UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS DOUTORADO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS DOUTORADO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS HUDSON HENRIQUE VIEIRA CORREIA CULTIVO IN VITRO DE OÓCITOS MAMÍFEROS: EFEITO DA TEMPERATURA DE TRANSPORTE DE OVÁRIO, DO SISTEMA DE CULTIVO FOLICULAR E DE INIBIDORES DA RETOMADA DA MEIOSE FORTALEZA - CEARÁ 2019

2 HUDSON HENRIQUE VIEIRA CORREIA CULTIVO IN VITRO DE OÓCITOS MAMÍFEROS: EFEITO DA TEMPERATURA DE TRANSPORTE DE OVÁRIO, DO SISTEMA DE CULTIVO FOLICULAR E DE INIBIDORES DA RETOMADA DA MEIOSE Tese apresentada ao Curso de Doutorado em Ciências Veterinárias do Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para à obtenção do título de Doutor em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Orientador: Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo. Coorientadora: Dra. Laritza Ferreira de Lima. FORTALEZA - CEARÁ 2019

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4 HUDSON HENRIQUE VIEIRA CORREIA CULTIVO IN VITRO DE OÓCITOS MAMÍFEROS: EFEITO DA TEMPERATURA DE TRANSPORTE DE OVÁRIO, DO SISTEMA DE CULTIVO FOLICULAR E DE INIBIDORES DA RETOMADA DA MEIOSE Tese apresentada ao Curso de Doutorado em Ciências Veterinárias do Programa de Pós- Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para à obtenção do grau de Doutor em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Aprovado em: 15 de fevereiro de BANCA EXAMINADORA

5 Dedico, A minha Avó, Vera Lucia Magalhães Vieira (in memoriam).

6 AGRADECIMENTOS À Universidade Estadual do Ceará (UECE) e ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV) pela capacitação profissional que me proporcionaram. A Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico (FUNCAP) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo incentivo concedido na forma de bolsa de estudo, pelo auxílio financeiro dessa pesquisa. Ao meu orientador Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo Papito por ter me recebido e orientado de forma competente e dedicada, sempre me fornecendo apoio acadêmico e incentivo profissional. A Dra. Ariella Shikanov por ter me recebido na Universidade de Michigan e me orientado, sempre me fornecendo apoio acadêmico. Dr. Anu David, agradeço pela atenção e ensinamentos durante o período de Doutorado sanduíche nos Estados Unidos. A Dra. Laritza minha mãe profissional, a quem não tenho palavras para agradecer toda ajuda, sempre de forma carinhosa durante o período de Doutorado no Brasil. Aos meus amigos e melhor equipe de trabalho Anna Clara, Naíza, Victor, Jesus e Chefe João por me receber em suas vidas de forma tão generosa. Agradeço pela amizade e por toda ajuda durante o tempo que estiveram no laboratório. Agradeço imensamente pelo ombro amigo, pelas histórias compartilhadas, pelos risos divididos comigo. A minha família, agradeço pelo apoio, carinho e compreensão durante esses anos em que estive ausente. Obrigado em especial a minha avó Vera Lucia Magalhães Vieira (in memoriam) que foi e sempre será um exemplo de vida, alegria, dedicação e força. A minha mãe Rosemeire Magalhães Vieira e ao meu Pai Carlos Henrique Correia que foram meus exemplos de vida, caráter e dedicação. Ao amor da minha vida, Mônica Freitas Miranda Correia, que foi e é a base mais sólida de sustentação que eu poderia ter e que me deu todo apoio e ombro amigo para que eu continuasse forte nesses quatro anos de doutorado. A Deus por estar presente me guiando, dando força, discernimento e protegendo durante todos os momentos desta caminhada. Finalmente, agradeço a todos que aqui não foram citados, mas ajudaram direta ou indiretamente para que essa tese fosse feita.

7 RESUMO Os objetivos da presente tese foram: 1) Determinar o efeito da temperatura de transporte (4 vs 33 ºC) sobre a morfologia, crescimento folicular, viabilidade, maturação oocita ria, e produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) de folículos pré-antrais e antrais iniciais caprinos isolados e cultivados por 18 dias (Fase I); 2) Avaliar as taxas de sobrevivência e ativação de folículos primordiais caprinos após 7 dias de cultivo in vitro em um sistema tridimensional na ausência (folículos primordiais isolados inclusos em Alginato - 0,8%) ou na presença de tecido ovariano (Fase II); 3) Avaliar as taxas de sobrevivência, ativação e crescimento folicular após 7 dias de cultivo in vitro de fragmentos ovarianos babuínos (Fase III) inclusos em diferentes matrizes (Alginato - 1% ou polyethyleneglycol-vinyl sulfone (PEG-VS) - 5%); 4) Investigar o efeito de diferentes concentrações de Cilostamida (10 e 20 µm) e tempos de exposição (6 e 12 horas) durante a MIV de oócitos bovinos e caprinos (Fase IV). Na Fase I, os ovários caprinos foram transportados individualmente em MEM-HEPES a 4 ou 33 C. Posteriormente, os folículos foram cultivados in vitro por 18 dias e os complexos cumulusoócito (CCO) maturados por 32 horas. Na Fase II, os folículos primordiais caprinos inclusos em Alginato (10 folículos/gota), ou envoltos em tecido ovariano (in situ) encapsulado ou não em Alginato, foram cultivados por 7 dias. Na Fase III, os folículos babuínos previamente criopreservados foram cultivados por 10 dias incluso em tecido ovariano (in situ), na presença ou ausência de matrizes extracelulares (PEG-VS vs Alginato) e de FSH. Por fim, na Fase IV, CCOs caprinos e bovinos foram cultivados por 30 horas, iniciando com a adição da Cilostamida (10 ou 20 µm) e/ou parede folicular por 6 ou 12 horas durante a pré-maturação in vitro (PMIV) antes da MIV (24 ou 18h). O melhor resultado para produção de oócitos totalmente crescidos e retomada meiótica foi obtido utilizando baixa (4 C) para folículos préantrais e alta (33 C) para folículos antrais iniciais (Fase I). Folículos primordiais caprinos isolados e encapsulados em Alginato apresentaram maiores percentuais de ativação folicular quando comparado aos demais tratamentos (Fase II). Na Fase III, a adição de FSH ao meio de cultivo no tratamento com matrizes (PEG-VS e Alginato) promoveu uma melhora na sobrevivência dos folículos pré-antrais babuínos inclusos em tecido ovariano após 10 dias cultivo in vitro. Na Fase IV, a combinação da concentração/tempo de exposição à Cilostamida durante a PMIV retardou a progressão meiótica apenas na espécie bovina após 6 e 12 horas de cultivo. Como conclusão, a temperatura de transporte afetou diferencialmente o desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais e folículos antrais iniciais caprinos (Fase I); cultivo de folículos primordiais caprinos isolados e inclusos em Alginato permitiu uma

8 melhor taxa de ativação folicular (Fase II). Em babuínos, utilização de matrizes extracelulares na presença de FSH melhorou a sobrevivência folicular após 10 dias de cultivo in vitro (Fase III). Por fim, na Fase IV, a Cilostamida retardou de forma concentração dependente a retomada da meiose somente na espécie bovina. Palavras-chave: Temperatura de transporte. Matriz extracelular. Pré-maturação in vitro. Ruminantes. Babuíno.

9 ABSTRACT The objectives of this thesis were: 1) To determine the effect of transport temperature (4 vs 33ºC) on morphology, follicular growth, viability and oocyte maturation, and production of reactive oxygen species (ROS) of preantral and early antral follicles goats for 18 days in vitro culture (Phase I); 2) to evaluate follicular survival and activation rates after 7 days of in vitro culture in a three-dimensional system in the absence (isolated primordial follicles and included in Alginate - 0.8%) or in the presence of ovarian tissue (Phase II); 3) To investigate the survival, activation and follicular growth after 7 days of in vitro culture of ovarian fragments of baboons (Phase III) included in different matrices (Alginate - 1% or poly(ethylene glycol)-vinyl sulfone (PEG) - 5%); 4) Investigate the effect of different concentrations of Cilostamida (10 and 20 μm) and exposure times (6 and 12 hours) during IVF of bovine and goat oocytes (Phase IV). In Phase I, goat ovaries were individually transported in MEM-HEPES at 4 or 33 C. Subsequently, the follicles were cultured in vitro for 18 days and cumulus-oocyte (CCO) complexes matured for 32 hours. In Phase II, the primordial goat follicles included in Alginate (10 follicles / drop), or wrapped in ovarian tissue (in situ) encapsulated or not in Alginate, were cultured for 7 days. In Phase III, precryopreserved baboon follicles were cultured for 10 days in ovarian tissue (in situ), in the presence or absence of extracellular matrices (PEG-VS vs. Alginate) and FSH. Finally, in the Phase IV, the goat and cattle COCs were cultured for 30 hours, starting with in vitro prematuration (IVPM) for 6 or 12 hours before IVM (24 or 18h). The best result for the production of fully-grown oocytes and meiotic resumption was obtained using low (4 C) for preantral follicles and high (33 C) for initial antral follicles (Phase I). Phase II results showed that caprine primordial follicles isolated and encapsulated in Alginate presented satisfactory rates of survival and higher percentages of follicular activation when compared to the other treatments. In the Phase III, treatments containing medium supplemented with FSH associated and extracellular matrices (Alginate and PEG-VS) promoted an improvement in the survival of baboon preantral follicles included in the ovarian tissue after 10 days in vitro culture. In the Phase IV, the combination of concentration/exposure time to cilostamide during IVPM delayed the meiotic progression only in the bovine species after 6 and 12 hours of culture. In conclusion, the transport temperature differentially affected the in vitro development of preantral follicles and initial antral follicles (Phase I); the in vitro culture of isolated goat primordial follicles enclosed in Alginate allowed a better rate of follicular activation (Phase II); In baboons, the use of extracellular matrices in the presence of FSH

10 improved follicular survival after 10 days of in vitro culture (Phase III). Finally, in the Phase IV, the cilostamide delayed in a concentration/dependent manner the meiotic resumption in bovine species only. Keywords: Transport temperature. Extracellular matrix. In vitro pre-maturation. Ruminant. Baboon.

11 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Constituição do folículo ovariano. Classificação e desenvolvimento folicular CAPÍTULO 1 - Ovarian transport temperature (4 vs 33 ºC) impacts differently the in vitro development of isolated goat preantral and antral follicles Figure.1. Schematic representation of the experimental design 69 Figure.2. Relationship of oocyte diameter and chromatin configuration (GV, germinal vesicle; GVBD, germinal vesicle breakdow; MI, metaphase I; MII, metaphase II) of preantral (A,B) and antral follicles (C,D) from ovaries previously transported at 4ºC and 33ºC and (E) antral follicles developed in vivo 70 Figure.3. Linear regression analysis of zona pellucida thickness with chromatin configuration (GV, germinal vesicle; GVBD, germinal vesicle breakdow; MI, metaphase I; MII, metaphase II) of oocytes from preantral (A), antral follicles (B), and antral follicles (C) developed in vivo 71 Figure.4. Relationship of zona pellucida thickness and oocyte diameter of preantral (A), antral follicles (B), and antral follicles (C) developed in vivo. Each point observed in the graph is an oocyte subjected to in vitro maturation CAPÍTULO 2 - Activation of goat primordial follicles in vitro: Influence of Alginate and ovarian tissue Figure 1. Experimental design to assess the effect alginate encapsulation on the development of isolated primordial follicle or enclosed in ovarian tissue after 0, 1 or 7 days of IVC 90 Figure 2. Representative images of follicles before (Day 0; A-C) and after IVC for 1 (D-F) or 7 days (G-I) from Fragment, Fragment + Alginate and Follicle + Alginate groups, respectively 90 Figure 3. Percentage of morphologically normal follicles before and after in vitro culture for 1 or 7 days.. 91 Figure 4. Primordial and primary follicles before and after in vitro culture

12 for 1 or 7 days 91 CAPÍTULO 3-3D Poly(ethylene glycol)-vinyl sulfone culture system supports the in vitro growth and differentiation of baboon preantral follicles Figure 1. Representative images of follicles after in vitro culture for 7 (A-E) 14 (B-F) 21 (C-G) 28 (D-H) days from Fragment (A-D), Fragment + PEG (E-H) groups, respectively. (Experiment I) Figure 2. (A-B) Representative images of these follicles enclosed in ovarian tissue fresh (Fresh control) or after vitrified (Vitrified control). (C) Percentage of follicles in fresh ovarian tissue and after vitrification (*P < 0.05). 106 Figure 3. Percentage of follicles in different stage of development in fresh ovarian tissue (Fresh control) and after vitrification (Vitrified control) (*P < 0.05) 107 Figure 4. Percentage of follicles in different stage of development in vitrified ovarian tissue before (non-cultured control-day 0) and after 7 days of culture of fragment without (fragment treatment) or encapsulated in PEG (Fragment + PEG treatment) (*P < 0.05) Figure 5. Representative images of follicles after in vitro culture for 3 (A-D) and 10 (E-H) days from PEG + FSH (A and E), PEG (B and F), ALG + FSH (C and G) ALG (D and H) groups, respectively. (Experiment II) Figure 6. Number of morphologically normal follicles in vitrified ovarian before (non-cultured control-day 0) and after 10 days of culture from PEG + FSH, PEG, ALG + FSH ALG groups 109 Figure 7. Percentage of follicles in different stage of development in vitrified ovarian tissue before (non-cultured control- Day 0) and after 10 days of culture from PEG + FSH, PEG, ALG + FSH ALG groups CAPÍTULO 4 - Cilostamide affects in a concentration and exposure timedependent manner the viability and the kinetics of in vitro maturation of caprine and bovine oocytes

13 Fig. 1. Fig. 2. Fig. 3. Fig. 4. Photographs of the chromatin configuration of oocytes after in vitro maturation (IVM). Characterization of viable oocytes after staining with Hoechst staining under fluorescence shows oocytes with a germinal vesicle (GV), with germinal vesicle breakdown (GVBD), at metaphase I (MI), at metaphase II (MII) and a degenerating oocyte (DEG) 128 Photographs of the viability and chromatin configuration of oocytes after in vitro maturation (IVM). Characterization of a viable oocyte after staining with Ethidium homodimer-1, Calcein- AM and Hoechst The percentage of germinal vesicle (GV) stage bovine (A) and caprine (B) oocytes after IVPM with different exposure times (6 and 12 hours), different concentrations of cilostamide (10 and 20 µm), follicular wall, and the combination of follicular wall and cilostamide (FW + cilostamide) 129 The percentage of metaphase II (MII) bovine (A) and caprine (B) oocytes after (IVPM + IVM - totaling 30 hours of culture) with different exposure times, different concentrations of cilostamide, follicular wall, and the combination of follicular wall and cilostamide (FW+ cilostamide). 130

14 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Principais trabalhos utilizando matrizes de Alginato e Poly(ethylene glycol) - PEG em sistemas de cultivo folicular 3D Tabela 2 - Lista de inibidores específicos da fosfodiesterase CAPÍTULO 1 - Ovarian transport temperature (4 vs 33 ºC) impacts differently the in vitro development of isolated goat preantral and antral follicles Table 1. Percentage of morphologically normal follicles and antrum formation (AF) after in vitro culture of preantral and antral follicles previously transported at 4 and 33 ºC 73 Table 2. Follicular growth rate (µm) (mean ± SEM) after in vitro culture of preantral and antral follicle previously transported at 4 and 33 ºC.. 74 Table 3. Oocyte diameter (mean ± SEM), ZP thickness and oocyte chromatin configuration after in vitro culture of preantral and antral follicles previously transported at 4 and 33 ºC. 75 Table 4. Oocyte diameter (µm) (mean ± SD) according to chromatin status after 32 h of in vitro maturation 76 Table 5. Zona Pellucida thickness (µm) (mean ± SD) according to chromatin status after 32 h of in vitro maturation.. 77 Table 6. Levels of reactive oxygen species (relative fluorescence units) (mean ± SEM) after in vitro culture of preantral and antral follicle previously transported at 4 and 33 ºC.. 78 CAPÍTULO 2 - Activation of goat primordial follicles in vitro: Influence of Alginate and ovarian tissue Table 1: Follicular, oocyte diameters (µm) and volume (mean ± SEM) filled by granulosa cells in preantral follicles subjected to IVC.. 92 CAPÍTULO 4 - Cilostamide affects in a concentration and exposure timedependent manner the viability and the kinetics of in vitro maturation of caprine and bovine oocytes Table 1. In vitro pre-maturation (IVPM) treatments of bovine and caprine oocyte in medium containing different concentrations of cilostamide (10 or 20 µm) and follicular wall alone or in combination after in vitro culture for 6, 12 and 30 hours 131

15 Table 2. Time course of in vitro maturation of caprine and bovine oocyte. 132 Table 3. Logistic regression coefficients and odds ratio (and 95% CI) for factors associated with germinal vesicle rates in caprine and bovine oocytes Table 4. Logistic regression coefficients and odds ratio (and 95% CI) for factors associated with metaphase II rates in caprine and bovine oocytes

16 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS BSA Bovine serum albumin (Albumina sérica bovina) Calceína-AM Calceína acetoximetil CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CO2 Dióxido de Carbono COCs Cumulus oocyte complexes (Complexos cumulus-oócito) DNA Deoxyribonucleic acid (Ácido desoxirribonucleico) Dr. Doutor Dra. Doutora EGF Epidermal growth factor (Fator de crescimento epidermal) FSH Hormônio Folículo Estimulante G Gauge GH Growth hormone (Hormônio do crescimento) GV Germinal vesicle (Vesícula germinal) h Horas HC Histologia clássica IGF-I Insulin-like growth factor-i (Fator de crescimento semelhante à insulina - I) ITS Insulin, tranferrin and selenium (Insulina, transferrina e selênio) IVC In vitro culture (cultivo in vitro) IVM In vitro maturation (Maturação in vitro) kg Quilograma LAMOFOPA Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Pré-Antrais LH Luteinizing hormone (Hormônio Luteinizante) M Molar MEM Minimal essential medium (Meio essencial mínimo) MEM+ Supplemented minimal essential medium (Meio essencial mínimo suplementado) MI Metaphase I (Metáfase I) MII Metaphase II (Metáfase II) min Minutos ml Mililitro

17 MOIFOPA Manipulação de Oócitos Inclusos em Folículos Ovarianos Pré-antrais mrna Messenger ribonucleic acid (Ácido ribonucléico mensageiro) ng Nanograma O2 Oxigênio p < 0.05 Probabilidade de erro menor do que 5% p. Página PDEs Fosfodiesterases PEG-VS PPGCV Polietilenoglicol Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias RVG Rompimento de vesícula germinal SAS Statistical analysis system (Sistema de análise estatística) SD Standard deviation (Desvio padrão) SEM Standard error of means (Erro padrão da média) TCM-199 Tissue culture medium (Meio de cultivo tecidual- 199) U Unidade UECE Universidade Estadual do Ceará VGBD Germinal vesicle breakdown (Quebra da vesícula germinal) α-mem Alpha minimal essential medium (Meio essencial mínimo alfa) μg Microgramas μl Microlitro μm Micrômetro

18 LISTA DE SÍMBOLOS % Porcentagem ~ Aproximadamente < Menor = Igual > Maior ± Mais ou Menos Maior ou igual C Graus Celsius µm Micromolar

19 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO REVISÃO BIBLIOGRÁFICA O OVÁRIO MAMÍFERO OOGÊNESE E FOLICULOGÊNESE REGULAÇÃO DAS DIFERENTES FASES DA FOLICULOGÊNESE Formação dos folículos primordiais Transição de folículos primordiais para primários Progressão de folículos primários para secundários Progressão de folículos secundários para antrais POPULAÇÃO E ATRESIA FOLICULAR MOIFOPA - CULTIVO IN VITRO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS Sistemas de cultivo in vitro Alginato Poly(ethylene glycol)-vinyl sulfone (PEG-VS) Fatores que afetam o cultivo in vitro de folículos pré-antrais Estado atual da biotécnica de MOIFOPA COMPETÊNCIA OOCITÁRIA Maturação Citoplasmática Maturação Nuclear Maturação Molecular CO-CULTIVO DURANTE A MATURAÇÃO IN VITRO (MIV) Co-cultivo de oócitos Co-cultivo com células somáticas Bloqueio temporário da maturação FOSFODIESTÉRASES (PDEs) Fosfodiesterase tipo Fosfodiesterase tipo FERRAMENTAS E PARÂMETROS PARA AVALIAR A EFICIÊNCIA DO CULTIVO IN VITRO JUSTIFICATIVA ESCOLHA DA ESPÉCIE... 49

20 3.2 ESCOLHA DA BIOTÉCNICA DE MOIFOPA E O PROCEDIMENTO DE PRÉ-MATURAÇÃO IN VITRO ORIGINALIDADE DO TRABALHO HIPÓTESE CIENTÍFICA OBJETIVOS GERAL ESPECÍFICOS CAPÍTULO 1 - Ovarian transport temperature (4 vs 33 ºC) impacts differently the in vitro development of isolated goat preantral and antral follicles CAPÍTULO 2 - Activation of goat primordial follicles in vitro: Influence of Alginate and ovarian tissue CAPÍTULO 3-3D Poly(ethylene glycol)-vinyl sulfone culture system supports the in vitro growth and differentiation of baboon preantral follicles CAPÍTULO 4 - Cilostamide affects in a concentration and exposure time-dependent manner the viability and the kinetics of in vitro maturation of caprine and bovine oocytes CONCLUSÃO PERSPECTIVAS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.. 141

21 20 1 INTRODUÇÃO O Brasil tem se destacado mundialmente na produção de bovinos com o segundo maior rebanho comercial no mundo, com aproximadamente 209,5 milho es de cabeças (IBGE, 2010). Em caprinos, essa produção é menos expressiva, com cerca de de cabeças, sendo destas (93%) localizadas na região Nordeste do país (IBGE, 2009). Embora esses números sejam notoriamente expressivos, tanto bovinocultura, mas principalmente a caprinocultura ainda exibe baixos índices de produtividade, o que se mostra diretamente relacionado, dentre outros fatores (por exemplo, manejo sanitário e nutricional deficientes), à elevada rusticidade dos métodos de reprodução comumente adotados. Nesse contexto, faz-se necessária a utilização de biotécnicas reprodutivas sofisticadas a fim de aumentar a eficiência reprodutiva da espécie caprina, e ainda promover a melhoria e preservação da genética desses animais. No entanto, as biotécnicas utilizadas atualmente não otimizam o potencial reprodutivo das fêmeas, sendo necessário o desenvolvimento de biotécnicas alternativas, como a Manipulação de Oócitos Inclusos em Folículos Ovarianos Pré-antrais (MOIFOPA), também conhecida como Ovário Artificial. A MOIFOPA tem por objetivo recuperar folículos pré-antrais antes que se tornem atrésicos e promover o seu crescimento, bem como sua completa maturação, através da utilização de sistemas de cultivo in vitro (FIGUEIREDO et al., 2007). Os folículos pré-antrais constituem a maior parte da população folicular ovariana. No entanto, poucos folículos conseguem desenvolver até o estágio de folículo pré-ovulatório, pois a grande maioria morre por atresia após iniciar o crescimento in vivo (EPPIG; O BRIEN, 1996), reduzindo assim o potencial reprodutivo das fêmeas. Assim, a MOIFOPA, no futuro, será capaz de contribuir, decisivamente, no sentido de oferecer condições propícias para a conservação e multiplicação de animais de alto valor genético e/ou em vias de extinção (FIGUEIREDO et al., 2011), bem como elucidar os mecanismos poucos conhecidos da foliculogênese ovariana. Além disso, a utilização desta biotécnica em modelos animais, como os babuínos, pode auxiliar no incremento da reprodução assistida em humanos, devido à alta similaridade entre as espécies. No entanto, até o presente momento, o resultado mais eficiente obtido pela MOIFOPA foi o nascimento de crias via veis a partir de folículos primordiais crescidos in vitro, fato este que foi alcanc ado apenas em camundongos (O BRIEN et al., 2003). Essa ineficiência da biotécnica pode ser devida a diversos fatores, como a temperatura de transporte dos ovários, o sistema e composição do meio de cultivo, limitando desde a ativação dos folículos

22 21 primordiais até seu completo desenvolvimento, comprometendo a produção in vitro de oócitos fertilizáveis e embriões. Com relação à ativação folicular, diversos pesquisadores têm sugerido que folículos primordiais necessitam de um ambiente rígido, semelhante ao do córtex ovariano para iniciar seu desenvolvimento in vitro (WOODRUFF; SHEA, 2011). Nesse sentindo, diferentes sistemas de cultivo vêm sendo testados (HORNICK et al., 2012; LARONDA et al., 2014), na tentativa de mimetizar o ambiente ovariano, como por exemplo o cultivo de folículos isolados inclusos em uma matriz extracelular como por exemplo o Alginato e o Poly(ethylene glycol)-vinyl sulfone (PEG-VS) (SHIKANOV et al., 2011). No entanto, até o momento, não há na literatura estudos que avaliem os efeitos do sistema de cultivo empregando matrizes extracelulares sobre o desenvolvimento in vitro de folículos primordiais de caprinos e babuínos. Outro fator limitante da MOIFOPA seria a aquisição de oócitos competentes ou maturados ao final do cultivo de folículos pré-antrais mais avançados (secundários) visando um aumento na produção de embriões. Sabe-se que maturação in vitro de oócitos de mamíferos é um processo complexo que envolve a sincronização entre a maturação citoplasmática e maturação nuclear (WATSON, 2007; MAO et al., 2014). Contudo, utilizando o cultivo in vitro de folículos secundários ainda não foi possível desenvolver um sistema que garanta o crescimento completo do oócito e uma perfeita e sicronização da maturação. Dessa forma, faz-se necessário desenvolver um sistema que permita aquisição da sincronização entre a maturação citoplasmática e nuclear in vitro. Para uma melhor compreensão deste trabalho, a revisão de literatura a seguir abordará aspectos relacionados à foliculogênese, população e atresia folicular, cultivo in vitro de folículos pré-antrais e seu estado atual, a importância dos sistemas de cultivo in vitro, competência oocitária, co-cultivo durante a maturação in vitro e inibidores da maturação nuclear.

23 22 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 O OVÁRIO MAMÍFERO Em todas as espécies mamíferas, o ovário é composto de duas regiões distintas, uma cortical e outra medular, e é circundado externamente por uma superfície epitelial, comumente conhecida como epitélio germinativo. A região medular é localizada na porção mais interna do ovário, com exceção dos equídeos, e contém nervos, vasos sanguíneos e linfáticos responsáveis pela nutrição e sustentação do ovário. Já o córtex ovariano é composto de tecido conjuntivo (fibroblastos, colágeno e fibras reticulares), folículos ovarianos em diferentes estágios de desenvolvimento, bem como corpos lúteos, albicans e hemorrágicos. O ovário desempenha duas funções prioritárias para o sistema reprodutivo das fêmeas, sendo responsável pela diferenciação e liberação de um oócito maturo para a fecundação (MCGEE; HSUEH, 2000), bem como pela síntese e secreção de hormônios (HIRSHFIELD, 1991). Tais eventos caracterizam, respectivamente, as funções gametogênica e endócrina do ovário. 2.2 OOGÊNESE E FOLICULOGÊNESE A oogênese consiste na formação e diferenciação das células germinativas primordiais (CGP) até a formação do oócito haplóide fecundado. Este processo inicia-se antes e termina após o processo de foliculogênese (VAN DEN HURK; ZHAO, 2005). O início do desenvolvimento ovariano em mamíferos é caracterizado pela migração das CGPs a partir do saco vitelínico para a gônada primitiva, com sua posterior colonização (BRISTOL-GOULD; WOODRUFF, 2006). As CGP migram para a crista genital e colonizam a gônada ainda indiferenciada, onde recebem a denominação de oogônias e começam a multiplicar-se por divisões mitóticas, formando ninhos de oogônias interligados por pontes intercelulares (PEPLING, 2006). Posteriormente, as oogônias entram na primeira divisão meiótica e param no estádio de diplóteno, sendo chamadas de oócitos primários, os quais apresentam-se com seus núcleos em vesícula germinativa (VG) (FIGUEIREDO et al., 2011). Em seguida, os oócitos perdem suas pontes intercelulares e são circundados por uma camada de células somáticas planas, também conhecidas como células da pré-granulosa, originárias do mesonefron e/ou epitélio ovariano (MCNATTY et al., 2000). A partir desse momento, são formados os folículos primordiais, dando início ao processo de foliculogênese. O folículo, por sua vez, é considerado a unidade morfofuncional do ovário, cuja função é proporcionar um

24 23 ambiente adequado para a sobrevivência, o crescimento e a maturação do oócito, mantendo sua viabilidade (CORTVRINDT; SMITZ, 2001). A foliculogênese é um processo complexo que envolve a formação, o crescimento e a maturação folicular sob a ação de hormônios e fatores de crescimento. O processo de foliculogênese tem seu início com a formação dos folículos primordiais, culminando com a geração dos folículos pré-ovulatórios ou de De Graaf (VAN DEN HURK; ZHAO, 2005; FIGUEIREDO et al., 2011). Durante o seu desenvolvimento, a estrutura folicular sofre alterações devido ao crescimento oocitário, diferenciação e multiplicação das células da granulosa e teca (HONDA et al., 2007), sendo os folículos classificados em pré-antrais (primordial, primário e secundário) e antrais (terciários e pré-ovulatórios) (FIGUEIREDO et al., 2011). Na maioria das espécies, os folículos pré-ovulatórios são caracterizados por apresentarem um oócito maturo no momento da ovulação. A maturação oocitária consiste em uma etapa crucial pela qual o oócito sofre modificações citoplasmáticas, completa sua primeira divisão meiótica (maturação nuclear), progredindo até a metáfase II (MEHLLMANN, 2005). Este processo é composto por inúmeras modificações estruturais e moleculares no citoplasma (maturação citoplasmática). Didaticamente, essa maturação citoplasmática pode ser subdivida em: redistribuição das organelas, dinâmica dos filamentos do citoesqueleto e maturação molecular. Figura 1 - Constituição do folículo ovariano. Classificação e desenvolvimento folicular. Fonte: Elaborado pelo autor.

25 REGULAÇÃO DAS DIFERENTES FASES DA FOLICULOGÊNESE Formação dos folículos primordiais Evidências sugerem o envolvimento de importantes moléculas e fatores de transcrição na formação dos folículos primordiais. Dentre estes, pode-se destacar o fator de linhagem germinal α (FIGα), detectado em oócitos ainda na fase embriona ria e considerado um dos primeiros fatores identificados com atuação efetiva nesse processo. Experimentos com camundongos knockout para o gene do FIGα têm revelado que este fator é crucial para a formac ão de folículos primordiais, uma vez que a inibic ão de FIGα funcional resultou na ausência de folículos primordiais ao nascimento e consequente esterilidade (SOYAL; AMLEH; DEAN, 2000). Outro fator que vem demonstrando importante papel durante o processo de formação folicular é o LHX8 (CHOI et al., 2008). Esse fator está envolvido no padrão de formação e sobrevivência do folículo primordial, sendo preferencialmente expresso no oócito de ovários de camundongas. Estudos recentes demonstraram que camundongas com ausência de expressão de LHX8 falharam em manter os folículos primordiais e que estes desapareceram na primeira semana de vida (CHOI et al., 2008). Após a formação dos folículos primordiais, os oócitos sofrem uma parada da meiose no estádio de diplóteno ou VG (prófase I) e as células da pré-granulosa interrompem sua multiplicação, atingindo uma fase de quiescência. A progressão da divisão meiótica ocorre somente na puberdade, com o pico pré-ovulatório dos hormônios folículo estimulante (FSH) e luteinizante (LH), formação dos oócitos secundários e outra parada da meiose na fase de metáfase II (FIGUEIREDO et al., 2011). A meiose será retomada novamente somente após a fecundação do oócito pelo espermatozóide, originando, ao final, o oócito haplóide fecundado (FIGUEIREDO et al., 2011). Estudos in vitro sugerem que hormônios como a progesterona e o estrógeno inibem a formação folicular (KEZELE; SKINNER, 2003) e que mudanças nos níveis desses hormônios nos ovários em desenvolvimento contribuem para regular o momento do processo de formação dos folículos primordiais (CHEN et al., 2007; NILSSON; SKINNER, 2009). Aliado a isto, Nilsson et al., (2011) reportaram o envolvimento do hormônio anti-mulleriano (AMH) na inibição da formação folicular, destacando o seu papel na redução do tamanho da reserva inicial de folículos primordiais em ovários de ratas. Em mamíferos, os folículos primordiais representam cerca de 95% da grande totalidade de folículos presentes no ovário. Até alguns anos atrás, acreditava-se que os

26 25 folículos primordiais formados durante a vida intrauterina ou logo após o nascimento (roedores) constituíam o pool de células germinativas disponíveis durante toda a vida reprodutiva de uma fêmea (EPIFANO; DEAN, 2002). Contudo, estudos mais aprofundados acerca desse tema demonstraram mecanismos envolvidos na síntese de novos oócitos e folículos no ovário de mulheres (BUKOVSKY et al., 2004) e camundongas (JOHNSON et al., 2004, 2005) durante a vida adulta, por meio de células germinativas intra e extraovarianas, questionando a idéia do estoque finito de folículos ao nascimento. Atualmente, a possibilidade da nova formação folicular (ou neofoliculogênese) tem se tornado algo bem estabelecido mundialmente, uma vez que estudos recentes associando técnicas in vitro e in vivo têm comprovado, em ovários de camundongas (ZOU et al., 2009) e mulheres (WHITE et al., 2012), o surgimento de novos oócitos e folículos a partir de células-tronco germinativas ovarianas, resultando até mesmo na obtenção de nascimentos em camundongas após a fecundação desses oócitos (ZOU et al., 2009) Transição de folículos primordiais para primários Os folículos primordiais podem permanecer meses a anos em estado quiescente até serem recrutados para iniciar o crescimento (OKTEM; URMAN, 2010; NILSSON et al., 2011). O início do crescimento dos folículos primordiais, também conhecido como ativação, caracteriza-se pelo início do crescimento oocitário, multiplicação das células da granulosa e transformação da morfologia dessas células da forma pavimentosa para a cúbica (AERTS; BOLS, 2010a). Quando o oócito é circundado por uma camada completa de células da granulosa de morfologia cúbica, os folículos atingem um estágio mais avançado de desenvolvimento e são classificados como primários (GOUGEON; BUSSO, 2000). Nesse tipo de folículo, as células da granulosa aumentam em número e tornam-se mais volumosas, passando a manter um estreito contato com o oócito mediado por endocitose (VAN DEN HURK; BEVERS; BECKER, 1997). Na espécie caprina, os folículos primários possuem diâmetro de aproximadamente 50 µm e são inicialmente observados por volta do 71 dia de vida fetal (BEZERRA et al., 1998). Sabe-se que o desenvolvimento folicular inicial, incluindo a transição de folículo primordial para folículo primário, é independente de gonadotrofinas e que é regulado, principalmente, por fatores intraovarianos (VAN DEN HURK; ZHAO, 2005). Diversos estudos comprovaram que (PICTON; BRIGGS; GOSDEN, 1998; FORTUNE, 2003; AERTS; BOLS, 2010a), a ativação de folículos primordiais é controlada por um delicado balanço entre

27 26 fatores inibitórios e estimulatórios presentes no próprio ovário. Nesse sentido, tem sido sugerido que a prevalência de fatores inibitórios no ambiente ovariano influencia a permanência dos folículos primordiais em seu pool de reserva, bloqueando a progressão folicular, e contribuindo para a preservação da vida reprodutiva das fêmeas (FORTUNE et al., 1998; BROEKMANS et al., 2007). Pesquisas nesse tema, utilizando camundongos geneticamente modificados, têm de fato relatado a atuação de algumas moléculas inibidoras da ativação folicular, incluindo a Tsc-1, PTEN, Foxo3a, p27 e Foxl2. De acordo com tais pesquisas, a perda da função dessas moléculas inibitórias resultou na ativação prematura do pool de folículos primordiais (CASTRILLON et al., 2003; RAJAREDDY et al., 2007; REDDY et al., 2008), causando uma inevitável exaustão da reserva folicular e falha ovariana prematura. Outra importante substância intraovariana de ação inibitória é o AMH. Esse hormônio é um dos membros da superfamília do fator de crescimento transformante β (TGFβ) e é sintetizado pelas células da granulosa de folículos em crescimento (WEENEN et al., 2004). Em camundongos nocaute para o gene do AMH, verificou-se um aumento no recrutamento de folículos primordiais, associado a um maior número de folículos em crescimento no ovário (DURLINGER et al., 1999, 2002). Tais achados foram posteriormente reforçados por estudos utilizando folículos de vacas (GIGLI et al., 2005) e mulheres (CARLSSON et al., 2006), os quais também constataram o papel inibitório do AMH sobre o crescimento dos folículos primordiais. Contudo, apesar da maioria dos trabalhos convergirem para tal efeito do AMH, existem relatos na literatura que defendem a atuação positiva desse hormônio no início do desenvolvimento de folículos primordiais em humanos (SCHMIDT et al., 2005). Além dos sinais inibitórios que bloqueiam a ativação prematura dos folículos primordiais, há também outros sinais no ovário, os estimulatórios, que promovem a transição desses folículos para o estágio primário. Tais sinais correspondem, principalmente, a fatores de crescimento originados de diferentes compartimentos foliculares, incluindo oócitos, células somáticas (granulosa e teca) e estroma, que atuam de maneira coordenada e sinérgica para promover o início do crescimento dos folículos (OKTEM; URMAN, 2010). Dentre os fatores de crescimento conhecidamente efetivos na ativação de folículos primordiais, destaca-se o kit ligand (KL). O KL é sintetizado pelas células da granulosa e atua em seu receptor (c-kit) expresso no oócito e células intersticiais/tecais (PARROTT; SKINNER, 1999; NILSSON; SKINNER, 2001), regulando o início do crescimento folicular. Aliado a isto, o KL exerce um efeito antiapoptótico sobre as CGP, oogônias, oócitos e folículos pré-antrais, e ainda controla

28 27 o crescimento dos oócitos e o recrutamento de células da teca (DRIANCOURT et al., 2000; HUTT; MCLAUGHLIN; HOLLAND, 2006). O fator inibidor de leucemia (LIF) e o fator de crescimento fibroblástico 2 (FGF-2 ou FGF básico), sintetizados pelas células da granulosa e pelo oócito, respectivamente, também possuem papel comprovado na ativação dos folículos primordiais, sendo capazes ainda de estimular a expressão do KL nas células da granulosa e, deste modo, otimizar o crescimento de folículos até o estágio primário (NILSSON; KEZELE; SKINNER, 2002) Progressão de folículos primários para secundários Com o crescimento dos folículos primários, inicia-se a formação dos chamados folículos secundários (PICTON; BRIGGS; GOSDEN, 1998). Estes folículos são caracterizados pela presença de duas ou mais camadas de células da granulosa cúbicas localizadas em torno do oócito, bem como pela formação de uma camada de células tecais envolvendo a membrana basal folicular (VAN DEN HURK; ZHAO, 2005). À medida que o folículo cresce, a camada de células tecais se estratifica e se diferencia em duas partes distintas. A parte mais periférica, denominada teca externa, composta de células não diferenciadas, ao passo que as células localizadas mais internamente, formando a teca interna, contêm algumas células precursoras de fibroblastos capazes de se diferenciar e secretar esteróides (GOUGEON, 2010). As células da teca interna correspondem à porção vascularizada do folículo e são definidas quando há a formação de quatro ou mais camadas de células da granulosa (LUCCI et al., 2001). Outra importante característica que marca a passagem de folículos primários para o estágio de folículos secundários corresponde à nítida identificação da zona pelúcida ao redor do oócito (LUCCI et al., 2001; VAN DEN HURK; ZHAO, 2005). Além disso, nos folículos secundários as células da granulosa apresentam uma extensiva rede de junções do tipo gap ou junções intercomunicantes, que correspondem a canais membranários que permitem a passagem de nutrientes, íons inorgânicos, segundos mensageiros e pequenos metabólitos entre as células (KIDDER; MHAWI, 2002; GOUGEON, 2010), fundamentais para manter a funcionalidade do folículo. Nesse estágio, os oócitos entram em extensiva fase de crescimento, resultando em uma complexa organização citoplasmática dependente da síntese de novos produtos gênicos e organelas, bem como da modificação e redistribuição das organelas já existentes (PICTON; BRIGGS; GOSDEN, 1998). Além do expressivo aumento no número de ribossomos, mitocôndrias e outras organelas, os oócitos em crescimento

29 28 acumulam grânulos glicogênicos, proteínas e lipídios e sofrem ainda um incremento na síntese de RNA e proteínas, considerados importantes para garantir a futura competência meiótica (VAN DEN HURK; ZHAO, 2005). O desenvolvimento de folículos secundários com multicamadas a partir de folículos primários é um processo lento que pode demandar meses. Vários estudos in vivo e in vitro têm demonstrado que o número de folículos secundários, seu tamanho, número de células e taxa de atresia são influenciados por gonadotrofinas, das quais o FSH é o fator de sobrevivência predominante, atuando ainda no estímulo à formação de junções gap entre as células da granulosa (VAN DEN HURK; BEVERS; BECKERS, 1997; VAN DEN HURK et al., 2000). Embora os folículos primários e secundários sejam responsivos às gonadotrofinas, estes podem se desenvolver com níveis mínimos de FSH circulante ou na ausência de receptores funcionais para esse hormônio, o que torna duvidoso o significativo papel in vivo do FSH nessa fase (VAN DEN HURK et al., 2000; VAN DEN HURK; ZHAO, 2005; OKTEM; URMAN, 2010). Por outro lado, diversos fatores intraovarianos, neurotrofinas e neurotransmissores vêm demonstrando relevante atuação na formação de folículos secundários em diferentes espécies. Entre as neurotrofinas e neurotransmissores, o NGF e o peptídeo intestinal vasoativo (VIP), respectivamente, têm se mostrado bons candidatos para estimular a transição de folículos primários para secundários. Na presença de níveis séricos normais de FSH, ovários de camundongas deficientes em NGF exibiram números acentuadamente reduzidos de folículos primários e secundários, havendo ainda uma marcada diminuição na proliferação de células da granulosa após o cultivo dos tecidos ovarianos dessas camundongas (DISSEN et al., 2001). O VIP também tem sido apontado como um importante regulador do desenvolvimento de folículos primários e secundários iniciais em bovinos (HULSHOF et al., 1994), além de ter sido implicado na função esteroidogênica das células da granulosa em estágios foliculares iniciais e mais avançados em roedores (MCGEE; HSUEH, 2000). Além destas substâncias, Yang e Fortune (2006, 2007) relataram ainda a influência da testosterona e do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) na transição de folículos primários para secundários, o que foi constatado após cultivos in vitro utilizando folículos pré-antrais bovinos. Dentre os fatores de crescimento envolvidos na formação dos folículos secundários, pode-se dar enfoque ao GDF-9 e à BMP-15. Tais substâncias são consideradas essenciais para a progressão até folículos secundários, uma vez que animais geneticamente deficientes para esses fatores mostraram um bloqueio do desenvolvimento folicular além do

30 29 estágio de folículo primário (DONG et al., 1996; MCNATTY et al., 2007). Além disso, diversos estudos recentes em folículos pré-antrais caprinos evidenciaram a importância da atuação do GDF-9 (MARTINS et al., 2008) e da BMP-15 (CELESTINO et al., 2011) na progressão de folículos primários até o estágio secundário in vitro, destacando ainda os seus efeitos positivos sobre a manutenção da viabilidade folicular nesta fase. Além desses fatores, o KL também tem sido associado a uma série de eventos relativos à formação dos folículos secundários, incluindo a proliferação das células da granulosa, regulação da esteroidogênese e recrutamento de células da teca (PARROTT; SKINNER, 1997, 2000; REYNAUD et al., 2000). Por meio do estímulo de alguns fatores, como a BMP-15 e o LIF, o KL sofre aumento da sua expressão nas células da granulosa (OTSUKA; SHIMASAKI, 2002; NILSSON; KEZELE; SKINNER, 2002), o que pode culminar na influência positiva do KL sobre a formação dos folículos secundários (DRIANCOURT et al., 2000). Vários outros fatores de crescimento intraovarianos, como o TGF-β, fator de crescimento epidermal (EGF), ativina e FGF-2, têm sido implicados na formação, desenvolvimento e também sobrevivência de folículos secundários em roedores e espécies domésticas, o que tem sido constatado por meio de estudos in vitro que identificaram a influência positiva destas substâncias sobre a proliferação das células da granulosa e/ou inibição da apoptose celular (ZHOU; ZHANG, 2005; OKTEM; OKTAY, 2007). Em contraste, outros estudos apontam o papel negativo do AMH não somente na formação e ativação folicular, mas também no desenvolvimento de folículos primários até o estágio secundário e demais estágios foliculares (OKTEM; URMAN, 2010) Progressão de folículos secundários para antrais Após o crescimento dos folículos secundários e organização das células da granulosa em várias camadas, ocorre a formação de uma cavidade repleta de líquido folicular denominada antro. A partir deste estágio, os folículos passam a ser denominados antrais ou cavitários. O crescimento dos folículos durante a fase antral é caracterizado pela proliferação e diferenciação das células da granulosa e da teca, aumento da vascularização folicular, crescimento do oócito e aumento do espaço contendo o fluido antral. Tal fluido corresponde ao ambiente ao qual o oócito é submetido durante o seu desenvolvimento e maturação e é composto de substâncias reguladoras derivadas do sangue ou de secreções das células foliculares (VAN DEN HURK; ZHAO, 2005). Entre essas substâncias, estão presentes

31 30 gonadotrofinas, esteróides, fatores de crescimento, enzimas, proteoglicanas e lipoproteínas, consideradas fundamentais para a determinação da qualidade oocitária (WU et al., 2007). Os sinais e mecanismos que regulam a formação da cavidade antral durante o desenvolvimento dos folículos secundários ainda não são plenamente compreendidos. Contudo, sabe-se que além da participação de aquaporinas presentes nas células da granulosa, bem como de ácido hialurônico e versicano produzidos por essas células, há ainda o envolvimento de hormônios e fatores de crescimento na formação antral (VAN DEN HURK; ZHAO, 2005; RODGERS; IRVING-RODGERS, 2010). De fato, estudos in vitro utilizando FSH (MAO et al., 2002; SARAIVA et al., 2011), LH (CORTVRINDT; HU, SMITZ, 1998), hormônio do crescimento (GH - MAGALHÃES et al., 2011), fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1 - MAGALHÃES-PADILHA et al., 2012), ativina (ZHAO et al., 2001), KL (REYNAUD et al., 2000) e EGF (GUTIERREZ et al., 2000) têm comprovado os efeitos destas substâncias na formação de antro em folículos secundários em crescimento. Aliado a isto, outros fatores locais, como o TGF-β (LIU et al., 1999), FGF-2 (ROBERTS; ELLIS, 1999), GDF-9 (HAYASHI et al., 1999) e BMP-15 (OTSUKA et al., 2000) têm sido considerados estimuladores da proliferação das células da granulosa nesta fase, evento fundamental para a ocorrência da progressão folicular. Em ratas, bovinos e primatas, o neutransmissor VIP foi apontado ainda como um importante regulador do desenvolvimento de folículos secundários (VAN DEN HURK et al., 2000; MCGEE; HSUEH, 2000). Os folículos antrais são primeiramente observados em ovários caprinos no 110 dia de crescimento fetal (BEZERRA et al., 1998). É importante destacar que pequenos folículos antrais podem ter diâmetros similares aos dos folículos secunda rios (~200 μm), embora aumentem rapidamente em tamanho com o contínuo acúmulo de fluido folicular (BRISTOL-GOULD; WOODRUFF, 2006). Em roedores, com o desenvolvimento do antro é possível identificar o crescimento e a aquisição da competência meiótica do oócito (EPPIG; SCHROEDER, 1989). Já em humanos e bovinos, o desenvolvimento da competência meiótica não é estritamente relacionado à formação do antro, mas há uma correlação direta entre a capacidade do oócito superar o bloqueio da meiose e o tamanho folicular nestas espécies (TROUNSON; ANDERIESZ; JONES, 2001). Em caprinos, a competência meiótica completa é adquirida em folículos de 3 mm, os quais correspondem a um oócito de aproximadamente 110 μm de diâmetro (HYTTEL et al., 2002). O desenvolvimento dos folículos antrais é caracterizado por uma fase de crescimento, recrutamento, seleção e dominância (VAN DEN HURK; ZHAO, 2005), sendo a formação de folículos pré-ovulatórios um pré-requisito para a ovulação e formação do corpo

32 31 lúteo, bem como para manutenção da fertilidade (DRUMMOND, 2006). A fase antral terminal é dependente das gonadotrofinas, FSH e LH, que induzem o recrutamento e o crescimento sincronizado de folículos antrais em ondas foliculares (FORTUNE et al., 2001). Além das gonadotrofinas, peptídeos sintetizados localmente desempenham papel-chave na regulação da fase antral, tanto por meio de mecanismos parácrinos como endócrinos (WEBB et al., 2003). Dentre esses peptídeos, merecem destaque o sistema IGF, os IGFs são sinérgicos ao FSH na promoção do crescimento folicular e produção de estradiol (FORTUNE; RIVERA; YANG, 2004). Ademais, a interação entre os FGFs e o FSH contribui positivamente para a manutenção do crescimento folicular nessa fase, uma vez que o FSH estimula a expressão dos receptores para os FGFs (FGFR-2b e FGFR-3c) em células da granulosa, sensibilizando as células de folículos recém-recrutados à ação mitogênica dos FGFs (BURATINI et al., 2005a,b). O aumento (pico) das concentrações plasmáticas de FSH constitui o estímulo necessário para o recrutamento e emergência da onda folicular (ADAMS et al., 1992). Em espécies monovulatórias, apenas um folículo é selecionado dentre os recrutados para continuar a crescer e diferenciar-se em folículo ovulatório, enquanto os demais têm como destino a atresia. O folículo selecionado é conhecido como folículo dominante e suprime ativamente o crescimento dos subordinados pela secreção de estradiol e inibina (GINTHER et al., 1996). Segundo Baker e Spears (1999), o aparecimento de folículos subordinados e dominantes é resultante de uma complexa interação entre ações endócrinas indiretas, resultantes da secreção de estradiol e inibina pelos grandes folículos selecionados, e regulações intraovarianas diretas, que envolvem a participação de fatores de crescimento locais e iniciam ou exarcebam a diferença entre folículos. Na fase final do desenvolvimento folicular, ocorre uma diminuição dos níveis circulantes de FSH em resposta ao alto nível de estradiol e inibina produzidos pelo folículo. Nesse momento, o LH passa a otimizar a foliculogênese, acelerando o desenvolvimento folicular e determinando uma redução nas exigências de FSH pelos folículos (FILICORI et al., 2001). Observa-se então a formação do folículo pré-ovulatório, caracterizado por um oócito circundado por células da granulosa especializadas, denominadas células do cumulus. Em resposta ao LH, as células da granulosa dos folículos pré-ovulatórios param de se multiplicar e iniciam o programa final de diferenciação. Com o pico pré-ovulatório de LH a partir da puberdade, o oócito retoma a meiose e progride da prófase I para a metáfase II, proporcionando a ovulação de um oócito maturo (AERTS; BOLS, 2010b).

33 POPULAÇÃO E ATRESIA FOLICULAR A população folicular difere entre as espécies, além de ser observada uma grande variação individual (KATSKA-KSIAZKIEWICZ, 2006), sendo de aproximadamente em camundongo fêmea (SHAW; ORANRATNACHAI; TROUNSON, 2000) e na mulher (BAKER, 1963). Durante a vida reprodutiva das fêmeas, ocorre uma redução ordenada no número de folículos pré-antrais (SHAW; ORANRATNACHAI; TROUNSON, 2000). Essa redução é devido a dois fenômenos que ocorrem naturalmente no ovário: (i) a ovulação e (ii) a atresia ou morte folicular. Somente uma pequena parte (0,1%) dos folículos primordiais chega à ovulação (NUTTINCK et al., 1993), pois a maioria (99,9%) torna-se atrésica durante as fases de crescimento e maturação oocitária (OTALA et al., 2002). O processo de atresia usualmente ocorre de forma diferenciada entre folículos préantrais e antrais. Em folículos pré-antrais, os primeiros sinais de morte folicular surgem no oócito, onde se pode observar a retração da cromatina nuclear e a fragmentação oocitária (SILVA et al., 2002). Após a formação do folículo antral ocorre uma alteração na sensibilidade do oócito e das células da granulosa. A partir deste estágio, o oócito torna-se altamente resistente e as primeiras alterações indicativas de atresia são observadas nas células da granulosa (JORIO et al., 1991). A atresia, apesar de causar a perda de vários folículos ovarianos, é um evento crucial para manutenção da homeostase ovariana em mamíferos (para revisão veja CELESTINO et al., 2009), assegurando a ciclicidade dos animais e prevenindo o desenvolvimento de múltiplos embriões durante a gestação (AMSTERDAM et al., 2003). É um fenômeno natural, comum a todas as espécies domésticas, e acomete folículos em qualquer fase do desenvolvimento, sendo mais comum nos estágios antrais mais avançados (GLAMOCLIJA et al., 2005) e pode ocorrer por via apoptótica ou degenerativa (MARKSTRÖM et al., 2002). A apoptose, também conhecida como morte celular programada, é um processo determinado geneticamente, ou seja, depende da expressão de genes pró- e anti-apoptóticos e tem como característica marcante a fragmentação do DNA a cada pares de base e a formação de corpos apoptóticos (HUSSEIN, 2005). De acordo com o estímulo inicial, a apoptose pode ocorrer através de receptores de superfície celular (receptores de morte), constituindo a via extrínseca, ou ainda através da mitocôndria com liberação de conteúdos citoplasmáticos para o espaço extracelular, a necrose geralmente resulta em resposta inflamatória intensa (CARINI et al., 1995).

34 33 Diante disso, visando evitar a enorme perda folicular pela atresia, nas últimas décadas, têm sido desenvolvidos vários modelos de cultivo in vitro que possibilitam o estudo dos fatores que controlam a atresia e estimulam o crescimento folicular. 2.5 MOIFOPA - CULTIVO IN VITRO DE FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS A MOIFOPA é uma biotécnica da reprodução que vem sendo aprimorada nos últimos tempos e consiste numa das principais ferramentas utilizadas atualmente para a elucidação da foliculogênese inicial. Tal biotécnica tem como principal objetivo resgatar oócitos oriundos de folículos pré-antrais, a partir do ambiente ovariano, e posteriormente cultivá-los in vitro até a maturação, prevenindo-os da atresia e possibilitando sua utilização em outras biotécnicas como FIV, transgênese e clonagem. Para alcançar esse objetivo é necessário o desenvolvimento de um sistema de cultivo in vitro ideal para cada etapa do desenvolvimento folicular (FIGUEIREDO et al., 2011). O cultivo in vitro de folículos pré-antrais é uma técnica que vem sendo largamente empregada com o intuito de avaliar o efeito de diferentes substâncias e concentrações sobre o desenvolvimento folicular, com o objetivo de mimetizar o ambiente ovariano proporcionando aos folículos as condições ideais para que se desenvolvam in vitro (FIGUEIREDO et al., 2011) Sistemas de cultivo in vitro Os folículos podem ser cultivados in situ, ou seja, inseridos no córtex ovariano ou na forma isolada. Em adição, o cultivo pode ser realizado em dois passos, podendo ser iniciado com o cultivo de folículos primordiais in situ até o estágio de folículo secundário, seguido de uma etapa de cultivo in vitro destes folículos na forma isolada (O BRIEN et al., 2003; TELFER et al., 2008). Em roedores, a pequena dimensão dos ovários possibilita o cultivo do órgão inteiro, o que tem sido bastante útil para o estudo da foliculogênese inicial em pequenos mamíferos (FORTUNE, 2003). Contudo, em animais domésticos de médio e grande porte, não é possível utilizar este modelo devido às grandes dimensões dos ovários. Uma alternativa para superar este obstáculo é o cultivo de pequenos fragmentos do córtex ovariano, o qual tem sido realizado para o estudo da ativação e crescimento de folículos em diferentes espécies, como caprinos (SILVA et al., 2004b), bovinos (BRAW-TAL; YOSSEFI, 1997), babuínos (WANDJI et al., 1997) e humanos (ZHANG et al., 2004). Além da

35 34 praticidade, o cultivo in situ apresenta como vantagem a manutenção do contato celular (ABIR et al., 2006) e da integridade tridimensional dos folículos. No entanto, neste tipo de modelo, embora haja uma expressiva ativação folicular, poucos folículos primários cultivados progridem até o estádio de folículo secundário (FORTUNE, 2003). O cultivo de folículos isolados apresenta como vantagens a possibilidade do acompanhamento individual dos folículos durante o cultivo, além de favorecer melhor perfusão do meio para o folículo (ABIR et al., 2006). Este sistema pode ser realizado de forma bidimensional (camundongo: EPPIG; SCHROEDER 1989; CORTVRINDT et al., 1996), na qual o folículo é cultivado diretamente sobre o suporte de plástico ou sobre uma matriz, ou ainda de forma tridimensional, na qual o folículo é incluso em uma matriz. O sistema de cultivo tridimensional evita a aderência das células foliculares ao suporte plástico e, consequentemente, a perda da integridade morfológica do folículo (NAYUDU; OSBORN, 1992). A manutenção da arquitetura folicular é de extrema importância para o desenvolvimento folicular e maturação oocitária, uma vez que o crescimento do oócito e sua competência meiótica citoplasmática são dependentes das junções gap entre oócito e células da granulosa, que controlam a passagem de fatores parácrinos. Além disso, a interrupção da comunicação entre as células durante o cultivo in vitro provoca a ovulação prematura e a degeneração do oócito liberado (EPPIG et al., 2005). Estudos têm demonstrado que o cultivo tridimensional modula a sobrevivência e crescimento celular, a secreção de substâncias e a resposta a estímulos (WEAVER et al., 1996). Hwa e colaboradores (2007) verificaram que o perfil de expressão gênica de células cultivadas em cultivo tridimensional mais se assemelha ao observado in vivo em comparação ao encontrado após cultivo bidimensional. Outra vantagem atribuída ao cultivo tridimensional é o fato dos fatores liberados pelas células da granulosa permanecerem próximos ao oócito, exercendo um efeito positivo sobre o seu desenvolvimento e possibilitando a formação de novas junções gap. Em sistemas bidimensional, o volume de meio utilizado e a aderência das células da granulosa ao substrato, que promove alterações na arquitetura dos folículos, pode resultar em uma exposição menos uniforme dos fatores secretados, dificultando sua difusão até o oócito (LOCHTER; BISSEL 1995). Diante das limitações que envolvem o cultivo 2D e tendo em vista a importância da manutenção do arranjo espacial das células, diferentes métodos de cultivo tridimensionais vêm sendo desenvolvidos a fim de mimetizar o microambiente encontrado in vivo pelas células dos mamíferos. Estes métodos podem ser baseados na utilização de hidrogéis.

36 35 Hidrogéis são polímeros capazes de absorver grande quantidade de água. Estruturalmente, são constituídos por uma ou mais redes poliméricas, formadas por cadeias macromoleculares interligadas por ligações covalentes ou interações físicas, como interações iônicas, hidrofóbicas ou pontes de hidrogênio (OVIEDO et al., 2008). Devido à sua estrutura reticulada, os hidrogéis são capazes de transportar oxigênio, nutrientes e resíduos (NGUYEN; WEST, 2002). De acordo com sua natureza, os hidrogéis podem ser naturais ou sintéticos. Dentre os hidrogéis naturais, o Alginato é o mais comumente utilizado para o cultivo tridimensional de folículos ovarianos (XU et al., 2006a; WEST et al., 2007). Já com relação aos polímeros sintéticos, podemos citar o Poly(ethylene glycol)-vinyl sulfone (PEG-VS; SAWHNEY et al., 1993; SHIKANOV et al., 2011) Alginato O Alginato é um polissacarídeo presente na parede celular de algas marinhas pardas da classe Phaeophyta e na parede celular de algumas bactérias, em que desempenha funções primariamente estruturais. Trata-se especificamente de um poli-uronídeo, formado por dois monômeros de base, β-d-manuronila e α-l-guluronila, conectados entre si por ligações glicosídicas entre seus carbonos de número 1 e 4. (ROWLEY et al., 1999). A gelificação, em particular, ocorre quando sais presentes no cálcio, ou quando o polímero é acidificado (transformado em ácido algínico). Diversos estudos têm utilizado com sucesso o Alginato no cultivo de folículos de murinos, macacos e humanos (PANGAS et al., 2003; KREEGER et al., 2006; XU et al., 2006a, 2009a, 2009b). Além disso, oócitos recuperados de folículos encapsulados em Alginato foram capazes de retomar a meiose, serem fertilizados e produzirem crias saudáveis (XU et al., 2006a). Alguns autores têm sugerido que concentrações baixas de Alginato (0,25% e 0,5%) foram mais eficientes em promover a manutenção da sobrevivência, a formação de antro, o crescimento folicular, a secreção de esteróides e a retomada da meiose em oócitos oriundos de folículos secundários cultivados in vitro (camundongas: XU et al., 2006b; WEST et al., 2007, 2009; macacas: XU et al., 2009b). Em caprino Brito et al., (2014), relata que o cultivo em 0,25 de Alginato garante a manutenção da comunicação intercelular, o que favorece o transporte de andrógenos a partir de células da teca interna para mural de células da granulosa e otimiza o processo de esteroidogênese. Contudo, estudos têm sugerido que concentrações mais altas e, consequentemente, géis mais rígidos são mais eficazes para o desenvolvimento de folículos primordiais e primários, uma vez que propiciam uma rigidez

37 36 semelhante ao do córtex ovariano in vivo (macacas: HORNICK et al., 2012; camundongas: TAGLER et al., 2014) Poly(ethylene glycol)-vinyl sulfone (PEG-VS) Poly(ethylene glycol)-vinyl sulfone (PEG-VS) é um sistema de hidrogel sintético, cuja estrutura também pode ser modificada para imitar várias condições in vivo. Nesse sentido, o hidrogel de PEG-VS é um dos melhores hidrogéis sintéticos testados para o cultivo de folículos ovarianos (SHIKANOV et al., 2011). A maior vantagem do uso do PEG-VS é a natureza bioquímica da sua molécula que permite o encapsulamento do folículo e é lentamente degradada por proteases secretadas pelas células foliculares durante o cultivo in vitro. A degradação do gel permite a expansão do folículo, mas continua exercendo uma força compressiva sobre o mesmo, mantendo sua integridade. Este sistema de cultivo foi capaz de suportar um aumento de 17 vezes do tecido durante o cultivo em um modelo murino, tornando-se uma opção viável para o cultivo em uma espécie maior, como seres humanos. Estudos têm demonstrado que o hidrogel de PEG é capaz de manter a viabilidade de células encapsuladas (BRYANT; ANSETH 2002), bem como possibilita a sobrevivência e crescimento de folículos secundários até o estágio antral inicial. Em adição, os oócitos oriundos desses folículos antrais foram capazes de retomar a meiose e alcançar a metáfase II (SHIKANOV et al., 2011). As desvantagens deste sistema de cultura incluem a falta de pistas ambientais, como a rigidez da matriz ou a presença de moléculas sinalizadoras biológicas. Outra desvantagem deste sistema é a quantidade de tensão de cisalhamento no folículo, que é prejudicial ao seu crescimento e desenvolvimento. Tabela 1 - Principais trabalhos utilizando matrizes de Alginato e Poly(ethylene glycol) - PEG em sistemas de cultivo folicular 3D (continua) ALGINATO Modelo Folículos Cultivo Autor Resultados animal (µm) (dias) Pangas et Desenvolvimento folicular normal com Rata 82±17 10 al., 2003 oócitos capazes de retomar a meiose. Xu et al., Desenvolvimento folicular normal com Rata nascidos vivos.

38 37 Tabela 1 - Principais trabalhos utilizando matrizes de Alginato e Poly(ethylene glycol) - PEG em sistemas de cultivo folicular 3D (conclusão) West et al., vs Maior crescimento folicular, formação de Rata antro e produção de estrogênio. PEG ALGINATO Xu et al., Macaca Aumento da sobrevida e diâmetro do Rhesus folículo. Brito et al., Maior taxa de crescimento e retomada Cabra meiótica. Silva et al., Oócitos em MII com a obtenção de Cabra embriões. Shikanov et 69% de formação de antro com condições Rata al., 2011 intermediárias de degradação da matriz. Ahn et al., Camund Maturação oocitária com formação de ongo pro-nucleos e blastocistos. Fonte: Elaborado pelo autor Fatores que afetam o cultivo in vitro de folículos pré-antrais Nas últimas duas décadas, vários sistemas de cultivo foram desenvolvidos e os resultados obtidos são dependentes da espécie animal estudada, do sistema de cultivo utilizado e principalmente da composição do meio, o qual deve garantir o fornecimento adequado de nutrientes, eletrólitos, antioxidantes, aminoácidos, substratos energéticos, vitaminas, fatores de crescimento e hormônios (EPPIG; SCHOEDER, 1989; BOLAND et al., 1994; FORTUNE, 2003; PICTON et al., 2008). É notório que, diferentes meios comerciais podem ser utilizados para o cultivo de folículos ovarianos in vitro. Dentre os meios de cultivo base utilizados para folículos pré-antrais, destacam-se o Meio Essencial Mínimo (MEM) (SILVA et al., 2004a; MATOS et al., 2007), o Meio de Cultivo Tecidual 199 (TCM199) (RAJARAJAN et al., 2006) e os meios Waymouth (MURUVI et al., 2005) e McCoy s (TELFER et al., 2008). Estudos têm demonstrado que a adição de diferentes suplementos ao meio de cultivo, como piruvato, glutamina, hipoxantina e ITS (Insulina, Transferrina e Selênio), aumenta o percentual de folículos morfologicamente normais e estimula o crescimento folicular (SILVA et al., 2004a; DEMEESTERE et al., 2005). Além disso, tem-se observado que o ácido ascórbico, importante antioxidante, também atua positivamente sobre a foliculogênese, promovendo uma redução da apoptose em folículos pré-antrais de

39 38 camundongos (MURRAY et al., 2001) e estimulando a manutenção da viabilidade folicular em caprinos (ROSSETTO et al., 2009) após cultivo de longa duração. Além da composição do meio de cultivo, outros fatores, como o ph, a temperatura e a tensão de oxigênio, são de extrema relevância para a promoção do desenvolvimento folicular, uma vez que proporcionam in vitro condições semelhantes ao ambiente ovariano (YE et al., 2007). Deficiências na regulação do ph podem comprometer a função e a viabilidade celular (KAPUS et al., 1994), bem como dificultar o desenvolvimento pré-implantacional de embriões (ratas: LANE et al., 1998; hamsters: ZHAO et al., 1995). No que diz respeito à temperatura, para o transporte dos ovários, em geral utiliza-se temperaturas mais baixas (4 a 20ºC) para reduzir o metabolismo celular e, consequentemente, minimizar o gasto de energia e diminuir a taxa de autólise do tecido (SALEHI et al., 2004). Já para o cultivo folicular in vitro, empregam-se temperaturas elevadas (37,5 a 39ºC), semelhantes à temperatura corporal interna da espécie a ser estudada. No que se refere à concentração de oxigênio ideal para o cultivo in vitro de folículos, os resultados ainda são controversos. Alguns trabalhos apontam a concentração de 5% de oxigênio como sendo mais eficaz para estimular o crescimento folicular (ovinos: CECCONI et al., 1999) e a competência oocitária (camundongas: EPPIG; WIIGGLESWORTH, 1995), enquanto outros estudos sugerem a utilização de 20% de oxigênio (bovinos: GIGLI et al., 2006; caprinos: SILVA et al., 2010). Devido a inferência desses fatores, os melhores resultados dessa biotécnica tem-se sido alcançado com o nascimento de murinos, no entanto nas espécies domésticas tem conseguido um número pequeno e variável de oocistos competentes e embriões. Dessa forma diversas metodologias tem sido empregada para melhorar a eficiência do cultivo e da maturação in vitro Estado atual da biotécnica de MOIFOPA Durante as últimas décadas tem se observado um avanço significativo quanto ao cultivo in vitro de folículos pré-antrais nas várias espécies. Indiscutivelmente, os melhores resultados, de forma geral, têm sido obtidos em camundongos, em que foi possível reproduzir por completo a foliculogênese, desde o estágio de folículo primordial até o nascimento de prole viva (O BRIEN et al., 2003). No entanto, não foi possível repetir esse resultado em outros mamíferos. A espécie bovina é a que tem apresentado maiores dificuldades, tendo como melhor resultado a obtenção de folículos no estágio antral a partir de folículos primários (SUN; LI, 2013), embora tenham sido capazes de produzir blastocistos (HUANG et al., 2013)

40 39 e, inclusive, o nascimento de crias vivas a partir de complexos granulosa-oócito obtidos de folículos antrais iniciais (HIRAO et al., 2004). Na espécie humana foi possível produzir oócitos meioticamente maduros a partir de folículos secundários (XIAO et al., 2015). Em ovinos (ARUNAKUMARI; SHANMUGASUNDARAM; RAO, 2010; LUZ et al., 2012), suínos (WU; EMERY; CARRELL, 2001), bubalinos (GUPTA et al., 2008), primatas não humanos (XU et al., 2011, 2013b) e caprinos (SARAIVA et al., 2010; MAGALHÃES et al., 2011; SILVA et al., 2014a) foi possível produzir oócitos maduros a partir do cultivo de folículos secundários que, após FIV bem sucedida, resultou na produção de embriões in vitro. Embora se tenha alcançado o estágio embrionário de mórula a partir de oócitos provenientes de folículos crescidos in vitro, as taxas de maturação oocitária ainda são muito baixas quando comparadas com as obtidas a partir de oócitos provenientes de folículos crescidos in vivo. Estes resultados, embora promissores, demostram a necessidade de continuar com os estudos, a fim de melhorar a eficiência dos meios e/ou sistemas de cultivo atuais, bem como, os da maturação in vitro. 2.6 COMPETÊNCIA OOCITÁRIA A competência oocitária é a capacidade do oócito para assegurar o desenvolvimento embrionário após a fecundação. Ela é adquirida de maneira gradual e sincronizada ao longo da maturação oocitária que culmina com a configuração cromossômica em metáfase II - MII. A maturação oocitária pode ser dividida em maturação citoplasmática, nuclear e molecular. A maturação citoplasmática engloba todas as mudanças estruturais a distribuição e organização das organelas citoplasmáticas. A maturação nuclear corresponde ao processo de reversão do primeiro bloqueio meiótico do oócito em estádio de VG até o segundo bloqueio meiótico em estádio de MII. Já a maturação molecular corresponde ao legado de instruções acumuladas durante a fase de VG que controla tanto a maturação nuclear como a citoplasmática (SIRARD, 2001) Maturação Citoplasmática A maturação citoplasmática compreende as mudanças estruturais e organizacionais das organelas que ocorrem no citoplasma do oócito iniciando no estágio de VG e culminando no estágio de MII. Ela envolve uma série de eventos complexos, incluindo a síntese de proteínas e de RNA citoplasmático. A maturação citoplasmática pode ser avaliada

41 40 pela distribuição das organelas, reorganização das mitocôndrias no citoplasma, complexo de Golgi e grânulos corticais (MAO et al., 2014). No oócito imaturo de suínos, bovinos, camundongos e humanos as mitocôndrias e o complexo de Golgi estão concentrados em torno da VG, afastando-se da região perinuclear na ruptura da vesícula germinal (RVG) e ocupando a maior parte do volume do oócito em MII (oócitos maduros) (MAO et al., 2014). Além disso, o número de complexos de Golgi, também aumenta com o diâmetro do oócito. Localizados um pouco mais concentrado no interior do oócito os complexos de Golgi produzem os grânulos corticais durante o crescimento oocitário (AUSTIN, 1956). Esses grânulos são dispersos aleatoriamente ao longo do citoplasma dos oócitos imaturos e migram para a região cortical do citoplasma durante a maturação meiótica em suínos (YOSHIDA et al., 1993) e bovinos (HOSOE; SHIOYA, 1997). Esta mudança de direção dos grânulos corticais é talvez o sinal mais facilmente observado na maturação citoplasmática. As funções do reticulo endoplasmático (RE) estão relacionadas ao enovelamento de proteínas e metabolismo de lipídios, sendo o RE a principal reserva interna de íons de cálcio. O RE sofre redistribuição e mudanças estruturais durante a maturação do oócito. Em camundongos in vivo na fase VG o RE é uniformemente distribuído ao longo do ooplasma (MANN et al., 2010), migrando para as regiões corticais em pequenos grupos ao longo do citoplasma ao atingir MII (MEHLMANN et al., 1995; MAO et al., 2014). Outro aspecto que pode ser utilizado para predizer a competência citoplasmática é o diâmetro do oócito, devido ao aumento do volume citoplasmático durante o crescimento folicular. Em suínos, oócitos com diâmetro menor que 100 µm é incompetente, porém, aqueles que atingem diâmetro igual ou superior a 110 µm possuem capacidade para alcançar a competência meiótica (MORBECK et al., 1992). Igualmente, a avaliação desse processo pode ser feita de forma indireta através dos aspectos morfológicos como a expansão das células do cumulus (SANTIQUET et al., 2014). A expansão do cumulus é um mecanismo independente da maturação citoplasmática e nuclear do oócito. Entretanto, a ausência ou o pequeno número de células de cumulus afeta negativamente a taxa de desenvolvimento embrionário em bovinos (LISLE et al., 2003). As interações entre as células do cumulus e oócitos são, portanto, essenciais para a competência ao desenvolvimento embrionário. Muitos autores consideram que a melhor forma de avaliar a maturação seja a submissão do oócito maduro à fecundação, clivagem e o posterior desenvolvimento embrionário e fetal (KRISHER, 2004). Portanto, a maturação citoplasmática deve ser interpretada como sendo um processo de capacitação gradual que, juntamente com a aquisição da competência meiótica do oócito (FERREIRA et al., 2009), produzem uma estrutura fertilizável.

42 Maturação Nuclear Maturação nuclear refere-se ao processo de reversão do primeiro bloqueio meiótico do oócito em estádio de VG até o segundo bloqueio meiótico em estádio de MII. A fase VG é mantida por vários anos no animal e o mecanismo desta parada prolongada, manteve-se sempre um mistério. A retomada da meiose em oócitos inclusos em folículos antrais avançados in vivo ocorre durante o pico de LH (HYTTEL et al., 1986), enquanto que se cultivados in vitro, os oócitos podem retomar espontaneamente a meiose (PINCUS; ENZMANN, 1935). O primeiro sinal de retomada da meiose é a etapa de RVG (SZOLLOSI et al., 1972). No entanto, a maturação nuclear continua a sua progressão para metáfase I (MI) sofrendo uma nova parada em MII, permanecendo assim até a fecundação. Os estágios de maturação nuclear podem ser classificados de acordo com sua configuração nuclear (LANDIM-ALVARENGA; CHOI, 1999), a saber; o estágio de VG é caracterizado pela presença de um núcleo esférico rodeado por uma membrana nuclear integra e cromatina descondensada; RVG é a fase intermediaria da maturação nuclear onde ocorre a primeira retomada da meiose, havendo condensação cromossômica e a desintegração da membrana nuclear; MI é caracterizada pela presença de uma placa metafásica localizada perifericamente no ooplasma; MII é caracterizada pela presença de cromossomo metafásico na periferia do ooplasma e pela extrusão do primeiro corpúsculo polar caracterizando a maturação nuclear Maturação Molecular Maturação molecular consiste na transcrição, estoque e processamento de RNAm que serão traduzidos em proteínas através dos ribossomos, sendo diretamente relacionada com os processos de maturação e subsequentes eventos celulares, tais como fertilização, formação de pró núcleos e a fase inicial da embriogênese (CROCOMO et al., 2013). A transcrição e estoque de RNAm ocorre durante a fase de foliculogênese, período em que o núcleo se encontre quiescente, cessando com a retomada da meiose. A maior parte de RNAm apresenta-se no ooplasma em forma inativa, após a ação de sinais específicos gerados durante a maturação, fertilização e desenvolvimento embrionário ocorre o início da tradução do RNAm. Assim, o sucesso do armazenamento e reativação do RNAm,

43 42 determina a competência do oócito para suportar os posteriores estágios de desenvolvimento (GOTTARDI; MINGOTI, 2009). 2.7 CO-CULTIVO DURANTE A MATURAÇÃO IN VITRO (MIV) Conforme mencionado anteriormente é bem conhecido que os oócitos necessitam atingir a maturação citoplasmática, bem como a maturação nuclear para se tornarem capazes de assegurar a fecundação e o desenvolvimento do embrião (TROUNSON; PERA, 2001). Com o intuito de melhorar ainda mais as taxas de maturação in vitro (MIV), diferentes tipos celulares têm sido utilizados para enriquecer os meios de cultivo in vitro. Oócitos de suínos, humanos e camundongos já foram maturados in vitro utilizando células do próprio folículo ovariano (células da granulosa ou da teca) (CASILLAS et al., 2014) ou de outros tecidos, tais como células do oviduto (CHAN et al., 2013), endoteliais e fibroblastos (KARIMPOUR MALEKSHAH et al., 2014), ou mesmo o próprio oócito (SUDIMAN et al., 2014). Maiores detalhes sobre esses sistemas de co-cultivo serão descritos a seguir Co-cultivo de oócitos O crescimento e o desenvolvimento durante a fase antral são dependentes do contato íntimo dos oócitos com as células do cumulus, as quais desempenham uma função crucial na secreção de fatores de crescimento, regulando a comunicação bidirecional entre ambos (GILCHRIST et al., 2008). Dentre esses fatores, podemos citar o GDF9 e a BMP15, os quais são membros da superfamília TGF-β e na maioria das espécies são encontrados exclusivamente no oócito (CRAWFORD; MCNATTY, 2012). Estudos têm demonstrado que fatores secretados pelo oócito aumentam a capacidade de desenvolvimento de complexos cumulus-oócitos (CCOs) bovinos obtidos a partir de matadouros (HUSSEIN et al., 2006). VANDERHYDEN, (1993) demonstrou que a regulação da expansão do cumulus é diferente em suínos e camundongos. A expansão das células do culmulus em CCOs suíno in vitro não é dependente do oócito, ao contrário da espécie murina (PROCHÁZKA et al., 1991). Os oócitos mantêm um microambiente altamente especializado, através de sinais parácrinos (LI et al., 2000). XIA et al. (1994) relataram que os fatores secretados pelas células do cumulus, durante o co-cultivo de oócitos desnudos, induzem a maturação nuclear e citoplasmática. Este microambiente aumenta o número de oócitos com maturação

44 43 citoplasmática e nuclear, o que assegura o desenvolvimento embrionário precoce (GILCHRIST et al., 2004) Co-cultivo com células somáticas As células do cumulus podem promover a maturação citoplasmática de oócitos ao longo do desenvolvimento folicular na fase antral, pois é durante este estágio que os oócitos vão gradualmente adquirindo competência (LI et al., 2000). Especula-se que alguns fatores secretados pelas células do cumulus tais como o GDF-9 e a BMP-15 podem agir no oócito auxiliando a maturação dos oócitos co-cultivados com monocamadas de células do cumulus (FENG et al., 2013), promovendo a sua competência para o desenvolvimento embrionário subsequente (JU; RUI, 2012). Visando mimetizar o microambiente natural do trato reprodutivo e produzir fatores antioxidantes para neutralizar espécies reativas de oxigênio, vários tipos de células têm sido utilizadas em monocamadas favorecendo a nutrição dos embriões cultivados in vitro (JOHNSON et al., 2008; OMAR FAROUK; VLAD, 2008). Desta forma, a utilização de células somáticas, independentemente de sua origem, tem um papel importante na produção de embriões viáveis. Considerando essas características, LOOS et al (1994) utilizou paredes de folículos antrais imaturos (3-6 mm) como protocolo para o bloqueio da meiose, permitindo a sincronização das maturações citoplasmática e nuclear. Em bovinos, a presença das células da granulosa nas paredes foliculares foi capaz de manter os oócitos com VG intacta (LOOS et al., 1994). Desta forma, a presença da PDE 4 pode ter favorecido o bloqueio da progressão da meiose Bloqueio temporário da maturação Acredita-se que o baixo desenvolvimento de oócitos maturos in vitro é devido à assincronia entre maturação nuclear e citoplasmática (EPPIG et al., 1994). Diante disso, numerosos estudos sugerem que o bloqueio temporário da meiose pode sincronizar a maturação nuclear e citoplasmática, tanto in vivo (WIERSMA et al., 1998) quanto in vitro (ratos: COTICCHIO et al., 2004, bovinos: MAYES et al., 2002 e macaco: JENSEN et al., 2002). Portanto, o conhecimento sobre o processo de bloqueio meiótico da maturação oocitária é fundamental para o aprimoramento de técnicas eficazes na produção in vitro de embriões.

45 44 O mecanismo mais aceito atualmente sobre o bloqueio meiótico está diretamente relacionado a elevadas concentrações intra-oocitárias de AMPc, reguladas pela atividade entre as enzimas adenilato-ciclase (AC) e as fosfodiesterases (PDE). Essas enzimas são responsáveis pela síntese e degradação de AMPc, respectivamente (FIMIA; SASSONE- CORSI, 2001; CONTI et al., 2002). Pelo menos 11 isoenzimas de PDE já foram identificadas (SODERLING; BEAVO, 2000). Apenas as PDE do tipo 1, 3, 4, 8 e 9 estão localizadas nos compartimentos foliculares. A PDE3 está principalmente envolvida no metabolismo de AMPc em oócitos, enquanto que a PDE4 está envolvida no metabolismo do AMPc nas células da granulosa (SASSEVILLE et al., 2006). 2.8 FOSFODIESTÉRASES (PDEs) Fosfodiesterases - PDEs são enzimas que degradam nucleotídeos cíclicos intracelulares, o AMPc ou o monofosfato cíclico de guanosina (GMPc), inativando-os. Estas enzimas compreendem atualmente uma família de onze fosfodiesterases (tabela 1) em mamíferos (CONTI, 2000). Elas estão presentes em todos os órgãos, incluindo o coração, os pulmões, os olhos, o cérebro e tecidos eréteis. As PDEs podem hidrolisar AMPc e GMPc. As PDEs 4, 7 e 8 são enzimas que degradam AMPc (CONTI, 2000; SODERLING; BEAVO, 2000) e as PDEs 5, 6 e 9 degradam GMPc. Já as PDEs 1, 2, 3, 10 e 11 degradam tanto o AMPc como o GMPc (CONTI, 2000; SODERLING; BEAVO, 2000). Cinco das onze famílias das PDEs estão presentes nos ovários: PDE1, PDE3, PDE4, PDE8 e PDE9 (GILULA et al., 1978; CONTI et al., 1991; BEAVO, 1995; FISHER et al., 1998; CONTI; JIN, 1999; CONTI, 2000). A PDE1 está presente nas células da granulosa e células da teca em ratos (CONTI et al., 1984) e no oócito de camundongos (BORNSLAEGER et al., 1984). Entretanto, a PDE3 foi relatada a sua expressão unicamente no oócito (REINHARDT et al., 1995; NOGUEIRA et al., 2003a,b) ao contrário da PDE4 que é expressa tanto nas células da granulosa como nas células da teca (TSAFRIRI et al., 1996). Tabela 2 - Lista de inibidores específicos da fosfodiesterase. Família Inibidores PDE1 Vinpocetine, Zaprinast e SCH (continua)

46 45 Tabela 2 - Lista de inibidores específicos da fosfodiesterase. (conclusão) PDE2 EHNA PDE3 Cilostamine. Milrinone, Amrinone, Enoximone e Lixazinone PDE4 Rolipram, RO , Denbufyline e Sadarverine PDE5 Sidenafil (Viagra), Zaprinast, DMPPO, E4021, SCH e GF248 PDE6 Sidenafil (Viagra), Zaprinast, DMPPO, E4021 e GF248 PDE7 Benzothieno-et benzothiadiazine dioxides PDE8 Dipyridamole e (IBMX - insensible) PDE9 Zaprinast e (IBMX - insensible) PDE10 Papaverine PDE11 Zaprinast e Dipyridamole Fonte: FRANCIS et al., Fosfodiesterase tipo 3 As fosfodiesterases do tipo 3 degrada AMPc em 5'-AMP, mas esta é a única família da fosfodiesterase que é bloqueada pela ação do GMPc (REINHARDT et al., 1995). A PDE3 tem dois genes que codificam para as enzimas A e B. São elas a A1, A2 e A3 (CHOI et al., 2001; SHITSUKAWA et al., 2001) e a 3B também possui três variantes (DEGERMAN et al., 1997). A PDE 3A e 3B têm a mesma organização estrutural. Estas duas formas são expressas e reguladas em diferentes tipos celulares. Por exemplo, o PDE3A encontrada nas plaquetas, no coração (OKRUHLICOVA et al., 1996) e na placenta (CHOI et al., 2001). A PDE3A está envolvida na agregação plaquetária (FEIJGE et al., 2004) e no controle da contração cardíaca (HERRING et al., 2001). Já a PDE3B é encontrada nos adipócitos, promovendo a sua diferenciação (TAIRA et al., 1993), nas células pancrea ticas β (HARNDAHL et al., 2002), nos mecanismos da lipólise e da glicólise, bem como na regulação da ingestão de nutrientes, no hipotálamo em resposta à leptina através PI-3kinases (ZHAO et al., 2002). Ambas PDE3 A e B estão também envolvidas no relaxamento das células do musculo liso vascular (REINHARDT et al., 1995; UCKERT et al., 2004). A PDE3A é a forma predominante expressa em oócitos de mamíferos. No folículo do ovário, a PDE3 foi localizada em oócitos de camundongos (TSAFRIRI et al., 1996; SHITSUKAWA et al., 2001), macacos (JENSEN et al., 2002) e humanos (NOGUEIRA et al.,

47 a). Para promover a parada meiótica dos oócitos pode ser usado inibidores nãoespecíficos (DEKEL; BEERS, 1978; 1980) ou o uso de inibidor específico da PDE-3 (TSAFRIRI et al., 1996; WIERSMA et al., 1998). A inibição desta enzima bloqueia o recomeço da meiose in vitro e em in vivo em camundongos (TSAFRIRI et al., 1996; WIERSMA et al., 1998), bem como, sua utilização aumenta a taxa de formação de blastocistos promovendo o desenvolvimento embrionário em camundongos (NOGUEIRA et al., 2003b) Fosfodiesterase tipo 4 A família da fosfodiesterase tipo 4 tem uma afinidade elevada para a hidrólise de AMPc. Ela é encontrada nos pulmões (TOWARD; BROADLEY, 2004), cérebro ou neurônios corticais (D'SA et al., 2002). Elas são codificadas por quatro genes: PDE4 A, B, C e D. Há mais de 20 variantes de PDE4, estando presente em células do ovário. No folículo de camundongos, utilizando a hibridação in situ revelou a presença de PDE4B nas células da teca, enquanto PDE4D foi encontrada nas células da granulosa (TSAFRIRI et al., 1996). Camundongos knockout para PDE4D apresentaram uma taxa muito baixa de fertilidade e a ovulação diminuiu em comparação com camundongos selvagens (JIN et al., 1999) provavelmente devido à diminuição da expressão do gene durante a diferenciação em células da granulosa (RICHARD et al., 2003). Em todos os casos, a expressão in vivo de PDE4D é importante para a diferenciação normal de células da granulosa e uma taxa de ovulação e fertilização normais. 2.9 FERRAMENTAS E PARÂMETROS PARA AVALIAR A EFICIÊNCIA DO CULTIVO IN VITRO Dependendo do tipo de sistema de cultivo in vitro (in situ ou isolado) existem diferentes ferramentas e parâmetros para avaliar a sua eficiência. Para avaliar a eficiência do cultivo de folículos pré-antrais in situ pode-se utilizar diferentes métodos consagrados na literatura. Dentre eles, podem-se destacar aqueles que permitem a avaliação da qualidade folicular, como por exemplo, a histologia clássica (HC) e a microscopia eletrônica de transmissão (MET). A HC é uma técnica importante para avaliação do cultivo in vitro de folículos préantrais. Essa técnica permite uma análise quantitativa e a verificação da mudança na

48 47 morfologia das células da granulosa de pavimentosa para cúbica. Dessa forma, a HC analisa os diferentes estágios foliculares, além de analisar a integridade morfológica do oócito e das células da granulosa. Essa técnica pode ser realizada tanto em folículos isolados, como em folículos inclusos em fragmentos de córtex ovariano (MATOS et al., 2007). Entretanto, a HC possui como desvantagens não permitir a avaliação da integridade de membranas e das organelas citoplasmáticas. A MET poderia ser considerada como um complemento à HC (MATOS et al., 2007; ROSSETTO et al., 2009), uma vez que é uma técnica qualitativa e acurada, capaz de permitir a avaliação da integridade de membranas celulares e organelas citoplasmáticas. Ela se mostra como uma ferramenta valiosa para detectar modificações morfológicas iniciais devido à atresia, as quais podem ser observadas apenas a nível ultraestrutural, antes de se tornarem mais visíveis e possíveis de serem identificadas por microscopia óptica (LUCCI et al., 2001). O sistema de cultivo isolado permite o acompanhamento individual do desenvolvimento folicular in vitro. Esta é uma grande vantagem, já que se utiliza apenas uma ocular micrométrica (aumento 100 X) associada a uma lupa estereoscópica ou um microscópio invertido para avaliar, de forma quantitativa, a morfologia (percentual de folículos intactos, extrusos ou degenerados), as taxas de crescimento e o diâmetro folicular, bem como a formação de antro (SÁ et al., 2017). Além disso, após o cultivo folicular, é possível mensurar o diâmetro oocitário, que é um dos parâmetros de avaliação mais importantes, pois está diretamente relacionado com a capacidade do oócito em maturar (CROZET; DAHIREL; GALL, 2000). O potencial esteroidogênico, ou seja, a capacidade que as células da granulosa e da teca tem de secretar esteroides sexuais, pode ser usado como parâmetro qualitativo de viabilidade folicular. A detecção e a quantificação da produção de hormônios no meio de cultivo folicular, durante e ao final do cultivo, pode ser realizada através de diferentes técnicas como, por exemplo, eletroquimioluminescência (CADENAS et al., 2017), ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) (BRODZKI et al., 2015) ou radioimunoensaio (RIA) (APOLLONI et al., 2015). Outra ferramenta para avaliar a viabilidade, tanto folicular quanto oocitária, é a microscopia de fluorescência. Geralmente, os folículos são incubados com sondas fluorescentes como, por exemplo, a calceína-am e o etídio homodímero. A calceína-am é clivada por enzimas com atividade esterase no interior das células vivas emitindo fluorescência verde a 486 nm. O etídio homodímero liga-se ao ácido nucléico de células não

49 48 viáveis com danos de membrana, emitindo fluorescência vermelha a 568 nm (LIMA et al., 2012). Este tipo de microscopia também pode ser utilizada para avaliar o status da maturação nuclear oocitária, que é um parâmetro crucial para avaliar a eficiência do sistema de cultivo in vitro. Neste caso, os oócitos são incubados com Hoechst 33342, o qual penetra no interior da célula e se intercala entre as bases nitrogenadas do DNA, emitindo fruorescência azul a 483 nm. Desse modo, esta técnica permite classificar o estágio meiótico dos oócitos, segundo sua cromatina, em: VG, RVG, MI ou MII, em que os três primeiros estágios são considerados imaturos e o último, M II, meioticamente maduro. Também pode-se classificar os oócitos como degenerados (DEG), quando apresentam a configuração da cromatina anormal (NISHIO et al., 2014). Uma vez que o sistema de cultivo está produzindo oócitos em MII (meioticamente maduros), outro ponto para avaliar a eficiência do sistema de cultivo é o desenvolvimento embrionário. Somente desta forma é possível assegurar que a maturação nuclear está sincronizada à maturação citoplasmática, ou seja, que o sistema de cultivo está sendo capaz de gerar oócitos competentes. Esta avaliação pode ser realizada através da ativação partenogenética (LUZ et al., 2012) ou por fecundação in vitro (FIV) (SILVA et al., 2014a), seguidas do cultivo in vitro de embriões (CIV). Finalmente é possível quantificar a expressão relativa de alguns genes relacionados à foliculogênese através da PCR quantitativa em tempo real (qrt-pcr). Esta técnica permite avaliar, por exemplo, a expressão de diferentes enzimas esteroidogênicas nas células da granulosa e da teca (FERREIRA et al., 2016), como por exemplo a CYP17 (responsável pela produção de andrógenos) (YOUNG; MCNEILLY, 2010), a CYP19A1(enzima responsável pela sínteses de estrógenos a partir de andrógenos) (EDSON; NAGARAJA; MATZUK, 2009) e a 3βHSD (responsa vel pela produc ão de progesterona entre outros hormônios) (TING; XU; STOUFFER, 2015), bem como a expressão de genes relacionados à diferenciação das células do cumulus, como o Amh (hormônio antimülleriano), e o LHR (receptor do hormônio luteinizante) (SÁNCHEZ et al., 2012), ou a competência oocitária, como o HAS2 (Hialuronano sintase-2) (EPPIG, 2001) e o PTGS2 (Prostaglandina endoperóxido sintase-2) nas células do cumulus, ambos relacionados com a expansão das células do cumulus (EPPIG, 2001; XIAO et al., 2015). Esta ferramenta, embora não proporcione uma ideia definitiva sobre a eficiência do cultivo, pode ajudar a compreender os resultados obtidos.

50 49 3 JUSTIFICATIVA As principais razões que justificaram a execução e a importância da presente tese foram baseadas nos seguintes pontos: 3.1 ESCOLHA DA ESPÉCIE Durante a realização da presente tese foram utilizadas três espécies: caprina, bovina e babuína. As espécies caprina e bovina são de grande interesse sócioeconômico no Brasil, em função de seu importante papel na produção de carne, pele e leite, bem como modelo experimental para animais que estão em risco de extinção ou apresentam alto valor genético. Em relação aos babuínos, estes apresentam alta semelhança com humanos sendo considerados excelentes modelos experimentais para humanos. 3.2 ESCOLHA DA BIOTÉCNICA DE MOIFOPA E O PROCEDIMENTO DE PRÉ- MATURAÇÃO IN VITRO A MOIFOPA é uma excelente ferramenta para aprimorar o conhecimento acerca da foliculogênese inicial in vitro nas diferentes espécies mamíferas, bem como aumentar as taxas de produção de folículos secundários avançados a partir de primordiais ativados, visando incrementar a maturação oocitária e a produção in vitro de embriões. A remoção dos complexos cumulus-oócito do ambiente ovariano pode provocar o reinício precoce da maturação nuclear, sem que a maturação citoplasmática tenha ocorrido, diminuindo consequentemente a competência ao desenvolvimento destes oócitos. Frente a esse problema a técnica de pré-maturação in vitro visa retardar a maturação nuclear permitindo uma sincronização desta com a maturação citoplasmática. Assim, torna-se potencialmente possível obter uma população homogênea de oócitos no mesmo estágio de maturação aumentando de forma significativa à quantidade de oócitos competentes. Além disso, esta técnica permite a flexibilização do tempo de transporte de oócitos do campo ao laboratório preservando sua viabilidade. Ainda, no que diz respeito a oócitos inclusos em folículos pré-antrais crescidos in vitro, essa técnica pode

51 50 auxiliar a elevar as taxas de maturação impedindo que os oócitos retomem a meiose durante o cultivo in vitro. 3.3 ORIGINALIDADE DO TRABALHO Fase 1- Sabe-se que o transporte ovariano adequado é de extrema importância para o sucesso do cultivo in vitro. Conforme relatado na revisão de literatura, trabalhos anteriores demonstraram que os folículos ovarianos apresentam requerimentos diferenciados durante o seu desenvolvimento. Entretanto, no início da execução do projeto de pesquisa, não haviam trabalhos a respeito da determinação da temperatura de transporte ovariano adequada para as diferentes categorias foliculares (pré-antrais e antrais). Fases II e III- A preservação da morfologia folicular por meio do uso de matriz extracelular, como por exemplo o Alginato e o PEG-VS, tem-se revelado como uma excelente estratégia para melhorar a eficiência do cultivo folicular in vitro. Entretanto, poucos trabalhos têm sido realizados utilizando as referidas matrizes no cultivo in vitro de folículos ovarianos caprinos e babuínos. A originalidade foi investigar o efeito do Alginato sobre cultivo de folículos primordiais caprinos inclusos em tecido ovariano na ausência ou presença de Alginato ou na forma isolada encapsulados em Alginato. Já em babuínos, o ineditismo foi comparar o cultivo de folículos primordiais inclusos em fragmentos de tecido ovarianos na ausência ou presença de Alginato, PEG-VS e FSH em uma mesma condição experimental. Fase IV- A sincronização da maturação nuclear e citoplasmática do oócito é de fundamental importância para melhorar a sua competência ao desenvolvimento. Diversos inibidores, incluindo a Cilostamida, vêm sendo testados no intuito de retardar o reinício da maturação nuclear. Entretanto, a associação destes inibidores com a parede folicular ainda não foi testada. Em caprinos, não existiam estudos utilizando protocolos de pré-maturação utilizando inibidores da retomada da meiose. Portanto, a originalidade deste trabalho foi à investigação dos efeitos in vitro da pré-maturação com Cilostamida associada à parede folicular sobre a cinética de maturação e viabilidade in vitro de oócitos caprinos e bovinos.

52 51 4 HIPÓTESE CIENTÍFICA Diante do exposto foram formuladas as seguintes hipóteses científicas: As taxas de sobrevivência, desenvolvimento e maturação in vitro de folículos pré-antrais e antrais iniciais em caprino são afetadas pela temperatura de transporte. A utilização de sistema de cultivo tridimensional, empregando o Alginato e o PEG-VS, melhora a sobrevivência, ativação e o desenvolvimento in vitro de folículos primordiais de babuínos e caprinos. O emprego de um inibidor da fosfodiesterase tipo 3 (Cilostamida) associada à parede folicular retarda a maturação nuclear sem afetar a viabilidade oocitária de oócitos caprinos e bovinos.

53 52 5 OBJETIVOS 5.1 GERAL Determinar o efeito da temperatura de transporte de ovários caprinos sobre a sobrevivência e o desenvolvimento de folículos pré-antrais e antrais iniciais (Fase I). Estabelecer um sistema de cultivo in vitro eficiente que mantenha a sobrevivência e promova a ativação de folículos primordiais caprinos (Fase II) e babuínos (Fase III). Estudar a cinética de maturação de oócitos caprinos e bovinos crescidos in vivo e o efeito da Cilostamida associada à parede folicular durante a pré-maturação in vitro (Fase IV). 5.2 ESPECÍFICOS Determinar o efeito da temperatura de transporte (4 vs 33 ºC) sobre a morfologia e o crescimento folicular, viabilidade e maturac ão oocita ria, bem como produc ão de espécies reativas de oxigênio (EROs) de folículos pré-antrais e antrais iniciais caprinos isolados após 18 dias de cultivo in vitro (Fase I); Avaliar as taxas de sobrevivência e ativação folicular após 7 dias de cultivo in vitro em um sistema tridimensional nas seguintes condições: folículos primordiais isolados encapsulados em Alginato, folículos primordiais inclusos em tecido ovariano na presença ou ausência de Alginato- 0,8% (Fase II); Determinar as taxas de sobrevivência, ativação e crescimento folicular após 28 dias de cultivo in vitro de fragmentos ovarianos de babuínos (Fase III) encapsulados em PEG-VS (5%). Avaliar as taxas de sobrevivência, ativação e crescimento folicular após 10 dias de cultivo in vitro de fragmentos ovarianos de babuínos (Fase III) encapsulados em diferentes matrizes (Alginato - 1% ou PEG-VS - 5%). Determinar as taxas de VG, RVG, MI e MII em oócitos crescidos in vitro após 0, 18, 24 e 30 horas de maturação in vitro nas espécies caprina e bovina (Fase IV).

54 53 Investigar o efeito das concentrações de Cilostamida (10 µm e 20 µm) e tempos de exposição (6 e 12 horas) durante o cultivo in vitro (PMIV e MIV) de oócitos bovinos e caprinos (Fase IV).

55 54 6 CAPÍTULO 1 Ovarian transport temperature (4 vs 33 ºC) impacts differently the in vitro development of isolated goat preantral and antral follicles Published 2017 Small Ruminant Research H.H.V. Correia a, L.A. Vieira a, C. Maside a, V.M. Paes a, R.F. Silva a, B.G. Alves a, F.W. Santos b, G.A. Apgar c, A.P.R. Rodrigues a, J.R. Figueiredo a*, a Laboratory of Manipulation of Oocytes and Preantral Follicles (LAMOFOPA), State University of Ceará, Fortaleza, CE, Brazil b Laboratory of Reproduction Biotechnology (Biotech), State of University of Pampa, Uruguaiana, RS, Brazil c Department of Animal Science, Food and Nutrition, Southern Illinois University- Carbondale, USA. *Correspondence should be addressed to: Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Pré-Antrais (LAMOFOPA). Universidade Estadual do Ceará (UECE). Av. Silas Munguba, 1700, Campus do Itaperi. Fortaleza CE Brasil. CEP: Tel.: ; Fax: address: jrf.lamofopapapers@gmail.com (J.R. Figueiredo)

56 55 Resumo O objetivo do presente estudo foi determinar o efeito da temperatura de transporte de ovários caprinos na sobrevivência e no desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais - FOPA e folículos antrais iniciais - FAI. De cada par ovariano, um ovário foi transportado individualmente a 4ºC, sendo o outro transportado a 33 C, em MEM tamponado com HEPES. Os folículos foram isolados na mesma temperatura em que o ovário foi transportado e posteriormente cultivado in vitro por 18 dias. Após o cultivo folicular, os CCOs foram recuperados e submetidos à maturação in vitro por 32 h, seguida da avaliação da viabilidade e da configuração da cromatina. Nossos resultados mostraram que não houve efeito da temperatura de transporte (4 vs 33 ºC) sobre a porcentagem de folículos morfologicamente normais, independentemente da categoria folicular avaliada. Folículos pré-antrais de ovários transportados a 4 ºC mostraram um atraso na formação de antro no dia 12 (78,33%) em relação aos transportados a 33 ºC (91,94%). As taxas de crescimento global para as duas categorias foliculares testadas transportadas a 33 ºC foram superiores às transportadas a 4 ºC. Os valores da espessura da zona pelúcida foram menores (P <0,05) nos oócitos de folículos antrais iniciais transportados a 4 ºC em relação aos oócitos de FOPAs e antrais iniciais transportados a 33 ºC. O diâmetro dos oócitos dos folículos antrais iniciais transportados a 4 ºC foi significativamente maior após o cultivo. A taxa de retomada da meiose foi maior quando os FOPAs foram obtidos de ovários transportados a 4 ºC do que quando transportados a 33 ºC. Por fim, observou-se uma produção significativamente maior de EROs somente para os folículos antrais iniciais no dia 6, quando os ovários foram previamente transportados a 4 ºC em comparação aos transportados a 33 ºC. Em conclusão, a temperatura de transporte afeta diferencialmente o desenvolvimento in vitro de FOPAs e FAI de cabra. Embora a temperatura de transporte elevada (33 ºC) melhore a formação de antro e crescimento folicular, independentemente da categoria folicular, o melhor resultado para a produção de oócitos totalmente crescidos e a retomada meiótica foi obtido usando temperatura baixa (4 ºC) e alta (33 ºC) para folículos pré-antrais e folículos antrais iniciais, respectivamente. Palavras-chave: temperatura de transporte; secundário; antral inicial; folículos; caprino; maturação.

57 56 Abstract The aim of the present study was to determine the effect of transport temperature of goat ovaries on the in vitro survival and development of preantral follicles and early antral follicles. From each ovarian pair, the ovaries were individually transported in HEPES-buffered MEM at two different temperatures (4 vs 33 C). The follicles were isolated at the same temperature that the ovary was transported and subsequently cultured in vitro for 18 days. After follicle culture, the cumulus-oocyte complexes were recovered and submitted to in vitro maturation for 32 h followed by the evaluation of oocyte viability and chromatin configuration. Our results showed that there was no effect of transport temperature (4 vs 33 C) on the percentage of morphologically normal follicles regardless of the evaluated follicular category. Preantral follicles from ovaries transported at 4 C showed a delay in the antrum formation at day 12 (78.33 %) in relation to 33 C (91.94 %). The overall growth rates for the two tested follicular categories (Preantral follicles and Early antral follicles) transported at 33 C was higher than those transported at 4 C. Zona pellucida thickness values were lower (P < 0.05) in the oocytes from early antral follicles transported at 4 ºC compared to oocytes harvested from preantral follicles and early antral follicles transported at 33 ºC. Oocyte diameter of early antral follicles transported at 4 ºC was significantly higher after culture. Meiotic resumption rate was higher when preantral follicles were obtained from ovaries transported at 4 C than transported at 33 C. Finally, it was observed a significant higher ROS production only for early antral follicles at day 6 when the ovaries were previously transported at 4 ºC than transported at 33 ºC. In conclusion, the transport temperature differentially impacts the in vitro development of goat preantral follicles and early antral follicles. Even though high transport temperature (33 ºC) improves antrum formation and follicular growth irrespective of follicular category (Preantral follicles and Early antral follicles); the best outcome for fully grown oocyte production and meiotic resumption were obtained using low (4 C) and high (33 C) temperature for preantral follicles and early antral follicles, respectively. Keywords: transport temperature; secondary; early antral; follicles; caprine; maturation.

58 57 1. Introduction The success of cryopreservation and in vitro culture of preantral follicles depend on the oocyte quality at the beginning of these procedures. One of the most important factors that compromises follicle quality as well as its further in vitro development is the transport of the ovaries to the laboratory, particularly during long distances (Evecen et al., 2010). Moreover, it has been hypothesized that the temperature utilized during ovarian transport may also influence the in vitro maturation (IVM), which can act by preventing or accelerating oocyte degeneration (Pereira et al., 2015). Therefore, it is extremely important to establish suitable ovary transport temperatures. Previous studies in goats, where the ovaries were transported at 4 C for a period of 4 h reported reduced rates of embryo production from in vitro grown oocytes enclosed in secondary follicles (Magalhães et al., 2011). In addition, despite the progress of the in vitro oocyte maturation from secondary follicles, the maturation rate of oocytes recovered from caprine preantral follicles is still unsatisfactory (29.4%) (Araújo et al., 2011) in contrast to those grown in vivo (88%; metaphase II) (Souza- Fabjan et al., 2014). On the other hand, 67.7% of pig oocytes from antral follicles transported at 35 C, Sreached the metaphase II stage (Oi et al., 2015). However, to the best of our knowledge, there are no studies that evaluate the effect of high (33-35 C) versus low (4 C) ovary transport temperature on the survival, growth and oocyte maturation from isolated caprine preantral follicles cultured in vitro simultaneously. In addition, it is not known whether preantral and antral follicles require specific transport temperature. Therefore, the aim of this study was to investigate the effect of transport temperature (high vs low) on: a) the in vitro follicle survival and development, b) reactive oxygen production (ROS) and c) oocyte maturation in goats.

59 58 2. Material and methods Unless mentioned otherwise, culture media and other chemicals used in this study were purchased from Sigma Chemical Co. (St Louis, MO, USA) Source of ovaries Ovaries (n = 60) from 30 non-pregnant adult (1 to 3-year-old), cyclic, mixedbreed goats (Capra hircus) were collected from three different slaughterhouses. Immediately after slaughter, the ovaries were washed with 70% alcohol for 10 s. Ovaries were then washed twice with Minimum Essential Medium (MEM) buffered with HEPES (MEM-HEPES), supplemented with 100 μg/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin and transported to the laboratory at two different temperatures: 4 C and 33 C. The ovary transportation lasted 2 to 4 h depending on the slaughterhouse location Experimental design The present study was performed in order to verify whether the transport temperature affects follicle development potential and consequently in vitro maturation of the oocyte. Ovaries were transported individually in tubes containing 15 ml of medium (HEPES-buffered MEM) for 2 to 4 h depending on the slaughterhouse location at two different temperatures, 4 ºC vs 33 ºC (Figure 1). In the laboratory, the ovaries were held at the same transport temperature and cut into small fragments; follicles were isolated and cultured in vitro for 18 days. Follicular morphology and antrum formation were assessed every six days. The cumulus-oocyte complexes (COCs) recovered after follicle culture were submitted to in vitro maturation (IVM) for 32 h, for further evaluation of oocyte viability and chromatin configuration Follicle isolation and culture Caprine ovaries were stripped of ligaments and surrounding fat tissue. The ovarian cortex was sliced (1 2 mm in thickness) using a surgical blade under sterile conditions. Slices were placed in a holding medium consisting of HEPES-buffered

60 59 MEM. Preantral follicles ( μm in diameter) and early antral follicles ( μm in diameter) were measured using a pre-calibrated ocular micrometer in a stereomicroscope (SMZ 645 Nikon, Tokyo, Japan) and manually dissected using 26- gauge (26 G) needles. After isolation, the follicles were transferred to 100 μl drops containing fresh holding medium under mineral oil to further evaluate follicular quality. Follicles with a visible oocyte surrounded by granulosa cells and an intact basement membrane were selected for culture. A total of 243 follicles, preantral follicles (n=122) and early antral follicles (n=121), were individually immersed in 100 μl drops of culture medium in Petri dishes (60 15 mm, Corning, USA) under mineral oil and cultured for 18 days at 39 C and 5% CO2. The medium was replaced partially every other day (60 μl), except at days 6 and 12, during which total medium replacement was performed to change the concentration of FSH. The culture medium consisted of α- MEM (Gibco, Invitrogen, Karlsruhe, Germany; ph ) supplemented with 3 mg/ml bovine serum albumin (BSA), ITS [10 μg/ml insulin, 5.5 μg/ml transferrin, and 5 ng/ml selenium], 2 mm glutamine, 2 mm hypoxanthine, 50 μg/ml ascorbic acid, and sequential bovine recombinant FSH (days 0-6: 100 ng/ml; days 6-12: 500 ng/ml, and days 12-18: 1000 ng/ml (Saraiva et al., 2011) Morphological evaluation of follicle development On days 0, 6, 12, and 18 of culture, follicles were classified according to their morphological features. The follicles were classified as degenerated when the oocytes and granulosa cells were dark and/or misshapen. In addition, on the same days, antral cavity formation (only in the preantral follicles groups) and the diameters of healthy follicles were recorded. The diameter of the follicles was determined as the mean of two perpendicular measurements of each follicle using a stereomicroscope (SMZ 645 Nikon, Tokyo, Japan) with an ocular micrometer (100 magnification). The growth rate was calculated as follows: the final diameter minus the initial diameter of viable follicles (at day 0), divided by the days of in vitro culture.

61 In vitro maturation of caprine oocytes After in vitro culture, all healthy follicles were opened using 26-G needles. Only oocytes larger than 110 µm (not including zona pellucida), with homogeneous cytoplasm and surrounded by at least one compact layer of cumulus cells were selected for IVM. Recovered cumulus oocyte complexes - COCs were washed twice with TCM199 medium buffered with HEPES (TCM199-HEPES) and washed twice in IVM medium without hormone, before maturation. The percentage of fully grown oocytes was calculated by dividing the number of retrieved oocytes ( 110 μm), by the total number of follicles at day 0 of culture. The selected COCs were placed in IVM medium composed of TCM199 supplemented with 0.5 μg/ml recombinant FSH, 5 μg/ml LH, 1 μg/ml 17β-E2, 10 ng/ml recombinant epidermal growth factor, 1 mm pyruvate, 100 μm cysteamine, 50 ng/ml recombinant insulin-like growth factor I, and 1% BSA. The oocytes were matured in microdrops in a proportion of one oocyte per 10 μl of IVM medium on culture dishes (30 15 mm) under mineral oil for 32 h in an incubator at 39 C with 5% CO Assessment of oocyte viability and chromatin configuration After IVM, the oocytes were mechanically denuded and washed two times in PBS supplemented with 3 mg/ml of BSA. Then, oocytes were incubated for 30 min in 100 μl of PBS supplemented with 4 mm calcein-am and 2 mm ethidium homodimer- 1, (Molecular Probes - LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit for mammalian cells - L3224, Invitrogen, Karlsruhe, Germany), 10 mm Hoescht and fixed with 0.5% glutaraldehyde for viability analysis under a fluorescence microscope (Nikon, Eclipse 80i, Tokyo, Japan). Oocytes were considered viable if the cytoplasm stained with calcein-am (green) and if the chromatin was not labeled with ethidium homodimer-1 (red). The emitted fluorescent signals of calcein-am and ethidium homodimer-1 were measured at 488 nm. In addition, the oocyte chromatin was labeled with 10 μm Hoescht (emission at 568 nm) and the chromatin configuration was classified as germinal vesicle (GV), germinal vesicle breakdown (GVBD), metaphase I (MI), and metaphase II (MII). The meiotic resumption rate was calculated by dividing the number of oocytes at GVBD, MI and MII by the total number of follicles at the onset of culture.

62 Levels of reactive oxygen species Levels of reactive oxygen species (ROS) in the culture medium were determined by a spectrofluorometric method (Loetchutinat et al., 2005), using 2,7 - dihydrodichlorofluorescein diacetate 230 (DCHF-DA) assay. Sample aliquot (50 µl) was incubated with 10 µl of DCHF-DA 231 (1 mm). The oxidation of DCHF-DA to fluorescent dichlorofluorescein (DCF) was measured for the detection of intracellular ROS. The DCF fluorescence intensity (FI) emission was recorded at 520 nm (with 480 nm excitation) 2 h after the addition of DCHF-DA to the medium. ROS results are presented as relative fluorescence units (mean±sem) Statistical analysis The software Sigma Plot 11 (Systat Software Inc., USA) was used to perform all statistical analyses. Data that were not normally distributed (Shapiro-Wilk test) were submitted to logarithmic transformation. Comparison of means (follicle and oocyte diameter, follicular growth rate, zona pellucida thickness, and ROS) between treatments were analyzed by Mann-Whitney test, while the Wilcoxon signed test was used to evaluate the effect of treatment within days of culture. The proportion of follicular variables (intact, degenerated, antrum formation, and meiotic resumption) between treatments and days of culture were analyzed by Fisher s exact test. A linear regression analysis was performed to evaluate the relationship of oocyte diameter and zona pellucida thickness with chromatin configuration (GV, GVBD, MI, and MII). Data are presented as mean (±SEM) and the results were considered different when P < Probability values > 0.05 and 0.1 indicated that a difference approached significance.

63 62 3. Results 3.1. Follicular integrity and development A total of 243 follicles were evaluated, 122 preantral follicles and 121 early antral follicles. The percentages of morphologically normal follicles and antrum formation during in vitro culture are shown in Table 1. For both follicular categories (Preantral follicles and Early antral follicles), the percentage of morphologically normal follicles did not differ between the treatments (4 vs 33 C), regardless of the culture period. However, a significant reduction in the percentage of morphologically normal follicles from Day 0 to Day 18 of culture in both follicular categories and transport temperatures was observed. Antrum formation in both treatments (4 vs 33 C) increased significantly from Day 0 to Day 12. When treatments (4 vs 33 C) were compared, it was observed that the percentage of antrum formation on Day 12 was significantly higher in preantral follicles derived from the ovaries transported at 33 C, however, this difference was not observed on Day 18. Follicular growth rate decreased significantly from the second (Day 6 to Day 12) to the last third (Day 12 to Day 18) of culture, regardless of follicular category (Table 2). Moreover, only the follicular growth rate of preantral follicles from ovaries transported at 33 ºC decreased significantly in follicular growth rate from the first (Day 0 to Day 6) to the second third (Day 6 to Day 12) of culture. Furthermore, it was observed in both follicular categories that the overall growth rate was higher (P < 0.05) when the ovaries were transported at 33 C than 4 C. Similar results were observed in the first third (for preantral and early antral follicles) and in the second third (only for early antral follicles). However, in the last third of culture the growth rates were similar between the two transport temperatures (4 and 33 C) regardless of the follicular category Oocyte growth, zona pellucida thickness and chromatin configuration A total of 111 oocytes were evaluated, being 60 from the in vivo grown antral follicles (non-cultured), 18 from preantral follicles and 33 from early antral follicles grown in vitro. The effect of the transport temperature on oocyte diameter, zona

64 63 pellucida thickness, and configuration of chromatin after IVM is shown in Table 3. Early antral follicles from ovaries transported at 4 C showed a larger mean oocyte diameter (P < 0.05) when compared to preantral follicles derived from ovaries transported in both temperatures (4 and 33 C), as well as early antral follicles from the ovaries transported at 33 C, but smaller (P < 0.05) than oocyte diameter from in vivo grown follicle (control). Zona pellucida thickness values were lower (P < 0.05) in the oocytes from early antral follicles transported at 4 ºC compared to oocytes harvested from preantral follicles and early antral follicles transported at 33 ºC. However, zona pellucida thickness was similar (P > 0.05) between preantral follicles and early antral follicles transported within the same temperature. The recovery rate of oocyte 110 µm and the percentage of meiotic resumption were higher when preantral follicles were obtained from ovaries transported at 4 C than 33 C. Conversely, the opposite was observed for early antral follicles considering the same end point. It is noteworthy that, contrary to early antral follicles, the production of MII oocytes from preantral follicles cultured in vitro only occurred when the ovaries were transported at 4 C. Data from the tested transport temperature (4 ºC and 33 ºC) within each follicular category (Preantral follicles and Early antral follicles) were combined and these data are shown in table 4 and 5. The oocyte diameter (Table 4) and the zona pellucida thickness (Table 5) were similar (P > 0.05) between in vitro grown preantral follicles and early antral follicles, regardless the chromatin status. However, MII oocyte from in vivo grown follicle showed a greater (P < 0.05) diameter and zona pellucida was thinner than preantral follicles and early antral follicles. Also, MI oocytes from preantral follicles and early antral follicles showed a greater (P < 0.05) diameter and zona pellucida was thinner (P < 0.05) compared to those in GV stage. MI and MII in in vitro grown oocytes showed similar (P > 0.05) zona pellucida thickness (Preantral follicles and early antral follicles) and diameter (only preantral follicles). However, GV oocyte showed thicker zona pellucida than the other chromatin configuration states, regardless follicular category. A simple linear regression analysis showed a positive correlation between oocyte diameter and ability to resume meiosis and to progress from GVBD to MII in all follicular classes regardless the transportation temperatures (Figure 2). Also, a negative relationship of meiotic progression to MII and zona pellucida thickness (Figure 3) as

65 64 well as zona pellucida thickness and oocyte diameter (Figure 4) were observed for both follicular categories and transportation temperatures Levels of reactive oxygen species On day 6 of culture, early antral follicles had significantly higher ROS production when the ovaries were previously transported at 4 ºC than 33 ºC (Table 6). Except for preantral follicles, ROS production increased from day 6 for 12 regardless the transport temperature. However, the ROS production was not correlated with any studied end point.

66 65 4. Discussion This study showed for the first time the effect of ovarian transport temperature on in vitro culture of isolated advanced preantral (secondary) and early antral follicles in goats. The results showed that preantral follicles and early antral follicles development was affected differently by transport temperature, being more appropriate to use low temperature (4 C) for preantral follicles and high temperature (33 C) for early antral follicles. Furthermore, the parameters used to evaluate the efficiency of in vitro follicle culture such as antrum formation, follicular and oocyte growth and oocyte ability to resume meiosis were differentially affected by transport temperature and varied between follicular categories. Our results showed that there was no effect of transport temperature (4 vs 33 C) on the percentage of morphologically normal follicles regardless of evaluated follicular category. However, previous studies showed that after in vitro culture of early preantral follicles (primordial and primary follicles) the percentage of morphologically normal follicles was higher when the ovaries were transported at low (4 ºC) than high (>20 ºC) transportation temperature (equine, Gomes et al., 2012; bovine, Lucci et al., 2004 and swine, Lucci et al., 2007). The authors suggested that preservation at 4 C can reduce the metabolic rate, lower nutrient requirements and oxygen and therefore enhance the follicular resistance at earlier follicular category (Gomes et al., 2012; Lucci et al., 2004). The difference between our results and those reported previously may be due to: 1) type of follicles cultured (the present study used isolated late secondary and early antral follicles) rather than primordial and primary follicles; 2) type of culture system (follicles cultured in the isolated form - present study vs in situ culture, i.e., preantral follicles enclosed in an ovarian slice). Preantral follicles from ovaries transported at 4 C showed a delay in the percentage of antrum formation at day 12 (78.33 %) in relation to 33 C (91.94 %) which was probably due to a metabolism reduction, requiring longer time for antrum formation. This can be confirmed by the fact that at the end of the culture period (day 18) the percentage of antrum formation was similar between 4 ºC (88.33 %) and 33 ºC (93.55 %). A similar antrum formation rate at day 12 (77 %) was reported by Araújo et al. (2011) and at day 18 (87.88 %) by Saraiva et al. (2010) in caprine using the same transport temperature (4 ºC).

67 66 The overall growth rates for the two tested follicular categories (Preantral follicles and Early antral follicles) transported at 33 C was higher than those transported at 4 C. This result clearly shows that unlike the maintenance of follicular morphology, the follicular growth is affected by transport temperature. Therefore, the reduction in the metabolic activity of the cell caused by short-term exposure to low temperature ensure further cell survival but not normal cell proliferation (Roy and Treacy, 1993). We suggest that low temperature may temporarily reduce the activity of cellular organelles, such as mitochondria, which in turn impacts cell division (Nogueira et al., 2008; Taş et al., 2006). This study showed for the first time in goats that zona pellucida thickness varies during in vitro maturation of oocytes grown in vitro (Preantral follicles and Early antral follicles) as well as of oocytes grown in vivo. Zona pellucida thickness values were lower (P < 0.05) in the oocytes from early antral follicles transported at 4 ºC compared to oocytes harvested from preantral follicles and early antral follicles transported at 33 ºC. Oocyte diameter of early antral follicles transported at 4 ºC was significantly higher after culture. Therefore, we suggest that the thinner zona pellucida thickness observed in this treatment may be due to the pressure on the zona pellucida caused by the larger oocyte. To confirm this thought, we observed a negative correlation between oocyte diameter and zona pellucida thickness. A similar correlation was reported by Bertrand et al. (1995) in human oocytes after IVM. For both preantral follicles and early antral follicles we observed a negative correlation between zona pellucida thickness and the ability of oocyte to resume meiosis and to progress through the different stages of chromatin configuration. This finding is in agreement with a previous study on IVM of human and mouse oocytes (Bertrand et al., 1996; Qi et al., 2002). Bertrand et al. (1995) showed that oocytes with smaller zona pellucida thickness presented in vitro fertilization rates significantly higher than zona pellucida thicker oocytes, suggesting that the thickness of the zona pellucida is an important parameter to be considered during oocyte development and fertilization. The meiotic resumption and the fully grown oocyte rates were higher when preantral follicles were obtained from ovaries transported at 4 C than 33 C. However, the opposite was observed in early antral follicles. Thus, this result could be due to differences in gene expression profiles between preantral follicles and early antral follicles impacting follicular metabolism. In a previous study in goat we found that

68 67 2,466 genes were stage-specific up- and down-regulated in the transition from secondary to early tertiary follicles and that gene expression profiles showed three major metabolic pathways (lipid metabolism, cell death, and hematological system) were significantly differentiated between the two follicle stages (Magalhães-Padilha et al., 2013). This study shows that the ROS production was not correlated with any studied end point. However, significantly higher ROS production was observed in early antral follicle group when the ovaries were previously transported at 4 ºC than 33 ºC. Since early antral follicles are more metabolically active than preantral follicles, we suggest that the transient increase in ROS production (oxidative stress) on 6 day of culture may be caused by heat shock which is known to induce oxidative stress (Nabenishi et al., 2012a,b). In conclusion, the transport temperature differentially affects the in vitro development of goat preantral follicles and early antral follicles. Although high transport temperature (33 ºC) improves antrum formation in preantral follicles and follicular growth in both follicular categories (Preantral follicles and Early antral follicles), the best outcome for fully grown oocyte production and meiotic resumption were obtained using low (4 C) and high (33 C) temperature for preantral follicles and early antral follicles, respectively.

69 68 Acknowledgments This research was supported by grants from the National Council for Scientific and Technological Development (CNPq-79/2013 linha 3 Rede Nordeste de Biotecnologia (Rede de pesquisa do ovário artificial) Processo N /2013-2). Hudson Correia is the recipient of a grant from FUNCAP/CE (Brazil). The authors thank Dr. Gary A. Apgar for assistance in manuscript preparation. Conflict of interest There is no conflict of interest that could be perceived as prejudicing the impartiality of the research reported.

70 69 Figure.1. Schematic representation of the experimental design. IVFC = in vitro follicle culture; IVM = in vitro maturation; PF = preantral follicle; EAF = early antral follicle.

71 70 Figure.2. Relationship of oocyte diameter and chromatin configuration (GV, germinal vesicle; GVBD, germinal vesicle breakdow; MI, metaphase I; MII, metaphase II) of preantral (A,B) and antral follicles (C,D) from ovaries previously transported at 4ºC and 33ºC and (E) antral follicles developed in vivo. Each point observed in the graph is an oocyte subjected to in vitro maturation. The oocytes were defined by values (GV = 2; GVBD = 3; MI = 4; and MII = 5) to chromatin configuration (dependent variable). A linear regression is represented by the equation and the black line for preantral 33ºC (A) [chromatin status = ( oocyte diameter), R 2 = 0.15, r = 0.39, P < 0.05]; preantral 4ºC (B) [chromatin status = ( oocyte diameter), R 2 = 0.39, r = 0.62, P < 0.001]; antral 33ºC (C) [chromatin status = (0.157 oocyte diameter), R 2 = 0.77, r = 0.87, P < 0.001]; antral 4ºC (D) [chromatin status = (0.127 oocyte diameter), R 2 = 0.58, r = 0.76, P < 0.001]; and antral - in vivo (E) [chromatin status = ( oocyte diameter), R 2 = 0.18, r = 0.42, P < 0.01].

72 71 Figure.3. Linear regression analysis of zona pellucida thickness with chromatin configuration (GV, germinal vesicle; GVBD, germinal vesicle breakdow; MI, metaphase I; MII, metaphase II) of oocytes from preantral (A), antral follicles (B), and antral follicles (C) developed in vivo. Each point observed in the graph is an oocyte subjected to in vitro maturation. The oocytes were defined by values (GV = 2; GVBD = 3; MI = 4; and MII = 5) to chromatin configuration (dependent variable). A linear regression is represented by the equation and the black line for preantral (A) [chromatin status = ( zona pellucida thickness), R 2 = 0.14, r = , P < 0.01]; antral (B) [chromatin status = (0.154 zona pellucida thickness), R 2 = 0.20, r = -0.45, P < 0.001]; and antral - in vivo (C) [chromatin status = (0.124 zona pellucida thickness), R 2 = 0.13, r = -0.36, P < 0.05].

73 72 Figure.4. Relationship of zona pellucida thickness and oocyte diameter of preantral (A), antral follicles (B), and antral follicles (C) developed in vivo. Each point observed in the graph is an oocyte subjected to in vitro maturation. A linear regression is represented by the equation and the black line for preantral (A) [zona pellucida thickness = (0.233 oocyte diameter), R 2 = 0.27, r = -0.52, P < 0.001]; antral (B) [zona pellucida thickness = (0.291 oocyte diameter), R 2 = 0.62, r = -0.79, P < 0.001]; and antral - in vivo (C) [zona pellucida thickness = (0.268 oocyte diameter), R 2 = 0.35, r = -0.59, P < 0.001].

74 73 Table 1. Percentage of morphologically normal follicles and antrum formation (AF) after in vitro culture of preantral and antral follicles previously transported at 4 and 33 ºC. MNF (%) Transport temperature 4 C 33 C Preantral Follicle Early Antral Follicle D0 D6 D12 D18 D0 D6 D12 D (60/60) aa 100 (62/62) aa (58/60) aa (61/62) aa (50/60) ba (53/62) ba (39/60) ca (42/62) ca 100 (60/60) aa 100 (61/61) aa (59/60) aba (60/61) aba (54/60) ba (55/61) ba (44/60) ca (46/61) ca AF 4 C (0/60) (%) aa (38/60) ba (47/60) bcb (53/60) ca C (0/62) aa (43/62) ba (57/62) ca (58/62) ca MNF - morphologically normal follicles; AF - antrum formation; a,b,c Within a row in the same treatment (P < 0.05); A,B Within a column in the same day and parameter (P < 0.05).

75 74 Table 2. Follicular growth rate (µm) (mean ± SEM) after in vitro culture of preantral and antral follicle previously transported at 4 and 33 ºC. Preantral Follicle Early Antral Follicle Transport Temperature n* D0-D6 D6-D12 D12-D18 Overall n* D0-D6 D6-D12 D12-D18 Overall 4 C ± ± 2.07 ± ± ± ± 1.35 ± ± 1.92 ab 2.21 aa 1.71 ba 1.02 B ab 2.83 ab 2.23 ba 1.03 B 33 C ± ± 2.83 ± ± ± ± ± ± 2.15 aa 2.62 ba 1.63 ca 0.98 A aa 2.12 aa 2.69 ba 0.92 A a,b,c Within a row (P < 0.05); A,B Within a column (P < 0.05); * Total number of evaluated follicles.

76 75 Table 3. Oocyte diameter (mean ± SEM), ZP thickness and oocyte chromatin configuration after in vitro culture of preantral and antral follicles previously transported at 4 and 33 ºC. Transport temperature 4 ºC Follicular Category Oocyte diameter (µm) (mean ± SEM) ZP thickness (µm) (mean ± SEM) % fully grow oocytes ( 110 µm) PF ± 1.00 A 6.69 ± 0.97 ABC (15/60) AC EAF ± 1.47 B 4.43 ± 0.83 A (11/60) A Meiotic Resumption (%) (12/60) AC (9/60) A GV GVBD MI MII DEG (3/60) (4/60) A 3.3 (2/60) A (5/60) A (3/60) A (7/60) AB (2/60) A 33 ºC PF ± 1.04 A 8.19 ± 2.44 BC 4.83 (3/62) B EAF ± 0.70 A 8.28 ± 0.67 C (22/61) C 4.83 (3/62) B (18/61) C (1/61) (2/62) (1/62) A (2/61) (3/61) A (13/61) B 4.9 (3/61) A In vivo grown ± 0.39 follicles C 4.97 ± 0.12 AB (60/60) D (60/60) D - - (13/60) B (47/60) C - EAF - Early Antral Follicle; PF - Preantral Follicles; A,B,C,D Within a column (P < 0.05); In vivo oocytes were collected from antral follicles grown in vivo and then further submitted to IVM

77 76 Table 4. Oocyte diameter (µm) (mean ± SD) according to chromatin status after 32 h of in vitro maturation. Oocyte source n* GV GVBD MI MII In vitro PF ± 1.18 aa ± 1.63 aa ± 2.27 ba ± 1.48 ba grown EAF ± 0.92 aa ± 2.32 ba ± 1.84 ba ± 0.63 ca In vivo grown follicles ± 2.64 aba ± 1.38 aa ± 0.46 bb EAF - Early Antral Follicle; PF - Preantral Follicles; a,b,c Different superscripts within the same follicular category indicate significant difference (P < 0.05); A,B Within the same chromatin status (P < 0.05); * Total number of evaluated oocytes.

78 77 Table 5. Zona Pellucida thickness (µm) (mean ± SD) according to chromatin status after 32 h of in vitro maturation. Follicular category n* GV GVBD MI MII In vitro PF ± 0.47 aa 6.42 ± 0.88 ba 6.47 ± 1.75 ba 8.94 ± 0.90 ba grown EAF ± 0.82 aa 8.17 ± 1.15 ba 6.36 ± 0.90 ba 7.43 ± 0.71 ba In vivo grown follicles ± 3.59 aa 4.71 ± 0.68 aa 5.04 ± 0.15 ab EAF - Early Antral Follicle; PF - Preantral Follicles; a,b, Different superscripts within the same treatment indicate significant difference (P < 0.05); A,B Within the same chromatin status (P < 0.05); * Total number of evaluated oocytes.

79 78 Table 6. Levels of reactive oxygen species (relative fluorescence units) (mean ± SEM) after in vitro culture of preantral and antral follicle previously transported at 4 and 33 ºC. Preantral Follicle Early Antral Follicle Transport Temperature n* D6 D12 D18 n* D6 D12 D18 4 C ± 1.71 aa ± 1.96 aa ± 1.99 aa ± 1.99 aa ± 1.97 ba ± 1.35 aa 33 C ± 2.24 aa ± 2.24 aa ± 0.69 aa ± 1.00 ab ± 1.93 ba ± 1.27 ba a,b Within a row and the same follicular class (P < 0.05); A,B Within a column (P < 0.05); * Total number of evaluated follicles.

80 79 References Araújo, V.R., Silva, G.M., Duarte, a B.G., Magalhães, D.M., Almeida, a P., Gonçalves, R.F.B., Bruno, J.B., Silva, T.F.P., Campello, C.C., Rodrigues, a P.R., Figueiredo, J.R., Vascular endothelial growth factor-a(165) (VEGF-A(165)) stimulates the in vitro development and oocyte competence of goat preantral follicles. Cell Tissue Res. 346, doi: /s Bertrand, E., Van den Bergh, M., Englert, Y., Clinical parameters influencing human zona pellucida thickness. Fertil. Steril. 66, Bertrand, E., Van den Bergh, M., Englert, Y., Fertilization and early embryology: Does zona pellucida thickness influence the fertilization rate? Hum. Reprod. 10, Evecen, M., Cirit, Ü., Demir, K., Özdaş, Ö.B., Taş, M., Birler, S., Pabuccuoǧlu, S., Effects of estrous cycle stage and transport temperature of ovaries on in vitro maturation of canine oocytes. Anim. Reprod. Sci. 117, doi: /j.anireprosci Gomes, R.G., Andrade, E.R., Lisboa, L.A., Ciquini, A., Barreiros, T.R.R., Fonseca, N.A.N., Seneda, M.M., Effect of holding medium, temperature and time on structural integrity of equine ovarian follicles during the non-breeding season. Theriogenology 78, doi: /j.theriogenology Loetchutinat, C., Kothan, S., Dechsupa, S., Meesungnoen, J., Jay-Gerin, J.P., Mankhetkorn, S., Spectrofluorometric determination of intracellular levels of reactive oxygen species in drug-sensitive and drug-resistant cancer cells using the 2,7 -dichlorofluorescein diacetate assay. Radiat. Phys. Chem. 72, doi: /j.radphyschem Lucci, C.M., Kacinskis, M.A., Rumpf, R., Báo, S.N., Effects of lowered temperatures and media on short-term preservation of zebu (Bos indicus) preantral ovarian follicles. Theriogenology 61, doi: /s x(03) Lucci, C.M., Schreier, L.L., MacHado, G.M., Amorim, C.A., Báo, S.N., Dobrinsky, J.R., Effects of storing pig ovaries at 4 or 20??C for different periods of time on the morphology and viability of pre-antral follicles. Reprod. Domest. Anim. 42, doi: /j x

81 80 Magalhães-Padilha, D.M., Geisler-Lee, J., Wischral, A., Gastal, M.O., Fonseca, G.R., Eloy, Y.R.G., Geisler, M., Figueiredo, J.R., Gastal, E.L., Gene Expression During Early Folliculogenesis in Goats Using Microarray Analysis. Biol. Reprod. 89, doi: /biolreprod Magalhães, D.M., Duarte, A.B.G., Araújo, V.R., Brito, I.R., Soares, T.G., Lima, I.M.T., Lopes, C.A.P., Campello, C.C., Rodrigues, A.P.R., Figueiredo, J.R., In vitro production of a caprine embryo from a preantral follicle cultured in media supplemented with growth hormone. Theriogenology 75, doi: /j.theriogenology Nabenishi, H., Ohta, H., Nishimoto, T., Morita, T., Ashizawa, K., Tsuzuki, Y., 2012a. The effects of cysteine addition during in vitro maturation on the developmental competence, ROS, GSH and apoptosis level of bovine oocytes exposed to heat stress. Zygote 20, doi: /s Nabenishi, H., Takagi, S., Kamata, H., Nishimoto, T., Morita, T., Ashizawa, K., Tsuzuki, Y., 2012b. The role of mitochondrial transition pores on bovine oocyte competence after heat stress, as determined by effects of cyclosporin A. Mol. Reprod. Dev. 79, doi: /mrd Nogueira, D., Romero, S., LVanhoutte, L., de Matos, G.D., Smitz, J., Oocyte invitro maturation. Textb. Assist. Reprod. Technol. Lab. Clin. Perspect. 3rd edn, Oi, A., Tasaki, H., Munakata, Y., Shirasuna, K., Kuwayama, T., Iwata, H., Effects of reaggregated granulosa cells and oocytes derived from early antral follicles on the properties of oocytes grown in vitro. J. Reprod. Dev. 61, doi: /jrd Pereira, L., Bersano, P., Lopes, M., Influência da temperatura de transporte de ovários na maturação in vitro de oócitos caninos coletados em diferentes estágios do ciclo estral. Bra. J. Vet. Res. Anim. Sci. 52, Qi, H., Williams, Z., Wassarman, P.M., Secretion and assembly of zona pellucida glycoproteins by growing mouse oocytes microinjected with epitope-tagged cdnas for mzp2 and mzp3*. Mol. Biol. Cell 13, doi: /mbc.01 Roy, S.K., Treacy, B.J., Isolation and long-term culture of human preantral follicles. Fertil. Steril. 59, doi: /s (16) Saraiva, M.V.A., Rossetto, R., Brito, I.R., Celestino, J.J.H., Silva, C.M.G., Faustino,

82 81 L.R., Almeida, A.P., Bruno, J.B., Magalhaes, D.M., Matos, M.H.T., Campello, C.C., Figueiredo, J.R., Dynamic medium produces caprine embryo from preantral follicles grown in vitro. Reprod. Sci. 17, doi: / Saraiva, M.V. a, Celestino, J.J.H., Araújo, V.R., Chaves, R.N., Almeida, a P., Lima- Verde, I.B., Duarte, a B.G., Silva, G.M., Martins, F.S., Bruno, J.B., Matos, M.H.T., Campello, C.C., Silva, J.R. V, Figueiredo, J.R., Expression of follicle-stimulating hormone receptor (FSHR) in goat ovarian follicles and the impact of sequential culture medium on in vitro development of caprine preantral follicles. Zygote 19, doi: /s Souza-Fabjan, J.M.G., Locatelli, Y., Duffard, N., Corbin, E., Touzé, J.L., Perreau, C., Beckers, J.F., Freitas, V.J.F., Mermillod, P., In vitro embryo production in goats: Slaughterhouse and laparoscopic ovum pick up-derived oocytes have different kinetics and requirements regarding maturation media. Theriogenology 81, doi: /j.theriogenology Taş, M., Evecen, M., Özdaş, Ö.B., Cirit, Ü., Demir, K., Birler, S., Pabuccuoǧlu, S., Effect of transport and storage temperature of ovaries on in vitro maturation of bitch oocytes. Anim. Reprod. Sci. 96, doi: /j.anireprosci

83 82 7 CAPÍTULO 2 Activation of goat primordial follicles in vitro: Influence of Alginate and ovarian tissue Submitted January 2019 Systems Biology in Reproductive Medicine H.H.V. Correia¹, L.F. Lima¹, F.G.C. Sousa, A.C.A. Ferreira¹, J. Cadenas¹, V.M. Paes¹, B.G. Alves¹, A. Shikanov², J.R. Figueiredo¹ ¹ Laboratory of Manipulation of Oocytes and Preantral Follicles (LAMOFOPA), State University of Ceará, Fortaleza, CE, Brazil. ² Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, Michigan, USA *Correspondence should be addressed to: Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Pré-Antrais (LAMOFOPA). Universidade Estadual do Ceará (UECE). Av. Silas Munguba, 1700, Campus do Itaperi. Fortaleza CE Brasil. CEP: Tel.: address: jrf.lamofopapapers@gmail.com (J.R. Figueiredo)

84 83 Resumo O presente estudo teve como objetivo avaliar o efeito de três sistemas de cultivo na ativação de folículos primordiais caprinos in vitro: folículos cultivados na forma isolada e encapsulados em Alginato (Folículos primordiais isolados + Alginato) ou inclusos em tecido ovariano (in situ), com ou sem Alginato (Fragmento + Alginato, e Fragmento sozinho, respectivamente). Após o cultivo, o tratamento com Folículos primordiais Isolados + Alginato apresentou uma porcentagem de folículos morfologicamente normais (FMN) semelhantes ao controle não cultivado e ao tratamento Fragmento sozinho. No entanto, o tratamento Fragmento + Alginato apresentou uma redução significativa no número de FMN quando comparado aos demais tratamentos. Em relação ao desenvolvimento folicular, nossos resultados mostraram que, independentemente do Alginato, a presença de tecido ovariano limitou a ativação dos folículos primordiais durante o cultivo in vitro. Notavelmente, o tratamento Folículos primordiais isolados + Alginato foi o único que promoveu significativamente a ativação folicular e aumentou os diâmetros foliculares e oocitário durante o período de cultivo, apontando uma maior proliferação celular. Em conclusão, a presença de tecido ovariano com ou sem Alginato limitou o desenvolvimento folicular (ativação) após o cultivo. No entanto, quando os folículos primordiais foram isolados e encapsulados em Alginato, apresentaram taxas de sobrevivência adequadas, maiores taxas de ativação folicular e continuaram a crescer durante o período de cultivo. Palavras-chave: sistema de cultura 3D; Alginato; Tecido ovariano; Folículos primordiais; Bode.

85 84 Abstract The present study aimed to evaluate the effect of three culture systems on caprine primordial follicle activation in vitro: follicles cultured either in the isolated form within Alginate (Isolated follicles + Alginate treatment), or enclosed in ovarian tissue (in situ), with or without Alginate (Fragment + Alginate, and Fragment alone treatments, respectively). After culture, the Isolated follicles + Alginate treatment presented a percentage of morphologically normal follicles (MNF) similar to both the non-cultured control and the Fragment Alone treatments. Nevertheless, Fragment + Alginate treatment showed a significant reduction in the number of MNF when compared to the other treatments. Regarding follicle development, our results showed that regardless of the Alginate, the presence of ovarian tissue limited primordial follicle activation during in vitro culture. Remarkably, the Isolated primordial follicle + Alginate treatment was the only one that significantly promoted follicle activation and increased both follicle and oocyte diameters during IVFC, pointing out a higher cell proliferation. In conclusion, the presence of ovarian tissue with or without Alginate limited follicle development (activation) after culture. Nevertheless, when primordial follicles were isolated and encapsulated in Alginate they presented suitable survival rates, higher rates of follicle activation and continued to grow throughout the culture period. Keywords: 3D culture system; Alginate; Ovarian tissue; Primordial follicles; Goat.

86 85 Introduction Early preantral follicles (primordial and primary) are the largest ovarian follicle population and represent an important source of potentially competent oocytes for further use in assisted reproductive technologies. Nevertheless, primordial follicles (PFs) are quiescent within the ovary, and usually activate and enter growth phase after exposure to activating or removal of inhibitory stimuli (Jonh et al., 2008). However, the mechanisms underlying PF activation and growth are still not well defined. The in vitro follicle culture (IVFC) is an outstanding tool to study the control of early folliculogenesis. Evidence has suggested that PFs need a stiff, similar to that of the ovarian cortex, to initiate their development in vitro (Woodruff and Shea, 2011). Other studies reported that the in vitro culture (IVC) of the ovarian cortical fragments has shown limited results regarding follicle growth (Telfer et al., 2008). Moreover, differences among fragments in terms of follicular population, number of follicles present and density of the tissue may occur (Hornick et al., 2012). To minimize the effects of heterogeneity of the ovarian fragments several groups proposed to isolate, encapsulate and culture PFs within an inert three-dimensional (3D) biomimetic matrix, such as Alginate (Shikanov et al., 2011; Laronda et al., 2014). Despite promising results with secondary and multiple primary follicle culture, this culture system has not demonstrated a proper development of PFs in vitro. Furthermore, there is no experimental data that compares under the same conditions isolated PFs cultured in a 3D system in the absence (isolated follicles embedded in Alginate) or presence of ovarian tissue. Therefore, the present study aims to compare the survival and development rates among isolated PFs embedded in Alginate with those enclosed in ovarian fragments in the presence or absence of Alginate.

87 86 Materials and methods Culture medium and chemicals Unless mentioned otherwise, the culture media and other chemicals used in the present study were purchased from Sigma Chemical Co. (St. Louis, USA). The basic culture medium consisted of α-mem (ph ) supplemented with 1.25 mg/ml bovine serum albumin, 1% ITS (10 µg/ml insulin, 5.5 µg/ml transferrin and 5 ng/ml selenium), 2 mm glutamine and 2 mm hypoxanthine, which was referred to as α- MEM +. Source of ovaries Ovaries (n=10) were collected at a local slaughterhouse from 5 adult mixedbreed goats, washed and transported within 1 h to the laboratory in MEM-HEPES at 4 C. Experimental protocol Ovarian cortex tissue samples from each ovarian pair were cut into 18 slices (approximate size 3x3x1 mm) (Figure 1). Twelve of the eighteen fragments were submitted to the mechanical isolation of PFs (Lucci et al., 1999). A total of thirty PFs were isolated per repetition. Groups of 10 follicles were embedded in 10 µl drop of Alginate (Isolated primordial follicle + Alginate treatment). The remaining six fragments were distributed randomly among the following treatments: Fragment + Alginate treatment (one fragment/20 µl drop of Alginate) and Fragment alone treatment (fragment without any matrix). The ovarian fragments and isolated follicles were either immediately fixed (Non cultured control) or in vitro cultured for 1 or 7 days and thereafter fixed for histological analysis as described previously (Lima et al., 2016). Both isolated follicles and the fragments were transferred to 48-well culture dishes containing 500 L of α-mem +. The culture was performed at 39 C in 5% CO2 in air. The experiment was replicated 5 times and the culture media were replaced every other day.

88 87 Follicle and tissue encapsulation in Alginate For encapsulation, each group of 10 isolated follicles or fragments of ovarian cortex were washed with 100 μl drops of Alginate to remove the holding medium. Sodium Alginate (55 65% guluronic acid) hydrogel was prepared as described in previous reports (Xu et al., 2006). Morphological analysis and evaluation of follicular growth in vitro Follicle stage and survival were assessed on serial sections. The unilaminar follicles were classified according to their developmental stage as primordial (one layer of flattened granulosa cells or one layer of a mixture of flattened and cuboidal granulosa cells) or primary (from one to less than two complete layers of cuboidal granulosa cells). Also, these follicles were still classified as histologically normal or atretic. To evaluate follicular activation, the percentages of healthy primordial and growing follicles were calculated before and after culture as previously described (Lundy et al 1999). Overall, 150 follicles were evaluated for each group (30 follicles/group/repetition). Statistical analysis All statistical analyses were carried out using Sigma Plot 11.0 (Systat Software Inc.). Comparison of means was analyzed by ANOVA followed by the Student- Newman-Keuls as a post hoc test, whereas follicular integrity and development were analyzed by chi-square test. Data was presented as percentage and mean ± standard error of mean (SEM) and P-value <0.05 was considered statistically significant. Results Follicular integrity and development Morphological features of normal follicles (MNF) before and after IVFC are shown (Figure 2). From D1 onwards, the Fragment + Alginate treatment showed a

89 88 significantly lower percentage of MNF when compared to the other treatments (Figure 3). After culture, there was a reduction in the percentage of PFs with a concomitant increase (P < 0.05) in the percentage of developing follicles (primary follicles) in all treated groups compared to their correspondent controls (Figure 4). On D7 of culture the highest (P < 0.05) percentage of primary follicles was achieved in the isolated primordial culture treatment. Follicular and oocyte growth during IVC A significant increase in follicle and oocyte diameter was observed in Isolated primordial follicles + Alginate treatment from D0 to D7. In contrast, oocyte diameter decreased from D0 to D7 in the Fragment + Alginate and Fragment alone treatments (P < 0.05). Only in the Isolated primordial follicles + Alginate treatment the volume filled by granulosa cells in preantral follicles increased from D0 to D7 and was higher than Fragment + Alginate treatment on D7 (P < 0.05) (Table 1). Discussion The present study compared for the first time the effect of three culture systems (isolated PFs embedded in Alginate matrix with those enclosed in ovarian fragments in the presence or absence of Alginate) on caprine PF development in vitro. Our results showed that the use of Alginate as a 3D matrix for isolated follicles promoted survival and follicle activation compared to the other two culture systems. The IVC of follicles in the isolated form within Alginate or those cultured only enclosed in ovarian tissue ensured appropriate preservation of follicular morphology. Nevertheless, the IVC of fragments encapsulated in Alginate had detrimental effect on the percentage of MNF suggesting that the extra pressure exerted by the Alginate on the tissue negatively affected follicle survival, possibly because Alginate hydrogels are nondegradable and have a relatively stable elasticity module (Laronda et al., 2014). An additional layer of hydrogel around already dense tissue could also limit the diffusion of nutrients and oxygen towards the cell during IVC further affecting follicle growth and survival.

90 89 Isolated follicles demonstrated activation rates 1.3 times higher compared to other treatments. The method of encapsulation of isolated PFs in Alginate promoted follicle activation and increased both follicle and oocyte diameters during IVFC. It has been suggested that Alginate mimics the role of the extracellular matrix in vivo (Telfer and Zelinski, 2013), maintaining follicular 3D structure, as well the contact between the oocyte and the surrounding granulosa cells, which facilitated the exchange of substances that are essential for follicular activation and survival (Sadeghnia et al., 2016). In contrast, presence of ovarian tissue around PFs restrained their activation during IVFC, suggesting increasing density and reduced diffusion during culture. In conclusion, the presence of ovarian tissue limited follicle development during IVC. Nevertheless, when PFs were isolated and encapsulated in Alginate they presented suitable survival rates, higher rates of follicle activation and continued to grow throughout the culture period. Acknowledgments This research was supported by grants from the National Council for Scientific and Technological Development (CNPq-79/2013 Linha 3 Rede Nordeste de Biotecnologia (Rede de pesquisa do ovário artificial) Processo N /2013-2). Hudson Henrique Vieira Correia is the recipient of a grant from CNPq (Brazil). Conflict of interest There is no conflict of interest that could be perceived as prejudicing the impartiality of the research reported.

91 90 Figure 1. Experimental design to assess the effect alginate encapsulation on the development of isolated primordial follicle or enclosed in ovarian tissue after 0, 1 or 7 days of IVC. Figure 2. Representative images of follicles before (Day 0; A-C) and after IVC for 1 (D-F) or 7 days (G-I) from Fragment, Fragment + Alginate and Follicle + Alginate groups, respectively.

92 91 Figure 3. Percentage of morphologically normal follicles before and after in vitro culture for 1 or 7 days. AB Differences among groups within the same day; ab Differences between days within the same group; * Differences from D0 within the same group (P < 0.05). Figure 4. Primordial and primary follicles before and after in vitro culture for 1 or 7 days. AB Differences among groups within the same day; ab Differences between days within the same group; * Differences from D0 within the same group (P < 0.05).

93 92 Table 1: Follicular, oocyte diameters (µm) and volume (mean ± SEM) filled by granulosa cells in preantral follicles subjected to IVC. Follicles Oocyte Volume (µm 3 ) Treatment D0 D1 D7 D0 D1 D7 D0 D1 D7 Fragment Alone Fragment + Alginate 28.1 ± 27.6 ± 26.3 ± 21.1 ± 19.4 ± 18.5 ± ± ± ± 0.7 Aa 0.7 ABa 0.8 Aa 0.5 Aa 0.6 Ab 0.7 Ab Aa Aa ABa 27.9 ± 28.7 ± 26.2 ± 21.3 ± 20.5 ± 18.6 ± ± ± ± 0.6 Aa 1.1 Aa 0.9 Aa 0.4 Aa 0.9 Aab 0.7 Ab Aa Aa Aa Isolated primordial follicles + Alginate 21.6 ± 0.03 Ba 25.8 ± 0.7 Bb 27.1 ± 0.8 Ab 13.9 ± 0.6 Ba 16.7 ± 0.5 Bb 17.4 ± 0.7 Ab ± Ba ± Ab ± Bb A,B,C within a column and a,b within a row and the same and point (P<0.05).

94 93 References Hornick, J.E., Duncan, F.E., Shea, L.D., Woodruff, T.K., Isolated primate primordial follicles require a rigid physical environment to survive and grow in vitro. Hum. Reprod. 27, John, G.B., Gallardo, T.D., Shirley, L.J., Castrillon, D.H., Foxo3 is a PI3Kdependent molecular switch controlling the initiation of oocyte growth. Dev. Biol. 1, Laronda, M.M., Duncan, F.E., Hornick, J.E., Xu, M., Pahnke, J.E., Whelan, K.A., Shea, L.D., Woodruff, T.K., Alginate encapsulation supports the growth and differentiation of human primordial follicles within ovarian cortical tissue. J. Assist. Reprod. Genet. 31, Lima, L.F., Rocha, R.M.P., Duarte, A.B.G., Brito, I.R., Silva, G.M., Rodrigues, G.Q., Nunes Pinheiro, D.C.S., Sales, A.D., Moura, A.A., Wheeler, M.B., Rodrigues, A.P.R., Campello, C.C., Figueiredo, J.R., Unexpected effect of the vehicle (grain ethanol) of homeopathic FSH on the in vitro survival and development of isolated ovine preantral follicles. Microsc. Res. Tech. 80, Lucci, C.M., Amorim, C.A., Báo, S.N., Figueiredo, J.R., Rodrigues, A.P., Silva, J.R., Gonçalves, P.B., Effect of the interval of serial sections of ovarian tissue in the tissue chopper on the number of isolated caprine preantral follicles. Anim. Reprod. Sci. 56, Lundy, T., Smith, P., O'Connell, A., Hudson, N.L., McNatty, K.P., Populations of granulosa cells in small follicles of the sheep ovary. J. Reprod. Fertil. 115, Sadeghnia, S., Akhondi, M.M., Hossein, G., Mobini, S., Hosseini, L., Naderi, M.M., Shirazi, A., Development of sheep primordial follicles encapsulated in alginate or

95 94 in ovarian tissue in fresh and vitrified samples. Cryobiology. 72, Shikanov, A., Smith, R.M., Xu, M., Woodruff, T.K., Shea, L.D., Hydrogel network design using multifunctional macromers to coordinate tissue maturation in ovarian follicle culture. Biomaterials. 32, Telfer, E.E., McLaughlin, M., Strategies to support human oocyte development in vitro. Int. J. Dev. Biol. 56, Telfer, E.E., McLaughlin, M., Ding, C., Thong, K.J., A two-step serum-free culture system supports development of human oocytes from primordial follicles in the presence of activin. Hum. Reprod. 23, Telfer, E.E., Zelinski, M.B., Ovarian follicle culture: advances and challenges for human and nonhuman primates. Fertil. Steril. 99, Xu, M., Kreeger, P.K., Shea, L.D., Woodruff, T.K., Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring. Tissue Eng. 12, Woodruff, T.K., Shea, L.D., A new hypothesis regarding ovarian follicle development: ovarian rigidity as a regulator of selection and health. J. Assist. Reprod. Genet. 28,

96 95 8 CAPÍTULO 3 3D Poly(ethylene glycol)-vinyl sulfone culture system supports the in vitro growth and differentiation of baboon preantral follicles Submitting 2019 H.H.V. Correia¹, A. David², B.G. Alves¹, J.R. Figueiredo¹, A. Shikanov²*, ¹ Laboratory of Manipulation of Oocytes and Preantral Follicles (LAMOFOPA), State University of Ceará, Fortaleza, CE, Brazil. ² Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, Michigan, USA *Correspondence should be addressed to: Prof. Ariella Shikanov Associate Professor Biomedical Engineering Department University of Michigan 1101 Beal Avenue Ann Arbor, Michigan address: shikanov@umich.edu

97 96 Resumo O presente estudo tem como objetivo avaliar o efeito das condições de cultivo in vitro (IVC) na sobrevivência e ativação de folículos primordiais de babuínos envoltos em fragmentos de tecido ovariano vitrificados, como segue: Experimento I: ausência ou presença de poli (etileno glicol) - vinil sulfona (PEG-VS); Experimento II: PEG-VS vs Alginato (ALG) em meio de cultivo com ou sem hrfsh. Os fragmentos de tecido ovariano criopreservados (tamanho aproximado de 3x3x1 mm) sozinhos ou encapsulados em PEG-VS foram submetidos a IVC (7, 14, 21 e 28 dias) em α-mem +. Fragmentos com o diâmetro médio (3x3x1 mm) encapsulados ou não em PEG-VS apresentaram altas taxas de morte folicular após 7 dias culminando com morte total entre 14 e 28 dias de cultivo. Com base nestes resultados, reduzimos o diâmetro médio dos fragmentos de (3x3x1) para (1x1x1 mm) e adicionamos hrfsh ao meio de cultivo comparando duas matrizes diferentes (PEG-VS vs ALG) para o Experimento II. Após 10 dias de cultivo, os tratamentos PEG + FSH e ALG + FSH reduziram (P <0,05) a porcentagem de MNF quando comparados ao controle vitrificado não cultivado. Entretanto, os tratamentos citados apresentaram maior (P <0,05) porcentagem de MNF quando comparados com o restante dos tratamentos sem hrfsh (Experimento II). Em conclusão, o tecido ovariano com o diâmetro proximal (3x3x1 mm) limitou o desenvolvimento folicular durante a VCI. No entanto, a redução do tamanho do fragmento para (1x1x1 mm) encapsulado em matrizes (PEG-VS e AlG) e associado à adição de hrfsh melhorou a sobrevivência dos folículos pré-antrais do tecido criopreservado. Palavras-chave: sistema de cultura 3D; Alginato; Hidrogel de PEG-VS; Tecido ovariano; Babuíno.

98 97 Abstract The present study aims to evaluate the effect of in vitro culture (IVC) conditions on the survival and activation of baboon primordial follicles enclosed in vitrificated ovarian tissue fragments, as follows: Experiment I: absence or presence of poly(ethylene glycol)-vinyl sulfone (PEG-VS); Experiment II: PEG-VS vs Alginate (ALG) in culture medium without or with hrfsh. The cryopreserved ovarian cortex tissue fragments (approximate size 3x3x1 mm) alone or encapsulated in PEG-VS were submitted to IVC (7, 14, 21 and 28 days) in α-mem +. Culture in fragments with the proximal diameter (3x3x1 mm) encapsulated or not in the PEG-VS hydrogel presented high rates of follicular death after 7 days and further total death between 14 and 28 days of culture. Based on these results we reduced the mean diameter of the fragments from (3x3x1) to (1x1x1 mm) and we added hrfsh to the culture medium comparing two different matrices (PEG-VS vs ALG) for Experiment II. After 10 days of culture, the treatments PEG + FSH and ALG + FSH reduced (P < 0.05) the percentage of MNF when compared to non-cultured vitrified control. However, the aforementioned treatments presented a higher (P < 0.05) percentage of MNF when compared to the rest of the treatments without hrfsh (Experiment II). In conclusion, the ovarian tissue with the proximal diameter (3x3x1 mm) limited follicle development during IVC. However, the fragment size reduction to (1x 1x1 mm) encapsulated in matrices (PEG-VS and AlG) and associated with the hrfsh addition improved the survival of preantral follicles from cryopreserved tissue. Keywords: 3D culture system; Alginate; PEG-VS hydrogel; Ovarian tissue; Baboon.

99 98 Introduction Cryopreservation is an attractive strategy for conservation of germinal cells, and it has been a reliable ally for assisted reproductive techniques, both in animal and human species. Being widely used in cryopreservation of ovaries may protect young cancer patients from sterilization caused by chemotherapy and radiotherapy. However, ovarian cryopreservation is a challenging procedure, requiring preservation of several cell types (oocytes, granulosa, theca, and stromal cells) as well as gap junctions and functional interactions (Fabbri et al., 2014). Moreover, the transplantation poses a potential risk by possibly reintroducing cancerous cells into the host (Dolmans et al., 2010; Rosendahl et al., 2010). Therefore, studies propose to combine cryopreservation with in vitro culture of ovarian preantral follicles to obtain fertilizable oocytes and further embryo in vitro production (Santos et al., 2007; Vanacker et al., 2013). To understand folliculogenesis, studies on in vitro culture of ovarian follicles or ovarian tissue fragments were largely used (McLaughlin et al., 2018; Mendez et al., 2018). Moreover, studies have suggested that primordial follicles need a stiff environment, similar to that observed in the ovarian cortex, to activate their development in vitro (Woodruff and Shea, 2011). To overcome this process, many groups have chosen to culture follicles within an inert extracellular matrix, such as 3- dimensional (3D) synthetic material such as poly(ethylene glycol)-vinyl sulfone (PEG- VS) or natural material such as Alginate to promote follicle activation in vitro in different species (Shikanov et al., 2011; Hornick et al., 2012; Laronda et al., 2014). Furthermore, to the best of our knowledge, there is no information about the in vitro culture of smaller ovarian fragments in baboons. Therefore, the present study aims to investigate the effect of in vitro culture conditions on the survival and activation of baboon primordial follicles enclosed in vitrified ovarian tissue, as follows: Experiment I: absence or presence of poly(ethylene glycol)-vinyl sulfone (PEG-VS); Experiment II: PEG-VS vs Alginate (ALG) in culture medium without or with hrfsh.

100 99 Materials and methods Culture medium and chemicals Unless mentioned otherwise, the culture media and other chemicals used in the present study were purchased from Sigma Chemical Co. (St. Louis, USA). Ovary collection Ovarian tissue source and vitrification The baboon ovaries (n=4) were collected from University of Oklahoma and vitrified as previously described (PMID: , PMID: , PMID: , PMID: ). Briefly, the ovaries were transferred into vitrification solution (L-15 supplemented with EG 10 ml, Me2SO 10 ml, sucrose 8.56 gr) for 20 minutes at room temperature. Then, they were loaded onto the Cryolock and plunged into liquid nitrogen. Thawing of ovarian tissue Vitrified ovaries were removed from liquid nitrogen and immersed in warming solution (0.5 and 0.25 M sucrose solutions in L-15 medium) for 3 and 5 minutes respectively at 37 ºC. Finally, the fragments were immersed in DM (L-15 and supplemented with 1% FBS) at 37 ºC. PEG-VS preparation and ovarian tissue encapsulation The ovarian tissue pieces with sizes (3x3x1 and 1x1x1mm) were individually encapsulated into a 10 µl droplet of the PEG-VS (5%) hydrogel as described in previous reports (Shikanov et al., 2011).

101 100 Alginate preparation and ovarian tissue encapsulation The ovarian tissue pieces with sizes (1x1x1 mm) were individually encapsulated into a 10 µl droplet of the Alginate (55 65% guluronic acid) hydrogel as described in previous reports (Xu et al., 2006). Culture media The basic culture medium consisted of α-mem (ph ) supplemented with 3% human serum albumin (HSA), 1% ITS (10 µg/ml insulin, 5.5 µg/ ml transferrin and 5 ng/ml selenium) and 1 ml/ml fetuin (α-mem + ) (Experiment I). In the Experiment II, it was used α-mem + alone or supplemented with 10 miu/ml hrfsh. Experimental protocol The vitrified fragments were transferred to 48-well and 96-well culture dishes containing 400 and 150 L of culture media, respectively experiment I and II as described below. The culture was performed at 37 C in 5% CO2 in a humidified incubator. The experiment was replicated 5 times and the culture media were replaced every other day. Experiment I The cryopreserved ovarian cortex tissue fragments were cut into 60 slices (approximate size 3x3x1 mm). Twenty fragments were immediately fixed ( Noncultured control) and the remaining ovarian fragments (n=40) were submitted to in vitro culture in α-mem + for 7, 14, 21 and 28 days as follows: preantral follicles enclosed in ovarian fragments were cultured in α-mem + alone (cultured control) or encapsulated in PEG-VS. Experiment II The cryopreserved ovarian cortex tissue fragments were cut into 80 slices

102 101 (approximate size 1x1x1 mm). Twenty fragments were immediately fixed ( Noncultured control) and the remaining ovarian fragments (n=60) were submitted to in vitro culture for 3, 6, and 10 days in the following conditions: preantral follicles enclosed in ovarian fragments were encapsulated in PEG-VS or Alginate and cultured in α-mem + alone or α-mem + supplemented with rhfsh. Morphological analysis and evaluation of follicular growth in vitro Before culture (fresh control) and after culture, the ovarian fragments were fixed in Bouin`s for 24 hours. After the fixation, the samples were washed (thrice) in alcohol (50 and 70 %) and embedded in paraffin. The paraffin blocks were cut into 6 m sections, each section was mounted on glass slides and stained by Hematoxylin/Eosin. Follicle stage and survival were assessed microscopically on serial sections. Coded anonymized slides were examined by one person only on a microscopy (Leica, 200 X magnification). The unilaminar follicles were classified according to their developmental stage as primordial (one layer of flattened granulosa cells or one layer of a mixture of flattened and cuboidal granulosa cells) or primary (from one to less than two complete layers of cuboidal granulosa cells) (Lundy et al 1999). Also, these follicles were still classified individually as histologically normal when an intact oocyte was present, surrounded by granulosa cells which were well organized in one or more layers and have no pyknotic nucleus. Atretic follicles were defined as those with a retracted oocyte, pyknotic nucleus, and/or disorganized granulosa cells detached from the basement membrane. Statistic All statistical analyses were carried out using Sigma Plot 11.0 (Systat Software Inc.). Comparison of means was analyzed by the Fisher`s exact teste, whereas follicular integrity and development were analyzed by chi-square test. Data was presented as percentage and mean ± standard error of mean (SEM) and P-value <0.05 was considered statistically significant.

103 102 Results Morphological normal follicles and development I A total of 1,557 follicles were evaluated before and after in vitro culture. Morphological normal and degenerated follicles enclosed in ovarian tissue before and after 7, 14, 21 and 28 days of in vitro culture are shown (Figure 1). The results showed a reduction (P < 0.05) in the percentage of morphological normal follicles (MNF) vitrified tissue (non-cultured) when compared to fresh control (non-vitrified and non-cultured) from 401 number of follicles in vitrified to 928 number in control (Figure 2C). In relation to the different follicular categories, the treatment vitrificated decreased P < 0.05) the percentages of primordial MNF when compared the fresh control (Figure 3). This effect was intensified after 7 days of culture in fragments with the proximal diameter (3x3x1 mm) encapsulated or not in the PEG-VS hydrogel that presented high rates of follicular death (Figure 4) and further total death between 14 and 28 days of culture (Figure 1). However, alive secondary follicles were observed in Fragment + PEG treatment only (Figure 4). Based on these results we reduced the mean diameter of the fragments from (3x3x1 mm) to (1x1x1 mm) and we added hrfsh to the culture medium comparing two different matrices (PEG-VS vs ALG) for Experiment II. Morphological normal follicles and development experiment II A total of 1,462 follicles were evaluated before and after in vitro culture. Morphological normal and degenerated follicles before and after 3 and 10 days of in vitro culture are shown (Figure 5). Compared to the non-cultured control, a significant reduction in the percentage of MNF was observed after culture regardless the treatments. However, it is important to emphasize that both treatments cultured with hrfsh presented a higher (P < 0.05) percentage of MNF compared to the treatments without hrfsh (Figure 6). The percentages of MNF in different follicle stages after in vitro culture for 10 days are shown (Figure 7). Dead follicles were found in all follicular categories and treatments which were higher than non-cultured control. Regardless the matrix (PEG or ALG), the addition of hrfsh reduced (P<0.05) the percentage of dead follicles. Compared to non-cultured control, PEG + FSH reduced the percentage of

104 103 primordial follicles with a concomitant increase in the percentage of primary follicles suggesting that follicular activation had occurred (P<0.05). Finally, in the presence of hrfsh, PEG-VS showed a higher percentage of primary follicles than ALG (P<0.05). Discussion This study demonstrated for the first time that adding hrfsh in association with PEG-VS or Alginate improved in vitro the survival and folliculogenesis of baboon preantral follicles enclosed in ovarian tissue. The IVC of follicles in tissue with culture in fragments with the proximal diameter (3x3x1 mm) encapsulated or not with PEG-VS failed to maintain follicular morphology (experiment I). An additional layer of hydrogel around already dense tissue could limit the diffusion of nutrients and oxygen towards the cell during culture further affecting follicle growth and survival, possibly causing a significantly lower survival of follicles in larger fragments of (3x3x1 mm) compared to the smaller ones. Besides that, we also observed several disorganizations of granulosa cells. We believe that the degeneration of the granulosa cells observed may be related to the low rates of survival and follicular development. Previously, studies in human and mouse demonstrated that follicular cells are more sensitive to cryoinjuries than oocytes when using the same technique (Eyden et al., 2004; Navarro-Costa et al 2005). Following cryopreservation, the cells need appropriate conditions (temperature and osmolarity) for its readaptation and return to the normal metabolism, being more susceptible to cell death (Men et al., 2003; Rahimi et al., 2004; Choi et al., 2008). Moreover, Castro et al. (2014) showed that bovine cryopreserved follicles require specific conditions for in vitro culture to respond in a similar way or to keep characteristics similar to fresh follicles. After 10 days of culture, tissues encapsulated with PEG and ALG with hrfsh showed higher rates of MNF compared to the treatments without hrfsh. In goats, Magalhães et al. (2009) reported that hrfsh maintained survival and follicular ultrastructure, and promoted the activation and growth of primordial follicles after Day 7 of culture. We believe that the positive effect of hrfsh observed on in vitro follicle culture in the present study might have been because of its direct and/or indirect action. Among the direct effects is the activation of genes that code for the stimulation of cell proliferation and steroid synthesis (Navalakhe et al., 2013). In addition, hrfsh

105 104 receptors were reported in oocytes of primordial follicles of porcine and primary follicles in humans (Méduri et al., 2002) and in granulosa cells from the primary follicle stage onward in horses (Scarlet et al., 2015). Among the direct effects is the activation of genes that code for the stimulation of cell proliferation and steroid synthesis (Navalakhe et al., 2013). Indirectly, hrfsh regulates the expression of some of the many important substances that play a role in folliculogenesis, such as kit-ligand, GDF- 9, and BMP-15 (Thomas et al., 2005). Such an effect is possibly because of the stimulatory effect of hrfsh on the expression of genes involved in proliferation and differentiation of granulosa cells (Ji et al., 2004), which in turn induce multiple signaling cascades (Wayne et al., 2007), and can quickly stimulate the activation of mitogen-activated protein kinases pathways and phosphatidylinositol 3-kinase, which impact cell proliferation (Hunzicker-Dunn et al., 2012). Conclusions In conclusion, the ovarian tissue with the proximal diameter (3x3x1 mm) limited follicle development during IVC. However, the fragment size reduction to (1x1x1 mm) included in matrices (PEG-VS and Alginate) and associated with the addition of hrfsh in the culture medium promoted improved survival of preantral follicles from cryopreserved tissue. Acknowledgments Hudson Henrique Vieira Correia is the recipient of a grant from CNPq (Brazil). Dean Myers, Ph D. University of Oklahoma for Baboon Tissue. Conflict of interest There is no conflict of interest that could be perceived as prejudicing the impartiality of the research reported.

106 105 Figure 1. Representative images of follicles after in vitro culture for 7 (A-E) 14 (B-F) 21 (C-G) 28 (D-H) days from Fragment (A-D), Fragment + PEG (E-H) groups, respectively. (Experiment I)

107 106 Figure 2. (A-B) Representative images of these follicles enclosed in ovarian tissue fresh (Fresh control) or after vitrified (Vitrified control). (C) Percentage of follicles in fresh ovarian tissue and after vitrification (*P < 0.05).

108 107 Figure 3. Percentage of follicles in different stage of development in fresh ovarian tissue (Fresh control) and after vitrification (Vitrified control) (*P < 0.05). Figure 4. Percentage of follicles in different stage of development in vitrified ovarian tissue before (non-cultured control-day 0) and after 7 days of culture of fragment without (fragment treatment) or encapsulated in PEG (Fragment + PEG treatment) (*P < 0.05).

109 108 Figure 5. Representative images of follicles after in vitro culture for 3 (A-D) and 10 (E-H) days from PEG + FSH (A and E), PEG (B and F), ALG + FSH (C and G) ALG (D and H) groups, respectively. (Experiment II)

110 109 Figure 6. Number of morphologically normal follicles in vitrified ovarian before (noncultured control-day 0) and after 10 days of culture from PEG + FSH, PEG, ALG + FSH ALG groups. A,B,C Indicate differences among treatments (P < 0.05). Figure 7. Percentage of follicles in different stage of development in vitrified ovarian tissue before (non-cultured control- Day 0) and after 10 days of culture from PEG + FSH, PEG, ALG + FSH ALG groups. A,B,C Indicate differences among treatments within the same follicular category (P < 0.05).

111 110 References Castro, S.V., Carvalho, A.A., Gomes Silva, C.M., Santos, F.W., Campello, C.C., de Figueiredo, J.R., et al. Frozen and fresh ovarian tissue require different culture media to promote in vitro development of bovine preantral follicles. Biopreserv Biobank, v. 12, p , Choi, J., Lee, B., Lee, E., Yoon, B-K., Bae, D., Choi, D. Cryopreservation of ovarian tissues temporarily suppresses the proliferation of granulosa cells in mouse preantral follicles. Cryobiology, v. 56, :p , Dolmans, M-M., Marinescu, C., Saussoy, P., Van Langendonckt, A., Amorim, C., Donnez, J. Reimplantation of cryopreserved ovarian tissue from patients with acute lymphoblastic leukemia is potentially unsafe. Blood, v. 116, p , Eyden, B., Radford, J., Shalet, S.M., Thomas, N., Brison, D.R., Lieberman, B.A. Ultrastructural preservation of ovarian cortical tissue cryopreserved in dimethylsulfoxide for subsequent transplantation into young female cancer patients. Ultrastruct Pathol, v. 28, p , Fabbri, R., Vicenti, R., Macciocca, M., Pasquinelli, G., Paradisi, R., Battaglia, C., et al. Good preservation of stromal cells and no apoptosis in human ovarian tissue after vitrification. Biomed Res Int, , Hornick, J.E., Duncan, F.E., Shea, L.D., Woodruff, T.K. Isolated primate primordial follicles require a rigid physical environment to survive and grow in vitro. Hum Reprod. v. 27, p , Hunzicker-Dunn, M.E, Lopez-Biladeau, B., Law, N.C., Fiedler, S.E., Carr, D.W., Maizels, E.T. PKA and GAB2 play central roles in the FSH signaling pathway to PI3K and AKT in ovarian granulosa cells. Proc Natl Acad Sci USA, v. 109, p. E , 2012.

112 111 Ji, Q., Liu, P.I., Chen, P.K., Aoyama, C. Follicle stimulating hormone-induced growth promotion and gene expression profiles on ovarian surface epithelial cells. Int J Cancer, v. 112, p , Laronda, M.M., Duncan, F.E., Hornick, J.E., Xu, M., Pahnke, J.E., Whelan, K.A., Shea, L.D., Woodruff, T.K. Alginate encapsulation supports the growth and differentiation of human primordial follicles within ovarian cortical tissue. J. Assist. Reprod. Genet, v. 31, p , Lundy, T., Smith, P., O'Connell, A., Hudson, N.L., McNatty, K.P. Populations of granulosa cells in small follicles of the sheep ovary. J Reprod Fertil, v. 115, p ,1999. Men, H.S., Monson, R.L., Parrish, J.J., Rutledge, J.J. Degeneration of cryopreserved bovine oocytes via apoptosis during subsequent culture. Cryobiology, v. 47, p , Méduri, G., Charnaux, N., Driancourt, M. A., Combettes, L., Granet, P., Vannier, B., Loosfelt, H., Milgrom, E. Follicle-stimulating hormone receptors in oocytes? J Clin Endocrinol Metab, v. 87, p , McLaughlin, M., Albertini, D.F., Wallace, W.H.B., Anderson, R.A., Telfer, E.E. Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system. Mol Hum Reprod, v. 24, p , Mendez, U., Zhou, H., Shikanov, A. Synthetic PEG Hydrogel for Engineering the Environment of Ovarian Follicles. Methods Mol Biol, v. 1758, p , Magalhães, D.M., Araújo, V.R., Lima-Verde, I.B., Matos, M.H.T., Silva, R.C., Lucci, C.M., et al. Different follicle-stimulating hormone (FSH) sources influence caprine preantral follicle viability and development in vitro. Braz J Vet Res Anim Sci, 46 (2009), pp

113 112 Navalakhe RM1, Jagtap DD, Nayak SU, Nandedkar TD, Mahale SD. Effect of FSH receptor-binding inhibitor-8 on FSH-mediated granulosa cell signaling and proliferation. Chem Biol Drug Des, v. 82, p , Navarro-Costa, P., Correia, S.C., Gouveia-Oliveira, A., Negreiro, F., Jorge, S., Cidadao, A.J., et al. Effects of mouse ovarian tissue cryopreservation on granulosa cell-oocyte interaction. Hum Reprod, v. 20, p , Rahimi, G., Isachenko, E., Isachenko, V., Sauer, H., Wartenberg, M., Tawadros, S., et al. Comparison of necrosis in human ovarian tissue after conventional slow freezing or vitrification and transplantation in ovariectomized SCID mice. Reprod Biomed Online, v. 9, p , Rosendahl, M., Andersen, M.T., Ralfkiaer, E., Kjeldsen, L., Andersen, M.K., Andersen, C.Y. Evidence of residual disease in cryopreserved ovarian cortex from female patients with leukemia. Fertil Steril, v. 94, p , Santos, R.R., Tharasanit, T., Van Haeften, T., Figueiredo, J.R., Silva, J.R.V., Van den Hurk, R. Vitrification of goat preantral follicles enclosed in ovarian tissue by using conventional and solid-surface vitrification methods. Cell Tissue Res, v.327, p , Shikanov, A., Smith, R.M., Xu, M., Woodruff, T.K., Shea, L.D. Hydrogel network design using multifunctional macromers to coordinate tissue maturation in ovarian follicle culture. Biomaterials, v. 32, p , Scarlet, D., Walter, I., Hlavaty, J., Aurich, C. Expression and immunolocalisation of follicle-stimulating hormone receptors in gonads of newborn and adult female horses. Reprod Fertil Dev, , Thomas, F.H., Ethier, J. F., Shimasaki, S., Vanderhyden, B. C. Follicle-stimulating hormone regulates oocyte growth by modulation of expression of oocyte and granulosa cell factors. Endocrinology, v.146, p , 2005.

114 113 Vanacker, J., Luyckx, V., Amorim, C., Dolmans, M-M., Van Langendonckt, A., Donnez, J., et al. Should we isolate human preantral follicles before or after cryopreservation of ovarian tissue? Fertil Steril, v. 99, p , Wayne, C.M., Fan, H.Y., Cheng, X., Richards, J.S. Follicle-stimulating hormone induces multiple signaling cascades: evidence that activation of Rous sarcoma oncogene, RAS, and the epidermal growth factor receptor are critical for granulosa cell differentiation. Mol Endocrinol, v. 21, p , Woodruff, T.K., Shea, L.D. A new hypothesis regarding ovarian follicle development: ovarian rigidity as a regulator of selection and health. J Assist Reprod Genet, v. 28, p. 3-6, Xu, M., Kreeger, P.K., Shea, L.D., Woodruff, T.K. Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring. Tissue Eng, v. 12, p , 2006.

115 114 9 CAPÍTULO 4 Cilostamide affects in a concentration and exposure time-dependent manner the viability and the kinetics of in vitro maturation of caprine and bovine oocytes Published 2019 Research in Veterinary Science H.H.V. Correia¹, L.A. Vieira¹, C.M. Mielgo¹, V.M. Paes 1, B.G. Alves 1, J.R.V. Silva², M.B. Wheeler 3, A.P.R. Rodrigues 1, J.R. Figueiredo¹* ¹ Laboratory of Manipulation of Oocytes and Preantral Follicles (LAMOFOPA), State University of Ceará, Fortaleza, CE, Brazil ² Biotechnology Nucleus of Sobral (NUBIS), Federal University of Ceará - Sobral, Brazil 3 Department of Animal Sciences, University of Illinois, Urbana-Champaign, Urbana, IL, United States *Correspondence should be addressed to: Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Pré-Antrais (LAMOFOPA). Universidade Estadual do Ceará (UECE). Av. Silas Munguba, 1700, Campus do Itaperi. Fortaleza CE Brasil. CEP: Tel.: ; Fax: address: jrf.lamofopapapers@gmail.com (J.R. Figueiredo)

116 115 Resumo Este estudo investigou: 1) a cinética da configuração da cromatina oocitária durante a maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos e caprinos; e 2) o efeito da pré-maturação in vitro (PMIV) utilizando cilostamida, parede folicular (PF) ou a associação entre elas. No experimento I, os complexos cumulus-oócito (CCOs) foram cultivados in vitro em meio de maturação padrão por 6, 12, 18 ou 30 horas. Para o experimento II, os CCOs foram cultivados durante 30 horas, quer num meio de MIV convencional ou em meio de PMIV contendo cilostamida (10 ou 20 µm) e PF isoladamente ou em combinação, durante 6 ou 12 horas antes do início da maturação. A taxa MII foi semelhante (P> 0,05) entre 18 e 30 horas de maturação, sendo ambas maiores (P <0,05) que 6 e 12 horas de MIV em ambas as espécies (Experimento I). Ao contrário da espécie caprina, em bovinos todos os tratamentos PMIV apresentaram maior (P <0,05) porcentagem de oócitos presos no estágio VG em comparação com o tratamento controle após 6 horas de cultivo. A porcentagem de oócitos bovinos em MII após 30 horas (PMIV + MIV) de cultivo em tratamento com 10μM de cilostamida + PF e PF sozinha cultivados por 6 horas apresentou porcentagens de MII semelhantes ao controle. No entanto, em caprinos, esses tratamentos reduziram significativamente os percentuais de MII em relação ao tratamento controle (Experimento II). Em conclusão, a combinação da concentração/tempo de exposição à cilostamida durante a PMIV retardou a progressão meiótica apenas em bovinos após 6 e 12 horas de cultivo. No entanto, em geral, o período de cultivo (PMIV + MIV) influenciou a configuração e cinética da cromatina oocitária em ambas as espécies. Palavras-chave: bovino, caprino, cilostamida, parada da meiose, pré-maturação.

117 116 Abstract This study investigated: 1) the kinetics of oocyte chromatin configuration during in vitro maturation (IVM) of caprine and bovine oocytes; and 2) the effect of in vitro prematuration (IVPM) with cilostamide with or without association of the follicular wall (FW) on the same parameters. In experiment I, cumulus-oocyte complexes (COCs) were cultured in vitro in a standard maturation medium for 6, 12, 18 or 30 hours. For experiment II, the COCs were cultured for 30 hours, either in a standard IVM medium or in IVPM containing cilostamide (10 or 20 µm) and FW alone or in combination, for 6 or 12 hours before the onset of maturation. The MII rate was similar (P > 0.05) between 18 and 30 hours of maturation, both of which were higher (P < 0.05) than 6 and 12 hours IVM in both species (Experiment I). Contrary to caprine, all IVPM treatments presented a higher (P < 0.05) percentage of bovine oocytes arrested at the GV stage than the control treatment after 6 hours of culture. The percentage of MII oocytes after 30 hours (IVPM+IVM) of culture in bovine oocytes treated with 10μM cilostamide associated with FW and FW alone cultured for 6 hours presented MII percentages similar to the control. However, in caprine, these treatments significantly reduced the percentages of MII in relation to the control treatment (Experiment II). In conclusion, the combination of concentration-exposure time to cilostamide during IVPM delayed meiotic progression in bovine after 6 and 12 hours of culture. However, overall the culture period (IVPM+IVM) influenced the oocyte chromatin configuration and kinetics in both species. Keywords: bovine, caprine, cilostamide, meiosis arrest, pre-maturation.

118 Introduction The maturation of mammalian oocytes is a complex process involving synchronization between cytoplasmic and nuclear maturation. Cytoplasmic maturation refers to the oocyte gaining the ability to form a viable embryo after fertilization and consists in the reorganization of the intracellular organelles, mrna storage, and synthesis of proteins and transcription factors. Nuclear maturation, on the other hand, is the progression of chromosomes to metaphase II of meiosis (Watson, 2007; Mao et al., 2014). Some in vitro matured oocytes are not able to complete cytoplasmic maturation and resume meiosis simultaneously thus limiting their potential for development (Chian, Lim, & Tan, 2004). This asynchrony is due to spontaneous nuclear maturation which leads to chromatin condensation, thus preventing RNA synthesis and the accumulation of several molecules essential for early development (Bilodeau & Côté, 2012). The use of strategies to regulate the meiotic cell cycle would be a useful alternative to avoid the asynchrony between nuclear and cytoplasmic maturation. It is believed that cyclic adenosine monophosphate (camp) plays a fundamental role in the maintenance of mammalian meiotic arrest. Increasing intra-oocyte levels of camp maintain meiotic arrest in vitro (M Conti et al., 2002) and can improve the synchronization between nuclear and cytoplasmic maturation (Nogueira et al., 2003a). In addition, numerous studies suggested that during maturation, temporary blockage of meiotic resumption (in vitro pre-maturation, IVPM) can synchronize nuclear and cytoplasmic maturation, either in vivo (Wiersma et al., 1998) or in vitro in several species including cattle, (Mayes, 2002; Thomas, Armstrong, & Gilchrist, 2002); monkeys, (Jensen et al., 2002); swine (Sasseville et al., 2006; Dieci et al., 2013) and mice, (Coticchio et al., 2004). The use of camp modulators, such as, cilostamide, on in vitro oocyte maturation is controversial since positive (Nogueira et al., 2003b), negative (Leen Vanhoutte et al., 2007) or no effects on MII rates (Gharibi et al., 2013) have been obtained. The temporary arrest of nuclear maturation of human oocytes with the specific phosphodiesterase type 3 inhibitor (ipde3) is beneficial for obtaining normal meiotic spindle configurations, normal chromosomes after the in vitro maturation (IVM), and also results in synchronization of germinal vesicle (GV) stage oocytes (Nogueira et al., 2003b). It is well known that oocytes recovered from large antral follicles spontaneously resume meiosis in vitro when released into culture medium. Therefore, it

119 118 has been suggested that the follicular wall inhibits meiotic resumption through the secretion of oocyte meiotic inhibitors from the granulosa cells (Richard and Sirard, 1996; Thomas et al., 2002). In cattle, cumulus-oocyte complexes (COCs) co-cultured in continuous contact with the follicular wall, for 24 hours, maintained all of their enclosed oocytes in GV stage (De Loos, Zeinstra, & Bevers, 1994). In vitro studies have also shown that co-culturing COCs with the follicular wall inhibits meiotic oocyte resumption, at least temporarily (Richard and Sirard, 1996). Further, paracrine factors secreted by granulosa and theca cells can regulate many important aspects during oocyte development (Richard and Sirard, 1996). Therefore, we hypothesize that the addition of the follicular wall during the in vitro culture of COCs may potentially improve the meiotic resumption inhibitory effect of cilostamide. The efficiency of cilostamide to block meiosis in large mammals: human (L. Vanhoutte, Nogueira, & De Sutter, 2009), pigs (Dieci et al., 2013), sheep (Gharibi et al., 2013) and cattle (Luciano, Franciosi, Modina, & Lodde, 2011) ranged from 50 to 90%. However, in human IVM, the use of ipde3 at 10 µm for 24 hours pre-maturation increased the rates of nuclear maturation without compromising embryonic development (Nogueira et al., 2006). In swine, ipde3 in the media, at a concentration of 1µM for 24 hours pre-maturation, improved developmental competence of in vitro matured oocytes (Dieci et al., 2013), increased the fertilization rate, and embryo development rate. Despite the importance of the synchronization of cytoplasmic and nuclear maturation reported in the aforementioned studies, there are no in vitro reports using cilostamide, a phosphodiesterase type 3 inhibitor - ipde3, in goat oocytes. Moreover, to the best of our knowledge, there are no studies investigating the effect of cilostamide in combination with the follicular wall during in vitro maturation of ruminant oocytes. Therefore, the aim of this study was to evaluate the effect of pre-maturation with cilostamide at different concentrations (10 µm or 20 µm) and exposure times (6 and 12 hours) with or without the follicular wall (FW) on the viability, and the kinetics of nuclear maturation of caprine and bovine oocytes. In addition, the kinetics of oocyte chromatin configuration change during in vitro maturation was also investigated in both species.

120 Materials and methods The reagents and chemical used in this study were obtained from Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) unless otherwise indicated Source of ovaries A total of 360 ovaries from non-pregnant cycling, adult, crossbred cows (n = 90) and goat does (n = 90) were collected, at a local slaughterhouse. Immediately postmortem, each pair of the caprine and bovine ovaries were washed twice in physiological saline solution (0,9% (w/v) NaCl) supplemented with antibiotics (100 μg/ml -1 kanamycin sulfate). Ovaries were transported to the laboratory in an insulated container in physiological saline solution 0.9% at 33 C (De Loos et al., 1994; Richard and Sirard, 1996). The transport time averaged ~4 h Collection and in vitro maturation of cumulus-oocytes complexes In the laboratory, a total of 1,721 COCs (n = 252 experiment I and, n = 1,469 experiment II) were aspirated from medium-sized follicles (2-4 mm in diameter in caprine and 4-6 mm in bovine) using 18-G needles connected to 10-mL disposable syringes. Oocytes with a compact cumulus mass and a dark, evenly granulated cytoplasm were washed in 5 ml of tissue culture medium (TCM-199 HEPES Modification) supplemented with 1% polyvinyl alcohol, 4.2 mm sodium bicarbonate, 10 mm HEPES, 2 mm glutamine, 50 UI/mL -1 penicillin and 50 µg/ml -1 streptomycin for bovine oocytes and TCM-199 supplemented with 10 mm HEPES, 15% fetal calf serum (FCS) and 1% antibiotics (streptomycin and penicillin) for caprine oocytes. Thus, COCs were washed twice in TCM-199 supplemented with 10% FCS, 0.2 mm sodium pyruvate, 2 mm L-Glutamine, 0.05 μg/ml -1 gentamicin for bovine oocytes and in TCM-199 supplemented with 1 mg/ml -1 BSA, 1 mm/ml -1 pyruvate, and 100 µm/ml -1 cysteamine previously equilibrated for at least 2 hours in a 5% CO2 in air atmosphere. The selected caprine and bovine oocytes were washed three times in the maturation medium consisting of TCM-199 supplemented with 10% FCS, 0.2 mm sodium pyruvate, 2 mm L-Glutamine, 0.05 μg/ml -1 gentamicin, 10 UI/mL -1 ecg and 10

121 120 UI/mL -1 hcg for bovine oocytes. For caprine oocytes, the maturation medium was TCM-199 supplemented with 1 mg/ml -1 BSA, 1 mm/ml -1 pyruvate, 0,5 µg/ml -1 FSHr, 5 µg/ml -1 LH, 1 µg/ml -1 17β-estradiol, 10 ng/ml -1 epidermal growth factor, 50 ng/ml - 1 insulin-like growth factor 1 and 100 µm/ml -1 cysteamine. Groups of 30 to 35 oocytes were cultured in 4-well dishes (Nunc, Roskilde, Denmark) containing 400 µl of maturation medium for both species and incubated for 30 hours at 39 C in a 5% CO2 in air atmosphere Isolation of follicular walls A total of 24 ovaries (caprine, n = 12 and bovine, n = 12) were used to produce the follicular walls. In each replicate, two ovaries from the same animal were divided into two halves using a surgical blade and placed in holding medium (MEM-HEPES). Follicles were visualized under a stereomicroscope (SMZ 645 Nikon, Tokyo, Japan), and then the early antral follicles (2-4 mm in caprine and 4-6mm in bovine) were isolated and transferred into Petri dishes (35 10 mm; Corning, USA) containing TCM- 199 HEPES with the same supplements described above. Next, each antral follicle was divided into two halves to generate two Hemi-follicular walls using a surgical blade, and then, the follicular walls (two halves for each well) were co-cultured with COCs in medium supplemented or not with cilostamide during in vitro pre-maturation as described further in the experimental design Preparation of stock solutions of cilostamide Cilostamide was diluted in pure dimethylsulfoxide solution to make the initial cilostamide concentration (1.5 M) and stored at -20 C. These stock solutions were diluted in IVM medium to produce the final concentrations of 10 µm and 20 µm Morphological evaluation COCs were classified as degenerated after culture (IVPM and/or IVM) when the oocytes and surrounding cumulus cells appeared dark or if the oocytes were misshapen In experiments I and II, the percentage of degenerate caprine COCs were 0% (n =

122 121 0/126) and 27% (n = 197/735), respectively and the percentage of degenerate bovine COCs were 0% (n = 0/126) and, 31% (n = 227/734), respectively. Only morphologically normal caprine and bovine COCs that showed an intact zona pellucida, bright and homogeneous cumulus cells and no dark oocyte were selected for the evaluation of chromatin configuration after in vitro culture. The percentage of morphologically normal caprine COCs were 100% (n = 126/126) for experiment I and, 73% (n = 538/735) for experiment II. The percentage of morphologically normal bovine COCs were 100% (n = 126/126) for experiment I and, 69% (n = 507/734) for experiment II). The oocytes were classified as GV, GVBD, MI, MII or degenerated (Fig. 1) Assessment of nuclear chromatin configuration of bovine and caprine oocytes after conventional in vitro maturation (Experiment I) As previously described, a total of 252 (126 bovine and 126 caprine). morphologically normal COCs (30-35 per tested time point) were evaluated. COCs were cultured in standard in vitro maturation medium, as described above, for 6, 12, 18 or 30 hours. After the designated culture period, the COCs were denuded mechanically by repeated pipetting with a pre-calibrated eyepiece micrometer using a stereomicroscope (SMZ 645 Nikon, Tokyo, Japan) at 100 magnification. The oocytes were labeled with 4 μm calcein-am (excitation at 488 nm), 2 μm ethidium homodimer- 1 (excitation at 568 nm) and 10 μm Hoechst (excitation at 483 nm), mounted on slides and examined using a fluorescence microscope (Nikon, Eclipse 80i, Tokyo, Japan). The oocytes were considered viable when the cytoplasm was positively marked by calcein-am (green fluorescence) and non-viable if the chromatin was marked by ethidium homodimer-1 (red fluorescence). Calcein-AM staining labelled the activity of intracellular esterases of viable cells and the ethidium homodimer-1 staining labelled the nucleic acids of non-viable cells indicating ruptured membranes (Fig. 2). Hoechst staining was used to assess of chromatin configuration, allowing the viewing of the stages of intact GV (presence of a spherical nucleus surrounded by an intact nuclear membrane and decondensed chromatin), the germinal vesicle breakdown (GVBDpresence of chromosomal condensation and disintegration of the nuclear membrane), metaphase I (MI- presence of a metaphase plate located peripherally in the ooplasm)

123 122 and metaphase II (MII- presence of the metaphase chromosomes at the periphery of the ooplasm, as well as by the extrusion of the first polar body) Assessment of nuclear chromatin configuration of bovine and caprine oocytes after in vitro pre-maturation with cilostamide with or without follicular wall (Experiment II) A total of 1,045 (507 bovine and 538 caprine) morphologically normal COCs (30-35 per treatment) were evaluated. This experiment was conducted to evaluate the effect of IVPM with cilostamide (10 µm or 20 µm), with or without the follicular wall, for 6 or 12 hours before the onset of maturation. The duration of subsequent in vitro maturation was 24 or 18 hours, respectively, totalling 30 hours of culture. This experiment had eleven treatments that were administered (Table 1). The IVPM medium consisted of IVM medium without hormones. Briefly, oocytes were transferred to 400 µl of IVPM in multi-dish wells and incubated for 6 or 12 hours at 39 C in a 5% CO2 in air atmosphere. After the exposure time, a portion of the oocytes (n = 30-35) in each IVPM treatment were denuded and assessed. The other portion of the COCs (n = 30-35) were transferred to fresh IVM medium without cilostamide and follicular walls and cultured for an additional 24 or 18 h, respectively. This portion of the COCs had a total of 30 hours of culture (IVPM+IVM) for all treatments (eleven treatments in total - Table 1). The total culture period of 30 hours was chosen and used for all treatments since a previous study showed that bovine oocytes are likely to resume meiosis shortly after 6 hours of culture even in the presence of milrinone, a PDE3 inhibitor. At the end of IVM and after IVPM, all COCs were completely denuded using hyaluronidase. The oocyte chromatin configuration, and viability were then evaluated as described above Statistical analysis All statistical analyses were performed using R Statistical software (R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria). The distribution of the oocyte meiotic stages among treatments was analyzed by chi-square or Fisher's exact test. Next, the factors treatment (control and cilostamide 10 or 20 µm), time of IVPM (6 or 12 hours), and FW, were considered in a multiple logistic regression analyses to determine their association with the GV and MII rates. Data are presented as

124 123 percentages, and the results were considered different when P < Probability values > 0.05 and < 0.1 indicate that a difference approached significance. 3. Results 3.1. Assessment of nuclear chromatin configuration of bovine and caprine oocytes after conventional in vitro maturation (Experiment I) Caprine and bovine oocyte kinetics (GV, GVBD, MI, and MII) after different culture periods of IVM (6, 12, 18 and 30 hours) are shown in Table 2. The results of experiment I showed the MII rate was similar (P > 0.05) between 18 and 30 hours of maturation, both of which were higher (P < 0.05) than 6 and 12 hours of IVM in both species Assessment of nuclear chromatin configuration of bovine and caprine oocytes after in vitro pre-maturation (Experiment II) The multiple logistic regression analysis was performed to evaluate the influence of the factors treatment (control and cilostamide concentration), FW, and IVPM time on GV (Table 3) and MII rates (Table 4). After 6 hours of IVPM, the blockage efficiency, i.e. maintenance of oocytes arrested at the GV stage ranged from 26.7 to 76.7% (Fig. 3). In bovine COCs, cilostamide concentration (0, 10 and 20 μm) and IVPM time were associated (P < 0.05) with the percentage of GV stage (Table 3). Oocytes subjected to cilostamide 20 μm had a higher odds (1.9 times) to remain at GV stage in comparison with cilostamide 10 μm and control groups. Also, oocytes subjected to IVPM for 12 hours were less likely (0.5 times) to remain at GV stage than those in vitro pre-matured during 6 hours. It is important to highlight that only the 20 μm cilostamide treatment maintained the percentage of GV oocytes for both 6 and 12 hours of IVPM (Fig. 3). In caprine, only IVPM time was associated (P < 0.05) with the GV rates. Thus, COCs in vitro pre-matured for 12 hours showed less probability (0.5 times) to remain at GV stage compared to those in vitro pre-matured for 6 hours (Table 3 and Fig. 3).

125 124 With regard to the influence of the cilostamide concentration (0, 10 and 20 μm), FW, and IVPM time on MII rates (Table 4), the data showed that in bovine COCs, cilostamide concentration (0, 10 and 20 μm) and FW were associated (P < 0.05) with the metaphase II rate. Oocytes exposed during IVPM to 20 μm cilostamide were less likely (0.6 times) to reach metaphase II in comparison with 10 μm cilostamide and control groups. In addition, oocytes subjected to IVPM associated with FW were less likely (0.5 times) to reach metaphase II than in IVPM without FW. Only bovine COCs treated with 10 μm cilostamide associated with FW or FW alone cultured for 6 hours showed a percentage of MII oocytes similar to the control treatment (Fig. 4). In goats, cilostamide concentration and IVPM time (P < 0.05) were associated with metaphase II rate. Oocytes subjected to cilostamide 20 μm had a higher odds (3.9 times) of reaching MII stage in comparison with cilostamide 10 μm and control groups. In addition, COCs pre-matured for 12 hours of IVPM showed increased odds (4.7 times) of reaching metaphase II in comparison with in vitro pre-matured oocytes for 6 hours. Conversely, a negative coefficient was observed for interaction (P < 0.05) treatment in vitro pre-maturation showing that the combined action of the two factors was less than their individual effects. In relation to the control, only oocytes exposed to 20 μm of cilostamide associated with FW had similar metaphase II rates within an interval of 6 hours of IVPM. In contrast, after 12 hours of IVPM the same treatment showed a decrease of metaphase II rates compared to the control (Table 4 and Fig. 4). 4. Discussion This study investigated, for the first time, the effect of IVPM with cilostamide (at different concentrations and exposure times) in the presence or absence of follicular walls on oocyte chromatin configuration and nuclear kinetics after culture (IVPM+IVM) in bovine and caprine oocytes. The results showed that, depending on the species, the combination of cilostamide concentration, exposure time and association with FW during IVPM, it is possible to temporary suppress oocyte meiotic resumption without significantly affecting further oocyte in vitro maturation. The nuclear kinetics (GV, GVBD, MI, and MII) of caprine and bovine oocytes were evaluated after different culture periods (6, 12, 18 or 30 hours) of IVM

126 125 (Experiment I). Higher rates of MII oocyte development were obtained in both species from hours of culture. Several authors have described similar results in cattle oocytes (Sharma et al., 1996; Wu et al., 1996). In contrast, Sharma et al. (1996) argued that caprine oocytes required a longer culture period (32 h) to complete nuclear maturation. However, Rho et al. (2001) reported in goats similar oocyte maturation rates were obtained after culture for 18 hours, which is in agreement with the results obtained in our study. Regarding IVPM, cilostamide has been shown to block meiotic resumption by inhibiting PDE3 in several species, including mice (Nogueira et al., 2003a), cattle (Albuz et al., 2010; Luciano et al., 2011) and humans (Wu, Ignotz, Currie, & Yang, 1996). This block seems to help synchronization between nuclear and cytoplasmic oocyte maturation in vitro (Nogueira et al., 2003a; Vanhoutte et al., 2008; Vanhoutte et al., 2009; Conti et al., 2012). In the present study, we investigated the ability of cilostamide (10 and 20µM) and/or FW to temporarily suppress meiotic resumption after exposure times of 6 and 12 hours. The proportion of oocytes at GV, GVBD, MI, and MII was determined at 6 and 12 hours of culture for both IVPM treatments and IVM control treatments. The efficiency of cilostamide to block meiotic resumption at GV stage ranged from 50 (Dieci et al., 2013) to 90% (L. Vanhoutte et al., 2009). In the present study, the highest percentage outcome for blocking meiotic resumption at GV stage was in the bovine at 76.7%, which is in the range seen in the available literature data. In cattle, except for the 10 μm cilostamide, 20 μm cilostamide + FW, and FW alone for 12 hours treatments, overall the IVPM treatments were efficient at temporarily blocking meiotic resumption, i.e., maintenance of oocyte at GV stage, in relation to control IVM treatments. In contrast, in goats none of IVPM treatments tested showed higher percentage of oocytes arrested at GV stage compared to the control treatments, even though an effect of exposure times (6 vs 12 hours) was observed. This suggests that there is a species-specific response to cilostamide and/or FW, which is similar to previous reported research (Vanhoutte et al., 2009; Luciano et al., 2011; Dieci et al., 2013; Gharibi et al., 2013). It is well known that the time course of oocyte chromatin configuration (GV, GVBD, MI, and MII) varies among species (caprine; Souza-Fabjan et al., 2014 and bovine; Sirard et al., 1989), which is in agreement with data presented in Table 2. Therefore, in addition to the species-specific differences, the differences in the GV rates between caprine and bovine oocytes it probably is due to differences in the

127 126 IVM media used. Moreover, it has been shown that the inhibitory effect of the phosphodiesterase-3 on oocyte meiotic resumption is concentration-dependent and also may vary among species (mice; Nogueira et al., 2003b, bovine; Albuz et al., 2010; Luciano et al., 2011 and human; Nogueira et al., 2006). The impact of the IVPM treatments on oocyte maturation after 30 hours of culture (IVPM + IVM) was investigated in the present study. For both species, most of the IVPM treatments reduced the MII rate significantly when compared to the control treatment. A suitable IVPM protocol should cause a temporary blockage of oocyte meiotic resumption without affecting further oocyte in vitro maturation. Taking into account these aspects, only one IVPM treatment in the bovine met this requirement. That treatment was 10 µm cilostamide with FW after 6 hours exposure (bovine). In cattle, this treatment showed a significantly higher rate of oocytes arrested at GV stage than the control treatment and it maintained the percentage of MII oocytes after 30 hours of culture in rates similar to the control treatment. This observation is likely due to the identification of an optimal combination of concentration-exposure time to cilostamide and FW used in the present study. It has previously been reported that the FW inhibits meiotic resumption through the secretion of meiotic inhibitors from granulosa cells (De Loos et al., 1994). Further, it has been shown that FW secreted paracrine factors improve oocyte meiotic and developmental competence (Richard and Sirard, 1996). 5. Conclusion In conclusion, the combination of concentration-exposure time to cilostamide during IVPM delayed meiotic progression in bovine after 6 and 12 hours of culture. However, overall the culture period (IVPM+IVM) influenced the oocyte chromatin configuration and kinetics in both species. Acknowledgments This research was supported by grants from the National Council for Scientific and Technological Development (CNPq-79/2013 Linha 3 Rede Nordeste de Biotecnologia (Rede de pesquisa do ovário artificial) Processo N /2013-2).

128 127 Hudson Henrique Vieira Correia is the recipient of a grant from CNPq (Brazil). This work was partially funded by the University of Illinois Experiment Station and the U.S. Department of Agriculture-National Institute of Food and Agriculture via Multistate Research Project W-2171, #ILLU to M.B. Wheeler. Conflict of interest There is no conflict of interest that could be perceived as prejudicing the impartiality of the research reported.

129 128 Fig. 1. Photographs of the chromatin configuration of oocytes after in vitro maturation (IVM). Characterization of viable oocytes after staining with Hoechst staining under fluorescence shows oocytes with a germinal vesicle (GV), with germinal vesicle breakdown (GVBD), at metaphase I (MI), at metaphase II (MII) and a degenerating oocyte (DEG). Fig. 2. Photographs of the viability and chromatin configuration of oocytes after in vitro maturation (IVM). Characterization of a viable oocyte after staining with Ethidium homodimer-1, Calcein-AM and Hoechst

130 129 Fig. 3. The percentage of germinal vesicle (GV) stage bovine (A) and caprine (B) oocytes after IVPM with different exposure times (6 and 12 hours), different concentrations of cilostamide (10 and 20 µm), follicular wall, and the combination of follicular wall and cilostamide (FW + cilostamide). * Significant differences between control and IVPM treatments in the same culture period (6 or 12 hours); a,b Different superscripts indicate significant differences between culture periods (6 or 12 hours) within the treatments (P < 0.05).

131 130 Fig. 4. The percentage of metaphase II (MII) bovine (A) and caprine (B) oocytes after (IVPM + IVM - totaling 30 hours of culture) with different exposure times, different concentrations of cilostamide, follicular wall, and the combination of follicular wall and cilostamide (FW+ cilostamide). * Significant differences between control and treatment groups (P < 0.05).