Biorreatores e Processos Fermentativos

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1 Biorreatores e Processos Fermentativos Aula 5 Prof a. Dr a Ilana L. B. C. Camargo Ciências Físicas e Biomoleculares IFSC - USP Biotecnologia do bioprocesso tem três estágios: Processo Upstream Biorreatores e biorreação Processo Downstream 1

2 Parte I Estágios do processo produtivo Bioprocesso aplicação industrial de reações ou vias biológicas mediadas por células vivas inteiras de animais, plantas ou microrganismos, ou enzimas sobre condições controladas para a biotransformação de matérias primas em produtos. Produto alimento, medicamento ou composto industrial Bioprocesso também pode ocorrer sem resultar em um produto direto biorremediação, desintoxicação de resíduos ou de efluentes com ou sem subproduto ou derivados Escala laboratorial Escala industrial 2

3 Biorreatores, reatores bioquímicos, reatores biológicos são os reatores químicos nos quais ocorrem uma série de reações químicas catalisadas por biocatalisadores Enzimas Células vivas Reatores enzimáticos ou Bioquímicos Biorreatores ou Reatores Biológicos Biorreatores Sistema não asséptico onde não é absolutamente necessário se operar com culturas inteiramente puras (sistemas de descarte de efluentes); Sistema asséptico onde as condições de assepsia são prérequisitos para a formação do produto com sucesso; 3

4 Nem todo processo de fermentação precisa ser livre de contaminações!! Produção caseira dos vinhos Antigamente, a maceração das uvas era feita com os pés!! Nem todo processo de fermentação precisa ser livre de contaminações!! Produção artesanal de queijo, vinho, vinagre, iogurte e cerveja, muitas vezes eram processadas satisfatoriamente, mesmo sob condições precárias de assepsia Queijo de leite de búfala Tanque de maceração das uvas Produção de vinhos (Hoje: prensa hidráulica) Quanto mais controle se tem sobre o processo de fermentação, maior é a facilidade em se manter a qualidade e garantir a reprodução do processo. 4

5 Chaim Weizmann e colaboradores, Inglaterra ( ) Início de FERMENTAÇÃO CONTROLADA Processo submerso anaeróbio de produção de acetona-butanol - grande escala com condições total de assepsia; - condições estritas de anaerobiose (Clostridium acetobutylicum); Proteção contra aeróbios, mas não impedia a contaminação por bacteriófagos!! Maceração das uvas Hoje: prensa hidráulica Dióxido de enxofre (conservante) 5

6 Biorreator ou fermentador Biorreator ou fermentador Variação em forma e tamanho dependendo da aplicação O design do biorreator depende de um número de fatores que incluem: -Tipo de células -Tipo de reação metabólica -Informação sobre a transferência de massa e calor -Viscosidade e homogeneização Tamanhos: -Frascos agitados (erlenmeyers): ml -Fermentadores de bancada: 1 L 30L -Fermentadores piloto: L -Fermentadores industriais: L Também podem ser bandejas, garrafas (fermentação sólida), colunas (imobilização células ou enzimas) 6

7 Biorreator ou fermentador 1943 EUA, Primeira planta industrial de fermentação para produção de penicilina em fermentadores de aço-carbono de 54 m 3 Reatores em aço-carbono Sistemas de agitação e aeração Fundo e tampa torriesféricos esterilizáveis Entrada para a adição de inóculo Antiespumante Coleta de amostras Descarga e saída dos gases formados durante a fermentação, etc. Biorreator ou fermentador Padrões de materiais usados nos fermentadores sofisticados: Todos os materiais que estão em contato com as soluções ou com a cultura do organismo devem ser resistentes à corrosão para prevenir a contaminação do processo com traços de metais; Não podem ser tóxicos pois se houver alguma dissolução do material ou componente não haverá inibição do crescimento da cultura; Inspeção visual do meio de cultura é uma vantagem, por isso deve haver materiais transparentes quando possível; O sistema de agitação, portas de entrada e de saída devem ser rígidas o suficiente para não deformar ou quebrar sob estresse mecânico; Materiais precisam suportar repetidas esterilizações por vapor em alta pressão; 7

8 Biorreator ou fermentador Sistema de agitação Reator agitado mecanicamente (STR: stirred tank reactor) Sonda ph Sonda oxigênio dissolvido Agitadores: turbinas Tanque cilíndrico vertical; Agitado mecanicamente ou não; Provido de sistema de aquecimento e resfriamento; Demais controles necessários ao processo; Camisa de resfriamento 8

9 Serpentinas Estudo atual Aumento de escala 12 Kg 800 Kg 9

10 Capacidade dos biorreatores de escala industrial 1- Pequena escala: 1 a 2 m 3 de capacidade cultivo de microrganismos patogênicos, ou para crescimento de células animais ou vegetais. Em geral, seu uso tem como objetivo produtos ligados à área de saúde 2 Escala intermediária: dezenas de metros cúbicos até 100 a 200 m 3 especificamente empregado na produção de enzimas, antibióticos e vitaminas. 3- Grande escala: reatores com milhares de metros cúbicos de capacidade - para processos que exigem poucos ou até mesmo nenhum cuidado de assepsia: fermentação alcoólica ou do tratamento biológico de resíduos Função primária de fermentação fornecer condições ambientais adequadas ao crescimento dos microrganismos Para tanto, 12 pontos devem ser observados: 1- O reator deve ser capaz de manter-se estéril por muitos dias, trabalhar sem problemas por longos períodos e satisfazer todas as exigências legislativas de contenção ambiental; 2- As exigências metabólicas dos microrganismos, quanto a aeração e agitação, devem ser plenamente satisfeitas, mantendo porém a integridade física dos mesmos; 10

11 Para tanto, 12 pontos devem ser observados: 3- A potência absorvida deve ser a menor possível; 4- Um eficiente sistema de controle de temperatura deve estar disponível; 5- Um sistema de controle de ph deve estar disponível; 6- Um sistema de tomada de amostras à prova de contaminação do conteúdo do fermentador deve ser parte integrante do equipamento. Para tanto, 12 pontos devem ser observados: 7- Perdas por evaporação devem ser mantidas ao mínimo; 8- Eficiente sistema de controle dos gases e saída do fermentador devem estar disponíveis; 9 - O reator deve exigir o mínimo em mão-de-obra para sua operação, limpeza e manutenção; 10 O reator deve preencher, sempre que possível, a característica de multi-propósito, contudo, a regulamentação de contenção ambiental e a possibilidade de contaminações cruzadas podem ser fatores limitantes 11

12 Para tanto, 12 pontos devem ser observados: 11- O reator deve ter as superfícies internas polidas e todas as suas conexões, na medida do possível, devem ser soldadas e não rosqueadas; 12- Na medida do possível, o reator deve manter uma geometria similar à dos reatores menores ou maiores, a fim de facilitar a ampliação de escala do processo. Biorreator ou fermentador Escala laboratorial ~1L Biorreator de bancada :// 12

13 Biorreator ou fermentador Composição: Reatores de bancada 1. Reatores de vidro com fundo arredondado ou chato e tampa superior de inox ligada ao corpo por uma flange. Diâmetro máximo = 60 cm. vidro borossilicato esterilizado em autoclave; 2. Reatores com corpo cilíndrico de vidro, com tampas superior e inferior em aço inoxidável. (10-20L). Biorreator ou fermentador Composição: Reatores Pilotos e industriais Volumes: 50 L a 500 m 3 Analisar materiais quanto: - Capacidade de resistir às pressões de esterilização - Resistência à corrosão - Toxicidade dos produtos resultante de uma eventual corrosão; - Custo do material Aço inoxidável 316 considerado adequado não resolve todos os problemas: produção de ácido cítrico ph 1 ou ph 2 corrosão Inox 317 com 3-4% de molibdênio Classes de aço inox no Brasil segue American Iron and Steel Institute (AISI) 13

14 Tabela 1. Composição de alguns tipos de aços inoxidáveis AISI. Composição nominal (%). Tipo de aço Carbono Cromo Níquel Titânio Molibdênio 304 0, L 0, , xc , L 0, Fermentação com células animais corrosão dos metais pesados insuspeitáveis problemas Biorreator ou fermentador Composição: Reatores Pilotos e industriais Outros materiais: Cobre (cervejarias resistência pelas leveduras chega a 30 ppm) Alumínio raramente utilizado pois reagentes podem atacá-lo; Níquel elevada resistência à corrosão; Titânio alto custo; Vidro borossilicato instalação de visores; Plásticos resistentes à corrosão, mas alguns não resistem muito a solventes (polietileno, polipropileno, PVC rígido...) Aço carbono Ferro + carbono: utilizado nos primeiros reatores empregados na produção de penicilina. Não é mais utilizado devido à dificuldade de limpeza e contaminação do produto 14

15 Fermentação microbiana: um sistema de três fases 1. Fase líquida: contém sais, substratos e metabólitos dissolvidos. Pode também possuir substrato imiscível em água; 2. Fase sólida: consiste nas células, substratos ou produtos insolúveis; 3. Fase gasosa: oxigênio, CO 2 Fatores físico-químicos que devem ser considerados em uma fermentação industrial Fatores importantes: 1 - Oxigênio 2 - Temperatura 3 - ph Sondas para determinação de ph po 2 Entrada de Inóculo meios/nutrientes anti-espumante Sistema de agitação Sistema de aeração Sistema de colheita de amostras 15

16 Fatores físico-químicos que devem ser considerados em uma fermentação industrial 1- Oxigênio Processos aeróbios têm destaque na Biotecnologia Industrial, pois estão envolvidos no cultivo de microrganismo para produção de antibióticos, enzimas, vitaminas, fermentos e inoculantes, proteínas recombinantes (hormônios, insulina), etc. Processos fermentativos envolvendo cultivo de células aeróbias ou aneróbias facultativas visando formação de produtos ou tratamento biológico de águas residuárias têm em comum o aspecto de exigirem um adequado dimensionamento do sistema de transferência de oxigênio (fase gasosa fase líquida) Fatores físico-químicos que devem ser considerados em uma fermentação industrial 1- Oxigênio Último elemento a aceitar elétrons Permite: - Armazenamento de energia ATP; - Reoxidação das coenzimas que participam das reações de desidrogenação. NADH NADH NADH Participam das reações de síntese de moléculas levando à sobrevivência das células e ao surgimento de novas células no processo de proliferação da biomassa microbiana, para a qual a energia é fundamental. Diagrams: (Tortora, Funke & Case, 2000) Prokaryotic Mariana Ruiz Binary Fission, JW Schmidt6 16

17 Fatores físico-químicos que devem ser considerados em uma fermentação industrial 1- Oxigênio C 6 H 12 O 6 + 6O 2 6CO 2 + 6H 2 O Para a oxidação de 1 mol de glicose, é necessário o consumo de 6 mols de O 2 Glicose é bastante solúvel, já O 2 é pouco solúvel em água. A concentração de oxigênio dissolvido na saturação é apenas da ordem de 7 mg O 2 /L (7ppm), ao se borbulhar ar atmosférico à pressão de 1 atm e a 35 o C. Nada adianta alimentar o biorreator se não houver um ótimo sistema de transferência de oxigênio - Transferência entre fases gasosa e aquosa; - Oxigênio dissolvido deve chegar às células; - Oxigênio deve penetrar nas células; - Oxigênio deve ser consumido na reação Fatores físico-químicos que devem ser considerados em uma fermentação industrial 1- Oxigênio Em reatores não aerados, o oxigênio é transferido do espaço livre acima do líquido. A agitação quebra continuamente a superfície do líquido e aumenta a área de transferência. O efeito da velocidade de agitação na entrada do gás em um biorreator de 2 L : 300 rpm 450 rpm 750 rpm 17

18 Fatores físico-químicos que devem ser considerados em uma fermentação industrial 1- Oxigênio Chicanas/Baffles Aumentam a turbulência e assim, melhoram a oxigenação do meio Fatores físico-químicos que devem ser considerados em uma fermentação industrial 1- Oxigênio Chicanas, quebra vórtice ou baffles Aumentam a turbulência e assim, melhoram a oxigenação do meio Normalmente: 4 chicanas equidistantes Largura: 10% do diâmetro do reator Devem ser fixadas a 1 ou 2 cm do corpo do fermentador para evitar zonas de estagnação Análise computacional de dinâmica de fluxos 18

19 Fatores físico-químicos que devem ser considerados em uma fermentação industrial 1- Oxigênio Chicanas afastadas da parede do biorreator Evita zonas de estagnação Concentração de Oxigênio dissolvida aumenta com a agitação Concentração de O 2 Co Co 1 Co t0 t1 Tempo 19

20 Fatores físico-químicos que devem ser considerados em uma fermentação industrial 1- Oxigênio Injetar ar esterilizado Devagar rápida Quando a velocidade de agitação é: pequena Bolhas não serão quebradas tendendo a subir direto para a superfície. Acumulam no eixo do agitador, coalescendo e diminuindo a transferência de oxigênio. grande as bolhas pequenas irão circular por todo o reator e terão o seu tempo de residência aumentado. Fatores físico-químicos que devem ser considerados em uma fermentação industrial 1- Oxigênio Métodos para aumentar a taxa de transferência de oxigênio (kla) no sistema: k L a diminui com o aumento do volume do líquido k L a aumenta com a área superficial do líquido k L a é maior quando as pequenas chicanas estão presentes 20

21 Fatores físico-químicos que devem ser considerados em uma fermentação industrial Métodos para aumentar a taxa de transferência de oxigênio (k L a) no sistema: -Aumento da pressão; -Aumento da concentração de O 2 no ar inserido no reator; -Aumento da agitação; -Aumento do fluxo de ar; -Redução de espumas e remoção de bolhas de ar da superfície. Biorreator ou fermentador Sistema de Controle de espuma Fatores que favorecem a formação de espuma: Meio de fermentação: meios ricos em proteínas tendem a formar mais espuma. Muitas células produzem moléculas tipo detergente (ácidos nucléicos e proteínas excretadas após lise das células ou compostos lipídicos produzidos durante o crescimento); Taxa de aeração e velocidade do agitador (, formação de espuma); 21

22 Biorreator ou fermentador Sistema de Controle de espuma Formação excessiva de espuma pode: 1. Bloquear os filtros de saída de ar; 2. Aumentar a pressão do biorreator O controle é feito com a adição de agentes antiespumantes baseados em silicone ou óleos vegetais que desestabilizam a espuma pela redução da tensão superficial. ON-OFF. Uma parte fica no meio e a outra acima do nível do líquido. Quando a espuma atinge a superfície do sensor que está em cima, existe a produção de uma corrente elétrica que é detectada pelo controlador, resultando na ativação da bomba. Biorreator ou fermentador Sistema de Controle de espuma Fatores que auxiliam na diminuição da formação da espuma: O volume livre no reator: em sistemas nos quais a espuma é formada facilmente, o volume de trabalho deve ser reduzido para facilitar o controle de espuma. Quanto maior o volume livre, maior a probabilidade da espuma colapsar por causa do seu próprio peso; Temperatura do condensador: em reatores de laboratório, uma temperatura mais baixa pode ajudar no controle da espuma. A densidade da espuma aumenta quando ela se move de uma região mais quente para a região fria do condensador, causando o colapso da espuma; Quebradores mecânicos de espuma: agitador de alta velocidade. A bolha é puxada para o agitador e colapsa por ação de forças mecânicas. Em pequenos reatores de laboratório são utilizados quebradores ultrassônicos, que geram vibrações de alta frequência responsáveis por quebrar as bolhas da espuma 22

23 Fatores que alteram a aeração de uma cultura microbiana Geometria do biorreator D T W B Wi Li Di C H L Geralmente cilíndricos. São construídos em dimensões padrão publicadas pela International Standards Organisation e British Standards Institution. Reatores do tipo STR, em geral: -Tanque cilíndrico -Relação de altura:diâmetro (H:D) 2:1 ou 3:1 23

24 Geometria do biorreator D T W B Esquema de tanque agitado por turbinas de pás planas, com indicação de dimensões importantes na transmissão de potência ao líquido Wi Li H L Máxima potência com mais de um impelidor: Di C Di < Hi < 2Di Hi = distância entre impelidores Di = Diâmetro do impelidor (m) D T = Diâmetro do tanque (m) H L = altura da coluna do líquido (m) C = distância do impelidor ao fundo do reator (m) Wi = altura da pá da turbina (m) W B = altura da chicana (m) Número de impelidores para uma máxima transferência de potência H L Di Di > N Impelidores > H L 2Di Di Geometria do biorreator Razão Valores Típicos Altura do líquido do reator e altura do reator Ht/Hl ~ 0,7-0,8 Altura do reator e diâmetro do tanque Ht/Dt ~ 1-2 Diâmetro do impelidor e diâmetro do tanque Da/Dt 1/3 1/2 Largura das chicanas e diâmetro do tanque Lb/Dt ~0,08 0,1 OBS Depende do nível de espuma produzido durante a fermentação Reatores europeus tendem a ser mais altos que os projetados nos EUA Reatores com turb. Rushton são geralmente 1/3 do diâmetro do tanque. Os de fluxo axial são maiores Geralmente 10% do diâmetro do reator Altura da pá do impelidor e diâmetro do impelidor W/Da 0,2 Largura da pá do impelidor e diâmetro do impelidor L/Da 0,25 Distância média entre o impelidor e a saída de gás e altura da pá E/W 1 24

25 Geometria do biorreator Fluxos: Axial e Radial Geometria do biorreator Fluxo axial: o líquido é dirigido para a base do reator, isto é, paralelo ao eixo do agitador. São deficientes em gerar turbulência e quebra das bolhas de ar, o que os tornam indesejáveis para cultivos aerados. Algumas marcas comerciais: Impelidor Lightnin 320, Impelidor KPC KROMA, Impelidor Pitched Impelidor Lightnin 25

26 Geometria do biorreator No fluxo radial, o líquido é inicialmente dirigido a parede do reator, isto é, ao longo do raio do tanque. Não é tão eficiente quanto o fluxo axial. Maior quantidade de energia é necessária para gerar o mesmo fluxo que o axial; Algumas marcas comerciais: tipo Arrowhead, de pás curvas, de pás retas verticais, Impelidor Rushton, Impelidor Smith. 26

27 Fatores físico-químicos que devem ser considerados em uma fermentação industrial 2- Temperatura Equipamentos devem ter sistema de transferência de temperatura. Reação no Biorreator Exotérmica Endotérmica Sistema de circulação de vapor e água quente podem aquecer o sistema e também podem ser úteis para esterilização do biorreator antes do início do processo da fermentação; Fatores físico-químicos que devem ser considerados em uma fermentação industrial 2- Temperatura Camisa (Jacket) ou serpentina de resfriamento Para o resfriamento de culturas, por onde pode passar água, por exemplo, com temperaturas menores 27

28 Fatores físico-químicos que devem ser considerados em uma fermentação industrial 2- Temperatura Camisas são cada vez menos utilizadas reduzida eficiência na transferência de calor pela circulação irregular do vapor ou da água de refrigeração; Serpentinas internas permitem boa troca térmica e eficiente circulação do fluido em alta velocidade Inconvenientes: a) Reduzem significativamente o volume útil do fermentador; b) Dificultam a limpeza interna; c) Dificultam a mistura eficiente do meio em fermentadores agitados mecanicamente; d) Podem ser um foco adicional de contaminação por defeito nas soldas difíceis de detectar. Serpentinas 28

29 Fatores físico-químicos que devem ser considerados em uma fermentação industrial 3- ph No biorreator deve haver um sistema de determinação de ph assim como uma entrada para balancear a reação com ácido/base que não ofereça nenhum risco de contaminação para o sistema. Temperatura e ph também ficam mais homogêneos com a agitação 29

30 Importância da agitação e mistura Agitação adequada é essencial pois proporciona os seguintes efeitos nas três fases: 1- Dispersão do ar no meio de cultivo 2- Homogeneização para igualar a temperatura, ph e concentração de nutrientes 3- Suspensão dos microrganismos e dos nutrientes sólidos 4- Dispersão de líquidos imiscíveis Importância da agitação e mistura Quanto maior a agitação, melhor será o crescimento? CUIDADO!! Agitação excessiva pode romper as células e aumentar a temperatura o que ocasiona uma redução na viabilidade celular!! Deve-se buscar o equilíbrio entre a necessidade de mistura do meio evitando-se o dano celular. 30

31 Características básicas de biorreatores 1. Sistema de agitação; 2. Sistema de distribuição de O 2 ; 3. Sistema de controle de espuma; 4. Sistema de controle de temperatura; 5. Sistema de controle de ph; 6. Portas de amostragem; 7. Sistema de limpeza e esterilização; 8. Linhas para esvaziar o biorreator. Bibliografia Schmidell W, Lima UA, Aquarone E, Borzani W. Biotecnologia Industrial: Engenharia Bioquímica. Volume 2. Ed Edgard Blücher LTDA, São Paulo, Cap. 8 e 20 Smith JE. Biotechnology. 4th ed. Cambridge University Press, Cap. 4 31