Agradecimentos. Pela valiosa contribuição para esta tese, manifesto o meu agradecimento:

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1 Agradecimentos Pela valiosa contribuição para esta tese, manifesto o meu agradecimento: à Prof. Doutora Maria do Céu Sousa, pela dedicação e interesse que sempre manifestou na concretização deste trabalho e pelo incansável apoio oferecido, à Prof. Doutora Maria Odete Afonso pela sua disponibilidade, encorajamento e conhecimentos transmitidos, ao Prof. Doutor Carlos Alves Pires pela sua dedicação e trabalho realizado nesta área, inspirador para qualquer principiante, ao Prof. Doutor Miguel Pardal pela sua disponibilidade e por achar que tudo é possível, ao Dr. Tiago Luz e Prof. José Paulo Sousa pela colaboração e apoio logístico na área da entomologia, ao Instituto Geofísico da Universidade de Coimbra, particularmente ao Eng. Paulo Ribeiro pelos dados climatológicos fornecidos, aos meus colegas e amigos, Dr. Ricardo, Dra. Carolina e Dr. Salvador por me ajudarem na escolha de alguns dos locais de estudo, à Filipa Varela por me apoiar na recolha dos flebótomos, e especialmente à Patrícia Cortês também pelo interesse, boa vontade e amizade que sempre dedicou ao longo deste estudo, ao meu incasável irmão, Adriano Nave, pelos conhecimentos transmitidos na área da geografia, pela preciosa ajuda na concretização deste trabalho e pelo incansável apoio até ao fim da sua elaboração, a todos os proprietários dos animais que serviram de base para a selecção dos locais, pela sua preciosa colaboração e hospitalidade, e ainda, aos meus pais, familiares e amigos que, directa ou indirectamente me apoiaram e encorajaram, muito obrigada a todos. I

2 Resumo As leishmanioses, actualmente consideradas como o terceiro grupo mais importante de doenças transmitidas por vectores, são doenças endémicas em 88 países, causadas por espécies de protozoários do género Leishmania. Conhecem-se cerca de trinta espécies de insectos flebotomíneos (Díptera: Psychodidae) que são vectores comprovados de Leishmania, pertencendo aos géneros Phlebotomus, no Velho Mundo ou Lutzomyia, no Novo Mundo. Além do homem, os hospedeiros vertebrados mais comuns incluem animais domésticos e silváticos. No sul da Europa, L. infantum é o agente causal de leishmaniose visceral, sendo o cão o principal reservatório no ciclo doméstico. Anualmente são reportados cerca de 700 casos humanos autóctones existindo uma seroprevalência de até 25% nos cães domésticos. As infecções por Leishmania são maioritariamente zoonoses rurais ou peri-urbanas de transmissão sazonal, com tendência a tornar-se cada vez mais suburbanas. Em anos recentes a doença reemergiu, afectando maioritariamente adultos co-infectados com Leishmania-vírus da imunodeficiência humana. Na Península Ibérica, os vectores mais estudados e que predominam são P. perniciosus e P. ariasi, tendo sido ambos encontrados infectados com Leishmania infantum. Em Portugal, onde a infecção canina é considerada estável, foram identificadas quatro regiões endémicas: o Alto Douro, a região metropolitana de Lisboa e Setúbal, o concelho de Évora e o Algarve. No concelho de Coimbra encontrou-se, entre 2003 e 2004, uma taxa de prevalência de infecção por Leishmania de 29,4% em cães recolhidos pelo Canil Municipal de Coimbra. Assim, e assumindo que é necessária uma prevalência de 2,5% para manter o carácter endémico da infecção, este concelho apresenta-se como provável região endémica de leishmaniose canina. Como, até à data, não foi comprovada a presença dos vectores de Leishmania no concelho de Coimbra, este estudo pretendeu identificar as espécies flebotomínicas existentes bem como as respectivas densidades, durante os meses apontados noutros estudos como sendo os de maior II

3 transmissão da infecção. Assim, utilizando uma armadilha luminosa do tipo CDC, foram prospectados 78 biótopos em 20 locais distribuídos por 13 freguesias do concelho de Coimbra, durante os meses de Julho a Outubro de A identificação das espécies flebotomínicas, foi feita essencialmente pela observação microscópica da espermateca das fêmeas e pela visualização directa da genitalia dos machos, seguindo as chaves de identificação previamente descritas para os flebótomos encontrados em Portugal. Durante o estudo foi também analisada a preferência das espécies flebotomínicas relativamente ao tipo de biótopos, bem como a relação entre a densidade das espécies e os valores médios de temperatura e humidade. Num total de 922 flebótomos capturados (569 machos e 353 fêmeas), 636 (69%) foram P. perniciosus, 216 (23,4%) P. ariasi, 67 (7,3%) Sergentomyia minuta e 3 (0,3%) foram P. sergenti. Das espécies do género Larroussius, comprovadamente vectores de Leishmania infantum em Portugal, P. perniciosus foi a espécie mais abundante e amplamente distribuída, apresentando uma evolução monofásica com um pico em Agosto, mês em que registou maior densidade (D=15,3). Relacionando as densidades com as condições climáticas, verificou-se que o pico de P. perniciosus não correspondeu ao mês mais quente (Julho) registado neste período em Coimbra, mas sim ao mês que, sendo quente, foi o mais húmido (Agosto). P. ariasi foi a segunda espécie mais encontrada, mantendo-se activa durante os quatro meses estudados, apresentando maiores densidades em Agosto (D=3,3) e Outubro (D=3,6), meses em que e a humidade relativa foi também maior (73,1% e 74,3%, respectivamente). Capturadas em biótopos domésticos e peridomésticos, ambas as espécies (P. perniciosus e P.ariasi) predominaram nas zonas periurbanas da área estudada e preferiram os quintais como locais de repouso. A análise de abundância de flebótomos totais encontrados na área estudada indica que as maiores capturas se efectuaram a leste e sul do concelho de Coimbra, correspondendo geograficamente à zona do Maciço Marginal e à das maiores altitudes, respectivamente. Este foi o primeiro estudo das espécies flebotomínicas no concelho de Coimbra, assinalando a presença dos principais vectores naturais de leishmanioses encontrados no nosso país. III

4 Abstract The leishmaniasis, currently considered the third most important group of diseases transmitted by vectors, are endemic in 88 countries, being caused by protozoa species of the genus Leishmania. About thirty species of phlebotomine sand flies (Diptera: Psychodidae) are known to be proven vectors of Leishmania, belonging to the genus Phlebotomus in the Old World or Lutzomyia in the New World. Besides the man, the most common vertebrate hosts include domestic and silvatic animals. In southern Europe, L. infantum is the causative agent of visceral leishmaniasis and the dog is the main reservoir in the domestic cycle. About 700 autochthonous human cases are reported each year and a seroprevalence of up to 25% is known in domestic dogs. The Leishmania infections are mostly rural and peri-urban seasonal transmission zoonosis, with a tendency to become increasingly sub-urban. In recent years, leishmaniasis is considered a re-emerging disease because it is affecting mostly adults co-infected with Leishmania-human immunodeficiency virus. In the Iberian Peninsula, the most studied and predominant vectors are P. perniciosus and P. ariasis, both proved to be found infected with Leishmania infantum. In Portugal, where the dog infection is considered stable, four endemic regions were identified: Alto Douro region, the metropolitan area of Lisbon and Setúbal, the municipality of Évora and the Algarve region. Between 2003 and 2004, it was found a prevalence rate of infection with Leishmania of 29.4%, among dogs captured by the Municipality Cannel of Coimbra. Assuming that a prevalence of 2.5% is necessary to maintain the endemic nature of the infection, the municipality of Coimbra presents itself as a likely endemic area of canine leishmaniasis. Once it was not yet proven the presence of vectors of Leishmania in the municipality of Coimbra, this study sought to identify the phlebotomine existing species and their densities, during the months indicated in other studies as the highest for the transmission of the infection. Thus, using a CDC light trap, a total of 78 biotopes were prospected in 20 locations spread over 13 districts of the IV

5 municipality of Coimbra, during the months of July to October The identification of phlebotomine sand flies species, was achieved by microscopic observation of the female spermatheca and the direct visualization of the male genitalia, following a previously described identification key for the Portugal phlebotomine species already found. In this study, it was also analyzed the species preference for the types of habitats as well as the relationship between the density of species and the average values of temperature and humidity. A total of 922 phlebotomine sand flies were captured (569 males and 353 females), of witch 636 (69%) were P. perniciosus, 216 (23.4%) were P. ariasi, 67 (7.3%) were Sergentomyia minuta and 3 (0.3%) were P. Sergenti. Among the species belonging to the subgenus Larroussius, witch are the proven vectors of Leishmania infantum in Portugal, P. perniciosus was the most abundant and widely distributed, presenting a development cycle with a peak in August, month at which was registered the higher density (D = 15,3). Relating the densities with the weather conditions, it was found that the peak for P. perniciosus did not matched the warmer month (July) registered on this period in Coimbra, but, was in the most humid but still worm month (August). P. ariasi was the second most frequent species, being active during the four months studied, showing higher densities in August (D = 3.3) and October (D = 3.6) matching the months in which relative humidity was also higher ( 73.1% and 74.3% respectively). Caught in domestic and peridomestic habitats, both species (P. perniciosus and P. ariasi) predominate in peri-urban areas on this study and preferred the yards for resting places. The analysis of total abundance of phlebotomine sand flies found in the study area indicates that the largest catches were made to the east and south of Coimbra municipality, corresponding to the geographical area of the Marginal Massif and the heist altitude, respectively. This was the first study on the phlebotomine sand flies species from the municipality of Coimbra, indicating the presence of the main natural vectors of leishmaniasis found in our country. V

6 Índice Agradecimentos... I Resumo... II Abstract...IV Índice...VI Lista de Figuras...VIII Lista de Quadros...X Lista de Abreviaturas...XI Capitulo I - Introdução geral As leishmanioses Situação mundial O parasita: Leishmania spp Transmissão das leishmanioses Insectos vectores Espécies vectores e sua distribuição na bacia mediterrânica Biologia e ciclo de desenvolvimento dos flebótomos Capacidade vectorial Ciclo biológico da Leishmania dentro do vector Mecanismos de transmissão Hospedeiros vertebrados Leishmaniose canina Distribuição e prevalência na Europa Leishmaniose em Portugal Controlo da infecção canina por Leishmania Capitulo II Material e métodos Caracterização do meio físico, biótico e humano do concelho de Coimbra Área e duração do estudo Selecção dos biótopos Método de captura Método de conservação VI

7 2.6 - Identificação morfológica das espécies flebotomínicas de Portugal Aspectos de morfologia geral Procedimento para a identificação das fêmeas Procedimento para a identificação dos machos Sistemática. Características dos géneros e subgéneros que ocorrem em Portugal Chaves de identificação dos flebótomos de Portugal Capitulo III Resultados Distribuição e densidade das espécies flebotomínicas no concelho de Coimbra Phlebotomus (Larroussius) perniciosus Newstead, Phlebotomus (Larroussius) ariasi Tonnoir, Sergentomyia (Sergentomyia) minuta Rondani, Phlebotomus (Paraphlebotomus) sergenti Parrot, Associação de espécies flebotomínicas Capitulo IV Discussão e conclusões Referências bibiliográficas VII

8 Lista de Figuras Figura 1. Distribuição das leishmanioses no sul da Europa... 4 Figura 2. Ciclo de vida de Leishmania spp... 5 Figura 3. Formas promastigotas (A) e amastigotas dentro de um macrófago (B) de Leishmania sp... 6 Figura 4. Ciclo biológico da Leishmania num vector competente Figura 5. Regiões endémicas confirmadas e suspeitas de leishmaniose canina em Portugal continental Figura 6. Gráfico termo-pluviométrico da Normal Climatológica , referente à estação climatológica do IGU Figura 7. Área de estudo e distribuição geográfica dos locais de captura Figura 8. Distribuição mensal do número de biótopos pelos locais de captura Figura 9. Número de noites de capturas para cada tipo de biótopo Figura 10. Fotografia exemplificativa do biótopo tipo galinheiro Figura 11. Jardim onde foram feitas capturas na Quinta do Areeiro Figura 12. Exemplo de um quintal tipo onde foram prospectados vários biótopos Figura 13. Pormenor de um anexo existente no quintal, em Ceira (local nº15)...34 Figura 14. A) Vista geral da armadilha CDC miniatura B) Pormenor do mecanismo da armadilha Figura 15. Flebótomo adulto Figura 16. Cabeça de uma fêmea de flebótomo Figura 17. Asa de um flebótomo e respectiva nomenclatura Figura 18. Vista lateral da genitália de um macho de flebótomo Figura 19. Genitália de uma fêmea de flebótomo Figura 20. Espermateca e furca do aparelho genital de uma fêmea de flebótomo Figura 21. Genitálias de flebótomos de: A) S. minuta, B) P. sergenti, C) P. papatasi, D) P. perniciosus e E) P. ariasi Figura 22. Espermatecas de A) S. minuta, B) P. ariasi C) P. perniciosus, D) P. sergenti e E) P. papatasi Figura 23. Distribuição de Phlebotomus (Larroussius) perniciosus Newstead, 1911, Phlebotomus (Larroussius) ariasi Tonnoir, 1921, Phlebotomus (Paraphlebotomus) sergenti Parrot, 1917 e Sergentomyia (Sergentomyia) minuta Rondani, 1843 na área estudada do concelho de Coimbra VIII

9 Figura 24. Número de biótopos e densidade de flebótomos, por mês Figura 25. Densidades mensais das espécies do subgénero Larroussius (P. perniciosus e P. ariasi) Figura 26. Densidades das espécies do subgénero Larroussius, P. perniciosus e P. ariasi, em relação aos locais urbanos e peri-urbanos da área estudada (A) e para o tipo de biótopo (B) Figura 27. Mapa do concelho de Coimbra mostrando a distribuição e número de flebótomos capturados na área estudada Figura 28. Panorâmica do local (nº10) em Torres de Mondego, onde foram capturados maior número de flebótomos Figura 29. Exemplar de uma fêmea de Phlebotomus perniciosus Figura 30. Relação entre a temperatura média mensal, a humidade e a densidade de machos e fêmeas de P. perniciosus Figura 31. Machos de Phlebotomus ariasi Figura 32. Relação entre a temperatura média mensal, a humidade e a densidade de machos e fêmeas de P. ariasi Figura 33. Relação entre a temperatura média mensal, a humidade e a densidade de machos e fêmeas de Sergentomyia minuta IX

10 Lista de Quadros Quadro I. Rastreios serológicos de infecção canina por Leishmania em Portugal Quadro II. Número de flebótomos capturados e respectiva densidade, por local e espécie Quadro III. Relação entre o número de machos e fêmeas capturados para cada espécie encontrada Quadro IV. Distribuição mensal do número de machos e fêmeas capturados para cada espécie encontrada Quadro V. Densidades de P. perniciosus, P. ariasi, S. minuta e P. sergenti para cada tipo de biótopo Quadro VI. Densidades por biótopos urbanos e peri-urbanos, das diferentes espécies de flebótomos encontradas Quadro VII. Associação de espécies flebotomínicas nos mesmos biótopos e número de biótopos prospectados X

11 Lista de Abreviaturas ADN - ácido desoxiribonucleico CDC - Centers for Disease Control CMC - Câmara Municipal de Coimbra D - densidade FML - fucose-mannose ligand GSP - gel secretor promastigota IAR - índice de atractividade relativa INE - Instituto Nacional de Estatística IHMT - Instituto de Higiene e Medicina Tropical LC - leishmaniose cutânea LCan - leishmaniose canina LPG - lipofosfoglicanos LV - leishmaniose visceral MF - matriz peritrófica SIDA - síndrome de imunodeficiência adquirida SMF - sistema mononuclear fagocítico VIH - vírus da imunodeficiência humana WHO - World Health Organization (Organização Mundial de Saúde) XI