UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

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1 1 UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS ÉRICA SUZANNE SOARES LEAL DESENVOLVIMENTO IN VITRO DE FOLÍCULOS SECUNDÁRIOS APÓS VITRIFICAÇÃO DE TECIDO OVARIANO CAPRINO FORTALEZA CEARÁ 2015

2 2 ÉRICA SUZANNE SOARES LEAL DESENVOLVIMENTO IN VITRO DE FOLÍCULOS SECUNDÁRIOS APÓS VITRIFICAÇÃO DE TECIDO OVARIANO CAPRINO Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinarias da Faculdade de veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias. Área de concentração: Reprodução e Sanidade animal. Linha de pesquisa: Orientadora: Profa. Dra. Ana Paula Ribeiro Rodrigues Co-Orientador: Prof. Dr. Luis Alberto Vieira FORTALEZA CEARÁ 2015

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5 5 Aos meu pais Dedico.

6 6 AGRADECIMENTOS À Deus, o ÚNICO capaz de proporcionar a felicidade plena, por nos conduzir com sabedoria a trilhar caminhos retos. À minha família agradeço grandemente, pelo entendimento da minha total ausência durante esses quase dois anos. A minha mãe, Maria do Perpétuo Socorro Leite, pelo seu amor incondicional, por acreditar nos meus sonhos e por me colocar sempre em suas orações me ensinando sempre a ser uma pessoa mais forte. Ao meu pai, João da Paz Leal, por sempre ser um pai presente e cuidadoso em todas as etapas da minha vida. A minha irmã, Lhais Suelen Soares Leal, por ser minha melhor amiga e parceira. Ao meu irmão João Paulo Soares Leal, que encontra-se com o (Senhor) mais que o tempo que viveu aqui neste mundo me ensinou a lutar pela vida com um sorriso no rosto (Quanta saudade). À minha orientadora Profa. Dra. Ana Paula Ribeiro Rodrigues e ao Prof. Dr. José Ricardo de Figueredo por terem me recebido no Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Pré- Antrais (LAMOFOPA) e me dado todo o suporte necessário durante o período de realização da minha Dissertação. Ao Prof. Dr. Claudio Cabral Campello por toda a sua ajuda e contribuição neste trabalho com a análise estatística, e por ter se mostrado sempre tão solicito em me ajudar. À minha equipe de experimentos: Luis Alberto Vieira, Anna Clara Accioly Ferreira, Naiza Arcângela de Sá, Franciele Lunardi Osmarine, por todo o suporte técnico, auxílio em cada etapa na realização desse trabalho. Agradeço grandemente ao Dr Luis Alberto Vieira, a quem eu não tenho palavras para agradecer a ajuda durante o período de mestrado. Algumas pessoas são importantes, no entanto existem algumas que são essenciais, e com certeza você foi uma peça fundamental nessa conquista. Muito obrigada pela sua atenção e ensinamentos, por cada palavra de apoio, por cada risada e por cada bronca. A toda equipe do Lamofopa, que contribuíram direta ou indiretamente, por toda a amizade e carinho.

7 7 Agradecimentos Intitucionais À Universidade Estadual do Ceará (UECE) e ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV) pela capacitação profissional que me proporcionaram. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo incentivo concedido na forma de bolsa de estudo. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo auxílio financeiro dessa pesquisa.

8 8 RESUMO A criopreservação do tecido ovariano pode contribuir sobremaneira para o êxito das técnicas de reprodução assistida em animais e humanos, através da conservação da reserva dos milhares de folículos pré-antrais presentes no córtex do ovário. Entretanto, o sucesso do desenvolvimento desses folículos após a criopreservação ainda é bastante variável, seja pelo transplante do ovário, seja pelo cultivo in vitro dos próprios folículos. Portanto, objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito da vitrificação sobre o desenvolvimento folicular após cultivo in vitro de folíciulos secundários caprinos em meio com ou sem adição do hormônio folículo estimulante (FSH) e do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). Fragmentos ovarianos foram distribuídos nos tratamentos 1 a 5. Tratamento 1: folículos secundários frescos imediatamente isolados e fixados (Controle ou T1); Tratamentos 2 e 3: folículos secundários isolados do tecido fresco e cultivados in vitro em α-mem (T2) ou α- MEM+FSH+VEGF (T3); e Tratamentos 4 e 5: folículos secundários isolados do tecido vitrificado e cultivados in vitro em α-mem (T4) ou α-mem+fsh+vegf (T5). Os folículos isolados de todos os tratamentos foram analisados quanto à morfologia, crescimento, viabilidade, proliferação celular (Ki67 e AgNOR) e níveis de espécies reativas de oxigênio (ROS). Embora, a morfologia de folículos vitrificados tenha sido inferior (P<0.05) a de folículos frescos, a viabilidade oocitária, formação de antro e níveis de ROS foram similares entre todos os tratamentos avaliados (P>0.05). O diâmetro folicular médio e taxas de crescimento geral e diário foram superiores (P<0.05) no T3, comparados aos demais tratamentos. A velocidade de crescimento (nulo, lento ou rápido) folicular e sua relação com a formação de antro mostrou que folículos frescos apresentaram maiores (P<0.05) taxas de crescimento lento no T2 e rápido no T3. Por outro lado, em folículos vitrificados (T4 e T5) as taxas crescimento nulo superaram (P<0.05) as taxas de crescimento rápido. Folículos com crescimento rápido apresentaram maior (P<0.05) taxa de formação de antro com relação ao crescimento lento ou nulo. A probabilidade de formação de antro de folículos que não cresceram foi de 40 %, essa taxa aumentou para 100 % naqueles folículos que apresentaram um crescimento diário de 45 µm. Células da granulosa de folículos em todos os tratamentos (T1, T2, T3, T4 e T5) apresentaram imunomarcação positiva para Ki67. Entretanto, a proliferação celular davaliada pela coloração de AgNOR e folículos do T2 e T3 foi menor (P>0.05) do que folículos do T1, T4 e T5. Conclui-se que folículos secundários podem ser isolados do tecido ovariano com sucesso após a vitrificação e, são capazes de sobreviver e formar antro durante seis dias de cultivo in vitro. No entanto, mais estudos são necessários para melhorar o crescimento in vitro de folículos secundários após a vitrificação. Palavras-chave: Vitrification, FSH, VEGF, Ovarian tissue cryosystem, Folículo pré-antral

9 9 ABSTRACT Cryopreservation can help assisted reproductive in animals and humans, through the conservation of ovarian follicles. However, the success of development in vitro of ovarian follicles after cryopreservation is still variable. Therefore, the aim of the present study was to evaluate the viability and in vitro development of isolated secondary follicles in absence (α- MEM) or presence of follicle stimulating hormone (FSH) and vascular endothelial growth factor (VEGF) (α-mem+fsh+vegf) from vitrified caprine ovarian cortex. Ovarian fragments were distributed in five treatments (1 to 5): fresh isolated secondary follicles and immediately fixed (Control or T1); isolated secondary follicles from the fresh tissue and in vitro cultured in α-mem (T2) or α-mem+fsh+vegf (T3); and isolated secondary follicles from vitrified and in vitro cultured tissue in α-mem (T4) or α-mem+fsh+vegf (T5). After six days of culture, the follicles of the treatments (T2, T3, T4 and T5) were evaluated for morphology, viability and follicular development (growth, antrum formation and proliferation of granulosa cells by Ki67 and AgNOR). Furthermore, the level of reactive oxygen species (ROS) was assessed in the culture medium. Although the morphology of vitrified follicles was lower (P<0.05) when compared with the fresh follicles, oocyte viability, antrum formation and ROS levels were similar in all the treatments (P>0.05). The follicular diameter average, overall and daily growth rates were higher (P<0.05) in T3. Follicular growth rate (null, slow and fast-growth) and its relation with the antrum formation showed that fresh follicles had higher (P<0.05) slow-growth rates (T2) and fast-growth (T3). On the other hand, in vitrified follicles (T4 and T5), the null rates were higher (P<0.05) than fast-growth rates. Follicles with fast-growth had higher (P<0.05) antrum formation rate when compared to the slow or null-growth. The probability of a follicle that not grow to form antrum, was 40 %, this rate rose to 100 % in those follicles that had a daily increase of 45 µm. Granulosa cells of follicles in all treatments (T1, T2, T3, T4 and T5) showed positive immunostaining for Ki67. However by AgNOR staining, the fresh follicles derived from T3 was significantly higher (P<0.05) compared to follicles of T1, T2, T4 and T5. In conclusion, secondary follicles can be isolated from ovarian tissue successfully after vitrification and are able to survive and form antrum in in vitro culture of six days. However, further studies are needed to improve the in vitro growth of isolated secondary follicles after vitrification. Key-words: Vitrificação, FSH, VEGF, Ovarian tissue cryosystem, Preantral follicles

10 10 LISTA DE FIGURAS CAPÍTULO 1 Figure 1. Caprine follicle diameter from fresh follicles (T2: α-mem and T3: α- MEM+ FSH+VEGF) and vitrified follicles (T4: α-mem and T5: α- MEM+FSH+VEGF). A,B Uppercase letters indicate significant differences (P<0.05) among treatments within the same day. a,b Lowercase letters indicate significant differences (P<0.05) between days of culture Figure 2. A) Percentage of overall follicular growth rate (%) and B) daily follicular growth rate (µm/day), fresh follicles (T2: α-mem and T3: α- MEM+FSH+VEGF) and vitrified follicles (T4: α-mem and T5: α- MEM+FSH+VEGF) during six days of culture. A,B,C Uppercase letters indicate significant differences (P<0.05) among treatment 45 Figure 3. Percentage of categories of follicular growth velocity, fresh follicles (T2: α-mem and T3: α-mem+fsh+vegf) and vitrified follicles (T4: α- MEM and T5: α-mem+fsh+vegf) during six days of culture. A,B,C Uppercase letters indicate significant differences (P<0.05) among treatments 46 Figure 4 Relationship between antrum formation and daily growth rate. Each point on the graph is a follicle observed during in vitro culture (n= 218). The evaluated follicles were defined by binary values (without antrum formation = No; presence of antrum formation = Yes) by dependent variable. The logistic regression equation is represented by the red line: Logit P = ( Daily growth rate) P 0.001). 48

11 11 Figure 5. The immunohistochemical staining for Ki67 in fresh follicle (A - T2: α- MEM and B - T3: α-mem+fsh+vegf); vitrified follicles (C - T4: α- MEM and D - T5: α-mem+fsh+vegf); (E) positive control and (F) negative control. Scale bar of 20 mm and 50 µm

12 12 LISTA DE TABELAS CAPÍTULO 1 Table 1. Morphology of fresh (T2 and T3) and vitrified (T4 and T5) follicles after in vitro culture Table 2. Relationship between categories of follicular growth rate velocity and antrum formation... 47

13 13 LISTA DE ABREVIATURAS ANOVA BHA BHT BSA C CaCl 2 Calceína - AM CAPES CAT CNPq CO 2 COCs DNA DNase Dr. Dra. DP EGF EP EROs FOPAS FSH G GP GH GPx GSH GSSG h HC H 2 O Análise de Variância butil hidroxianisol butil hidroxitolueno Albumina sérica bovina Graus Celsius Cloreto de cálcio Calceína acetoximetil Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Catalase Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Dióxido de Carbono Complexos cumulus-oócito Ácido desoxirribonucleico Desoxirribonuclease Doutor Doutora Desvio Padrão Epidermal growth factor (Fator de crescimento epidermal) Erro Padrão Espécies Reativas de Oxigênio Folículos pré-antrais Hormônio Folículo Estimulante Gauge Galato de propila Growth hormone (Hormônio do crescimento) Glutationa Peroxidase Glutationa Glutationa dissulfeto Horas Histologia clássica Água

14 14 H 2 O 2 Peróxido de hidrogênio ICAM-1 Intercellular Adhesion Molecule 1 (Molécula de adesão intercelular 1) ITS Insulina, transferrina e selênio IGF-I Insulin growth factor similar - I (Fator de crescimento semelhante à insulina I) CIV Cultivo in vitro MIV Maturação in vitro Kg Quilograma LH Hormônio Luteinizante LAMOFOPA Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Pré-Antrais M Molar MEM Meio essencial mínimo mg Miligrama MI Metáfase I MII Metáfase II MIV Maturação in vitro min Minutos ml Mililitro mm Milimolar MMP-9 Metalopreinase da matriz-9 MOIFOPA Manipulação de Oócitos Inclusos em Folículos Ovarianos Pré-antrais RNAm Ácido ribonucléico mensageiro Na + Íon sódio ng Nanograma O 2 - O 2 OH - Oxigênio Radical superóxido Radical hidroxila P< 0,05 Probabilidade de erro menor do que 5% P> 0,05 Probabilidade de erro maior do que 5% p Página PAI-1 Plasminogen activator inhibitor-1 (Inibidor do ativador do plasminogênio-1) PPGCF Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas PIVE Produção in vitro de embriões

15 15 RVG Ruptura da Vesícula Germinal rfsh Hormônio Folículo Estimulante recombinante SAS Sistema de análise estatística sec Segundo SOD Superoxido desmutase TBHQ Terc-butil hidroquinona TIMP-2 Tissue inhibitor of metalloproteinases-2 (Inibidor de tecido de metaloproteinase tipo 2 TCM-199 Meio de cultivo tecidual- 199 U Unidade UECE Universidade Estadual do Ceará VG Vesícula Germinativa α-mem Meio essencial mínimo alfa α-mem + Meio essencial mínimo alfa modificado α-mem-hepes Meio essencial mínimo alfa tamponado com HEPES μg Micrograma μl Microlitro μm Micrômetro % Porcentagem ~ Aproximadamente < Menor = Igual > Maior ± Mais ou Menos Maior ou igual

16 16 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA ASPECTOS ESTRUTURAIS, MORFOLÓGICOS E FISIOLÓGICOS FOLICULOGÊNESE, CLASSIFICAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E POPULAÇÃO FOLICULAR BIOTÉCNICA DE MOIFOPA CRIOPRESERVAÇÃO DE OVÁRIO E FOLÍCULOS PRÉ- 20 ANTRAIS Cultivo in vitro de folículos pré-antrais (secundários) isolados do córtex ovariano... Uso do FSH no cultivo de folículos pré-antrais... Uso do VEGF no cultivo de folículos pré-antrais... AVALIAÇÃO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS ISOLADOS APÓS CULTIVO IN VITRO... JUSTIFICATIVA... HIPÓTESES CIENTÍFICAS OBJETIVOS... GERAL... ESPECÍFICOS... CAPÍTULO 1... CONCLUSÕES... PERSPECTIVAS REFERÊNCIAS... 66

17 17 1 INTRODUÇÃO A criopreservação de tecido ovariano é uma técnica bastante utilizada, para a preservação de gametas femininos assegurando a conservação de espécies animais, bem como possibilitando a recuperação da fertilidade, tanto em humanos quanto em animais (BEDAIWY;FALCONE, 2004). A grande vantagem dessa biotécnica, é que a colheita do tecido independe da idade e fase do ciclo estral ou menstrual (SHAW et al., 2000), além de envolver menos questões éticas e sociais do que a criopreservação de oócitos e embriões, sobretudo quando esse processo é realizado na espécie humana (ZHANG et al., 2009). Além disso, a criopreservação do ovário permite preservar todo o capital folicular, especialmente, folículos nos estágios iniciais de desenvolvimento, ou seja, os folículos pré-antrais (primordiais, primários e secundários). A conservação desse material, pode ser realizada tanto por congelação lenta (AMORIM et al., 2012) como por vitrificação (LORNAGE et al., 2006). A vitrificação tem se destacado como um método eficaz para a preservação de tecido ovariano pelo fato de anular ou minimizar a formação de cristais de gelo, grandes responsáveis pelas crioinjúrias extremamente comuns na congelação lenta. Além disso, é um método rápido e de fácil aplicação e baixo custo, tendo apresentado bons resultados inclusive, com o nascimento em espécies domésticas, como os ovinos (BORDES et al., 2005; LORNAGE et al., 2006) e humanos (KAWAMURA et al., 2013, SUZUKI et al., 2015). Apesar do sucesso já comprovado com a criopreservação e transplante de ovário, esse último pode se caracterizar como um inconveniente, quando em pacientes humanos oferece o risco de reintrodução de células cancerosas. Em espécies animais, sobretudo animais de produção, como os caprinos, o transplante pode também não ser a técnica de escolha para a restauração da fertilidade de um determinado indivíduo, pelos inconvenientes em manter o animal em um sistema de imunossupressão, bem como pela baixa relação custo/benefício. No entanto, a criopreservação de folículos secundários e seu posterior cultivo in vitro visando a obtenção de oócitos fertiliváveis e embriões produzidos in vitro, pode ser uma alternativa promissora como técnica de reprodução assistida (TRA). Estudos anteriores em caprinos, realizados por nossa equipe demostraram que é possível a produção de embriões a partir de folículos secundários, cultivados in vitro (MAGALHÃES et al., 2011, SARAIVA et al., 2010). Destaque-se que esses resultados foram um marco da técnica de manipulação de oócitos inclusos em folículos pré-antrais (MOIFOPA), no mundo. Recentemente, SILVA et al. (2014) também obtiveram maiores taxas de embriões produzidos in vitro cultivando folículos secundários, adicionando na

18 18 composição do meio de cultivo, o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e o hormônio folículo estimulante (FSH). Tanto o VEGF (ARAÚJO et al., 2011), como o FSH (MATOS et al., 2007, MAGALHÃES et al., 2009) já foram utilizados com sucesso no meio de cultivo in vitro de folículos pré-antrais caprinos, cultivados isolados ou inclusos no córtex ovariano, respectivamente. Embora, todos esses estudos tenham sido realizados com folículos não criopreservados, acredita-se que é possível obter sucesso cultivando folículos secundários pós-vitrificação. Recentemente, em um estudo com tecido ovariano bovino, nossa equipe mostrou que folículos pré-antrais frescos e criopreservados (congelação lenta ou vitrificação) necessitam de diferentes meios de cultivo para manter a sua morfologia e sobrevivência in vitro (CASTRO et al., 2014). Outros pesquisadores também sugeriram que folículos pré-antrais ovinos (BANDEIRA et al., 2015) e caprinos (CARVALHO et al., 2013, 2014), após a vitrificação necessitam de um meio de cultivo in vitro próprio, visando um melhor desenvolvimento. Portanto, considerando os avanços, bem como as informações já disponíveis na literatura sobre o desenvolvimento in vitro de folículos secundários frescos, o estabelecimento de um sistema de cultivo para folículos criopreservados, se constitui um grande desafio a ser superado, o qual foi o ponto central da investigação realizada neste trabalho. Com o intuito de mostrar a relevância e proporcionar um melhor entendimento deste estudo, a revisão de literatura a seguir, destaca: aspectos estruturais, morfológicos e fisiológicos do ovário mamífero; foliculogênese; caracterização, classificação e população folicular; biotécnica de MOIFOPA; criopreservação de tecido ovariano, com ênfase no processo de vitrificação; avanços no cultivo de folículos pré-antrais e, importância da composição do meio de cultivo para o desenvolvimento folicular in vitro.

19 19 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 ASPECTOS ESTRUTURAIS, MORFOLÓGICOS E FISIOLÓGICOS DO OVÁRIO O ovário é um dos órgãos mais importantes do sistema reprodutor feminino e é considerado um órgão heterogêneo, pois contém folículos ovarianos em vários estágios de desenvolvimento e estruturas conhecidas como corpos lúteos e corpos albicans (ADHIKARI e LIU, 2009). O tamanho desse órgão varia com a espécie e fase do ciclo ovariano (HAFEZ; HAFEZ, 2004). Porém, de forma geral, apresenta forma de amêndoa e é constituído por duas regiões, uma cortical e uma medular (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004; GARTNER; HIATT, 2007). Na grande maioria dos mamíferos, a região cortical é localizada externamente (FIGUEIREDO et al., 2008), sendo pouco vascularizada, na qual estão presentes células do estroma, os folículos ovarianos e as demais estruturas mencionadas acima (HAFEZ; HAFEZ, 2004; CARNEIRO, 2004). Já a região medular, em geral, localizada na parte interna do ovário, é responsável pela sustentação, vascularização e inervação do órgão, sendo constituída por numerosos vasos sanguíneos e linfáticos, nervos e tecido conjuntivo frouxo (JUNQUEIRA;CARNEIRO, 2004; GARTNER; HIATT, 2007). A superfície do ovário também conhecida como mesotélio ovariano é o mesotélio pélvico modificado que reveste ovário, composto de uma simples camada de células epiteliais que variam de achatadas a cúbicas com poucas características distinguíveis (AUERSPERG et al., 2001). Sob esse epitélio, o estroma forma uma camada de tecido conjuntivo denso e sem vasos, a albugínea do ovário (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004). A principal função da gônada feminina é a diferenciação e liberação do oócito maturo (função exócrina ou gametogênica) para fertilização e sucesso da propagação das espécies (MCGEE; HSUEH, 2000, GOUGEON, 2004). Adicionalmente, o ovário produz esteroides (função endócrina) que permitem o desenvilvimento das características sexuais secundárias da fêmea que preparam o organismo do indivíduo para receber o embrião (HIRSHFIELD, 1991) e suportam a gestação (MCGEE; HSUEH, 2000, GOUGEON, 2004). 2.2 FOLICULOGÊNESE, CLASSIFICAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E POPULAÇÃO FOLICULAR Foliculogênese é conhecida como o processo de formação, crescimento e desenvolvimento dos folículos ovarianos (FIGUEIREDO et al., 2008). O folículo é a unidade

20 20 morfofuncional do ovário e é caracterizado por um oócito circundado por células somáticas (células da granulosa e da teca), sendo responsável por albergar em seu interior, o oócito, permitindo que o mesmo complete seu desenvolvimento e maturação (CORTVRINDT; SMITZ, 2001). Com o desenvolvimento, o folículo passa por mudanças morfológicas, resultando em diferentes categorias foliculares de acordo com o seu estágio de evolução (HULSHOF et al., 1994). Os folículos ovarianos podem ser classificados em duas grandes categorias (i) folículos pré-antrais e (ii) folículos antrais. Essa grande classificação diz respeito à presença ou ausência de uma cavidade repleta de líquido folicular, presente apenas nos folículos antrais (VARGHESE et al., 2008). Os folículos pré-antrais representam a fase inicial do desenvolvimento folicular e podem ser subdivididos em primordiais, intermediários, primários e secundários (FIGUEIREDO et al., 2008). O folículo primordial encontra-se em estágio de quiescência e representa a reserva oocitária ovariana. Os folículos nesse estágio são caracterizados por um oócito localizado centralmente circundado por células da granulosa de formato pavimentoso (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004). Através de mecanismos ainda completamente não elucidados, alguns folículos são selecionados para deixarem o estágio de quiescência e prosseguirem seu desenvolvimento (FIGUEIREDO et al., 2008). Esse desenvolvimento é marcado pela mudança conformacional das células da granulosa, que passam do formato pavimentoso para o cúbico caracterizando o processo de ativação folicular. Assim, um folículo que possui células da granulosa tanto de formato pavimentoso quanto cúbico, é denominado de transição. Quando o oócito passa a ser circundado somente por células da granulosa de formato cúbico os folículos são então denominados primários. A partir dessa fase, o desenvolvimento é caracterizado pela multiplicação das células da granulosa, passando o folículo a apresentar duas ou mais camadas de células da granulosa cúbicas. Nessa fase, o folículo passa a ser denominado secundário. Na fase subseqüente já pode ser observada a cavidade antral e o folículo é, então, denominado de terciário (fase antral inicial) e, com o aumento do líquido folicular, o oócito fica preso ao folículo por um pedículo constituído por células foliculares e passa a ser denominado folículo pré ovulatório (MAGOFFIN et al., 2005; RAJKOVIC et al., 2006). No que concerne à população folicular, sabe-se que na maioria das espécies esta é estabelecida ainda na vida intrauterina (ZUCKERMAN, 1951) e, a partir de então, ocorre uma redução sistemática nesse pool (SHAW; ORANRATNACHAI; TROUNSON, 2000). A população folicular preantral já foi estimada em diferentes espécies, sendo de em

21 21 bovinos (SILVA-SANTOS et al., 2011), em ovinos (AMORIM et al., 2000), em caprinos (LUCCI et al., 1999) e em suínos (ALVES et al., 2012) por ovário. In vivo, apenas um pequena minoria dos folículos chega à ovulação (0,1%), enquanto a grande maioria é perdida pelo processo denominado atresia folicular (FIGUEIREDO et al., 2008). A depleção folicular decorre principalmente pela apoptose, processo também conhecido como morte celular programada (KIESS; GALLAHER, 1998). Esse evento acomete tanto folículos pré-antrais quanto folículos antrais (TILLY, 1996; MAGOFFINet al., 2005) e exerce um papel importante no controle e regulação do número de folículos que serão ovulados (KIESS; GALLAHER, 1998, GLAMOCLIJA et al., 2005). Tendo em vista que uma depleção folicular massiva ocorre durante a vida reprodutiva da fêmea, técnicas como a manipulação de oócitos inclusos em folículos ovarianos pré-antrais (MOIFOPA) pode ser aplicada com a finalidade de reduzir o impacto da perda folicular, sobre a reprodução da fêmea. 2.3 BIOTÉCNICA DE MOIFOPA A MOIFOPA consiste essencialmente na preservação pelo frio (criopreservação) e cultivo in vitro dos folículos pré-antrais fora do ambiente ovariano e pode ser uma grande aliada às TRAs, visando a restauração da função ovariana e reprodutiva. Os tópicos e apresentam uma breve descrição e avanços da criopreservação e cultivo de folículos pré-antrais Criopreservação de ovário e folículos pré-antrais A criopreservação tem a função de preservar células, tecidos ou órgãos inteiros usando temperaturas ultra-baixas, a fim de reduzir o metabolismo celular (AMORIM et al., 2011) e pode ser realizada através de dois métodos distintos, isto é, a congelação lenta e a vitrificação. A congelação lenta é caracterizada por uma redução gradual da temperatura, (SANCHES, 2009) e utiliza baixas concentrações de ACPs e uma desidratação celular também de foma gradual. Já na vitrificação os fluidos passam do estado líquido diretamente para um estado sólido amorfo denominado vítreo (YAMAKI et al., 2002), utilizando elevadas concentrações de ACPs, e uma rápida e radical (ACKER; MCGANN, 2003) redução ( C / mim) da temperatura (WOWK, 2010).

22 22 Atualmente, a criopreservação de tecido ovariano tem mostrado resultados satisfatórios para aplicação na reprodução assistida, por preservar um grande número de oócitos (DELA PEÑA et al., 2002). Além disso, a criopreservação de tecido ovariano seguida do transplante permite a revascularização tecidual (ARAV et al., 2005; RAHIMI et al., 2010), bem como a restauração da função reprodutiva. Em países da Europa e Estados Unidos a criopreservação tem sido bastante utilizada em mulheres após tratamentos gonadotóxicos, como a radio e ou quimioterapia contra o câncer (SALLE et al., 2003). As drogas e métodos utilizados nesses tratamentos atuam interrompendo o ciclo de proliferação celular normal (MALTARIS et al., 2009), atingindo não apenas as células cancerosas, mas também as células germinativas saudáveis, responsáveis pela função reprodutiva (BEN-AHARON et al., 2010). Desta forma, a preservação de células germinativas femininas (oócitos) pela criopreservação do tecido ovariano antes desses tratamentos é uma alternativa de grande relevância para mulheres que desejam ter filhos após a cura do câncer. Na espécie humana pelo menos 60 nascimentos (DONNEZ, DOLMANS et al., 2015) já foram relatados após o transplante de tecido ovariano criopreservado. Na grande maioria desses relatos foi utilizada a congelação lenta como técnica de criopreservação. Entretanto, esse método apresenta uma grande probabilidade de injúrias nos tecidos e células causadas pela formação de gelo intracelular, o que não tem sido observado, com a vitrificação. A vitrificação é um método alternativo á congelação lenta para a criopreservação de tecidos e células. Por ser um método ultra-rápido resulta na solidificação sem cristalização, ou seja, sem formação intracelular de cristais de gelo (KEROS et al., 2009). Apesar de fácil execução, a velocidade de redução da temperatura no procedimento de vitrificação é uma etapa crucial, pois deve ser superior à taxa de resfriamento crítico da solução para permitir a formação do estado vítreo antes da organização dos cristais de gelo (POSILLICO et al., 2010). A termodinâmica revela que, se um líquido é resfriado suficientemente rápido, pode-se obter um estado sólido amorfo, conhecido como estado vítreo (RUBINSKY, 2003; BALABAN et al., 2008). Por essa característica, a vitrificação tem sido amplamente utilizada na reprodução assistida, pois além de sua simplicidade e rapidez durante o procedimento (VAJTA et al., 1998), este método não forma cristais de gelo, reduzindo os danos celulares (DELA PEÑA et al., 2002). Várias técnicas de vitrificação como, a convencional por palhetas (SAKI; RAHIM; ZERGANI, 2009), agulhas de acumputura (HASHIMOTO et al., 2010), cobertura direta (CHEN et al., 2006), fiberplug (BEEBE; NOTTLE, 2010, já foram descritas na literatura, na tentativa de maximizar os resultados obtidos. No entanto, todas essas técnicas apresentam

23 23 desvantagens, como o risco de contaminação, no caso de sistemas abertos (WANG et al., 2008), altos volumes da solução de vitrificação como a hemi palheta (KEROS et al., 2009). ou mesmo por utilizar recipientes que não conduzem bem a transferência de temperatura como os criotubos (WANG et al., 2008). Com a finalidade de evitar esses inconvenientes, nossa equipe desenvolveu em 2013, um novo dispositivo (ovarian tissue cryosystem - OTC) para aplicação da técnica de superfície sólida (CARVALHO, et al., 2013) do tecido oavriano caprino. Posteriormente, ao desenvolvimento, esse dispositivo já foi utilizado com bastante sucesso para a vitrificação, não somente de ovários caprinos (CARVALHO et al., 2014, FAUSTINO et al., 2014), mas também em ovários ovinos (BANDEIRA et al., 2015). Apesar da viabilidade da vitrificação do tecido ovariano já ter sido reportada na literatura por diferentes autores, inclusive com relatos ao nascimento em ovinos (BORDES et al., 2005, LONARGE et al., 2006) e humanos (KAWAMURA et al., 2013 SUZUKI et al., 2015) após o transplante do tecido previamente vitrificado, existe ainda uma grande preocupação relacionada ao o risco de reintrodução de células cancerosas a pacientes que superaram a doença. Em se tratando de animais de produção, sabe-se que é bastante inconveniente manter um animal (alotransplantado) em um regime de tratamento imunossupressor de modo a evitar casos de rejeição do enxerto. Além disso, a relação custo/benefício para a produção não é satisfatória. Portanto, admite-se que uma alternativa promissora para evitar essa problemática seja o cultivo in vitro de folículos secundários após a criopreservação do tecido ovariano. O cultivo in vitro de folículos secundários caprinos tem sido realizado com sucesso, inclusive com a obtenção de embriões produzidos in vitro, como mostrado a seguir. Após procedimento de vitrificação e crioestocagem, esses folículos podem ser cultivados in vitro visando seu crescimento e desenvolvimento, retomada da maturação oocitária (LUNARDI et al., 2015) e obtenção de oócitos maturos aptos à fecundação visando a produção in vitro de embriões. Em seguida, esses embriões poderão ser transferidos para obtenção de descendentes viáveis, seja em seres humanos, animais de produção de grande interesse econômico como os caprinos ou até mesmo em animais em risco de extinção Cultivo in vitro de folículos pré-antrais (secundários) isolados do córtex ovariano No que concerne ao cultivo in vitro de folículos pré-antrais, a MOIFOPA é também conhecida como Ovário artificial, e envolve o isolamento ou resgate dos folículos préantrais antes que entrem em processo de atresia e destinados ao cultivo in vitro na tentativa de promover o seu crescimento e desenvolvimento para a obtenção de oócitos maturos ou em

24 24 metáfase II aptos à fecundação para posterior obtenção de embriões produzidos in vitro. (FIGUEIREDO et al., 2007). Embora essa técnica, atualmente, ainda esteja em pleno desenvolvimento, os estudos têm contribuído de forma significativa para a elucidação da foliculogênese inicial (desenvolvimento de folículos pré-antrais), cujo processo ainda não está totalmente elucidado. Apesar disso, os estudos realizados pela equipe do LAMOFOPA na espécie caprina, mostram a viabilidade dessa técnica para o avanço do conhecimento sobre o desenvolvimento folicular, bem como para a reprodução assistida. Tem sido observado notável progresso no cultivo in vitro de folículos pré-antrais em várias espécies. Em suínos (WU et al., 2001), bubalinos (GUPTA et al., 2008), caprinos (SARAIVA et al., 2010; MAGALHÃES et al., 2011), ovinos (LUZ et al., 2012) e primatas não humanos (XU et al., 2011), folículos secundários crescidos in vitro resultaram na obtenção de oócitos maturados, os quais foram fecundados in vitro, com posterior desenvolvimento embrionário. Entretanto, os resultados sobre a taxa embrionária ainda não são satisfatórios e, acredita-se que essas taxas possam ser melhoradas com a descoberta de um meio de cultivo apropriado para o desenvilvimento folicular in vitro. A composição do meio é um importante fator para a obtenção de sucesso durante o cultivo de folículos pré-antrais in vitro. Sabe-se que os folículos podem ser potencialmente influenciados por fatores de crescimento produzidos pelas células do estroma e por outros folículos, ou por fatores (hormônios e fatores de crescimento) produzidos dentro dos próprios folículos (FORTUNE, 2003). Assim, diversos autores têm investigado fatores referentes ao meio de cultivo como a presença de nutrientes e suplementos (SILVA et al.; 2004, PICTON et al., 2008). Dessa forma, a composição do meio é uma importante ferramenta para a obtenção do sucesso do cultivo de FOPA in vitro, visto que, é no meio de cultivo que os folículos encontrarão subsídios necessários para dar suporte ao seu crescimento (TELFER et al., 2000). Com isso, tem se testado fatores ao meio de cultivo como VEGF e FSH (ARAÚJO et al., 2011; SILVA et al., 2014). Acreditamos que é possível a obtenção de resultados semelhantes com o cultivo de folículos secundários após a vitrificação de tecido ovariano, pois, embora existam poucos estudos, LUNARDI et al., (2015) relataram na espécie ovina, que folículos isolados podem ser cultivados com sucesso após a vitrificação. No entanto, acredita-se que o meio de cultivo é um aspecto fundamental para garantir o desenvolvimento folicular in vitro. Considerando os resultados obtidos com o VEGF e FSH que esses compostos sejam essenciais para folículos secundários caprinos Uso do FSH no cultivo de folículos pré-antrais

25 25 O FSH é uma glicoproteína sintetizada e secretada pelas células gonadotróficas na hipófise anterior (BROWN; MCNEILLY, 1999) regulada pelo hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH), bem como por substâncias esteroidais e não-esteroidais produzidas nas gônadas (BERNARD et al., 2010). Esse hormônio é considerado um dos reguladores primários da foliculogênese, sendo responsável por uma variedade de reações que incluem proliferação e diferenciação das células da granulosa, maturação folicular (ADASHI, 1994), síntese de esteroides e expressão de receptores para o fator de crescimento epidermal (EGF), hormônio luteinizante (LH), dentre várias outras substâncias (FORTUNE, 2003). Na espécie bovina, o FSH in vitro, promoveu um aumento do diâmetro de folículos primários e secundários isolados e manteve a sobrevivência (WANDJI et al., 1996) e o crescimento folicular (GUTIERREZ et al., 2000). Em caprinos, a adição de 50 ng/ml FSH ao meio de cultivo de folículos pré-antrais inclusos no tecido ovariano foi responsável pela manutenção da sobrevivência dos folículos, bem como pelo aumento dos diâmetros folicular e oocitário após sete dias de cultivo (MATOS et al., 2007; MAGALHÃES et al, 2009). No que se refere à utilização do FSH no cultivo in vitro de folículos pré-antrais isolados, RODRIGUES et al. (2010) verificaram que o FSH, teve um importante papel no crescimento desses folículos, tanto em caprinos e como em ovinos, após 18 dias de cultivo in vitro. Além disso, SARAIVA et al. (2011) demonstraram que a utilização de concentrações crescentes de FSH (100 ng/ml até o dia 6, 500 ng/ml até o dia 12 e 1000 ng/ml até o dia 18 de cultivo) melhorou o desenvolvimento in vitro de FOPA caprinos. A partir deste estudo, nossa equipe de pesquisa incluiu o FSH como um dos componentes do meio de base para o cultivo in vitro de folúculos pré-antrais, suplementado com o hormônio luteinizante - LH, o fator de crescimento epitelial - EGF (SARAIVA et al., 2010) ou o hormônio do crescimento -GH (MAGALHÃES et al., 2011), sendo possível, portanto, a obtenção dos primeiros embriões caprinos oriundos de folículos secundários isolados cultivados in vitro, relatados na literatura internacional Uso do VEGF no cultivo de folículos pré-antrais O VEGF faz parte de uma família de proteínas composta por pelo menos seis membros (A, B, C, D, E e F) e é conhecido como um importante fator de permeabilidade vascular e mitogénico, sendo responsável por manter a estrutura e aumentar a permeabilidade capilar (REDMER et al., 2001). A expressão desse fator já foi demonstrada em folículos pré-

26 26 antrais e foi identificada em oócitos de folículos primordiais humanos (OTANI et al, 1999; HARATA et al 2006), em folículos primários de ratos (CELIK-OZENCI et al. 2003) e humanos (HARATA et al., 2006), bem como nas células da granulosa e tecais de folículos secundários bovinos (FORTUNE et al., 2007). Estudos in vitro demonstraram que, tanto no folículo, como no fluido folicular, a expressão da proteína VEGF aumenta significativamente de acordo com o estágio de desenvolvimento folicular (BARBONI et al 2000; GREENAWAY et al. 2005). Recentemente, nossa equipe demonstrou que a adição do VEGF ao meio de cultivo melhorou a retomada da meiose do oócito oriundo de folículos secundários caprinos cultivados in vitro (ARAÚJO et al., 2011). Algumas estratégias são empregadas para avaliar a resposta ou desempenho dos folíclos pré-antrais isolados, cultivados in vitro. Através dessas estratégias, é possível avaliar as alterações ocorridas ao longo do cultivo, bem como, monitorar a qualidade folicular e o desenvolvimento folicular, como mostrado no tópico abaixo. 2.4 AVALIAÇÃO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS ISOLADOS APÓS CULTIVO IN VITRO Morfologia e viabilidade folicular O monitoramento da eficiência do cultivo in vitro de folículos ovarianos pré-antrais pode ser realizado através da avaliação de mudanças morfológicas tanto no oócito quanto nas células foliculares (MATOS et al., 2006; MAGALHÃES et al., 2009; ARAÚJO et al., 2010). Portanto, esse tipo de avaliação tem sido amplamente empregado após a descongelação ou aquecimento, tanto do ovário, como dos folículos pré-antrais. No entanto, somente a análise morfológica não é suficiente para garantir uma boa avaliação, sendo necessário, o emprego de outros ensaio como a viabilidade folicular. O uso da microscopia de fluorescência para a análise dos folículos pré-antrais após o cultivo in vitro, vem sendo empregado com sucesso em diversas espécies, principalmente para avaliação da viabilidade celular após cultivo (BRUNO et al., 2009; SARAIVA et al., 2011; SILVA et al., 2011). Para essa finalidade, pode-se fazer uso do marcadores, calceína AM e etídio homodímero-1, que conferem uma marcação dupla, identificando simultaneamente células viáveis e não viáveis, respectivamente. A Calceína-AM, atravessa passivamente a membrana celular, sendo clivada por esterases nas células vivas, e como produto dessa clivagem o componente fluorescente de

27 27 coloração verde é então visualizada (VAN DEN HURK et al., 1998; LOPES et al., 2009). Já o etídio homodímero, é evidenciado somente quando ocorre a perda da integridade da membrana, cessa a atividade da esterase, e o etídio reage com os ácidos nucléicos, produzindo a fluorescência de coloração vermelha (SANTOS et al., 2006; MATOS et al., 2007) Desenvolvimento folicular As técnicas de avaliação do cultivo in vitro permitem o monitoramento da situação (qualidade e atividade) folicular antes e após o cultivo, sendo de grande importância para a melhoria dos sistemas de crescimento in vitro de folículos pré-antrais. A análise do diâmetro folicular tem como objetivo avaliar a dinâmica folicular durante o cultivo in vitro, ou seja seu crescimento que vem acompanhado com a formação da cavidade antral. Vários trabalhos utilizam dessas avalições (MATOS et al., 2007; ARAÚJO et al., 2011; LUNARDI et al., 2015) Proliferação de células da granulosa A análise da proliferação celular pode ser avaliada por técnicas diversas, dentre elas a coloração conhecida como AgNOR e aimunolocalização da proteína Ki67. As regiões organizadoras nucleolares (nucleolar organizer regions - NOR), representam os loops de DNA, os quais são ativamente transcritos para o RNA ribossômico (RNAr) e consequentemente em proteína. As NORs estão associadas com proteínas não histônicas arginofílicas ou argentafins, as quais podem ser visualizadas pela coloração com a prata (GARCIA et al., 2013). Portanto, a coloração de AgNOR é capaz de identificar o RNAr durante a interfase. É no nucléolo que há armazenamento e produção de RNAr, que ligado a várias proteínas formam os ribossomos. O número de NORs mostra a atividade proliferativa, a partir da fase G1, a qual é marcada por intensa produção de proteínas e RNAr. Vários autores têm, atualmente, utilizado a coloração de AgNOR para avaliação do proliferação celular em folículos pré-antrais cultivados dentro (BANDEIRA et al., 2014, CASTRO et al., 2014) ou isolados (LUNARDI et al., 2015) do córtex ovariano. No início da década passada, uma análise detalhada do ciclo celular revelou que o antígeno para a preoteína Ki67 estava presente no núcleo das células em todas as fases do ciclo (G1, S, e G2), inclusive na mitose. Células quiescentes ou em repouso na fase G0 não expressam o Ki67. Devido ao fato do Ki67 está presente em todas as céluals em proliferação

28 28 (células normais ou tumorais), após esse estudo, essa proteína rapidamente se tornou um excelente marcador para determinar a proliferação de uma determinada população celular (SCHOLZEN et al., 2000). Atualmente, vários autores têm utilizado a expressão do Ki67 para avaliação do proliferação celular em folículos pré-antrais (AMORIM., 2013, VANACKER et al., 2013).

29 29 3 JUSTIFICATIVA A criopreservação de tecido ovariano associada ao transplante pós criopreservação tem sido uma técnica proposta para a preservação da fertilidade, bem como da função reprodutiva na espécie humana e em animais de grande valor zootécnico e econômico. A vitrificação como um dos métodos de criopreservação tem apresentado resultados promissores, incluindo o nascimento de indivíduos saudáveis nas espécies murina (WANG et al., 2009), ovina (BORDES et al., 2005) e humana (KAWAMURA et al., 2013, SUZUKI et al., 2015). Apesar disso, a aplicação do transplante em pacientes humanos, pós cura de doenças malignas como o câncer é questionável devido aos riscos de reintrodução de células cancerosas. Já no caso de animais de produção, como os caprinos, a limitação do transplante de tecido ovariano após criopreservação é a inconveniência para o produtor em manter um animal transplantado, ou seja, em regime imunossupressor. Além disso, é um processo economicamente pouco viável. Desta forma, acredita-se que o cultivo in vitro de folículos pré-antrais (secundários) isolados seja uma estratégia promissora para eviatar esses inconvenientes, seja em humanos ou animais de produção. Após procedimento de vitrificação e crioestocagem, os folículos secundários podem ser cultivados in vitro visando seu crescimento e desenvolvimento, retomada da maturação oocitária (LUNARDI et al., 2015) e obtenção de oócitos maturos aptos à fecundação visando a produção in vitro de embriões. Em seguida, esses embriões poderão ser transferidos para obtenção de descendentes viáveis, seja em seres humanos, animais de produção de grande interesse econômico como os caprinos ou até mesmo em animais em risco de extinção. Embora, a literatura tenha mostrado que é possível, obter embriões caprinos após fertilização in vitro, a partir de oócitos oriundos de folículos secundários desenvolvidos in vitro, ainda não foi demosntrado que isso seja possível a partir de folúclos caprinos pós vitrificação. Sabe-se que o desenvolvimento folicular in vitro também depende muito da composição do meio cultivo utilizado. Portanto, considerando os resultados satisfatórios verificados em trabalhos anteriores com a utilização do FHS e VEGF, acredita-se que essas substâncias possam ser empregados no cultivo in vitro de folículos secundários, com sucesso. A utilização da espécie caprina neste trabalho tem um significado tanto para a pesquisa básica, como para a pesquisa aplicada. O ovário caprino é amplamente utilizado como modelo em estudos para a espécie humana, haja vista a similaridade ovariana entre as duas espécies. Além da semelhança com relação à estrutura morfológica e funcional do ovário, o processo de foliculogênese da cabra também apresenta similaridades a esse processo

30 30 observado na mulher. Desta forma, sugere-se que a espécie caprina possa ser utilizada como um modelo translacional para espécie humana. No contexto da reprodução animal, destaque-se que a foliculogênese in vitro já tem sido bastante estudada na espécie caprina, o que nos dá maiores subsídios e informações mais precisas, para uma análise mais segura a cerca do desenvolvimento in vitro de folículos previamente vitrificados. Sob o ponto de vista econômico, a cabra, representa uma importante fonte de proteína para a população humana, seja pela produção de leite ou carne. Portanto, o desenvolvimento de TRAs que venham a contribuir para a preservação da função reprodutiva ou preservação e utilização do material genético de animais valiosos, após a morte do animal, é de grande interesse para o setor agropecuário.

31 31 4 HIPÓTESES CIENTÍFICAS É possível isolar folículos secundários após a vitrificação do córtex ovariano caprino; Folículos secundários isolados do ovário, pós vitrificação, podem se desenvolver in vitro.

32 32 5 OBJETIVOS 5.1 GERAL caprino. Cultivar in vitro folículos secundários isolados, após a vitrificação do tecido ovariano 5.2 ESPECÍFICOS Avaliar a morfologia e a viabilidade de folículos secundários cultivados por seis dias, após a vitrificação do córtex ovariano, utilizando o OTC; Analisar o desenvolvimento folicular (crescimento, formação de antro e proliferação celular) após o cultivo in vitro de folículos secundários isolados, após a vitrificação do córtex ovariano; Investigar o efeito da presença do FSH e VEGF sobre o cultivo in vitro de folículos secundários caprinos, após a vitrificação do córtex ovariano; Avaliar os níveis de ROS após o cultivo in vitro de folículos secundários previamente vitridicados.

33 33 6 CAPÍTULO 1 In vitro growth and development of isolated secondary follicles from vitrified caprine ovarian tissue Periódico: Animal Reproduction Science (Submetido em : 2 de Dezembro de 2015) Fator de impacto: 1.5 e Qualis: A2

34 34 In vitro growth and development of isolated secondary follicles from vitrified caprine ovarian cortex E.S.S. Leal a, L.A. Vieira a, N.A.R. Sá a, G.M. Silva a, F.O. Lunardi a, A.C.A. Ferreira a, C.C. Campello a, B.G Alves a, F.W.S. Cibin b, J. Smitz c, J.R. Figueiredo a, A.P.R Rodrigues a* a Faculty of Veterinary Medicine, LAMOFOPA, PPGCV, State University of Ceara, Fortaleza-CE, Brazil.. b University Federal of Pampa. Uruguaiana-Rio Grande do Sul, Brazil. c Follicle Biology Laboratory, Center for Reproductive Medicine, UZ Brussel, Laarbeeklaan 101, B-1090 Brussels, Belgium.

35 35 Abstract The aim of this study was to evaluate the viability and the development in vitro of isolated secondary follicles cultured in absence (α-mem) or presence of FSH and VEGF (α- MEM+FSH+VEGF) from vitrified caprine ovarian cortex. Ovarian fragments were distributed over five conditions (T1 to T5): fresh isolated secondary follicles were immediately fixed (T1); isolated secondary follicles from the fresh tissue and in vitro cultured in α-mem (T2) or α-mem+fsh+vegf (T3); and isolated secondary follicles from vitrified and in vitro cultured tissue in α-mem (T4) or α-mem+fsh+vegf (T5). After six days of culture, the follicles of treatments (T2, T3, T4 and T5) were evaluated for morphology, viability and follicular development (growth, antrum formation and proliferation of granulosa cells by Ki67 and AgNOR). Furthermore, the reactive oxygen species (ROS) was assessed in the culture medium. Results indicated that morphology of vitrified follicles was altered (P<0.05) when compared with the fresh follicles, oocyte viability, antrum formation and ROS were similar between treatments (P>0.05). The follicular diameter average, overall and daily were highest (P<0.05) in T3. Granulosa cells of follicles in treatments (T1, T2, T3, T4 and T5) marked positive for Ki67. However, the fresh follicles derived from T3 had a significantly higher AgNOR staining (P<0.05) compared to follicles of T1, T2, T4 and T5. In conclusion, secondary follicles can be isolated from vitrified and warmed ovarian cortex and survive and form antrum when growing in an in vitro culture after six days. However, further studies are needed to improve the in vitro growth of isolated secondary follicles after vitrification. Keywords: caprine; isolated follicles; vitrification; follicle development; FSH;VEGF.

36 36 1. Introduction With the advancement of medicine and technology, scientists have been seeking intensively to maintain the survival of cancer patients as well as to preserve the reproductive function of women undergoing gonadotoxic treatments as chemotherapy and/or radiotherapy (Zhou et al., 2010; Nasrabadi et al., 20015), which can lead to ovarian failure (Cecconi et al., 2004), early menopause or even infertility. In this way, the cryopreservation (slow freezing or vitrification) of preantral follicles enclosed in ovarian cortex has been considered as a promising strategy for restoring fertility in women. Although slow freezing has been used successfully for several years, the technique holds a risk of intracellular ice formation, the main responsible for cryoinjury and inducer of changes in morphology and tissue ultrastructure (Wang et al., 2008; Nasrabadi et al., 2015). On the other hand, vitrification, besides being fast, practical and bearing lower cost, enables the solidification of the cryopreservation solution without crystallization and without cryopreservation solution, avoiding the formation of intracellular ice crystals (Bagchi et al., 2008). According to Donnez et al. (2015), until now, more than 40 births have been reported after transplantation of previously cryopreserved ovarian cortex. However, some authors emphasized the risk of reintroducing carcinogenic cells at the time of autograft (Dolmans et al., 2010). Nonetheless, before starting a gonadotoxic treatment, preantral follicles present in ovarian cortex can be cryopreserved for future use. After an indefinite period of cryostorage, these follicles can be recovered (isolated) from the ovarian cortex and cultured in vitro with the aim of obtaining competent oocytes. Although there are no reports about in vitro embryo produced from isolated preantral follicles previously cryopreserved in caprine, our research team has already shown that this is possible using isolated secondary follicles cultured in vitro (Saraiva et al., 2010; Magalhães et al., 2011). Recently, a study using sheep reported that vitrified secondary follicles grew and