ou mais sintomas C.albicans C.tropicalis 16 57,1 34, ,0 66,0 TOTAL 47 62,7 100,0 4 14,3 66,7 2 4,3 33,3 6 8,0 100,0 C.glabrata C.parapsilosis C.krusei Infecção mista ,9 3,6 3,6 3,6 50,0 20,0 25,0 33,3 5 10,6 50, ,3 100,0 4 8,5 80,0 5 6,7 100,0 3 6,4 75,0 4 5,3 100,0 2 4,3 66,7 3 4,0 100,0 TOTAL ,0 37, ,0 62, ,0 100,0 A presença de pseudo-hifas e alguns casos com hifas verdadeiras ocorreram na maioria das amostras em que foi isolada a C. albicans e todos os isolados de C. tropicalis. Estas estruturas foram encontradas com maior frequência nas pacientes que apresentavam de 3 ou mais sintomas sugestivos de CVV (Tabela 5) no entanto, observou-se que na maioria dos casos em que foi isolada a Candida tropicalis, a despeito da formação frequente de filamentos, as pacientes apresentavam somente corrimento vaginal (Tabela 3). Tabela 5- Número de sinais e sintomas e estruturas evidenciadas ao exame direto das amostras clínicas de secreção vaginal coletadas entre junho de 2014 e fevereiro de Número de sinais e sintomas 1 a 2 sintomas >2 sintomas TOTAL Blastosporos em brotamento 12 42,9 37, ,6 62, ,7 100,0 Blastosporos e pseudohifas 14 50,0 36, ,1 63, ,7 100,0 Blastosporos +PH+HV 2 7,1 40,0 3 6,4 60,0 5 6,7 100,0 TOTAL ,0 37, ,0 62, ,0 100,0

59 42 Nesta investigação, no que se refere aos fatores de risco, verificou-se que a maioria das mulheres apresentavam vida sexual ativa (97,7%), com parceiro fixo (72,7%). Um percentual de 60,2% eram portadoras de alguma DST, 86,7% faziam uso de roupas oclusivas. Destaca-se ainda o fator idade, onde foi observado que 70,3% das pacientes tinham idade entre 18 a 30 anos. Comparando-se as pacientes com CVV esporádica e os casos de CVVR quanto à influência dos fatores predisponentes, não se observou nenhuma diferença estatisticamente significativa (Tabela 6). Quanto ao uso prévio de antifúngicos, verificou-se através do prontuário médico das pacientes participantes, que 80/128 (62,5%) utilizaram antifúngicos tópicos e/ou sistêmicos para CVV. Destas 64 (80%) relataram persistência de alguns sintomas clínicos e 16 (20 %) não apresentaram melhora clínica. Em relação ao tratamento, 46 (57,5%) das pacientes afirmaram que se submeteram a um esquema terapêutico prescrito pelo médico, 24 (30,1%) relataram uso constante da medicação por conta própria e, 10 (12,5 %), haviam interrompido o tratamento. Assim, observou-se o uso de quatro antifúngicos: miconazol e cetoconazol, pertencentes à classe dos imidazólicos; nistatina, pertencente à classe dos poliênicos e fluconazol, pertencente à classe dos triazólicos, sendo o miconazol e nistatina de aplicação tópica, na forma farmacêutica de creme vaginal; o cetoconazol por via oral e o último de aplicação sistêmica, na forma farmacêutica de comprimido.

60 43 Tabela 6 Associação entre fatores predisponentes a vulvovaginite (hábitos e antecedentes) com diagnóstico clínico. Fatores predisponentes CVV n=70 CVVR n=58 Total n=128 p n (%) n (%) n (%) Faixa etária < 30 anos >30 anos ,9 27, ,2 32, ,3 29,7 0,248 Uso de contraceptivos orais Usa 13 18, , ,0 0,971 Não usa 57 81, , ,0 Uso de antibióticos Sim 10 14,3 8 13, ,1 0,4714 Não 60 85, , ,9 DST associada Presente 46 65, , ,2 0,218 Ausente 24 34, , ,8 Uso de roupas oclusivas Sim 62 88, , ,7 0,676 Não 8 11,4 9 15, ,3 Uso de roupas sintéticas Sim 31 44, , ,2 0,727 Não 39 55, , ,8 Doença de base Presente 4 5,7 4 6,9 8 6,3 0,531 Ausente 66 94, , ,8 Vida sexual ativa Sim 69 98, , ,7 0,429 Não 1 1,4 2 3,4 3 2,3 Nº Parceiros/ano Múltiplos parceiros 25 35, , ,3 0,010* Parceiros fixos 45 64, , ,7

61 Perfil de susceptibilidade obtido pela metodologia comercial Etest Os resultados dos perfis de susceptibilidade das pacientes com CVV participantes deste estudo, para as três drogas antifúngicas, estão representados na tabela 7. Todos os isolados de C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. krusei e C. tropicalis apresentaram 100% de susceptibilidade ao antifúngico anfotericina B. As CIMs para este poliênico variaram de 0,023 a 1,0 µg/ml. Os testes de suscetibilidade ao fluconazol, também caracterizaram a maioria dos isolados como sensíveis a este azólico. As CIMs variaram de 0,016 a 256 µg/ml. Dez amostras estudadas mostraram-se resistentes ao itraconazol e dezenove dose-dependentes, as CIMs tiveram variação de 0,004 a 32 µg/ml. Quanto aos isolados de C. glabrata, 100% apresentaram susceptibilidade ao fluconazol e anfotericina B. Para o itraconazol seis isolados (46,2%) apresentaram resistência e sete isolados (53,8%) foram susceptível dose-dependentes. Os isolados de C. tropicalis, C. krusei e C. parapsilosis mostraram 100% de sensibilidade ao fluconazol e anfotericina B. Para o itraconazol apresentaram respectivamente quatro isolados (66,7%); dois isolados (50%) e um isolado (20%) com sensibilidade dose-dependente. Tabela 7 - Perfil de suscetibilidade aos antifúngicos de Candida spp isoladas de secreção vaginal de pacientes atendidas no centro de referência em DST de Manaus, FUAM (n=78). Espécies (n) Sensibilidade n(%) FCZ ITR AMB S SDD R S SDD R S SDD R C. albicans(50) 48 (98) 0 2(2) 41 (84) 5 (10) 4 (6) 50 (100) 0 0 C. glabrata(13) 13 (100) (53,8) 6 (46,2) 13 (100) 0 0 C. tropicalis(6) 6 (100) (33,3) 4 (66,7) 0 6 (100) 0 0 C. parapsilosis(5) 5 (100) (80) 1 (20) 0 5 (100) 0 0 C. krusei (4) 4 (100) (50) 2 (50) 0 4 (100) 0 0 TOTAL(78) 76 (97,4) 0 2 (2,6) 49 (62,8) 19 (24,4) 10 (12,8) 78 (100) 0 0 FCZ: fluconazol; ITR: itraconazol; AMB: anfotericina B; S:sensível; SDD: susceptível dosedependente; R: resistente

62 Análise molecular dos isolados fúngicos A técnica de extração de DNA utilizado-se o kit comercial da QIAamp Tissue and Blood com a ruptura celular com pérolas de vidros, possibilitou a obtenção do DNA genômico dos 78 isolados de Candida e de duas cepas padrão ATCC com qualidade satisfatória, tamanho condizente com o esperado para DNA genômico e alto rendimento. A concentração de DNA foi estimada entre 17,5 e 70,0 ng/µl. A região ITS/DNAr foi amplificada com êxito, para todas as espécies de Candida isoladas no estudo. A restrição com a enzima Ddel para investigação dos perfis de RFLP produziu perfis de tamanhos únicos, entre os isolados clínicos e cepas de referência ATCC. Para as espécies de C. albicans a restrição produziu um perfil de quatro fragmentos fragmentos :450, 400, 275 e 200 pb, semelhante para C. tropicalis:425, 350, 275 e 200 pb, C. parapsilosis mostrou um perfil de três fragmentos :550, 350 e 275 pb e C. krusei :550, 375 e 150, enquanto as espécies C. glabrata apresentaram perfis de aproximadamente 800, 425 e 275 pb. A Figura 6 apresenta os perfis de RFLP (Primers ITS5-NL4, enzima de restrição DdeI) obtidos a partir de DNA extraído de 78 culturas isolados de paciente com CVV. 800 pb 350 pb Figura 6: Perfis de RFLP DE 78 isolados vaginais (Primers ITS5-NL4, enzima de restrição DdeI). L: Ladder 50pb.

63 46 Seis isolados de C. albicans que demonstraram resistência in vitro pelo E-test, e mais 5 isolados desta mesma espécie que foram caracterizados como susceptíveis, foram submetidos à genotipagem pela técnica do MLST descrita por Bougnoux (73). Para a amplificação dos 7 housekeeping genes destes isolados, foram realizadas 77 reações de PCR. Os resultados das corridas eletroforéticas para a visualização dos produtos amplificados estão demonstrados na Figura 8. As reações utilizando os iniciadores para os genes SYA, VP13 e ZWF foram positivas para todos os isolados analisados, entretanto, para os genes ATT1, ADP1 e ACC1, três isolados não apresentaram produtos de amplificação (amostras 59, 37 e 201), e para o gene MPIb além destes três isolados, um outro isolado (amostra 234) também não amplificou. As reações foram todas repetidas confirmando a ausência de amplificação nestas 4 amostras para estes mesmos iniciadores. O isolado 138 apesar do sucesso na amplificação de todos os genes, apresentou problema na reação de sequenciamento dos produtos amplificados. Assim, foram identificados um total de 41 genótipos, entre os 7 fragmentos dos genes de isolados de 11 pacientes incluídos no estudo. Todos os isolados apresentaram no mínimo um sitío heterozigótico. A heterozigose a partir do produto do PCR do genoma de C. albicans, pode ser vista a partir de dois picos de tamanhos aproximados, representados nas sequências observadas nos cromatogramas. A ocorrência de picos confundidores de menor tamanho pode levar a erros na análise das sequências verdadeiramente heterozigóticas. Entretanto estes erros podem ser minimizados verificando-se a qualidade dos cromatogramas. Não foi visto nenhuma poliploidia nestes fragmentos durante o nosso estudo, o que poderia ser evidenciado na leitura dos cromatogramas no qual seria notado mais de dois picos para a mesma posição no gene. O número de genótipos únicos, encontrados para os isolados deste estudo, variou de 3 a 6 para cada gene totalizando 34. Foram encontrados 3 genótipos únicos para os fragmento AAT1, 4 para SYA1, 5 para ACC, ZWF1 e VPS13 e 6 para os fragmentos ADP1 e MPIb (Tabela 8).

64 47 Foram detectadas 100 heterozigoses, como as apresentadas na ilustração da Figura 7. A heterozigose mais comum ocorreu pela presença de Y=C+T com 42 vezes (42%), R=A+G com 38 (38%), W=A+T com 9 (9%), K=G+T com 5 (5%) e M=A+C com 6 (6%). Não foi detectada nenhuma heterozigose por S=C+G. As tabelas do Anexo D ilustram todos os 48 sítios polimórficos dos sete fragmentos dos housekeeping genes estudados. Foi possível verificar nestes sítios, as variações homozigóticas representadas pelas letras A, C, T, e G, ou heterozigóticas pelas letras Y, R, W, M e K Figura 7. Cromatograma parcial de um dos isolados para o fragmento ZWF1. Na ilustração existem três sítios heterozigóticos destacados em azul nas posições 31, 43 e 49 com a presença destes picos C/T, A/T e C/T, respectivamente.