UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS LARITZA FERREIRA DE LIMA UTILIZAÇÃO DO HORMÔNIO FOLÍCULO ESTIMULANTE (FSH) HOMEOPÁTICO NO CULTIVO IN VITRO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS OVINOS INCLUSOS EM FRAGMENTOS DE TECIDO OVARIANO FORTALEZA 2011

2 LARITZA FERREIRA DE LIMA UTILIZAÇÃO DO HORMÔNIO FOLÍCULO ESTIMULANTE (FSH) HOMEOPÁTICO NO CULTIVO IN VITRO DE FOLÍCULOS PRÉ- ANTRAIS OVINOS INCLUSOS EM FRAGMENTOS DE TECIDO OVARIANO Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Linha de Pesquisa: Reprodução e Sanidade de Pequenos Ruminantes. Orientador: Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo. Co-orientadora: Profa. Dra. Ana Paula Ribeiro Rodrigues FORTALEZA

3 R672e Lima, Laritza Ferreira de Utilização do hormônio folículo estimulante (FSH) homeopático no cultivo in vitro de folículos pré-antrais ovinos inclusos em fragmentos de tecido ovariano/ Laritza Ferreira de Lima.- Fortaleza, p. Orientador: Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo Co-orientadora: Profa. Dra. Ana Paula Ribeiro Rodrigues Dissertação (Mestrado em Ciências Veterinárias) - Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária 1. Cultivo in vitro. 2. Folículos ovarianos. 3. Homeopatia. 4. FSH I. Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de Veterinária CDD :

4 LARITZA FERREIRA DE LIMA UTILIZAÇÃO DO HORMÔNIO FOLÍCULO ESTIMULANTE (FSH) HOMEOPÁTICO NO CULTIVO IN VITRO DE FOLÍCULOS PRÉ- ANTRAIS OVINOS INCLUSOS EM FRAGMENTOS DE TECIDO OVARIANO Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias. Aprovada em: BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo (Orientador) Universidade Estadual do Ceará - UECE Profa. Dr. Stelio Pacca Loureiro Luna Universidade Estadual de São Paulo - UNESP Dra. Ana Beatriz Graça Duarte Universidade Estudual do Ceará - UECE 4

5 Aos meus pais, Eudázio e Marilac. Dedico... 5

6 AGRADECIMENTOS À Universidade Estadual do Ceará (UECE) e ao Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV) pela capacitação profissional que me proporcionaram, ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo incentivo concedido na forma de bolsa de estudo, além de ter, juntamente com a Rede Nordeste de Biotecnologia (Renorbio), a Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP) e a Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico (FUNCAP) auxiliado financeiramente essa pesquisa. Á Deus por me amparar nos momentos difíceis, me dar força interior para superar as dificuldades, mostrar os caminhos nas horas incertas e me suprir em todas as minhas necessidades. Ao meu orientador Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo, que por acreditar em mim, me mostrou o caminho da ciência. Também o agradeço por sua ajuda, por acreditar no futuro deste projeto e contribuir para o meu crescimento profissional e por ser também um exemplo a ser seguido. À Profa. Dra. Ana Paula Ribeiro Rodrigues por sua inteligência e sinceridade, que contribuiram bastante para o meu crescimento intelectual e profissional. Aos integrantes do LAMOFOPA que de certa forma contribuíram direta e indiretamente na realização deste trabalho. Em especial, à mestranda Anelise Maria Costa Vasconcelos Alves, à doutoranda Rebeca Magalhães e à mestranda Patrícia Magalhães de Andrade que sempre estiveram do meu lado, seja me dando força e apoio, participando diretamente deste trabalho e me ajudando em todos os momentos. À Profa. Juliana Jales de Hollanda Celestino, à Dra. Jamily Bezerra Bruno, à Dra. Márcia Viviane Alves Saraiva e à doutoranda Roberta Nogueira Chaves, cujos ensinamentos durante a iniciação científica despertaram o meu interesse pela pesquisa. Por todo apoio, pela amizade e pelo exemplo de profissionalismo e competência. Ao Professor Cláudio Cabral Campello, por todos os conhecimentos compartilhados, pela disponibilidade e prestatividade. 6

7 À Professora Sônia Nair Báo e sua equipe do Laboratório de Microscopia Eletrônica de Transmissão da Universidade de Brasília (UnB), pela disponibilidade e suporte para a execução da análise ultraestrutural. A todos os amigos da UnB pelo carinho e apoio. Ao Dr. Cláudio Afonso Pinho Lopes pela ajuda e apoio durantes as análises de microscopia eletrônica em Brasília. À banca examinadora, por ter aceitado prontamente o convite e, sobretudo pela sua prestimosa colaboração ao corrigir o presente trabalho. À minha família, a qual amo muito, pelo carinho, paciência e incentivo. Em especial ao meu pai, Franscico Eudázio Nobre de Lima, e minha mãe, Luiza de Marilac da Silva Ferreira, com sua paciência infinita, sua crença absoluta na capacidade de realização deste trabalho e seu auxílio financeiro foram, indubitavelmente, os elementos propulsores desta dissertação. Ao meu namorado, Alexandre Souza Bezerra, meu companheiro nesta trajetória, soube compreender, a fase pela qual eu estava passando. Durante a realização deste trabalho, sempre tentou entender minhas dificuldades e minhas ausências, procurando se aproximar de mim através da própria dissertação, sempre incentivando, apoiando e, o melhor de tudo, sempre me cobrando para que eu continuasse e concluísse mais esta etapa de nossas vidas. Agradeço-lhe, carinhosamente, por tudo isto. 7

8 A mente que se abre a uma nova idéia jamais voltará ao seu tamanho original. Albert Einstein 8

9 RESUMO Diversas biotecnologias estão sendo utilizadas nos ovinos com objetivo de melhorar a produção de embriões, dentre as quais podemos destacar a biotécnica de Manipulação de Oócitos Inclusos em Folículos Ovarianos Pré-Antrais. Entretanto, a literatura mostra que a MOIFOPA tem uma baixa eficiência para obtenção de embriões, além de um alto custo, sendo necessário o uso de alternativas, como por exemplo, a homeopatia. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do hormônio folículo estimulante homeopático (FSHd) sobre a viabilidade, ativação e crescimento in vitro de folículos ovarianos pré-antrais ovinos. Para tanto, fragmentos de córtex ovariano foram cultivados por 1 ou 7 dias (39ºC em estufa; 5% de CO 2 em ar) em α-mem suplementado na ausência ou presença de FSHd ( dinamizado 6, 12, ou 30 vezes em álcool) ou álcool (Al) adicionados em diferentes intervalos (24 ou 48h). Antes e após o cultivo, os folículos pré-antrais foram analisados utilizando histologia clássica, microscopia eletrônica de transmissão e de fluorescência, e classificados em primordiais, transição, primários e secundários, bem como em normais ou atrésicos. Após 7 dias de cultivo, todos os tratamentos testados reduziram significativamente a porcentagem de folículos morfologicamente normais quando comparados ao tecido fresco (controle), exceto o tratamento FSHd6 após um dia de cultivo (P<0,05). Além disso, quando comparados ao α-mem sozinho, somente os tratamentos FSHd6 24h, FSHd12 24h e 48h apresentaram percentuais de folículos normais superiores (P>0,05). Após 1 e 7 dias de cultivo, todos os tratamentos um aumento significativo na percentagem de folículos em desenvolvimento quando comparados ao controle fresco (P>0,05). Já em relação ao α-mem, após 7 dia de cultivo, somente o tratamento FSHd6 24 e 48h diferiu do α-mem (P>0,05). No tocante ao diâmetro folicular e oocitário, foram observados aumentos significativos somente no tratamento Al 24h e FSHd6 24h após 7 dias de cultivo quando comparado ao controle (P>0,05). As análises ultraestrutural e de fluorescência confirmaram a integridade dos folículos cultivados na presença de FSH dinamizado após 7 dias de cultivo. Desta forma, o presente estudo mostrou evidências que o FSHd6 24h atua sobre a foliculogênese inicial em ovelhas, uma vez que promoveu o crescimento in vitro e manteve a viabilidade de folículos préantrais. Palavras-chave: Cultivo in vitro. Folículos ovarianos. Homeopatia. FSH. 9

10 ABSTRACT Several biotechnology are being used in sheep to improve the production of embryos, of which manipulation of oocytes enclosed in preantral follicles (MOEPF). However, the literature shows that MOEPF has a low efficiency to obtain embryos, a high cost, and required the use of alternatives such as homeopathy. The aim of this study was to evaluate the effect of dynamized follicle-stimulating hormone (dfsh) on the viability, activation and in vitro growth of ovarian preantral follicles in sheep. For this purpose, slices of ovarian cortex were cultured for 1 or 7 days (39 C in incubator, 5% CO 2 in air) in supplemented α-mem in the absence or presence of dfsh (6, 12, or 30 times in alcohol) or alcohol (Al) added in different intervals (24 or 48 hours). Before and after culture, the preantral follicles were analyzed using classical histology, transmission electron microscopy and fluorescence microscopy, and follicles were classified as primordial, intermediate, primary and secondary, as well as normal or atretic. After 7 days of culture, all treatments significantly reduced the percentage of morphologically normal follicles when compared to the tissue fresh (control), except FSHd6 treatment after 1 day of culture (p<0.05). When compared to α-mem alone, only FSHd6 24h, FSHd12 24h and 48h showed higher percentages of normal follicles (p<0.05). After 1 and 7 days of culture, all treatments showed a significant reduction in the percentage of primordial follicles with a concomitant increase in the percentage of developing follicles when compared to the fresh control (p<0.05). Compared to α-mem, after 1 day of culture, all treatments significantly reduced the percentage of primordial follicles, but after 7 days, only FSHd6 24 and 48h reduced the number of these follicles (p<0.05). Concerning the follicle and oocyte diameters, significant increases were observed only in Al and FSHd6 treatments (with addition every 24 h) after 7 days of culture when compared to the control, α-mem and the other treatments (p<0.05). The ultrastructural and fluorescence analyses confirmed the integrity of the follicles cultured in the presence of dynamized FSH after 7 days of culture. Thus, this study showed evidences that FSHd6 added every 24 acts on the initial folliculogenesis in sheep, since it promoted the in vitro growth of preantral follicles and the maintenance of their viability. Keywords: In vitro culture. Ovarian follicles. Homeopathy. FSH. 10

11 LISTA DE FIGURAS Figura 1 Figure 1 Figure 2 Figure 3 Figure 4 Estádios do desenvolvimento folicular nas fases pré-antral e antral 23 Experimental protocol for in vitro culture of preantral follicles in medium containing dynamized 6 FSH (d6fsh), 12 (d12fsh) or 30 times (d30fsh), or alcohol (Al) added every 24 or 48h Histological sections after staining with periodic acid Schiffhematoxylin, showing a normal follicle in the fresh control (A), normal follicles after culture with d6fsh (24h) for seven days (B), and degenerated follicles after culture in d30fsh (48h) for seven day (C). Note the retracted oocyte with a pyknotic nucleus (C). O: Oocyte; Nu: oocyte nucleus; GC: granulosa cells (400x, bar = 20 μm) Percentage (mean ± SD) of morphologically normal preantral follicles in fresh control (noncultured) and after culture for 1 or 7 days in the absence or presence of alcohol (Al) or dynamized FSH (dfsh). * Differs significantly from control follicles (p < 0.05); + Differs significantly from α-mem + in each day of culture (p < 0.05); a, b Differs significantly among treatments in each day of culture (p < 0.05); Differs significantly with the progression of the culture period from day 1 to 7 in the same treatment (p < 0.05) 83 Percentage (mean ± SD) of developing follicles in fresh control (noncultured) and after culture for 1 or 7 days in the absence or presence of alcohol (AL) or dynamized FSH (dfsh). * Differs significantly from control follicles (p < 0.05); + Differs significantly from α-mem + in each day of culture (p < 0.05); a, b Differs significantly among treatments in each day of culture (p < 0.05); Differs significantly with the progression of the culture period from day 1 to 7 in the 11

12 same treatment (p < 0.05) 84 Figure 5 Figure 4 Ultrastructural analysis of noncultured preantral follicle (A) and preantral follicle cultured for seven days in medium containing d6fsh (24 h) (B). O: oocyte; GC: granulosa cell; m: mitochondria; v: vacuole; ve: vesicle; nuc: nucleolus; MP: plasma membrane of the oocyte; Mnu: nuclear membrane; Mcg: plasma membrane of the granulosa cell (A and B: bar = 2 µm). Three to five follicles per group were examined and photomicrographs are representative examples...87 Viability assessment of ovine preantral follicles using fluorescent probes. A1) Preantral follicle from the fresh control group classified as viable (A2). B1) Follicle cultured for seven days in medium containing d6fsh (24 h) demonstrating to be viable (B2) after labeling by calcein-am (green fluorescence; bar: 10 µm)

13 LISTA DE TABELAS Tabela 01 Medicamentos homeopáticos utilizados para tratar distúrbios reprodutivos em humanos e animais de produção.60 Table 1 Follicular and oocyte diameters (mean ± SD) in fresh control (noncultured) and after culture for 1 or 7 days in the absence or presence of alcohol (Al) or dynamized FSH (dfsh)

14 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS Al ANOVA: BMP-15: BSA: CH CNPq: CO 2 : dfsh (FSHd) Fig.: FINEP: FOPA FSH: FSHp: FSHR FUNCAP: G GC: Alcohol Analysis of variance (Análise de variância) Bone morphogenetic protein-15 (Proteína Morfogenética-15) Bovine serum albumin (Albumina sérica bovina) Classic Histology (Histologia clássica) Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Dióxido de carbono Dynamized Follicle Stimulating Hormone (Hormônio Folículo Estimulante dinamizado) Figure (Figura) Financiadora de Estudos e Projetos Folículos pré-antrais Follicle Stimulating Hormone (Hormônio Folículo Estimulante) Hormônio Folículo Estimulante porcino Receptor Hormônio Folículo Estimulante Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico Gravidade Granulosa cell (Célula da granulosa) GDF-9: Growth Diferentiation Factor-9 (Fator de Crescimento e Diferenciação-9) GLM: General linear models h: Horas HEPES ITS: KL: kv 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid Insulin, Tranferrin and Selenium (Insulina, Transferrina e Selênio) Kit Ligand Quilovolt 14

15 L: Litro LAMOFOPA: LH: Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Pré-antrais Luteinizing hormone (Hormônio luteinizante) m: Mitochondria (Mitocôndria) M: Molar Mgc: MEM: MET: MF mg: Min: ml: Mm: mm: Mm 3 : MNu MOIFOPA: MP: mui: ng: nm: Nu: Nuc (Membrana Celula da granulosa) Minimum essencial médium (Meio essencial mínimo) Microscopia Eletrônica de Transmissão Microscopia de fluorescência Miligramas Minutes (Minutos) Mililitros Milímetros Milimolar Milímetros cúbicos membrana nuclear Manipulação de Oócitos Inclusos em Folículos Ovarianos Pré-antrais Oócito-membrana plasmática Mili-unidades internacionais Nanogramas Nanômetros Oocyte nucleus (Núcleo oocitário) Nucleolus (Nucléolo) O: Oocyte (Oócito) ºC: Graus Celsius P<0.05: Probabilidade de erro menor do que 5% P>0.05: Probabilidade de erro maior do que 5% 15

16 ph: PPGCV: RENORBIO: rfsh (FSHr): SAS: SD: SNK: TEM: TPM UECE: UK UnB USA: Potencial Hidrogeniônico Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias Rede Nordeste de Biotecnologia Recombinant Follicle Stimulating Hormone (Hormônio Folículo Estimulante recombinante) Statistical analysis system (Sistema de análise estatística) Standard deviation (Desvio padrão) Student-Newman-Keuls Transmission electronic microscopy Tensão pré-menstrual Universidade Estadual do Ceará United Kingdom (Reino Unido) Universidade de Brasília United States of America (Estados Unidos da América) v: Vacuole (vacúolo) (vacúolo) Ve α-mem: α-mem+: µg: µl: Vesicle (vesícula) Alpha minimum essential medium (Meio essencial mínimo alfa) Supplemented Alpha minimum essential medium (Meio essencial mínimo alfa suplementado) Microgramas Microlitros µm Micromolar Μm: Micromêtros %: Percentage (Porcentagem) ±: Mais ou menos Al ANOVA: Alcohol Analysis of variance (Análise de variância) 16

17 BMP-15: BSA: CNPq: CO 2 : Fig.: FINEP: FOPA FSH: dfsh (FSHd) FSHR FSHp: rfsh (FSHr): FUNCAP: G GC: Bone morphogenetic protein-15 (Proteína Morfogenética-15) Bovine serum albumin (Albumina sérica bovina) Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Dióxido de carbono Figure (Figura) Financiadora de Estudos e Projetos Folículos pré-antrais Follicle Stimulating Hormone (Hormônio Folículo Estimulante) Dynamized Follicle Stimulating Hormone (Hormônio Folículo Estimulante dinamizado) Receptor Hormônio Folículo Estimulante Hormônio Folículo Estimulante porcino Recombinant Follicle Stimulating Hormone (Hormônio Folículo Estimulante recombinante) Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico Gravidade Granulosa cell (Célula da granulosa) GDF-9: Growth Diferentiation Factor-9 (Fator de Crescimento e Diferenciação-9) GLM: General linear models h: Horas ITS: KL: Insulin, Tranferrin and Selenium (Insulina, Transferrina e Selênio) Kit Ligand L: Litro LAMOFOPA: LH: Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Pré-antrais Luteinizing hormone (Hormônio luteinizante) m: Mitochondria (Mitocôndria) 17

18 M: Molar MEM: MF MET: mg: Min: ml: Mm: mm: Mm 3 : MNu MP: Mgc: MOIFOPA: mui: ng: nm: Nu: Minimum essencial médium (Meio essencial mínimo) Microscopia de fluorescência Microscopia Eletrônica de Transmissão Miligramas Minutes (Minutos) Mililitros Milímetros Milimolar Milímetros cúbicos membrana nuclear Oócito-membrana plasmática (Membrana Celula da granulosa) Manipulação de Oócitos Inclusos em Folículos Ovarianos Pré-antrais Mili-unidades internacionais Nanogramas Nanômetros Oocyte nucleus (Núcleo oocitário) O: Oocyte (Oócito) P<0.05: Probabilidade de erro menor do que 5% P>0.05: Probabilidade de erro maior do que 5% ph: PPGCV: RENORBIO: SAS: SD: SNK: Potencial Hidrogeniônico Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias Rede Nordeste de Biotecnologia Statistical analysis system (Sistema de análise estatística) Standard deviation (Desvio padrão) Student-Newman-Keuls 18

19 TPM TEM: UECE: UnB USA: Tensão pré-menstrual Transmission electronic microscopy Universidade Estadual do Ceará Universidade de Brasília United States of America (Estados Unidos da América) v: (vacúolo) ve: α-mem: α-mem+: µg: µl: µm: (vesícula) Alpha minimum essential medium (Meio essencial mínimo alfa) Supplemented Alpha minimum essential medium (Meio essencial mínimo alfa suplementado) Microgramas Microlitros Micromêtros µm Micromolar %: Percentage (Porcentagem) ±: Mais ou menos ºC: Graus Celsius 19

20 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA Folículogênese Atresia folicular Aplicações da biotécnica de MOIFOPA Sistemas de cultivo in vitro de folículos pré-antrais (FOPA) Importância da composição do meio para o desenvolvimento 27 folicular in vitro Hormônio Folículo Estimulante (FSH) Estado atual do cultivo in vitro de folículos pré-antrais Técnicas para análise folicular após o cultivo in vitro CAPÍTULO I A homeopatia como alternativa no tratamento de distúrbios reprodutivos e sua utilização nas biotécnicas reprodutivas JUSTIFICATIVA HIPÓTESE CIENTÍFICA OBJETIVOS Objetivo Geral Obejtivos Específicos CAPÍTULO II Hormônio folículo estimulante dinamizado atua no desenvolvimento de folículo pré-antrais ovinos cultivados in vitro CONCLUSÕES PERSPECTIVAS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

21 1 INTRODUÇÃO O ovário mamífero contém milhares de oócitos inclusos em folículos primordiais, porém, somente uma pequena proporção consegue alcançar a ovulação, uma vez que a grande maioria dos folículos morre por atresia (FORTUNE, 1994). Desta forma, o desenvolvimento de sistemas de cultivo que contribuam para a ativação e o crescimento folicular até estádios em que os oócitos estejam competentes para serem maturados e fertilizados in vitro, poderia aumentar a produção in vitro de embriões e facilitar a identificação de fatores que controlam o desenvolvimento de folículos ovarianos. No entanto, para desenvolver tal sistema de cultivo in vitro, faz-se necessária a adição de diferentes fatores de crescimento e hormônios. Dentre os hormônios comumente adicionados ao meio de cultivo e que tem demonstrado bons resultados, destaca-se o Hormônio Folículo Estimulante (FSH). Estudos in vitro têm mostrado que o FSH está envolvido na proliferação celular, formação de antro, síntese de esteróides e expressão de receptores para outras substâncias importantes, como por exemplo, o Hormônio Luteinizante (LH), (GUTIERREZ et al., 2000; NILSSON & SKINNER, 2001; PAKARAINEN et al., 2005; THOMAS et al., 2005). Matos et al. (2007a) demonstraram que a adição de FSH na concentração de 50 ng/ml após cultivo in vitro de folículos pré-antrais caprinos promoveu a manutenção da viabilidade, ativação e crescimento folicular. O cultivo in vitro de folículos pré-antrais é uma biotécnica que possui inúmeras vantagens, no entanto para se tornar economicamente viável no futuro, faz-se necessário minimizar o alto custo do material utilizado, principalmente dos hormônios e fatores de crescimento adicionados ao meio. Diante disso, uma alternativa nunca antes testada no cultivo in vitro de folículos ovarianos que poderá assegurar o baixo custo e a otimização dessas substâncias é a homeopatia. A homeopatia é uma terapia alternativa, que utiliza substâncias extremamente diluídas (KHUDA-BUKHSH, 2006). Tal terapia já vem sendo utilizada há alguns anos em animais de produção para diversas finalidades (ALBERTI et al., 2004; VARSHNEY; NARESH, 2005; SOTO et al., 2008;). No tocante à reprodução, tem sido descrito que medicações homeopáticas podem atuar positivamente no aparelho reprodutor, melhorando a fertilidade e, por conseguinte, a atividade reprodutiva (GERHAR & WALLIS, 2002; LOBREIRO, 2007).

22 Para uma melhor compreensão deste trabalho, a revisão de literatura a seguir fará uma explanação sobre a foliculogênese pré-antral e uma atualização dos avanços relativos ao cultivo in vitro de folículos pré-antrais com ênfase na espécie ovina. Ainda será abordada a importância da utilização da homeopatia como terapia alternativa em distúrbios reprodutivos em animais. Parte dessa revisão deu origem ao artigo intitulado: A homeopatia como alternativa no tratamento de distúrbios reprodutivos e sua utilização nas biotécnicas reprodutivas, submetido no periódico Ciência Animal. 22

23 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Folículogênese: O folículo é considerado a unidade morfológica e funcional do ovário mamífero, que proporciona um ambiente ideal para a sobrevivênica, o crescimento e a maturação do oócito (CORTVRINDT; SMITZ, 2001a). Essa estrutura é composta por um oócito circundado por células somáticas (granulosa e/ou teca). Durante o processo da foliculogênese, a morfologia folicular é alterada devido ao crescimento oocitário, proliferação e diferenciação das células da granulosa e o aparecimento das células da teca (BRISTOL-GOULD; WOODRUFF, 2006). Devido a essa mudança morfológica, os folículos podem ser classificados em dois grandes grupos: pré-antrais ou não-cavitários e antrais ou cavitários (FIGUEIREDO et al., 2008). Os folículos pré-antrais representam mais de 90% da população folicular do ovário (SAUMANDE et al., 1981) e podem ser classificado em primordiais, transição, primários e secundários. Os folículos primordiais encontram-se em estádio de quiescência (CORTVRINDT e SMITZ, 2001a) e são os primeiros folículos formados no ovário, constituindo o pool de reserva dos gametas femininos (QU et al., 2000). A população de folículos primordiais presente ao nascimento acredita-se ser finita, embora esta noção tenha sido contestada com a possibilidade de ocorrer neoogênese após o nascimento (BUKOVSKY et al., 2004). Apesar de alguns folículos primordiais serem estimulados a crescer, a maioria deles permanecerá inativa (MCGEE; HSUEH, 2000). Os folículos primordiais consistem de um oócito primário circundado por uma única camada de células da pré-granulosa de formato pavimentoso, verificando-se apenas uma justaposição do oócito e células da granulosa, sem nenhuma junção específica (LUCCI et al., 2001). Com a ativação, esses folículos saem do estádio de quiescência e passam a se desenvolver para o estádio de folículos primários (VAN DEN HURK; ZHAO, 2005). A ativação folicular é caracterizada pelo aumento do diâmetro oocitário, proliferação das células da granulosa e transformação do formato destas células de achatado para cúbico. Durante esta fase, os folículos que contêm células da granulosa tanto no formato achatado como cúbico são denominados folículos de transição, sendo chamados de primários somente quando todas as células forem cúbicas (LUCCI et al., 2001). Quando duas ou mais camadas de células da granulosa se desenvolvem e as células da teca podem ser evidenciadas do estroma circundante, os folículos secundários 23

24 são formados. Além disso, eles são caracterizados por um oócito circundado por uma zona pelúcida, em que há um aumento no número de microvilos (VAN DEN HURK; ZHAO, 2005). Com o crescimento dos folículos secundários e organização das células da granulosa em várias camadas, ocorre a formação de uma cavidade repleta de líquido denominada antro. A partir deste estádio, os folículos passam a ser denominados terciários. Estes folículos são constituídos por um oócito, circundados pela zona pelúcida, células do cumulus, células da granulosa mural, uma cavidade contendo líquido folicular, uma membrana basal e duas camadas de células tecais. Durante o desenvolvimento folicular, a produção de fluido antral é intensificada pelo aumento da vascularização folicular e permeabilidade dos vasos sangüíneos, os quais estão fortemente relacionados com o crescimento do folículo antral. O desenvolvimento dos folículos antrais é caracterizado por uma fase de crescimento, recrutamento, seleção e dominância (VAN DEN HURK; ZHAO, 2005). Dependendo da espécie, os folículos pré-ovulatórios podem apresentar um oócito secundário e representam o estádio final do desenvolvimento folicular. A formação de folículos pré-ovulatórios é um pré-requisito para a ovulação e produção do corpo lúteo, bem como manutenção da fertilidade (DRUMMOND, 2006) Atresia folicular Apesar da grande população de folículos primordiais presente no ovário, a grande maioria desses folículos não alcança a ovulação, sendo eliminados por atresia (FORTUNE, 1994). A atresia é um fenômeno natural que leva à exaustão do pool de folículos pré-antrais (MORITA; TILLY, 1999) e é comum a todas as espécies domésticas, podendo ocorrer em qualquer estádio do desenvolvimento folicular (GLAMOCLIJA et al., 2005). Nos estádios iniciais da foliculogênese, a atresia é detectada no oócito e em seguida, nas células da granulosa (MORITA; TILLY, 1999), verificando-se o processo inverso em folículos antrais (GLAMOCLIJA et al., 2005). A atresia pode ocorrer por via degenerativa (SAUMANDE et al., 1991) e/ou apoptótica (FIGUEIREDO et al., 2008). A degeneração pode ser observada quando ocorrem alterações no fornecimento de oxigênio e nutrientes para o ovário. Nesta situação, a isquemia pode ser uma das principais causas do desencadeamento da morte folicular (FARBER, 1982), resultando em alterações na permeabilidade da membrana celular. Essas alterações podem levar ao aumento de água intracelular e do volume celular, vacuolização citoplasmática, 24

25 extravasamento do conteúdo celular para o tecido circundante (ELMORE, 2007) e, conseqüentemente, degeneração (BARROS;HERMOSILLA; CASTRO 2001). Já a apoptose é um processo de morte celular individual e ativo, caracterizado pela fragmentação nuclear e pela formação de corpos apoptóticos (RACHID; VASCONCELOS; NUNES, 2000), sem alteração de organelas e liberação dos constituintes celulares para o tecido circundante (ELMORE, 2007). É um evento determinado geneticamente, ou seja, depende do balanço da expressão de genes pró e anti-apoptóticos (BARNETT et al., 2006), e é observado nos folículos ovarianos durante toda a vida fetal e adulta. De acordo com o estímulo apoptótico inicial, a apoptose pode ocorrer através de receptores de superfície celular (receptores de morte), constituindo a via extrínseca, ou ainda através de fenômenos ocorridos na mitocôndria, constituindo esta a via intrínseca. No entanto, há evidências de que os dois caminhos estejam ligados e que as moléculas em uma via podem influenciar a outra (IGNEY; KRAMMER, 2002). Assim, a atresia folicular, seja por meio do processo degenerativo ou apoptótico, leva a morte de 99,9% dos folículos presentes no ovário, fazendo com que este órgão seja de baixíssima produtividade (IRELAND; ATEN; BEHRMAN 1988). Diante disso, vários estudos (ANDRADE et al., 2005, MATOS et al., 2007) têm sido realizados na tentativa de desenvolver um sistema de cultivo que possa promover a ativação e o crescimento folicular in vitro, para evitar assim as perdas foliculares que ocorrem naturalmente in vivo Aplicações da biotécnica de MOIFOPA Para evitar a grande perda folicular in vivo, a biotécnica de MOIFOPA (Manipulação de Oócitos Inclusos em Folículos Ovarianos Pré-Antrais) vem sendo desenvolvida na tentativa de se aumentar a eficiência reprodutiva dos rebanhos. Tal biotécnica visa o resgate dos folículos pré-antrais a partir dos ovários antes que eles se tornem atrésicos, e o posterior cultivo folicular in vitro até a maturação seguida do processo de fecundação, visando proporcionar assim uma produção de embriões em larga escala (FIGUEIREDO et al, 2007). Assim no futuro, a MOIFOPA proporcionaria a multiplicação de animais de alto valor zootécnico ou em vias de extinção, bem como a elucidação dos mecanismos envolvidos na regulação da foliculogênese inicial, atualmente pouco compreendida. Além disso, o fornecimento de uma população homogênea de oócitos oriundos de um mesmo animal proporcionado pela biotécnica de MOIFOPA poderá contribuir também para a 25

26 padronização de técnicas, como a clonagem, fertilização in vitro e transgênese, uma vez que poderiam ser utilizados oócitos em um mesmo estádio de desenvolvimento e de mesma origem (TELFER, 1996). Essa biotécnica também seria de importante aplicação na reprodução assistida de mulheres com problemas de infertilidade, bem como preservar a fertilidade feminina. Nesse caso, os ovários de mulheres, que se submeterão a tratamentos de radio ou quimioterapias, podem ser previamente removidos e congelados para posterior autotransplante ou cultivo in vitro. Além disso, por meio da biotécnica de MOIFOPA também é possível testar in vitro a ação benéfica ou tóxica de fármacos nanoestruturados ou não sobre os folículos ovarianos, antes do seu emprego em experimentos envolvendo seres humanos e ainda animais (FIGUEIREDO et al., 2011) Sistemas de cultivo in vitro de folículos pré-antrais (FOPA) O cultivo in vitro de FOPAs é uma etapa integrante da MOIFOPA que vem sendo largamente empregada. Para tanto, diversos sistemas de cultivo têm sido desenvolvidos no sentido de promover o crescimento e garantir a manutenção da viabilidade de folículos pré-antrais in vitro (VAN DEN HURK et al., 2000). Nesses sistemas de cultivo in vitro, os folículos ovarianos podem ser cultivados inclusos no próprio tecido ovariano (cultivo in situ) ou na forma isolada (cultivo de folículos isolados). No cultivo in situ, pode-se utilizar o ovário inteiro ou fragmentos do córtex ovariano. Em roedores, devido à pequena dimensão e consistência de seus ovários, normalmente é feito o cultivo folicular na forma de órgão inteiro. Entretanto, em primatas e animais domésticos, foi desenvolvido um sistema in vitro com fragmentos de córtex ovariano, uma vez que os ovários destas espécies são muito grandes e com tecido estromal fibroso. No sistema in situ, é possível estudar principalmente os fatores que podem afetar o início do crescimento de folículos primordiais quiescentes, ou seja, a ativação folicular (FORTUNE, 2003) e o crescimento de folículos primários (bovinos: BRAW-TAL & YOSSEFI, 1997; humanos: ZHANG et al., 2004; caprinos: SILVA et al., 2004). Além da praticidade, o cultivo de fragmentos de córtex ovariano tem a vantagem de manter o contato celular e a integridade tridimensional dos folículos (ABIR et al., 2001, ABIR et al., 2006). No cultivo de folículos isolados, geralmente são utilizados folículos secundários, obtidos a partir de métodos mecânicos e/ou enzimáticos (vacas: FIGUEIREDO et al., 1993; cabras: LUCCI et al., 1999; ovelhas: CECCONI et al., 1999; ratas: ZHAO, 2000; 26

27 camundongas: LENIE et al., 2004, PESTY et al., 2007). Esses folículos podem ser cultivados em modelo bidimensional, no qual são cultivados diretamente sobre o suporte de plástico (placa de cultivo) ou sobre uma matriz extracelular como, por exemplo, o colágeno, ou ainda em modelo tridimensional (DEMEESTERE et al., 2005). Esse ultimo modelo possui como vantagem a manutenção da integridade folicular e provavelmente pode auxilar na ativação de mecanorreceptores (XU et al, 2006a, b; WEST et al, 2007; WEST-FARRELL et al, 2009; SMITZ et al., 2010). O cultivo de folículos isolados, independente do tipo, apresenta como vantagens permitir o acompanhamento individual dos folículos durante o cultivo, além de favorecer uma maior perfusão do meio para o folículo (ABIR et al., 2006). Estudos têm demonstrado a utilização de um sistema de cultivo em duas etapas como a melhor escolha, em que a primeira consiste no cultivo in situ dos folículos primordiais até alcançar o estádio secundário, seguida do isolamento e cultivo individual destes folículos até o estádio antral (O BRIEN; PENDOLA; EPPIG, 2003; TELFER et al., 2008; PICTON et al., 2008;). Este tipo de cultivo poderia levar a um maior número de folículos recrutados do estádio quiescente, além de possibilitar o desenvolvimento até estádios foliculares mais avançados (SMITZ et al., 2010). 2.5 Importância da composição do meio para o desenvolvimento folicular in vitro A composição do meio de cultivo é outro fator importante para a obtenção de sucesso durante o cultivo in vitro de folículos pré-antrais. Uma variedade de meios de base tem sido usada para o desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais em muitas espécies. Estes meios podem ser simples, contendo apenas sais inorgânicos e substratos energéticos ou em sua maioria, ser complexos contendo aminoácidos e vitaminas. Dentre os meios mais utilizados, podemos destacar o Meio Essencial Mínimo (MEM - JEWGENOW, 1998, NEWTON et al., 1999); meio Waymouth (MURUVI et al., 2005); meio McCoy s (TELFER et al., 2008) e α-mem (CORTVRINDT; SMITZ; VAN STEIRTEGHEM, 1996; O BRIEN; PENDOLA; EPPIG, 2003; DUARTE et al., 2011; CELESTINO et al, 2011). Esses meios de cultivo geralmente possuem componentes com funções vitais para garantir a viabilidade e o crescimento folicular como: eletrólitos, antioxidantes, aminoácidos, substratos energéticos e vitaminas (PICTON et al, 2008). A disponibilidade 27

28 de substratos energéticos no meio, por exemplo, controla a regulação do metabolismo, o transporte através da membrana plasmática e o potencial de desenvolvimento in vitro de oócitos cultivados (GARDNER et al., 2000). Além desses componentes, esses meios são ainda comumente suplementados com diferentes substâncias incluindo: antibióticos, insulina, transferrina, selênio (WRIGHT et al. 1999), hipoxantina, piruvato e glutamina (JEWGENOW et al., 1998; SILVA et al. 2004), bem como diferentes fatores de crescimento (TELFER et al. 2008) e hormônios (MATOS et al., 2007a, SARAIVA et al., 2011), com destaque para a presença do hormônio folículo estimulante Hormônio Folículo Estimulante (FSH) O FSH é uma gonadotrofina secretada pela adenohipófise, cuja principal função é o desenvolvimento e a maturação gonadal durante a puberdade, além da seleção, recrutamento e desenvolvimento de folículos dominantes (SIMONI et al., 1996; FIGUEREDO et al., 2008). Embora os folículos pré-antrais sejam predominantemente regulados por fatores intra-ovarianos (ROY; TREACY 1993; GONG et al., 1996), já foram detectados receptores para FSH (FSHR) a partir do estádio de folículos primários (MCNATTY et al. 1999, 2000). Estudos mostram uma ação do FSH no crescimento de folículos pré-antrais, tendo, portanto, um papel coadjuvante no controle da fase pré-antral (XU et al., 1995; MCNATTY et al., 1999; GUTIERREZ et al., 2000; WEBB et al., 2003). Além disso, outros estudos demonstraram que o FSH promove crescimento folicular, aquisição de competência meiótica de oócitos, fecundação e desenvolvimento embrionário (HULSHOF et al., 1995; MATOS et al., 2007a, WU et al., 2007). Matos et al. (2007a) demonstraram que a adição de FSH, na concentração de 50 ng/ml, no cultivo in vitro de FOPAs caprinos promoveu a manutenção da viabilidade, ativação e crescimento folicular. Outros estudos afirmam que o FSH age na formação de antro em diferentes espécies (ovinos: CECCONI et al. 1999; bovinos: GUTIERREZ et al. 2000; suínos: MAO et al. 2002; ARUNAKUMARI et al., 2007). Estudos in vitro têm mostrado que o FSH está envolvido na proliferação celular, síntese de esteróides e expressão de receptores para outras substâncias importantes, como por exemplo, o hormônio luteinizante (LH), Kit ligand (KL) e fator de crescimento e diferenciação-9 (GDF-9) (SKINNER, 2001; PAKARAINEN et al., 2005; NILSSON; THOMAS et al., 2005; CHEN et al., 2009). 28

29 O FSH pode ser extraído da urina de mulheres pós-menopáusicas bem como de extrato de hipófise de animais domésticos, como o FSH porcino (pfsh), além de poder ser produzido a partir da tecnologia recombinante (FSHr CALDER, et al. 2003). O FSHr é mais puro e homogêneo, o que poderia propiciar uma maior eficácia nos resultados de crescimento folicular (CLOSSET, et al. 1989). Recentemente, autores demonstraram que o FSHr é mais eficiente do que o FSH urinário ou porcino no crescimento de folículos murinos e caprinos cultivados in vitro (CALONGOS, et al. 2008; MAGALHÃES et al. 2009). Entretanto, esse hormônio recombinante possui um alto custo, sendo necessário o estudo de outras alternativas, como a homeopatia, para tornar o uso desta substância economicamente viável Estado atual do cultivo in vitro de folículos pré-antrais É indiscutível que grandes progressos já tenham sido observados no cultivo in vitro de folículos pré-antrais em diferentes espécies animais. Em felinos (JEWGENOW & STOLTE, 1996) e marsupiais (BUTCHER & ULLMAN, 1996) já foi observado o crescimento de folículos ovarianos pré-antrais isolados após o cultivo in vitro, porém, sem a formação de antro. Nas espécies bovina e humana (ROY & TREACY, 1993; GUTIERREZ et al., 2000; MCCAFFERY et al., 2000;) folículos pré-antrais isolados desenvolveram-se in vitro até o estádio antral. Em suínos, bubalinos, ovinos e caprinos, folículos secundários crescidos in vitro produziram oócitos maturos que foram posteriormente fecundados in vitro resultando em produção embrionária (WU; EMERY; CARREL, 2001; GUPTA et al., 2008; ARUNAKUMARI; SHANMUGASUNDARAM; RAO, 2010; SARAIVA et al., 2010; MAGALHÃES et al., 2011a). Apesar do grande avanço no cultivo in vitro de folículos pré-antrais com as referidas espécies supracitadas, os resultados mais satisfatórios têm sido observados em animais de laboratório. Carrol et al. (1991) obtiveram o nascimento de camundongos após criopreservação, crescimento, maturação e fecundação in vitro de oócitos oriundos de folículos primários. O Brien et al. (2003) obtiveram os melhores resultados de nascimento de camundongos a partir de folículos primordiais desenvolvidos, maturados e fecundados in vitro. Embora existam vários resultados positivos nos estudos que utilizam o cultivo in vitro de FOPA, a produção in vitro de embriões em animais domésticos a partir do oócitos oriundo de FOPA crescidos e maturados in vitro ainda é baixa, variável e de alto custo, sendo inviável para ser utilizado na forma comercial. Faz-se necessário, portanto, a 29

30 realização de estudos para encontrar alternativas para a melhoria da eficiência e a redução principalmente dos custos, que em sua maioria se deve à utilização de fatores crescimento e hormônios. Dessa forma, este trabalho testou a homeopatia visando avaliar se as substâncias homeopáticas poderiam ter efeito sobre o cultivo de FOPA in vitro. No capítulo II desta dissertação, que consiste em um artigo de revisão intitulado A homeopatia como alternativa no tratamento de distúrbios reprodutivos e sua utilização nas biotécnicas reprodutivas, será abordado com mais detalhes a relação da homeopatia com a reprodução. 2.7 Técnicas para análise folicular durante o cultivo in vitro Diferentes métodos que avaliam desde a ativação de folículos primordiais até a completa aquisição da competência oocitária após o cultivo in vitro têm sido utilizados para testar a eficiência de um adequado sistema de cultivo (MATOS et al., 2007b). Dentre eles, pode-se destacar aqueles que permitem a avaliação da qualidade folicular, como por exemplo, a histologia clássica (HC), a microscopia eletrônica de transmissão (MET) e a microscopia de fluorescência. A HC é uma técnica importante para avaliação do cultivo in vitro de folículos préantrais, pois além de permitir uma análise quantitativa, permite ainda verificar a mudança na morfologia das células da granulosa de pavimentosa para cúbica, podendo analisar os diferentes estádios foliculares, além de analisar a integridade morfológica do oócito e das células da granulosa. Essa técnica pode ser realizada tanto em folículos isolados, como naqueles inclusos em fragmentos de córtex ovariano (MATOS et al., 2007b). Entretanto, a HC possui como desvantagens não permitir a avaliação da integridade de membranas e das organelas citoplasmáticas. A MET poderia ser considerada um complemento à HC (MATOS et al., 2007a,b; MARTINS et al., 2008, ROSSETTO et al., 2009; LIMA-VERDE et al., 2010), uma vez que é uma técnica qualitativa e acurada, capaz de permitir a avaliação da integridade de membranas celulares e organelas citoplasmáticas (SALEHNIA; MOGHADAM; VELOJERDI, 2002). Ela se mostra como uma ferramenta valiosa para detectar modificações morfológicas iniciais devido à atresia, as quais podem ser observadas apenas em nível ultraestrutural, antes de se tornarem mais visíveis e possíveis de serem identificadas por microscopia óptica (LUCCI et al., 2001; LOPES et al., 2009). Na microscopia de fluorescência são utilizados marcadores fluorescentes, que 30

31 quando excitados por certos comprimentos de onda, absorvem energia e emitem luz de maior comprimento de onda (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2005). A microscopia de fluorescência é considerada uma técnica confiável, prática e rápida para analisar a viabilidade (CORTVRINDT; SMITZ, 2001b; LOPES et al., 2009), tendo sido, portanto, empregada para avaliação de folículos pré-antrais após o cultivo in vitro em diversos trabalhos (BRUNO et al., 2009; SILVA et al., 2010; MAGALHÃES et al., 2011b). Nesses trabalhos, são utilizadas sondas como a calceína-am, que detecta atividade da esterase intracelular existente em células viáveis, e o etídio homodímero-1, que marca ácidos nucléicos em células não-viáveis, com ruptura na membrana plasmática (LOPES et al., 2009). Dessa forma, essa técnica pode oferecer uma nova ferramenta para investigações metabólicas e de aspectos relacionados ao desenvolvimento folicular in vitro (BRUNO et al., 2009). 3. CAPÍTULO I A homeopatia como alternativa no tratamento de distúrbios reprodutivos e sua utilização nas biotécnicas reprodutivas. 31

32 (Homeopathy as an alternative in the treatment of reproductive disorders and their use in reproductive biotechnologies) Periódico: Ciência Animal (Submetido em agosto de 2011) A homeopatia como alternativa no tratamento de distúrbios reprodutivos e sua utilização nas biotécnicas reprodutivas. (Homeopathy as an alternative in the treatment of reproductive disorders and their use in reproductive biotechnologies) Laritza Ferreira de Lima, 1* Anelise Maria Costa Vasconcelos Alves, 1 Rebeca Magalhães Pedrosa Rocha 1, Juliana Jales de Holanda Celestino 2, Jamily Bezerra Bruno 1, Ana Paula Ribeiro Rodrigues 1, José Ricardo de Figueiredo 1 1)Faculdade de Medicina Veterinária, LAMOFOPA, PPGCV, Universidade Estadual do Ceará, Fortaleza-CE, Brasil. 2) Universidade da Integração Internacional da Lusofonia Afro-Brasileira (UNILAB) 32

33 *Corresponding address: Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV) Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Pré-Antrais (LAMOFOPA) Universidade Estadual do Ceará (UECE) Av. Paranjana, 1700, Campus do Itaperi. Fortaleza CE Brasil. CEP: Tel.: ; Fax: address: laritza_lima@yahoo.com.br (Laritza Ferreira da Lima) RESUMO O processo reprodutivo é composto de uma série complexa de eventos que ocorrem de uma forma ordenada e cronológica. Entretanto, diversos fatores podem interromper o ciclo reprodutivo causando infertilidade ou esterilidade. Neste contexto, o emprego da homeopatia poderia contribuir para a reversão do quadro patológico. Apesar da homeopatia ser uma ciência antiga, desperta ainda uma série de questões e dúvidas quanto à sua eficiência. Diante disso, esta revisão tem como objetivo relatar a importância dos medicamentos homeopáticos na reprodução humana e animal, enfatizando o papel desses medicamentos no tratamento de distúrbios reprodutivos. Palavras-chaves: reprodução, dinamização, fertilidade, homeopatia 33

34 ABSTRACT The reproduction is composed of several complex events that occur in an orderly and chronological way. However, many factors may disrupt the reproductive cycle, thus causing infertility or sterility. In this context, the use of homeopathy may contribute to reverse the pathological condition. In spite of homeopathy being an ancient science, it arises many questions and doubts about its efficiency. Therefore, this review paper aims to report the importance of homeopathic medicines in animal and human reproduction, emphasizing the role of these drugs in the treatment of reproductive disorders. Keys words: reproduction, dynamization, fertility, homeopathy 1. INTRODUÇÃO A homeopatia é uma ciência que foi elaborada por Samuel Hahnemann no século XVIII (Khuda-Bukhsh, 2006). No início, essa ciência era considerada uma terapia alternativa usada no tratamento de algumas doenças que afetavam humanos. Atualmente, ela é considerada um ramo da medicina humana e veterinária, e pode até mesmo ser utilizada no tratamento de pestes agrícolas em plantações (Betti et al., 2003). Essa ciência tem como base a utilização de medicamentos em uma dosagem mínima durante o tratamento, ou seja, na menor quantidade que uma substância poderia ser administrada para evitar seus efeitos colaterais e ainda assim permitir uma resposta regulatória capaz de levar à cura (Trichard, 2003; Teixeira, 2008). A homeopatia é utilizada normalmente para tratar doenças agudas ou crônicas, como mastite, dores de cabeça, infecções recorrentes, problemas digestivos, câncer, problemas psicológicos ou comportamentais. Além disso, os medicamentos homeopáticos podem ser utilizados para tratar distúrbios reprodutivos como a 34

35 esterilidade, bem como para melhorar a taxa de nascimentos após o uso de biotécnicas reprodutivas (Soto et al., 2009; 2010; Sinsen, 2010). Diante disto, esta revisão tem como objetivo abordar a importância dos medicamentos homeopáticos na reprodução humana e animal, enfatizando o seu papel no tratamento de distúrbios reprodutivos e sua utilização na melhoria das biotécnicas reprodutivas. 2. A HOMEOPATIA COMO CIÊNCIA E PRINCÍPIOS BÁSICOS A homeopatia é uma ciência baseada na lei dos semelhantes, que utiliza substâncias extremamente diluídas, em que ocorre a liberação de uma energia terapêutica latente nas substâncias brutas, que agem no campo energético dos seres vivos. Samuel Hahnemann (1790) demonstrou que doses extremamente baixas de determinadas substâncias potencializam o efeito do medicamento, o que resulta numa melhor resposta clínica. Ele acreditava que a "força vital" existente na substância seria liberada pelo processo de diluição para o veículo, o qual se comportaria como medicamento (Hahnemann, 1996; Khuda-Bukhsh, 2006). Acredita-se que isto seja possível devido aos choques mecânicos (sucussões) repetidos em cada fase de preparação em uma série de diluições (Reilly et al., 1986). O ponto de partida para a maioria dos medicamentos homeopáticos é a tinturamãe, um extrato alcoólico da substância original. As substâncias insolúveis, em água ou álcool, são inicialmente trituradas em presença de lactose antes de serem suspensas no solvente alcoólico. Essa solução passa por um processo denominado potenciação que 35

36 consiste em diluições alternadas sucussões (Reilly et al., 1986). Durante o preparo do medicamento homeopático (substância dinamizada), a tintura mãe pode ser diluída em um diluente inerte em séries de dez (1:10) ou em potências múltiplas de dez (1:100) (Castro, 1999). Ao final de todas as potenciações, o medicamento dinamizado pode ser utilizado na presente forma diluída, ou ainda quando aplicável, na forma de comprimidos, grânulos, pó ou outras matérias inertes para ser administrado em seres humanos ou animais (Lockie & Geddes, 1995). Mais tarde, a terapia homeopática foi comprovada em alguns estudos para tratar patologias cardíacas, respiratórias, dentre outras (Biswas & Kuda-Bukhsh, 2002; Pathak et al., 2003; Witt et al., 2005). Em alguns desses trabalhos, as doses do princípio eram tão baixas (30 dinamizações) que as deixavam indistinguíveis do placebo (Reilly et al., 1986; Reilly et al., 1994; Taylor et al., 2000). Nesses casos havia uma melhoria significativa nos sintomas dos pacientes tratados em comparação aqueles que receberam placebo, oferecendo uma prova de que a alta diluição homeopática de um antígeno não pode ser equiparada a um simples placebo (Bellavite et al., 2005). A homeopatia vem sendo utilizada há alguns anos em animais de produção com objetivo de tratar mastites (Varshney et al., 2005) e papilomatoses (Prakash, 1993), substituindo antibióticos, antidiarréicos (Soto et al., 2008), vermífugos (Alberti, 2004) e carrapaticidas (Arenalis, 2002). 2.1 MECANISMO DE AÇÃO Uma série de homeopatas tem proposto hipóteses para explicar o mecanismo de ação da homeopatia. Davenas et al. (1988) relataram a respeito da possível existência da droga ultradiluída em um veículo, sob a forma de molécula de memória, que é capaz de induzir mudanças ao nível do corpo. Essa molécula memória poderia ser explicada pela teoria da física quântica, a qual fala que uma substância seria potencializada pela dinamização, devido à quebra de algumas das suas diminutas partículas do seu átomo que levaria à liberação de sua energia ativa (Davydov, 1994). Outros autores (Lo et al., 2000; Zhou et al., 2000) citam a possibilidade de uma diluição homeopática infinitesimal capaz de manter o poder de ativar o mesmo receptor celular que a substância original da qual foi preparada. Eles se baseiam no fato de que o soluto gera nanoestruturas específicas no solvente que permanecem estáveis. Essas 36