Aula 05: Biorreatores. Gabriel Brognara e Gustavo Martins d Oliveira

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1 Aula 05: Biorreatores Gabriel Brognara e Gustavo Martins d Oliveira 1

2 Introdução Biorreatores: Reatores nos quais ocorrem uma série de reações químicas catalisadas por biocatalisadores, ou seja, células vivas (animais, vegetais, ou microbianas) ou enzimas. Divisão: Reatores Enzimáticos: o Reações ocorrem na ausência de células vivas; Reatores Biológicos: o Reações ocorrem na presença de células vivas; Os Biorreatores de microrganismos são os mais bem difundidos, desde a década de

3 Introdução A aplicação de microrganismos para a confecção de bens de consumo sempre esteve presente na história (e.g., vinho, cerveja, queijos), sendo satisfatoriamente produzido mesmo com condições precárias de assepsia; Para ser aderida ao setor industrial, tornou-se necessário um maior controle sobre a fermentação para ser garantida a assepsia dos meios de produção; Destaca-se o esforço para a aplicação de fermentação controlada, com total assepsia, de acetona-butanol na década de 1910, assim como a primeira planta industrial em 1943 de penicilina com fermentadores de aço-carbono, agitadores, aeração e outros novos aperfeiçoamentos; A alta demanda de produtos derivados da biotecnologia exigiu desenvolvimento de reatores mais bem equipados para assepsia, controle de produção, contenção ambiental e melhor rendimento. 3

4 Construção Principais parâmetros a serem considerados durante o projeto de desenvolvimento de um biorreator: i. As exigências metabólicas dos microrganismos, quanto à areação, agitação, temperatura, ph devem ser satisfeitas; ii. O reator deve ser à prova de contaminação, tanto do conteúdo do fermentador como do meio ambiente, possuindo sistemas de esterilização e amostragem eficientes; O projeto deve satisfazer todas as exigências legislativas de contenção ambiental. 4

5 Escalas dos Biorreatores Distinção de 3 grandes grupos no que se refere à escala de produção industrial: i. Reatores da ordem de unidades de metros cúbicos: comum para produtos da área de saúde, usando microrganismos patogênicos, células animais ou vegetais; ii. iii. Reatores da ordem de dezenas de metros cúbicos: comum para a produção de enzimas, antibióticos e vitaminas; Reatores da ordem de milhares de metros cúbicos: comum, por exemplo, para a fermentação alcóolica e tratamento de resíduos. Não é necessário grandes cuidados com assepsia. 5

6 Materiais A escolha dos materiais deve ser feita levando em consideração as condições particulares às quais os materiais serão expostos. Levando, principalmente, em consideração as exigências das operações assépticas; Reatores de bancada (1-20L): o Vidro Borossilicato: superfícies lisas, facilidade de limpeza, não tóxico, resistente à corrosão e facilidade de inspeção visual; Reatores Piloto e Industriais (50L 500m 3 ): o Aço inoxidável (liga AISI 316): superfícies lisas, resistência às pressões de esterilização e à corrosão (principalmente íons cloreto). Pode ser dopado com molibdênio 3-4% a fim de obter resistência a phs extremamente ácidos. 6

7 Outros Materiais Cobre: possui alta toxicidade (leveduras resistentes - antigas cervejarias); Alumínio: ingredientes do meio usualmente o atacam (raramente usado); Níquel: Elevada resistência térmica e à corrosão; Titânio: Elevada resistência à corrosão (Alto custo); Plásticos: Resistência à corrosão, entretanto sensível a solventes certos solventes; Aço carbono: Dificuldade de esterilização (antiga produção de penicilina); 7

8 Geometria do Biorreator Reatores Agitados Mecanicamente (Strirred Tank Reactor): 8

9 Agitação Problema: Manter as condições ambientais no meio de fermentação o mais uniforme possível. Tempo de mistura: o É o tempo necessário para obter uma perfeito homogeneização do meio; Dispersão de altos volumes de ar: o Avaliação da eficiência da dispersão, verificando a resistência do reator a inundação, ou seja, a formação de uma grande bolha de ar; Transferência de calor: o A manutenção de temperatura necessita de um adequado fluxo do meio junto às superfícies de refrigeração. 9

10 Turbinas A eficiência da transferência de oxigênio é o principal fator avaliado durante a escolha da turbina do biorreator; Atualmente existem vários modelos, entretanto o mais frequente é a turbina de seis pás planas de Rushton; A relação diâmetro da turbina e diâmetro do reator possui um alto impacto na eficiência: o Turbinas Rushton: razão igual a 1/3; requer um elevado consumo de energia. o Reatores Industriais: razão de 1/3 a 1/2; Geralmente possuem duas ou mais turbinas, sendo que o espaçamento das mesmas é importante na eficiência. 10

11 (1) disco rígido com planas (ou Rushton); (2) Idem, com pás apenas na parte inferior; (3) Turbina aberta com pás de inclinação variável; (4) Hélice marinha; (5) Detalhe de (1). 11

12 Fluxos Radial (pás planas): Axial (hélices): 12

13 Quebra-Vórtices Ao aumentar a turbulência da agitação, espera-se aumentar a eficiência da distribuição de O 2 no meio Entretanto, tal processo resulta na formação de vórtices, que dificultam a eficiência do processo; Para evitar tal problema, insere-se quebra-vórtices ou chicana no biorreator. 13

14 Quebra-Vórtices Usualmente, recomenda-se: o O uso de 4 quebra-vórtices equidistantes; o De largura da ordem de10% do diâmetro do reator; o Fixadas a 1 ou 2 cm do corpo do fermentador de modo a evitar a formação de zonas de estagnação; o Aparafusadas a suportes reforçados (devidamente soldados à parede do fermentador): alta resistência e facilidade na manutenção; Importante: Células animais são extremamente sensíveis as forças de cisalhamento ocasionadas pela agitação, devido a inexistência de parede celular. 14

15 Aeração Problema: Manter as condições de oxigenação de modo a garantir a alta formação do produto de interesse Os processos de maior destaque são os que se encontram em aerobiose; A aeração é um dos aspectos que mais influencia na rapidez e eficiência do processo, sendo normalmente um fator limitante devido à baixa solubilidade que o oxigênio possui em meio líquido; Utilizam-se os difusores de ar para fornecer O 2 ao meio de cultura; A forma como ar é fornecido ao reator varia com o seu design e com o microrganismo utilizado; 15

16 Tubo Aberto Simples (A): Difusores de Ar o Deve ser afixado centralmente sob a turbina e o mais distante possível dessa, a fim de reduzir o perigo de inundar a turbina em uma grande bolha de ar. Difusor em Anel (C): o Apresentam o inconveniente de exigir uma manutenção, pois podem entupir facilmente quando se utilizam meios ricos. Tubo Aberto em Y (B): o Meio termo entre A e C. 16

17 Distribuição de O 2 Para conseguir garantir máxima eficiência dos métodos de aeração, existem vários trabalhos dedicados à modelagem matemática de como a dissolução do oxigênio se dá para um meio com características bem definidas, que varia com o tempo de fermentação devido aos produtos formados, e com diferentes necessidades fisiológicas das células em diferentes etapas do crescimento de biomassa. Tais modelos possibilitam o desenvolvimento de experimentos que determinam certas constantes que caracterizam o processo de transferência de

18 Esquema ilustrando as várias resistências que uma molécula de O 2 enfrenta para se difundir desde uma bolha até a célula. 18

19 Controle de O 2 Para garantir que o meio está corretamente aerado, torna-se necessário o monitoramento dos níveis de O 2 dissolvidos no meio; Esse monitoramento é feito através de uma sonda inserida no biorreator, composto por um cátodo de Platina envolto por um eletrólito, um ânodo de Prata, e uma membrana permeável para gases; O oxigênio terá uma tendência proporcional à sua concentração no meio de atravessar a membrana semipermeável. Ele passa por uma reação de redução na superfície do cátodo, o que gera um sinal de corrente indicativo de quanto oxigênio está difundido no meio, caso sejam conhecidos os valores de pressão e temperatura; O sensor depende tanto da temperatura quanto da pressão ambiente; É necessário calibrá-lo toda vez antes de ser usado; 19

20 Esquema de um sensor de O 2. 20

21 Controle de Temperatura Problema: Gradientes de temperatura afetam consideravelmente a formação de bioprodutos Jaquetas térmicas: o Reduzida eficiência na transferência de calor pela circulação irregular do vapor ou da água de refrigeração. Serpentinas internas ou externas: o No caso das internas, tem-se dificuldade na realização de limpeza e mistura do meio. 21

22 Controle de ph Problema: Devido a atividade metabólica, os íons H + e OH - não estarão em equilíbrio, afetando o processo produtivo Um modo bastante eficiente de manutenção de ph é realizado através de uma solução tampão no meio de cultura, evitando uma mudança brusca no ph; O monitoramento do ph é realizado através de uma sonda inserida no biorreator; Devido a existência de uma membrana constituída por sílica na sonda, a mesma consegue interagir com os íons H +. Fato que resulta na formação de um potencial elétrico que é proporcional ao ph. Deste modo, ao medir o potencial é obtido o ph através de um ajuste de um simples ajuste de escala; 22

23 Esquema da sonda de monitoramento do ph. Conversão do potencial elétrico na escala do ph. 23

24 Controle de ph Para que a conversão de escala esteja sempre correta, deve-se sempre realizar a calibração da sonda de modo que a 0mV o ph seja 7 e aumente para 59.16mV a cada 1 de ph; A medida realizada é extremamente dependente da temperatura, sendo necessário a realização de compensações na escala quando possível. (mudança de 0.03 no ph a cada 10 C); A precisão desse método é aproximadamente 0.05 no ph. Considerando a compensação da temperatura, tem-se uma precisão de 0.01 no ph; Quando é necessário realizar um ajuste no ph, procede-se na adição de ácidos ou bases no meio. No caso de células animais, pode-se também injetar gás de C

25 Controle de Espuma Problema: Espumas podem entupir encanamentos resultado em uma pressão excessiva no sistema além de afetar a distribuição de 0 2 Em sistemas de fermentação com bactérias ou leveduras, verifica-se o que oxigênio injetado junto com a alta agitação podem resultar na formação de espuma; Além disso, em sistemas com células animais, verifica-se que a baixa agitação de meios ricos em proteínas promovem também a formação de espuma; 25

26 Controle de Espuma A detecção da espuma é realizada através de uma sonda que é inserida no biorreator. Quando a mesma entra em contato com a espuma, um circuito elétrico é estabelecido promovendo a liberação de um antiespumante (óleos de silicone, por exemplo); Quebradores Mecânicos: o Espumas são atraídas a determinadas turbinas operando em alta rotação de modo a quebrá-las; o Inevitavelmente células presentes no meio são destruídas; Caso necessário, pode-se também realizar a diminuição do volume do biorreator e/ou operar em temperaturas mais baixas. 26

27 Amostragem e Esvaziamento A fermentação industrial requer o monitoramento de todo o processo para se ter controle de cada etapa. Para isso, o biorreator deve ser equipado com linhas de amostragem, em que pequenas quantidades do volume no reator são extraídas para analisar seus componentes; Além disso, quando a fermentação tiver ocorrido em sua totalidade desejada, será necessário extrair todo o conteúdo do reator para a purificação do produto resultante; As linhas de amostragens, e por consequência as de esvaziamento, são montadas de tal forma que é possível haver transferência do líquido sem que haja contaminação do ambiente e nem do meio. Consistem de encanamentos vedados, diferentes sistemas de selos, eixos, válvulas, e sistemas de esterilização à vapor e filtros. 27

28 Linhas clássicas de transferência, ilustrando os sistemas de encanamento, válvulas, e esterilização que acompanham a passagem da amostra. 28

29 Linha de transferência ilustrando a utilização de uma válvula controlada pneumaticamente. 29

30 Esterilização do Equipamento Como o biorreator é um ambiente altamente controlado, é necessário um sistema capaz de esterilizar por completo todos as componentes do equipamento, inclusive as válvulas e tubulações; Existem vários métodos difundidos na indústria para garantir a esterilização, todos eles levando a algum tipo de dano irreparável em células e em enzimas: o Calor úmido (vapor); o Calor seco; o Irradiação UV; o Agentes químicos; O mais empregado na indústria é o calor úmido, usando vapor de água saturado, sob pressão e a altas temperatura. 30

31 Esterilização do Equipamento A esterilização do equipamento é realizado através da injeção de vapor de água aquecido (até 120 C) e sob pressão (1 atm) no interior do reator e dos tubos, preenchendo todo o equipamento com vapor e expulsando o ar que estava contido ali; Após todo o ar ter sido expulso, a injeção é interrompida, apenas sendo ativada para manter o nível de vapor e a temperatura, de tal forma que o reator permaneça com calor úmido dentro dele por um tempo variável, garantindo a desnaturação de todas as enzimas e microrganismos que estejam contidos no equipamento; Quando a aparelhagem tiver ficado por tempo suficiente sob essa condição de calor úmido, ela é bombeada com ar esterilizado, ao mesmo ritmo em que o vapor é deixado para esfriar, de tal forma que não haja a possibilidade de se fazer vácuo dentro do reator; Normalmente, a esterilização do reator ocorre por ele todo ao mesmo tempo, podendo ou não ter o meio de cultura junto. 31

32 Esterilização do Ar O ar que é fornecido e retirado do meio de cultura deve ser esterilizado para garantir que não haja a contaminação do ambiente e nem do meio; Também existem diferentes formas de garantir a esterilização do ar: o Aquecimento; o Radiação; o Filtração; A filtração é o método mais difundido na indústria, tanto por sua eficiência quanto, seus baixos custos Os filtros são equipamentos compostos por um material poroso ou fibroso, altamente denso, capaz de reter compostos estranhos macroscópicos. E também rodeados por sistemas de esterilização a vapor, para eliminar os microrganismos contidos no ar. 32

33 Esquema de um Filtro de Ar usado em uma montagem de um biorreator. Usado tanto para filtrar o ar que entra quando o ar que sai do reator. 33

34 Esquema que ilustra a montagem de um filtro de ar acoplado ao interior de um reator, mostrando a passagem do ar desde a sua esterilização até a sua inserção no meio de cultura. 34

35 Conclusão 35

36 Referências SHMIDELL, Willibaldo; ALMEIDA LIMA, Urgel de; ARQUARONE, Eugênio; BORZANI, Walter; Biotecnologia Industrial: Volume 2 Engenharia Bioquímica. Ed. Edgard Blüncher. MC NEIL, Brain; HARVEY, Linda M.; Pratical Fermentation Technology. Ed. Wiley. WILLEY, Joanne M.; Sherwood, Linda M.; WOOLVERTON, Chrisopher J.; Prescott, Harley and Klein s Microbiology. Ed. Higher Education. SMITH, John E.; Biotechnology. Ed. Cambridge University Press. 36