PLANT CELL CULTURE & MICROPROPAGATION

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1 Volume 6 - Número 1 - Ano 2010

2 ISSN Volume 6, Número 1, 2010 PLANT CELL CULTURE & MICROPROPAGATION Cultura de Células & Micropropagação de Plantas Publicação Científica da Associação Brasileira de Cultura de Tecidos de Plantas Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, MG, v. 6, n. 1, p. 1-55, 2010

3 A revista Plant Cell Culture & Micropropagation, editada semestralmente pela Editora da Universidade Federal de Lavras (Editora UFLA), publica artigos científicos da área de cultura de tecidos de plantas por membros da comunidade científica nacional e internacional. Com uma tiragem de 600 exemplares é distribuída aos membros da ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE CULTURA DE TECIDOS DE PLANTAS (ABCTP) em dia com a anuidade. Para se associar à ABCTP consulte o site: < PERMUTA A revista Plant Cell Culture & Micropropagation deseja fazer permuta com revistas de áreas afins. ABCTP Universidade Federal de Lavras Departamento de Biologia Setor de Fisiologia Vegetal Caixa Postal: 3037 Lavras MG CEP abctp@ufla.br FICHA CATALOGRÁFICA

4 Diretoria Presidente Renato Paiva UFLA Secretário Moacir Pasqual UFLA Secretário Adjunto Antônio Carlos Torres EMBRAPA Hortaliças Tesoureiro Guilherme Augusto Canella Gomes Benger do Brasil Comissão Editorial Editor Chefe Renato Paiva UFLA Conselho Editorial Antônio Carlos Torres EMBRAPA Hortaliças Moacir Pasqual UFLA Renato Paiva UFLA Secretaria Daiane Peixoto Vargas UFLA Diogo Pedrosa Corrêa da Silva UFLA Milene Alves de Figueiredo Carvalho UFLA Nomenclatura Científica Manuel Losada Gavilanes UFLA Revisão de Português Rose Mary Chalfoun Bertolucci Revisão de Inglês Renato Paiva UFLA Revisão de Referências Bibliográficas Márcio Barbosa de Assis Editoração Eletrônica Fernanda Campos Pereira Editora UFLA

5 Consultoria Científica (v.6, n.2, 2010) Ana Cardoso Clemente F. F. de Paula IFBAMBUI Antônio Carlos Torres EMBRAPA Antonio Fernando Caetano Tombolato IAC Antônio Paulino da Costa Netto UFG Aparecida Gomes de Araújo UFLA Beatriz Appezzato-da-Glória USP Breno Santos UNIFAL-MG Dayse Cristina de Carvalho UFPR Fernanda Carlota Nery UFSJ Fernanda Pereira Soares MAPA Franciane Tavares Braga EPAMIG Jéferson Luiz Dallabona Dombroski UFMT João Maurício Cavalcante Alves UFLA José Eduardo Brasil Pereira Pinto UFLA Juçara Terezinha Paranhos UFSM Leonardo Ferreira Dutra EMPRAPA Marcelo Murad Magalhães UFLA Marguerite Germaine Ghislaine Quoirin UFPR Milene Alves de Figueiredo Carvalho UFLA Rodrigo Kelson Silva Rezende UFGD Sandro Barbosa UNIFAL-MG Soami Fernanda Caio Deccetti Suzan Kelly Vilela Bertolucci UFLA Suzana Stefanello UFPR Therezinha Rangel Câmara UFRPE Vanessa Stein UFG Virginia Silva Carvalho UENF Weliton Antonio Bastos de Almeida UFRB

6 ISSN Plant Cell Culture & Micropropagation CONTEÚDO ESTIOLAMENTO E REGENERAÇÃO In vitro DE Ananas comosus var. erectifolius: UMA PLANTA VALIOSA DA AMAZÔNIA Etiolation and In vitro regeneration of Ananas comosus var. erectifolius: a valuable Amazon Plant Flávia Dionísio Pereira, José Eduardo Brasil Pereira Pinto, Helen Cristina de Arruda Rodrigues, Luciana Domiciano Silva Rosado, Suzan Kelly Vilela Bertolucci, Osmar Alves Lameira MEIO DE CULTURA, CONCENTRAÇÃO DE BAP E FOTOPERÍODO NA MICROPROPAGAÇÃO DE ANTÚRIO EIDIBEL POR SEGMENTOS CAULINARES Culture medium, bap concentration and photoperiod on micropropagation of anthurium Eidbel stem segments Marcos Vinícius Marques Pinheiro, Gabrielen de Maria Gomes Dias, Ana Cristina Portugal Pinto de Carvalho, Levi de Moura Barros INDUÇÃO DE CALOS In vitro A PARTIR DE SEGMENTOS FOLIARES DE Coffea canephora CV. CONILON In vitro induction of callus from leaf segments of Coffea canephora CV. Conilon Maurício Reginaldo Alves dos Santos, Maria das Graças Rodrigues Ferreira, Arêssa de Oliveira Correia, Neidiane Farias Costa Reis, Manuel de Souza Santos INDUÇÃO DE CALOS EM NERVURA MEDIANA DE FOLHAS NÃO EXPANDIDAS DE PUPUNHEIRA (Bactris gasipaes Kunth.) Callus induction in mid-rib of non expanded leaves of palm peach (Bactris gasipaes Kunth.) Maurício Reginaldo Alves dos Santos, Maria das Graças Rodrigues Ferreira, Arêssa de Oliveira Correia, Josilene Félix da Rocha, Keila Cristina de Souza Correa REDUÇÃO DA NECROSE APICAL E HIPERIDRICIDADE DE PLANTAS DE Lavandula angustifolia Mill. CULTIVADAS in vitro Reduction of apical necrosis and hyperhydricity in in vitro cultured lavandula angustifolia mill. Plantlets Marília Pereira Machado, Luiz Antonio Biasi, Vanessa Reinhart, Gabriel Distéfano Santos INFLUÊNCIA DE ANA E BAP E DA MODALIDADE DE CULTIVO in vitro DE TAIOBAS (Xanthosoma sagittifolium (L.) SCHOTT) Influence of naa and bap and methods for in vitro growth of tannia (Xanthosoma sagittifolium (L.) Schott) Cristina Soares de Souza, Fernando Luiz Finger, Adilson Ricken Schuelter Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p. 1-55, 2010

7 COMUNICAÇÃO CIENTÍFICA STAINABILITY AND FLUOROCHROMATIC REACTION IN FRESH MICROSPORES AND POLLEN ISOLATED FROM Phaseolus vulgaris L. Coloração e reação fluorocromática em micrósporos e pólen frescos isolados de Phaseolus vulgaris L. Lia Rosane Rodrigues, Jorge Ernesto de Araujo Mariath

8 ESTIOLAMENTO E REGENERAÇÃO in vitro DE Ananas comosus var. erectifolius: UMA PLANTA VALIOSA DA AMAZÔNIA Estiolamento e regeneração in vitro de Ananas comosus var. erectifolius... 1 ETIOLATION AND in vitro REGENERATION OF Ananas comosus var. erectifolius: A VALUABLE AMAZON PLANT FLÁVIA DIONÍSIO PEREIRA 1 JOSÉ EDUARDO BRASIL PEREIRA PINTO 2 HELEN CRISTINA DE ARRUDA RODRIGUES 3 LUCIANA DOMICIANO SILVA ROSADO 4 SUZAN KELLY VILELA BERTOLUCCI 5 OSMAR ALVES LAMEIRA 6 1 Eng. Agrônoma, Dra., Pós-doutoranda - Universidade Federal de Lavras/UFLA Dep.de Agricultura - Laboratório de Cultura de Tecidos e Plantas Medicinais, campus Universitário s/n - Cx. P Lavras, MG - flavia1808@hotmail.com 2 Doutor, Professor Titular, - Universidade Federal de Lavras/UFLA Dep.de Agricultura - Laboratório de Cultura de Tecidos e Plantas Medicinais, campus universitário s/n - Cx. P Lavras, MG - jeduardo@dag.ufla.br 3 Doutoranda em Produção Vegetal - Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho/UNESP Dep. de Tecnologia -. Via de Acesso Prof. Paulo Donato Castellane, campus universitário Jaboticabal, SP. 4 Doutoranda em Genética e Melhoramento - Universidade Federal de Viçosa Dep.de Fitotecnia -. Av. P.H. Rolfs, s/n Viçosa, MG - helenarruda11@gmail.com 5 Professora - Universidade Federal de Lavras - Laboratório de Cultura de Tecidos e Plantas Medicinais - campus universitário s/n Cx. P Lavras, MG - suzan@ufla.br 6 Pesquisador, Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária - Centro de Pesquisa Agroflorestal da Amazônia Oriental, Embrapa Amazônia Oriental. Av. Enéas Pinheiro, s/n, Laboratório de Biotecnologia, Marco - Cx. P.: Belém, PA - Embrapa, Amazônia Oriental - osmar@cpatu.embrapa.br RESUMO Ananas comosus (L.) Merr. var. erectifolius (L.B.Sm.) Coppens & F. Leal, popularmente conhecida como curauá, é uma planta nativa da Amazônia. Suas folhas produzem fibras lignocelulósicas com grande potencial na indústria automobilística devido a sua resistência, maciez e peso reduzido. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito do tamanho da plântula inicial na regeneração de brotos estiolados, do número de brotos estiolados por frasco na regeneração de plântulas, a influência da consistência do meio de cultivo, com ou sem agitação na regeneração de brotos estiolados, e a obtenção de plântulas de curauá provenientes dos brotos estiolados. Foram utilizadas plântulas com tamanhos de 1,0 a 2,5; 3,0 a 4,5 e 5,0 a 6,5 cm. O meio foi o MS semissólido com 10 mm ANA. Os explantes foram cultivados em meio MS líquido em frascos sob agitação de 85 rpm utilizando 4, 6 e 8 brotos estiolados. Os segmentos nodais dos brotos estiolados foram inoculados no meio MS líquido sem agitação; sob agitação contínua a 85 rpm e no meio solidificado com ágar a 0,6%. Para o tamanho da plântula, não houve diferença significativa para número e comprimento médio dos brotos. Para o número de explante por frasco houve diferença significativa para o número médio de brotações. Para os fatores físicos houve diferença significativa entre os sistemas de cultivo. A micropropagação através de brotos estiolados é eficiente na produção de mudas de Ananas comosus var. erectifolius. O tamanho do explante inicial não influência na indução do número de brotos estiolados. O número de 6 a 8 brotos estiolados inoculados por frasco induz maior número de plântulas por frasco (13 a 15 plântulas/frasco). O meio líquido sem agitação induz maior proliferação de brotos. O sistema radicular é obtido no meio MS sem a presença de regulador de crescimento. Termos para indexação: Fibras vegetais, micropropagação, planta medicinal. ABSTRACT Ananas comosus (L.) Merr. var. erectifolius (L.B.Sm.) Coppens & F. Leal species is native from the Amazon region and known as curauá. Its leaves produce lignocellulose fibers with great automobile industry potential due to its resistance, softness and reduced weight. The purpose of this work was to evaluate the initial plantlet size in etiolated shoot regeneration, the number of etiolated shoots per flask in plantlet regeneration, the effect of culture medium consistency with and without shaking in etiolated shoots regeneration and the production of plantlets from etiolate shoots. Plantlets size varied from 1.0 to 2.5; 3.0 to 4.5 and 5.0 to 6.5 cm. MS semisolid medium was supplemented with 10 mm NAA. The explants were cultured in MS medium in flask under 85 rpm shaking using 4, 6 and 8 etiolated shoots. Etiolated shoot from nodal segments were inoculated in liquid MS medium without shaking, under 85 rpm continuous shaking and on 0.6% agar solid medium. For plantlet size, there was no significative difference for number and shoot average length. For explant number per flask there was significative difference for shoot average number. For physical factors there was significative difference among culture systems. Micropropagation from etiolate shoots is efficient for the production of Ananas comosus var. erectifolius. The initial explant size has no influence on the induction of etiolated shoots. Six to 8 etiolated shoots inoculated per flask induce higher plantlet number per flask (13 to 15 plantlets/flask). Liquid medium without shaking induces higher shoot proliferation. The root system is obtained in MS medium without growth regulator. Index terms: vegetable fiber, micropropagation, medicinal plant. (Recebido em 23 de janeiro de 2008 e aprovado em 31 de agosto de 2010) Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p. 1-09, 2010

9 2 PEREIRA, F. D. et al. INTRODUÇÃO O curauá (Ananas comosus var. erectifolius (L.B.Sm.) Coppens & F.Leal - Bromeliaceae) é uma planta cujas folhas produzem fibras lignocelulósicas, de utilização múltipla e diversificada. Trata-se de uma bromeliácea rústica, ainda pouco conhecida e estudada, característica da Amazônia, podendo crescer em solo arenoso e pouco fértil, chegando a atingir entre um metro e um metro e meio de altura. Cada planta produz entre 12 e 15 folhas, das quais são extraídos cerca de 2 quilos de fibra (RAMALHO, 2005). Estudos recentes têm demonstrado o grande potencial do uso das fibras dessa planta na fabricação dos revestimento para a indústria automobilística, devido à sua resistência, maciez e peso reduzido (RAMALHO, 2005; SILVA, 2004). Neste contexto, a crescente demanda de fibras do curauá por grupos empresariais o torna uma espécie estratégica, criando perspectivas socioambientais e socioeconômicas. O curauá é fiel às suas origens amazônicas e só se desenvolve em clima quente e úmido, criando um problema para a produção de mudas fora desta região e consequentemente, uma escassez de matéria-prima para atender à indústria automobilística (SILVA, 2004). A propagação vegetativa utilizando técnicas de cultura de tecido tem sido um valioso instrumento na propagação clonal rápida de diversos tipos de plantas como, por exemplo, Eremanthus erythropappus (ROSAL et al., 2007), Lychnophora pinaster Mart. (SOUZA et al., 2007), Casuarina cunninghamiana D. Macleish (SHEN et al., 2010), Brassica rapa L. (COGBILL et al., 2010), Pyrus communis L. (BELL & SRINIVASAN, 2010). A adoção do método de estiolamento como técnica de propagação vegetativa mantém a estabilidade genética por ser uma clonagem. A utilização desta técnica para a micropropagação foi demonstrada em abacaxi (BARBOZA & CALDAS, 2001; KISS et al., 1995; PEREIRA et al., 2001). Como o curauá é uma espécie de grande interesse industrial, carente de informações científicas e técnicas adequadas de propagação in vitro, o objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito do tamanho da plântula inicial na regeneração de brotos estiolados, o número de brotos estiolados por frasco na regeneração de plântulas, a influência da consistência do meio de cultivo com ou sem agitação na regeneração de brotos estiolados e a obtenção de plântulas de curauá provenientes dos brotos estiolados. MATERIAL E MÉTODOS Estabelecimento da cultura in vitro Exsicata de Ananas comosus L. Merr. var. erectifolius (L.B.Sm.) Coppens & F.Leal foi depositada no Herbário IAN EMBRAPA Amazônia Oriental sob registro nº As gemas axilares de curauá foram retiradas de plantas matrizes com dois anos de idade provenientes da Embrapa CPATU (Belém-PA). Em câmara de fluxo laminar, as gemas foram imersas em álcool 70% por 30 segundos, e, posteriormente, em água sanitária 2,5% NaClO e mantidos sob agitação durante 20 minutos. Após esse período, as gemas foram lavadas por seis vezes em água destilada estéril. Tamanho da plântula na regeneração de brotos estiolados Foram utilizadas plântulas de curauá com os seguintes tamanhos: 1,0 a 2,5 cm, 3,0 a 4,5 cm e 5,0 a 6,5 cm. As plântulas foram desfolhadas e os talos inoculados em meio líquido MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962) suplementado com 10 mm de ANA (Ácido naftaleno acético). Foi utilizado frasco com volume interno de 250 ml (9,5cm de altura e 5,5cm de diâmetro). As culturas foram mantidas em sala de crescimento sob temperatura de 26±1 C e no escuro. Após 40 dias, avaliaram-se o número e o comprimento médio dos brotos estiolados. Número de brotos estiolados por frasco na regeneração de plântulas A parte apical e o sistema radicular dos brotos estiolados obtidos acima foram removidos. O segmento nodal contendo duas gemas por brotos estiolados com um tamanho aproximadamente de 2,5 cm foi inoculado em frascos com volume interno de 250 ml contendo 15 ml de meio MS líquido e mantidos sob agitação de 85 rpm em mesa agitadora orbital. O número de explantes inoculados Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p. 1-09, 2010

10 Estiolamento e regeneração in vitro de Ananas comosus var. erectifolius... 3 por frasco foram 4, 6 e 8 brotos estiolados. Os explantes foram mantidos por 90 dias em sala de crescimento à temperatura de 26±1 C e, fotoperíodo de 16 horas sob uma intensidade luminosa de 25mmol m -2 s -1. Após esse período, avaliaram-se o número e o comprimento das plântulas regeneradas. Consistência do meio de cultivo e agitação na regeneração de brotos estiolados Fase I - Os explantes primários, ou seja, as bases foram provenientes de plântulas in vitro de curauá inoculados em meio MS sem regulador de crescimento. As plântulas foram desfolhadas e cortadas com 5 a 8 mm acima da base da plântula. As bases foram cultivadas em meio MS semissólido com 50mL de meio suplementado com 10 mm ANA. As bases foram mantidas por 40 dias no escuro em sala de crescimento com temperatura de 26±1 C. Fase II - Após 40 dias, removeram-se a parte apical e o sistema radicular dos brotos estiolados. Quatro segmentos nodais de aproximadamente 2,5 cm foram inoculados horizontalmente em frasco com volume interno de 250 ml contendo 15 ml de meio MS líquido sem regulador de crescimento. Os brotos estiolados foram cultivados sem agitação (T1); sob agitação contínua a 85 rpm em mesa agitadora orbital (T2) e em meio semissólido com 0,6% de ágar (T3). Os explantes foram mantidos em sala de crescimento com temperatura de 26±1 C e fotoperíodo de 16 horas sob uma intensidade luminosa de mmol. m -2. s -1 fornecida por lâmpadas do tipo fluorescente branca fria. Após 90 dias, avaliaram-se: o número, o comprimento e a biomassa fresca e seca das brotações. Enraizamento in vitro e aclimatização O enraizamento in vitro foi conduzido apenas em meio MS sem reguladores de crescimento em sala de crescimento com a temperatura de 26±1 C e fotoperíodo de 16 horas de luz sob uma intensidade luminosa de 25-30mmol m -2 s -1 fornecida por lâmpadas fluorescentes brancas frias. Foi utilizado frasco com volume interno de 250 ml (9,5cm de altura e 5,5cm de diâmetro) e mantidos em sala de crescimento. Após 20 a 30 dias, todas as brotações estavam enraizadas com um comprimento de 4 a 6 cm de altura. Após esse período, as plântulas foram lavadas para remover o meio de cultura e colocadas em bandejas plásticas com composto Plantmax (Eucatex, Jundiaí, SP) em casa de vegetação sob 50% de sombreamento, temperatura média de 25 0 C e 80% de umidade. Analise estatística O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado (DIC), com 10 repetições por tratamento. Os dados foram submetidos à análise de variância com aplicação do teste F a 5%, e as médias analisadas pelo teste de Scott-Knott a 5%. O programa utilizado para análise dos dados foi o software estatística (SISVAR). RESULTADOS E DISCUSSÃO Tamanho da plântula na regeneração de brotos estiolados Todos os segmentos provenientes de diferentes tamanhos de plântulas regeneram brotos estiolados de coloração branca com folhas pequenas e finas. No escuro os entrenós do talo da plântula do curauá se alongaram, separando os nós que, normalmente, em presença de luz, permanecem próximos uns aos outros. O estiolamento promove a separação dos nós e facilita o desenvolvimento de gemas axilares e a manipulação para fins de micropropagação. O número e o tamanho médio de brotos estiolados produzidos por explante inicial foram estatisticamente iguais em todos os tratamentos aos 40 dias de cultivo no escuro (Tabela 1). No tratamento com a plântula de comprimento 3,0 a 4,5cm obteve-se 3,5 brotos estiolados com 7,6 cm de altura por explante. No tratamento com 5,0 a 6,5 cm regenerou 3,1 brotos estiolados com 6,5 cm de altura por explante, enquanto o tratamento com 1,0 a 2,5 cm obteve-se 2,6 brotos estiolados com 4,5 cm de altura (Tabela 1 e Figura 1). O tamanho no qual as porções basais foram excisadas para serem inoculadas possibilitou que os explantes contivessem reservas suficientes para serem disponibilizadas, o que pode ter levado à uniformidade Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p. 1-09, 2010

11 4 PEREIRA, F. D. et al. apresentada pelas brotações em todos os tratamentos. O tamanho do explante determina suas possibilidades de sobrevivência, assim como a capacidade de crescimento. Uma hipótese sugerida para explicar tais resultados, possivelmente, está relacionada a fatores nutricionais do explante. Segundo Cappelades et al. (1991) e Pereira et al. (2001), porções basais apresentam maior quantidade de reservas acumuladas em seus tecidos, o que poderia levar as brotações regeneradas a se utilizarem dessas reservas para sustentar seu crescimento inicial.. A fim de maximizar a regeneração de plantas de laranja Pêra, Silva et al. (2005) avaliaram tamanhos de segmentos de epicótilo. Os explantes maiores foram os mais responsivos. Reis et al. (2003), estudando o tamanho de segmentos internodais na multiplicação de Psychotria ipecacuanha (Brat.) Stokes, verificaram que explantes com 1,0 e 1,5 cm apresentaram maiores números de brotos (5 a 6 brotos) quando comparados com o de 0,5 cm. O comprimento do broto estiolado é uma variável de grande importância no método de estiolamento de plantas, pois está diretamente relacionada com o número de nós que serão regenerados em novas plântulas quando expostas à luz. Verificou-se através dos trabalhos no laboratório que os brotos estiolados obtidos possuíam um número médio de entrenós de seis que, conseqüentemente, apresentavam um número médio de gemas axilares de vinte quatro (PEREIRA et al., 2008). Número de brotos estiolados por frasco na regeneração de plântulas O número de plântulas regeneradas por broto estiolado, aos 90 dias de cultivo em MS líquido, variou com o número de explantes inoculados por frasco. O frasco inoculado com 8 e com 6 explantes produziu maior número médio de plântulas, 15,1 e 13,1, respectivamente e com 4 explantes produziu 5,6 plântulas (Tabela 2 e Figura 1a, 1b e 1c). A exposição à luz promoveu a regeneração das gemas axilares dos brotos estiolados em plântulas. As plântulas regeneradas eram bem formadas e vigorosas. Ao serem excisadas as folhas eram rígidas, evidenciando a presença de fibras. Não foi observada a presença de calos. TABELA 1 - Efeito do tamanho da plântula na regeneração de brotos estiolados. Tamanho da plântula na regeneração de brotos estiolados Tamanho da plântula inicial (cm) Número de brotos estiolados/explante Comprimento de brotos estiolados (cm) 1,0 a 2,5 2,6 a* 4,9 a 3,0 a 4,5 3,5 a 7,6 a 5,0 a 6,5 3,1 a 6,5 a * Médias seguidas da mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott. TABELA 2 - Efeito do número de brotos estiolados por frasco na regeneração de plântulas. Efeito do número de brotos estiolados por frasco na regeneração de plântulas Número de brotos estiolados/frasco Número de plântulas/frasco Comprimento de plântulas (cm) 4 5,6 b* 4,4 a 6 13,1 a 3,9 a 8 15,1 a 3,8 a * Médias seguidas da mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott. Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p. 1-09, 2010

12 Estiolamento e regeneração in vitro de Ananas comosus var. erectifolius... 5 FIGURA 1 Esquema da micropropagação de Ananas comosus var. erectifolius a partir de brotos estiolados. Experimento I: 1. Plântulas estabelecidas in vitro; 2. Excisão de plântulas com diferentes tamanhos; 3. Cultivo dos explantes no escuro nos tratamentos; 4. Formação de brotos estiolados. Experimento II: 5. Excisão de brotos estiolados; 6. Cultivo na luz de diferentes números de segmentos nodais em meio líquido; 7. Plântulas obtidas no frasco inoculado com 4 explantes (a); com 6 explantes (b) e com 8 explantes (c). Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p. 1-09, 2010

13 6 PEREIRA, F. D. et al. Por meio de observações visuais das brotações, pôde-se observar que não houve nenhuma planta com alterações morfológicas (Figura 1a, 1b e 1c). Os aspectos morfológicos encontrados no presente trabalho são semelhantes aos de Ramirez (1984) em abacaxi. O autor afirma que o método de estiolamento tem a vantagem de evitar danos na região de regeneração e de impedir a formação de calos, podendo assim, proporcionar menores taxas de variabilidade somaclonal que os protocolos convencionais de micropropagação. Outro fato relevante no presente trabalho é que se conseguiu regenerar plântulas em MS sem a adição de regulador de crescimento, proporcionando uma redução dos custos de produção dessas mudas. O comprimento da plântula constitui um indicador do crescimento do vegetal. Verificou-se que não houve diferença significativa para o comprimento médio de plântulas. O frasco inoculado com 4 explantes cresceu 4,4 cm, o frasco com 6 explantes 3,9 cm e o frasco com 8 explantes 3,8 cm. Efeito dos fatores físicos na regeneração de brotos (Fase I e Fase II) Os brotos estiolados cresceram provenientes da base das plântulas entre 4 e 5 semanas cultivadas no escuro, porque com a presença de luz esses não estiolam. Houve o desenvolvimento de mais de um broto estiolado por base, estes surgiram das gemas axilares. Os fatores físicos, ou seja, consistência do meio de cultivo e agitação ou não influenciaram na regeneração dos brotos estiolados. Os resultados preliminares indicaram que os segmentos nodais dos brotos estiolados necessitam de luz para a regeneração de brotos se permanecerem no escuro ficam apenas estiolado. Todos os segmentos nodais utilizados regeneram-se em plântulas bem formadas, vigorosas com a coloração verde-escura característica das plantas matrizes (Figura 2). Constatouse a ausência de plântulas com alterações morfológicas após várias repicagens e a existência de poucas raízes. Embora os sistemas caulinares e radiculares tendam a um equilíbrio, em bromélia, o crescimento do sistema caulinar é muito superior. Segundo Peres & Kerbauy (2000), muitas bromélias possuem estruturas caulinares capazes de absorver sais, fato que pode ter garantido a boa formação dos brotos, mesmo com um número baixo de raízes. Não foi observado o crescimento em forma de clusters, nem a presença de calos e nem o estado hiperhídrico das brotações regeneradas. O número de plântulas regeneradas por segmento nodal variou com o tipo de cultivo utilizado. Os dados mostram diferença significativa (P<0,05) entre os tratamentos (tabela 3). O tratamento em meio líquido sem agitação produziu maior número médio de brotos 9,0 por explante, com agitação contínua 6,2 brotos por explante e o meio semissólido 4,4. Para o comprimento médio dos brotos, o tratamento com agitação contínua foi o que produziu brotos maiores com 4,5 cm de tamanho, o sem agitação 2,7 cm e o meio semissólido 1,8 cm. A biomassa fresca do tratamento sem agitação pesou em média com 3,48 mg, o com agitação contínua 2,70 mg e no meio semissolido pesou em média 0,57 mg. Os fatores físicos, tanto consistência do meio, quanto com ou sem agitação, também influenciaram na biomassa seca onde com agitação se obteve um peso de 0,28 mg, sem agitação contínua 0,15 mg e o no meio semissólido 0,06 mg de matéria seca (Tabela 3). É provável que o ágar, como agente solidificante, tenha interferido nos processos de absorção e de translocação de íons e de água. Além disso, segundo Ziv (1995), o maior contato dos explantes e raízes com o meio faz com que a taxa de assimilação de nutrientes pelo material vegetal em cultivo seja favorecida no meio líquido. Neste trabalho, foi observado que o Ananas comosus var. erectifolius primeiro é estabelecido em meio semissólido e sua proliferação foi melhor em meio líquido. Venkatachalan et al. (2006) relataram a formação direta de brotos em banana (AAB) somente quando cultivados em meio líquido. Chen et al. (2005) relataram à propagação de lírio em grande escala usando o meio semissólido para o estabelecimento do explante e a proliferação usando o meio líquido. Karasawa et al. (2006) constataram a melhor proliferação de brotos de Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p. 1-09, 2010

14 Estiolamento e regeneração in vitro de Ananas comosus var. erectifolius... 7 FIGURA 2 Micropropagação de Ananas comosus var. erectifolius a partir de brotos estiolados. Fase I:1- Plântulas in vitro; 2- Plântulas segmentadas; 3- Explante basal cultivado em meio MS + 10 mm ANA; 4- Brotos estiolados no escuro; Fase II: 5- Brotos estiolados segmentados; 6- Segmento nodal; 7- Segmento nodal cultivado na luz em diferentes condições; 8- Regeneração de brotos. A Meio líquido sem agitação; B Meio líquido com agitação; C Meio semissólido. Plantas aclimatizadas mostrando o sistema radicular bem formado. Pennisetum purpureum Schumach em meio semissólido do que em meio líquido. Pereira et al. (2008) observaram na mesma espécie A. erectifolius que no estabelecimento o meio semissólido foi mais eficiente e a micropropagação em meio líquido. A resposta na proliferação de brotos é muito dependente do genótipo. Alvard et al. (1993) mostraram que cultivos em meio líquido requerem um suporte ou agitação. Por tal razão, é Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p. 1-09, 2010

15 8 PEREIRA, F. D. et al. provável que a agitação do meio líquido tenha fornecido melhor condição de aeração necessária para a respiração do explante, proporcionando maior crescimento do explante e maiores valores da biomassa seca. Observou-se que, no sistema sem agitação com Ananas comosus var. erectifolius, a taxa de multiplicação do material vegetal foi maior do que as demais condições físicas podendo proporcionar redução dos custos na produção (Tabela 3). Enraizamento in vitro e aclimatização As brotações formaram raízes em meio líquido MS sem regulador de crescimento e transferidas para a casa de vegetação com 70% de sombreamento e 80% de umidade com 100% de sucesso (Figura 2). CONCLUSÕES O protocolo de micropropagação através de brotos estiolados é eficiente na produção de mudas de Ananas comosus var. erectifolius. O tamanho do explante inicial não influência na indução do número de brotos estiolados. O número de brotos estiolados de 6 a 8 inoculados por frasco induz maior número de plântulas por frasco de 13 a 15 plântulas. O meio líquido sem agitação induz maior proliferação de brotos. O sistema radicular é obtido no meio MS sem a presença de regulador de crescimento. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem ao CNPq e a FAPEMIG pela bolsa de produtividade e pelo apoio financeiro, assim como a CAPES pela bolsa de estudos. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALVARD, D.; COTE, F.; TEISSON, C. Comparison of methods of liquid medium cultures for banana micropropagation: effect of temporary immersion of explants. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Dordrecht, v. 32, n. 1, p , BARBOZA, S. B. S. C.; CALDAS, L. S. Estiolamento e regeneração na multiplicação in vitro do abacaxizeiro híbrido Pe x SC-52. Pesquisa agropecuária brasileira, Brasília, v. 36, n. 3, p , BELL, R. L.; SRINIVASAN, C. Effect of nutrient media on axillary shoot proliferation and preconditioning for adventitious shoot regeneration of pears. In vitro Cellular Development Biology Plant, Secaucus, v. 45, n. 6, p , CAPPELADES, M.; LEMEUR, R.; DEBERGH, P. Effects of sucrose on starch acumulation and rate of photosyntesis in Rosa cultured in vitro. Plant Cell Tissue and Organ Culture, Amsterdam, v. 25, n. 1, p , CHEN, J.; HALL, D. E.; LUCA, V. D. Effects of the growth retardant paclobutrazol on large-scale Micropropagation of daylily(hemerocallis spp.). In vitro Cellular Development Biology Plant, Secaucus, v. 41, n. 1, p , COGBILL, S.; FAULCON, T.; JONES, G.; MCDANIEL, M. Adventitious shoot regeneration from cotyledonary explants of rapid-cycling fast plants of Brassica rapa L. Plant Cell Tissue and Organ Culture, Amsterdam, v. 101, n. 2, p , KARASAWA, M. M. G.; PINTO, J. C.; PEREIRA, A. V.; PINTO, J. E. B. P. Evaluation of culture medium consistencies on proliferation of in vitro propagated elephant grass (Pennisetum purpureum Schum.). Plant Cell Culture & Micropropagation, Lavras, v. 2, n. 1, p , KISS, E.; KISS, J.; GYULAI, G.; HESZKY, L. E. A novel method for rapid microprogation of pineapple. HortScience, Alexandria, v. 30, n. 1, p , MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A. Revised medium for rapid growth and biossays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, Copenhagen, v. 15, n. 3, p , PEREIRA, F. D.; BRAGA, M. F.; SÁ, M. E. L.; ALCINO, O. G.; COLENGHI, I. C. Influência de BAP e NAA na multiplicação de abacaxi cv Perolera a partir de brotos estiolados in vitro. Bioscience Journal, Uberlandia, v. 17, n. 2, p , PEREIRA, F. D.; PINTO, J. E. B. P.; ROSADO, L. D. S.; RODRIGUES, H. C. A.; BERTOLUCCI, S. K. V.; LAMEIRA, O. A. Micropropagation of the fiber-rich Amazonian Species Ananas erectifolius (Bromeliaceae). HortScience, Alexandria, v. 43, n. 7, p , Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p. 1-09, 2010

16 Estiolamento e regeneração in vitro de Ananas comosus var. erectifolius... 9 PERES, L. E. P.; KERBAUY, G. B. Controle hormonal de desenvolvimento das raízes. Universa, Brasília, v. 8, p , RAMALHO, E. A folha amazônica que virou arte. Disponível em: < article_124.asp>. Acesso em: 1 ago RAMIREZ, A. L. Reproduction of pineapple (Ananas comosus L. Merr.) by tissue culture. Cultivos Tropicales, Habana, v. 63, p , REIS, É. S.; PINTO, J. E. B. P.; CORRÊA, R. M.; PEREIRA, F. D.; BERTOLUCCI, S. K. V. Influência dos meios MS e WPM associados a diferentes concentrações de Benzilaminopurina na multiplicação de ipeca (Psychotria ipecacuanha (Brot.) Stokes. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE CULTURA DE TECIDOS DE PLANTAS, 1., Anais p ROSAL, L. F.; PINTO, J. E. B. P.; BERTOLUCCI, S. K.; CORRÊA, R. M.; COSTA, L. C. B. Micropropagation of the medicinal plant Eremanthus erythropappus (DC.) MacLeish. HortScience, Alexandria, v. 42, n. 6, p , SHEN, X.; CASTLE, W. S.; GMITTER JUNIOR, F. G. In vitro shoot proliferation and root induction of shoot tip explants from mature male plants of Casuarina cunninghamiana Miq. HortScience, Alexandria, v. 45, n. 5, p , SILVA, C. País pesquisa mais fibras naturais para carros. Disponível em: < n o v o s _ d e s t a q u e s / o p o r t u n i d a d e / mostra_matéria.asp?cd_noticia=8356>. Acesso em: 1 out SILVA, R. P.; COSTA, M. A. P.; SOUZA, A. S.; ALMEIDA, W. A. B. Regeneração de plantas de laranja Pêra via organogênese in vitro. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 40, n. 12, p , SOUZA, A. V.; PINTO, J. E. B. P.; BERTOLUCCI, S. K.; CORRÊA, R. M.; COSTA, L. C. B.; DYER, W. E. In vitro propagation of Lychnophora pinaster (Asteraceae): a threatened endemic medicinal plant. HortScience, Alexandria, v. 42, n. 7, p , VENKATACHALAN, L.; THIMMARAJU, R.; SREEDHAR, R. V.; BHAGYALAKSHMI, N. Direct shoot and cormlet regeneration from leaf explants of Silk Banana (AAB). In vitro Cellular Development Biology Plant, Secaucus, v. 42, n. 3, p , ZIV, M. The control of bioreactor environment for plant propagation in liquid culture. Acta Horticulturae, Wageningen, v. 393, p , Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p. 1-09, 2010

17 10 MEIO DE CULTURA, PINHEIRO, CONCENTRAÇÃO M. V. M. et al. DE BAP E FOTOPERÍODO NA MICROPROPAGAÇÃO DE ANTÚRIO EIDIBEL POR SEGMENTOS CAULINARES CULTURE MEDIUM, BAP CONCENTRATION AND PHOTOPERIOD ON MICROPROPAGATION OF ANTHURIUM EIDIBEL STEM SEGMENTS MARCOS VINÍCIUS MARQUES PINHEIRO 1, GABRIELEN DE MARIA GOMES DIAS 2, ANA CRISTINA PORTUGAL PINTO DE CARVALHO 3, LEVI DE MOURA BARROS 3 1 Doutorando em Botânica Universidade Federal de Viçosa/UFV Campus Universitário, Departamento de Biologia Vegetal Viçosa, MG macvini@gmail.com 2 Doutoranda em Agronomia/Fitotecnia Universidade Federal de Lavras/UFLA Campus Universitário, Cx. P Lavras, MG gabriellen@gmail.com 3 Pesquisador (a) Embrapa Agroindústria Tropical Rua Dra. Sara Mesquita, nº. 2270, Bairro Pici Fortaleza, CE cristina@cnpat.embrapa.br; levi@cnpat.embrapa.br RESUMO Apesar de a micropropagação vir sendo empregada para a rápida propagação clonal de antúrio, os custos do processo ainda são altos. Visando a minimizar este problema, o trabalho objetivou aumentar a taxa de multiplicação in vitro. Para isso, avaliaram-se os efeitos de meio de cultura (MS e Pierik), concentração de BAP (2,22; 4,44; 6,66 e 8,88 ìm) e fotoperíodo (12 e 16 horas) na micropropagação de Anthurium andraeanum Linden var. Eidibel. Os explantes, segmentos caulinares contendo dois nós, obtidos a partir de mudas estabelecidas in vitro, foram inoculados em frascos contendo 30 ml de meio de cultura e mantidos em câmara de crescimento com temperatura de 25±1º C, intensidade luminosa de 30 ìmol m -2 s -1 e fotoperíodo de acordo com o tratamento. A taxa de multiplicação foi avaliada aos 30, 45 e 60 dias após a inoculação dos explantes. Utilizou-se o delineamento inteiramente casualizado, em arranjo fatorial 2 x 4 x 2, constituído de 5 repetições de 3 frascos (4 explantes/frasco). Os dados foram transformados para a raiz quadrada de (x + 0,5), submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey a 5% de significância. As maiores taxas de multiplicação foram obtidas no meio Pierik em todas as avaliações, e quanto aos fotoperíodos testados, os valores registrados não apresentaram diferença na primeira avaliação. Em relação às concentrações de BAP testadas, não foram registradas diferenças no meio Pierik. Com base na análise dos resultados obtidos, para micropropagação desta variedade de antúrio, recomenda-se o meio Pierik, acrescido de 2,22 µm de BAP, sob fotoperíodo de 12 horas, com a realização de subcultivos em intervalos de 30 dias. Termos para indexação: Araceae, Anthurium andraeanum, floricultura, cultura de tecidos. ABSTRACT Although the micropropagation has been used for quick anthurium clonal propagation the costs of the process are still high. In order to reduce this problem, the objective of this work was to increase the in vitro multiplication rate. For this, it was evaluated the effects of culture medium (MS and Pierik), BAP concentration (2.22; 4.44; 6.66 and 8.88 ìm) and photoperiod (12 and 16 hours) on the micropropagation of Anthurium andraeanum Linden var. Eidibel. The explants, stem segments with two nodes, obtained from in vitro plantlet, were inoculated in flasks with 30 ml of culture media and maitained in growth room under temperature of 25±1º C, light intensity of 30 ìmol m -2 s -1 and photoperiod varying as a function of the treatment. The multiplication rate was evaluated at 30, 45 and 60 days after the explants inoculation. A completely randomized design was used in a factorial scheme of 2 x 4 x 2 with 5 replicates of 3 flasks (4 explants/flask). The data were transformed to the square root of (x + 0.5) and the means were compared by Tukey s test (p<0.05). The higher multiplication rates were obtained in Pierik medium in all evaluations, and in relation to the photoperiod, there were no differences in the first evaluation. No difference was observed regarding the BAP concentrations used in the Pierik medium. The results indicate that for the micropropagation of this anthurium variety, it is recommended the use of Pierik medium supplemented with 2.22 ìm BAP under 12 hours of photoperiod, subcultured at each 30 days. Index terms: Araceae, Anthurium andraeanum, floriculture, tissue culture. INTRODUÇÃO As exportações brasileiras de flores e plantas ornamentais somaram, em 2009, US$ 31,137 milhões, valor que representou uma queda substancial de 12,30% em relação ao desempenho do ano anterior (JUNQUEIRA & PEETZ, 2010a). Esses autores enfatizam que tal resultado era aguardado, tendo em vista os efeitos da crise econômica e financeira internacional que abalou sensivelmente os principais mercados importadores da floricultura nacional, (Recebido em 24 de dezembro de 2008 e aprovado em 31 de agosto de 2010) Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p , 2010

18 Meio de cultura, concentração de bap e fotoperíodo como os EUA, os países da União Européia e o Japão. Ao longo do primeiro semestre de 2010, as importações brasileiras de produtos da floricultura atingiram o valor global de US$ 14,287 milhões, representando um acréscimo de 1,64% em relação ao valor obtido no mesmo período do ano anterior (US$ 14,056 milhões). O resultado, apesar de pequeno, não deixou de ser surpreendente, levando-se em conta a persistência da crise econômica e financeira, prevalecente nos principais mercados importadores; as quedas registradas na produção interna brasileira, decorrentes de fatores climáticos adversos, além do problema com o trânsito aéreo internacional, em decorrência dos fechamentos de aeroportos europeus, devido às fortes fumaças provocadas pela erupção do vulcão na Islândia, em abril de 2010 (JUNQUEIRA & PEETZ, 2010b). Os principais pólos de produção de flores e plantas ornamentais, no Ceará, estão localizados na Região Metropolitana de Fortaleza, incluindo o Maciço de Baturité, na Serra da Ibiapaba, na região do Cariri e no Baixo Acaraú. Atualmente, o Estado ocupa o primeiro lugar nas exportações de rosas e flores tropicais e o segundo de flores frescas cortadas do País. Os principais produtos exportados são rosas (31%), bulbos (28%), flores tropicais (25%), mudas (10%) e folhagens (3%) (CASTRO, 2007). Os antúrios se destacam como um dos produtos comerciais de maior potencial tanto para o mercado interno, quanto para as exportações. No Brasil, os antúrios são cultivados principalmente no Estado de São Paulo. Entretanto, nos últimos anos, tem sido verificada uma relativa dispersão desta cultura para áreas do norte e do nordeste do país, com destaque para os Estados de Pernambuco, Bahia, Alagoas e Ceará (JUNQUEIRA & PEETZ, 2008). No Ceará, os antúrios merecem destaque entre as flores tropicais sendo cultivados, principalmente, no Maciço de Baturité. Os antúrios pertencem ao gênero Anthurium Schott. (Araceae) que compreende mais de 600 espécies, normalmente herbáceas, epífitas, eretas ou trepadeiras. Suas flores são hermafroditas e apresentam o fenômeno da protoginia, ou seja, quando a parte feminina torna-se receptiva, a masculina ainda está imatura, o que previne a autofecundação e favorece o cruzamento entre plantas. A maioria das espécies do gênero é ornamental, destacandose pela beleza da folhagem, sendo Anthurium andraeanum Lindl. de maior importância, devido ao tamanho, ao colorido e à durabilidade pós-colheita de suas inflorescências (TOMBOLATO, 2004; TOMBOLATO et al., 2004). Os antúrios podem ser propagados por sementes, rebentos, estacas e cultura de tecidos. A propagação sexuada, além de demandar cerca de três anos para que ocorra o primeiro florescimento e cinco para que a cultura possa ser explorada comercialmente, tem o inconveniente da alta heterogeneidade das plantas em razão da variabilidade genética nas progênies resultantes do plantio por sementes (LAMAS, 2002). Esta variabilidade, no entanto, é fundamental para a obtenção de novas variedades. A propagação assexuada pode ser feita por divisão de touceiras, ou seja, por rebentos, estaquia e, mais recentemente, por micropropagação (TOMBOLATO, 2004). Os métodos por divisão de touceiras e estaquia, porém, fornecem apenas algumas unidades de novas mudas anualmente, além de possibilitar a disseminação de pragas e doenças. A principal vantagem da micropropagação é a produção de um elevado número de plantas, em curto espaço de tempo e em área física reduzida, quando comparada com os métodos tradicionais de multiplicação. A sanidade das plantas produzidas por essa técnica e seu conseqüente vigor garantem, além de um material de plantio de qualidade superior, a obtenção de plantas de tamanho padronizado, permitindo um manejo mais adequado do cultivo, o que reflete diretamente nos custos de produção. Além disso, Fuzitani & Nomura (2004) citam a uniformização de características tais como: época de floração, coloração, tamanho e forma das inflorescências. Entretanto, essa técnica tem como desvantagens o elevado custo final da muda e a possibilidade de ocorrência de variantes somaclonais. O uso da micropropagação tem se destacado, também, no lançamento de novas variedades desenvolvidas pelos programas de melhoramento genético (SOUZA & JUNGHANS, 2006). Um exemplo é o programa de melhoramento desenvolvido pelo Instituto Agronômico (IAC), no qual são selecionados materiais adaptados às Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p , 2010

19 12 PINHEIRO, M. V. M. et al. nossas condições climáticas para exploração comercial tanto para flor de corte quanto para planta de vaso. No IAC, entre as 12 seleções de Anthurium andraeanum, quatro foram selecionadas para produção comercial e lançadas como variedades: IAC Astral, IAC Cananéia, IAC Eidibel e IAC Ômega. Dessas, destaca-se a Eidibel, que por ser uma planta vigorosa, de porte médio, altamente produtiva, de crescimento rápido, com inflorescências de formato, brilho e longevidade pós-colheita comercialmente aceitos, tornou-se muito atrativa aos consumidores. Além disso, sua inflorescência é de coloração vermelho forte, cor de maior demanda de mercado entre as flores de corte. Esses fatores possibilitaram que essa variedade se tornasse, atualmente, a mais cultivada em todo o Brasil (LEME, 2004). Considerando-se o potencial desta espécie para a geração de emprego e renda nas regiões produtoras, sua grande aceitação nos principais mercados consumidores e a necessidade de melhoria dos processos de multiplicação da planta, foi realizado o presente trabalho que objetivou a otimização do protocolo de multiplicação in vitro de Anthurium andraeanum var. Eidibel por meio de segmentos caulinares (microestacas). MATERIAL E MÉTODOS O trabalho foi realizado no Laboratório de Cultura de Tecidos e Genética Vegetal da Embrapa Agroindústria Tropical (CNPAT), em Fortaleza, Ceará, no período de outubro a dezembro de Foram utilizados como explantes segmentos caulinares contendo dois nós (microestacas), por meio do seccionamento de mudas de antúrio (Anthurium andraeanum) var. Eidibel, aos 60 dias após estabelecimento in vitro. Essas mudas foram obtidas a partir da indução de calogênese em folhas jovens, com posterior organogênese de brotações. As plantas matrizes foram cedidas pelo Instituto Agronômico (IAC) em Campinas, São Paulo. Em câmara de fluxo laminar, sob condições assépticas, os explantes foram inoculados em frascos de vidro transparente com capacidade de 220 ml contendo 30 ml de meio de cultura e mantidos em sala de crescimento, a 25 ± 1ºC, intensidade luminosa de 30 ìmol m -2 s -1, sob fotoperíodo, de acordo com o tratamento. Os meios de cultura utilizados foram MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962) e Pierik (PIERIK, 1976) suplementados com 30 g L -1 e 20 g L -1 de sacarose, respectivamente. Os meios foram solidificados com ágar a 5,5 g L -1 e o ph ajustado para 5,8 antes da autoclavagem, realizada a 121ºC por 15 minutos. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, em arranjo fatorial 2 x 4 x 2, dois meios de cultura (MS e Pierik), quatro concentrações de 6- benzilaminopurina BAP (2,22; 4,44; 6,66 e 8,88 µm) e dois fotoperíodos (12 e 16 horas), constituído de cinco repetições de três frascos, com quatro explantes/frasco, totalizando 60 explantes/tratamento. As taxas de multiplicação foram avaliadas aos 30, 45 e 60 dias após a inoculação dos explantes, contando-se o número de brotos formados/explante. Os dados foram transformados para a raiz quadrada de (x + 0,5) e submetidos à análise de variância, sendo as médias comparadas pelo teste de Tukey a 5% de significância. RESULTADOS E DISCUSSÃO De acordo com a análise de variância, houve significância para o fator meio de cultura em todos os períodos avaliados, para o fator fotoperíodo e para a interação meio de cultura x concentração de BAP nas duas últimas avaliações efetuadas. Em relação ao número de brotos formados por explante nos dois meios de cultura testados, observou-se, nos três períodos avaliados, que as maiores taxas de multiplicação foram registradas no meio Pierik (Tabela 1). A principal diferença entre esses dois meios de cultura é a concentração utilizada dos macronutrientes. No meio Pierik, as concentrações dos cinco macronutrientes (NH 4 NO 3, KNO 3, CaCl 2.2H 2 O, MgSO 4.7H 2 O e KH 2 PO 4 ) são reduzidas à metade, comparadas com as concentrações normalmente utilizadas no meio MS. Especificamente, em relação ao nitrato de amônio a concentração recomendada é de 1650 mg L -1 e 825 mg L -1 nos meios MS e Pierik respectivamente. Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p , 2010

20 Meio de cultura, concentração de bap e fotoperíodo O crescimento e a morfogênese das plantas cultivadas in vitro são influenciados tanto pela quantidade, quanto pela forma inorgânica, nitrato (NO 3- ) e amônio (NH 4+ ), disponibilizadas do nitrogênio. A razão entre as concentrações dessas duas formas parece ser o fator determinante do crescimento, sendo que a de amônio deve ser, no máximo, um terço da de nitrogênio total (CALDAS et al., 1998), tendo em vista que este íon é tóxico para maioria das plantas (GEORGE et al., 2008). Em meios de cultura, com elevadas concentrações de amônio, pode ocorrer aumento da produção de etileno (BARKER & COREY, 1987; COREY & BARKER, 1987), acarretando a formação de brotos com crescimento retardado ou com hiperhidricidade. Além disso, altas concentrações de amônio também podem afetar as respostas das células aos reguladores de crescimento, em especial na divisão celular e na morfogênese (MOTT et al., 1985). Em circunstâncias normais, o efeito tóxico do amônio é evitado por sua conversão em aminoácido e rápida assimilação pelos tecidos vegetais. Na composição da maioria dos meios de cultura, o íon nitrato necessita ser suplementado juntamente com o íon amônio, uma vez que as plantas não se desenvolvem adequadamente tendo o nitrato como única fonte de nitrogênio (GEORGE et al., 2008). Pierik e colaboradores (PIERIK, 1976; PIERIK et al., 1979) foram pioneiros em demonstrar a importância da concentração de amônio, presente no meio de cultura, para o cultivo in vitro do antúrio. Esses autores observaram formação de partes aéreas, apenas quando a concentração de NH 4 NO 3 foi reduzida de 825 mg L -1 para 200 mg L -1, constatando que esse efeito era causado pelo íon amônio e não pelo íon nitrato, substituindo o NH 4 NO 3 tanto por (NH 4 ) 2 SO 4 quanto por NaNO 3. Os resultados obtidos no presente trabalho, no qual se verificou que baixas concentrações de NH 4 NO 3 foram favoráveis para a multiplicação in vitro de antúrio, confirmam as observações de Geier (1986), Lightbourn & Prasad (1990), Pierik (1976) e Puchooa & Sookun (2003). Na maioria dos trabalhos com cultura de tecidos de antúrios, os meios de cultivo derivam da formulação básica do meio MS, utilizandose para os macronutrientes, concentrações reduzidas à metade ou a concentrações ainda menores. Pierik (1976) introduziu uma seqüência de modificações do meio MS, alterando as concentrações dos macronutrientes, para as fases de indução de calos, multiplicação e regeneração de plantas. E, embora com menor freqüência, também tem sido empregadas modificações do meio de cultivo Nitsh (1969) cuja composição é muito semelhante aos meios MS e Pierik, para produção de mudas in vitro de espécies do gênero Anthurium (GEIER, 1990). Tombolato & Costa (1998) recomendam a utilização do meio Pierik para micropropagação das variedades de antúrio lançadas pelo Instituto Agronômico (IAC). O número de brotos produzidos por explante, aos 30 dias de cultivo in vitro (em média 2,50), foi estatisticamente igual nos dois fotoperíodos testados. Entretanto, nas culturas mantidas, até os 45 e 60 dias, o número médio de brotos formados por explante foi superior, no fotoperíodo de 16 horas. Aos 30 dias de cultivo in vitro, as culturas expostas por 16 horas de luz diária apresentaram maior valor para formação de brotos/explante, apesar de não terem sido identificadas diferenças significativas em relação ao fotoperíodo de 12 horas. Verificou-se que o cultivo dos explantes sob regime de 16 horas de luz contínua, condição para a maioria dos cultivos realizados em laboratórios, proporcionou o melhor resultado em termos de número de mudas obtidas (Tabela 2). A intensidade luminosa ótima depende da espécie, do tipo de cultura e do fenômeno morfogenético a ser controlado ou induzido e em geral o período de iluminação varia entre 12 e 16 h/dia (HANDRO & FLOH, 1990). Não se dispõe de informações sobre o efeito do fotoperíodo na micropropagação de antúrio, entretanto algumas modificações no regime de luz são citadas. Geier (1990) recomenda, para a fase de multiplicação, que as culturas sejam mantidas sob fotoperíodo de 14 horas com intensidade luminosa variando de 30 a 50 ìmol m -2 s -1. Já Tombolato & Costa (1998) sugerem que as culturas sejam mantidas, sob fotoperíodo de 16 horas, e Vargas et al. (2004) sob 24 horas de luz continua de 50 ìmol m -2 s -1. Do ponto de vista econômico, a otimização de um sistema comercial de micropropagação requer diminuição dos gastos com energia elétrica, que, Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p , 2010

21 14 PINHEIRO, M. V. M. et al. segundo Grattapaglia & Machado (1998), é um dos principais componentes do custo de uma planta micropropagada. Na interação meio de cultura x concentração de BAP, foi identificada significância para os parâmetros avaliados aos 45 e aos 60 dias de cultivo in vitro. Os maiores valores para o número de brotos formados por explante, tanto aos 45 quanto aos 60 dias de cultivo in vitro, foram registrados no meio de cultura Pierik, exceto para a concentração de 4,4 µm de BAP, cujos valores foram estatisticamente iguais para os dois meios testados (Tabela 3). TABELA 1 - Número médio de brotos formados/explante de Anthurium andraeanum var. Eidibel, aos 30, 45 e 60 dias de cultivo in vitro, nos meios de cultura MS e Pierik. Meio de cultura Dias de cultivo in vitro MS 2,36 b 2,89 b 3,14 b Pierik 2,64 a 3,30 a 3,77 a CV (%) 6,92 6,83 6,87 *Médias seguidas pela mesma letra na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. TABELA 2 - Número médio de brotos formados/explante de Anthurium andraeanum var. Eidibel, aos 30, 45 e 60 dias de cultivo in vitro, em fotoperíodos de 12 e 16 horas. Fotoperíodo (número de horas) Dias de cultivo in vitro ,42 a 2,98 b 3,28 b 16 2,59 a 3,22 a 3,63 a CV (%) 6,92 6,83 6,87 *Médias seguidas pela mesma letra na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. TABELA 3 - Número médio de brotos formados/explante de Anthurium andraeanum var. Eidibel, em função do meio de cultura e da concentração de BAP, aos 45 e aos 60 dias de cultivo in vitro. BAP (µm) 45 dias de cultivo in vitro 60 dias de cultivo in vitro Meio de cultura Meio de cultura Média MS Pierik MS Pierik Média 2,22 2,73 a B 3,32 a A 3,03 A 2,78 b B 3,78 a A 3,28 A 4,44 3,21 a A 3,02 a A 3,11 A 3,59 a A 3, 42 a A 3,50 A 6,66 2,76 a B 3,38 a A 3,07 A 2,99 ab B 3,96 a A 3,47 A 8,88 2,88 a B 3,49 a A 3,18 A 3,20 ab B 3,92 a A 3,56 A Média 2,89 b 3,30 a - 3,14 b 3,77 a - CV(%) 6,83 6,87 *Médias seguidas de letras iguais minúsculas, nas colunas, e maiúsculas, nas linhas, por época de avaliação, não diferem entre si, pelo Teste de Tukey a 5% de probabilidade. Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p , 2010

22 Meio de cultura, concentração de bap e fotoperíodo No meio de cultura Pierik, a redução da concentração de BAP de 4,44 para 2,22 µm, proporcionou aumento da taxa de multiplicação de 3,02 para 3,32 e de 3,42 para 3,78 aos 45 e 60 dias de cultivo, respectivamente. Comportamento semelhante foi relatado por Puchooa & Sookun (2003) que verificaram, nas três variedades de antúrio estudadas, intensificação na formação de parte aérea quando, no meio Nitsch (1969), a concentração de BAP foi reduzida de 4,44 para 2,22 µm. Entretanto, efeito contrário foi verificado por Atak & Çelik (2009), comparando as variedades de antúrio Arizona e Sumi cultivadas em meio MS contendo metade das concentrações de sais e adicionado com 4,44 µm de BAP e 0,45 µm de 2,4D e observando maior número de brotos na variedade Arizona. No meio de cultura MS, a concentração de 4,44 µm de BAP acarretou aumento no número de brotos formados/ explantes (3,21), em comparação com os demais tratamentos.o mesmo comportamento foi relatado por Liendo & Mogollón (2009), que verificaram para cv. Nicoya um aumento no número de brotos quando cultivados em meio MS na concentração de 4,44 µm de BAP. Para a cv. Rubrun, Maira et al. (2010) recomendam o meio de cultura MS suplementado com 9 µm de BAP e 2,26 µm de ANA como o mais indicado para a produção de brotos. Lightbourn & Prasad (1990) registraram os melhores índices de multiplicação, para todas as variedades de antúrio testadas, no meio de cultura Nitsch (1969) adicionado de 0,9 a 3,6 µm de BAP, obtendo de 3 a 5 brotos por calos quando as culturas foram mantidas sob fotoperíodo de 12 horas e intensidade luminosa de 50 ìmol.m -2 s -1. Os autores constataram que concentrações superiores a 4,44 µm de BAP estimularam a proliferação de calos e reduziram a formação de brotos. No presente trabalho, quando foram adicionadas concentrações de 2,22 e 4,44 µm de BAP ao meio Pierik, os índices de multiplicação foram muito semelhantes, variando de 3,02 a 3,78. Entretanto, a utilização de concentrações maiores de BAP não reduziu formação de brotos. Vargas et al. (2004) obtiveram, em média, 3,6 brotações por explante quando as culturas foram subcultivadas em meio MS contendo 4,4 µm de BAP e 0,05 µm de ácido naftalenoácetico (ANA) e mantidas sob 24 horas de luz contínua e intensidade luminosa de 50 ìmol m -2 s -1, após 30 dias de cultivo in vitro. Comparando-se esses resultados com os obtidos no presente trabalho, verifica-se que, no meio de cultura MS, utilizando-se a mesma concentração de BAP, o número de brotos formados por explante foi de 3,21 e 3,59, aos 45 e 60 dias de cultivo in vitro, respectivamente. Entretanto, as culturas foram mantidas em regime de luz inferior, isto é, 12 e 16 horas de luz diária e intensidade luminosa reduzida de apenas 30 ìmol m -2 s -1. Na literatura são poucas as informações disponíveis em relação ao número de mudas de antúrio obtidas ao final do processo de micropropagação, além disso, os valores mencionados apresentam grande variação. No protocolo descrito por Castro et al. (1982), foram obtidas, em média, 30 mudas/segmento foliar, após 12 meses de cultura, por meio da organogênese indireta. Por outro lado, via organogênese direta, a metodologia proposta por Martin et al. (2003) possibilitou a obtenção de aproximadamente 300 mudas/explante foliar, no período de 200 dias. No presente trabalho, utilizando-se o meio de cultura Pierik acrescido de 2,22 µm de BAP, sob fotoperíodo de 12 horas, a taxa média de multiplicação foi de 2,65. Nessas condições, ao final de 6 meses, efetuando-se subcultivos sucessivos de 30 dias cada, podem ser obtidas 346 mudas a partir de um único segmento caulinar da cultivar de antúrio Eidibel. Entretanto, se os subcultivos forem efetuados a cada 45 (3,07) e 60 dias (3,34), seriam obtidas 89 e 37 mudas, respectivamente, após este mesmo intervalo de tempo. O período de incubação mais comum entre repicagens é de quatro semanas, podendo este não ser o intervalo ideal para otimizar a taxa de multiplicação (GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998). George (1993) informa que o intervalo entre subcultivos depende da taxa de crescimento da cultura e que, a ± 25 o C, a repicagem é, geralmente, efetuada de quatro a seis semanas. Para a variedade de antúrio estudada, pode-se recomendar a realização de subcultivos com intervalos de 30 dias. Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p , 2010

23 16 PINHEIRO, M. V. M. et al. CONCLUSÕES A redução dos macronutrientes associada à diminuição da concentração de BAP para 2,22 µm proporciona as maiores taxas de formação de brotos de Anthurium andraeanum var. Eidibel. Os diferentes fotoperíodos afetam a formação de brotos de Anthurium andraeanum var. Eidibel. Durante a fase de multiplicação, o intervalo mais indicado para a realização de subcultivos sucessivos é de 30 dias. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem ao Instituto Agronômico (IAC) por ceder as mudas in vitro para a realização desse trabalho e a Embrapa Agroindústria Tropical e ao CNPq pela concessão das duas bolsas e auxílio à pesquisa. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ATAK, Ç.; ÇELIK, Ö. Micropropagation of Anthurium andraeanum from leaf explants. Pakistan Journal of Botany, Karachi, v. 41, n. 3, p , BARKER, A. V.; COREY, K. A. Ammonium-induced ethylene evolution by horticultural crops. HortScience, Stanford, v. 22, p. 381, CALDAS, L. S.; HARIDASAN, P.; FERREIRA, M. E. Meios nutritivos. In: TORRES, A. C.; CALDAS, L. S.; BUSO, J. A. (Eds.). Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. Brasília: Embrapa-SPI; Embrapa-CNPH, v. 1, p CASTRO, C. E. F.; FONSECA, M. S.; SONDAHL, M. R.; MATHES, L. A. F. Propagação vegetativa do antúrio in vitro. In: CONGRESSO DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE FLORICULTURA E PLANTAS ORNAMENTAIS, 3., 1982, Salvador. Anais... Campinas: Fundação Cargil, p CASTRO, S. de. Sertão está virando um jardim. Diário do Nordeste Online, Fortaleza, v. 10 set Disponível em: < h t t p : / / d i a r i o d o n o r d e s t e. g l o b o. c o m / materia.asp?codigo=468732>. Acesso em: 13 nov COREY, K. A.; BARKER, A. V. Physiology of ethylene evolution by tomato plants under ammmonium-induced stress. HortScience, Stanford, v. 22, p. 381, FUZITANI, E. J.; NOMURA, E. S. Produção de mudas in vitro. Revista Brasileira de Horticultura Ornamental, Campinas, v. 10, n. 1/2, p , GEIER, T. Anthurium. In: AMMIRATO, P. V.; EVANS, D. A.; SHARP, W. R.; BAJAJ, Y. P. S. (Eds.). Handbook of plant cell culture: ornamental species. New York: McGraw- Hill, p GEIER, T. Factors affecting plant regeneration from leaf segments of Anthurium andraeanum Schott (Araceae) cultured in vitro. Plant Cell, Tissue Organ Culture, Dordrecht, v. 6, p , GEORGE, E. F. Plant Tissue culture techniques. In:. Plant propagation by tissue culture. 2. ed. Edington: Exegetics, chap. 1, p GEORGE, E. F.; HALL, M. A.; KLERK, G. D. In:. Plant propagation by tissue culture. Dordrecht: Springer, chap. 3, p GRATTAPAGLIA, D.; MACHADO, M. A. Micropropagação. In: TORRES, A. C.; CALDAS, L. S.; BUSO, J. A. (Eds.). Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. Brasília: Embrapa-SPI; Embrapa-CNPH, v. 1, p HANDRO, W.; FLOH, E. I. S. Aspectos básicos do controle da morfogênese in vitro. In: TORRES, A. C.; CALDAS, L. S. (Eds.). Técnicas e aplicações da cultura de tecidos de plantas. Brasília: ABCTP; Embrapa-CNPH, p JUNQUEIRA, A. H.; PEETZ, M. da S. Análise conjuntural do comércio exterior da floricultura brasileira: balanço 2009 e perspectivas Disponível em: < w w w. h o r t i c a. c o m. b r / a r t i g o s / 2010_Analise_Conjuntural_do_Comercio_Exterior.pdf>. Acesso em: 26 jul. 2010a. JUNQUEIRA, A. H.; PEETZ, M. da S. Análise conjuntural do comércio exterior da floricultura brasileira: 1º semestre de São Paulo: Hórtica Consultoria e Treinamento, 2010b. 9 p. JUNQUEIRA, A. H.; PEETZ, M. da S. Cultivares de Anthurium en el mercado brasileño. Horticultura Internacional, Madrid, p , Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p , 2010

24 Meio de cultura, concentração de bap e fotoperíodo LAMAS, A. da M. Floricultura tropical: técnicas de cultivo. Recife: Sebrae/PE, p. LIENDO, M.; MOGOLLÓN, N. Multiplicación clonal in vitro del anturio (Anthurium andraeanum Lind. cv. Nicoya). Bioagro, Barquisimeto, v. 21, n. 3, p , LEME, J. M. Resfriamento e conservação de antúrio IAC Eidibel f. Dissertação (Mestrado em Engenharia Agrícola) Universidade Estadual de Campinas, Campinas, LIGHTBOURN, G. L.; PRASAD, P. V. D. In vitro techniques for rapid multiplication of varieties of Anthurium andraeanum in Jamaica. Proceedings Interamerican Society Tropical Horticulturae, Orlando, v. 34, p. 3-5, MAIRA, O.; ALEXANDER, M.; VARGAS, T. E. Micropropagation and organogenesis of Anthurium andreanum Lind cv Rubrun. In: JAIN, S. M.; OCHATT, S. J. (Eds.). Protocols for in vitro propagation of ornamental plants, methods in molecular biology. New York: Humana, p MARTIN, K. P.; JOSEPH, D.; MADASSERRY, J.; PHILIP, V. J. Direct shoot regeneration from lamina explants of two commercial cut flowers cultivars of Anthurium andraeanum Hort. In Vitro Cellular Developmental Biology-Plant, Columbia, v. 39, p , MOTT, R. L.; CORDTS, J. M.; LARSON, A. M. Nitrogen and growth regulator effects on shoot and root growth of soybean in vitro. In: HENKE, R. R.; HUGHES, K. W.; CONSTANTIN, M. J.; HOLLAENDER, A. A.; WILSON, C. M. (Eds.). Tissue culture in forestry and agriculture. New York: Plenum, p MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, Copenhagen, v. 25, n. 3, p , NITSCH, J. P. Experimental androgenesis in Nicotiana. Phytomorphology, Jodhpur, v. 19, p , PIERIK, R. L. M. Anthurium andraeanum Lindl. plantlets produced from callus tissues cultivated in vitro. Physiologia Plantarum, Copenhagen, v. 37, p , PIERIK, R. L. M.; LEEUWEN, P. V.; RIGTER, G. C. M. Regeneration of leaf explants of Anthurium andraeanum Lindl. in vitro. Netherlands Journal of Agricultural Science, Wageningen, v. 27, p , PUCHOOA, D.; SOOKUN, D. Induced mutation and in vitro culture of Anthurium andreanum. Food and Agricultural Research Council, Réduit, p , SOUZA, A. da S.; JUNGHANS, T. G. Introdução à micropropagação de plantas. Cruz das Almas: Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical, p. TOMBOLATO, A. F. C. Cultivo comercial de plantas ornamentais. Campinas: Instituto Agronômico, p. TOMBOLATO, A. F. C.; COSTA, A. M. M. Micropropagação de plantas ornamentais. Campinas: Instituto Agronômico, p. (Boletim técnico, 174). TOMBOLATO, A. F. C.; MATTHES, L. A. F.; UZZO, R. P.; CASTRO, A. C.; SAKAI, M.; SAES, L. A. Recursos genéticos e melhoramento do antúrio (Anthurium andraeanum Linden) no IAC APTA. Revista Brasileira de Horticultura Ornamental, Campinas, v. 10, n. 1/2, p. 1-5, VARGAS, T. E.; MEJÍAS, A.; OROPEZA, M.; GARCÍA, E. da. Plant regeneration of Anthurium andreanum cv Rubrun. Electronic Journal of Biotechnology, Valparaíso, v. 7, n. 3, p , Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p , 2010

25 18 REDUÇÃO DA NECROSE MACHADO, APICAL M. P. et E al. HIPERIDRICIDADE DE PLANTAS DE Lavandula angustifolia Mill. CULTIVADAS in vitro REDUCTION OF APICAL NECROSIS AND HYPERHYDRICITY IN in vitro CULTURED Lavandula angustifolia Mill. PLANTLETS MARÍLIA PEREIRA MACHADO 1 ; LUIZ ANTONIO BIASI 2 ; VANESSA REINHART 3 ; GABRIEL DISTÉFANO SANTOS 3 1 Doutoranda em Agronomia Universidade Federal do Paraná/UFPR Rua dos Funcionários, 1540, Juvevê, Laboratório de Micropropagação de Plantas Curitiba, PR ma_rilia10@hotmail.com 2 Professor Associado do Departamento de Fitotecnia e Fitossanitarismo Universidade Federal do Paraná/UFPR - Rua dos Funcionários, 1540, Juvevê Curitiba, PR biasi@ufpr.br 3 Graduando (a) em Agronomia Universidade Federal do Paraná /UFPR Rua dos Funcionários, 1540, Juvevê Curitiba, PR vanessinharnt@hotmail.com; gds227@gmail.com RESUMO A necrose apical e a hiperidricidade que ocorrem em plantas cultivadas in vitro podem inviabilizar o processo de micropropagação. Em lavanda micropropagada, estes problemas são frequentes, dificultando a obtenção de protocolos eficientes. O objetivo deste trabalho foi avaliar diferentes concentrações de cloreto de cálcio (CaCl 2 ) no meio de cultura sobre a necrose apical e hiperidricidade das brotações micropropagadas de Lavandula angustifolia Mill. Brotações micropropagadas de L. angustifolia foram subcultivadas em meio de cultura MS suplementado com 1,0 µm BAP e concentrações de 440, 880, 1320, 1760, 2200 e 2640 mg L -1 de CaCl 2. Foram testadas as mesmas concentrações no meio de enraizamento. As avaliações foram realizadas a cada 40 dias. O delineamento experimental foi em blocos casualizados, com quatro repetições e 10 brotações por parcela. O aumento da concentração de CaCl 2 no meio de cultura MS reduziu significativamente a necrose apical e a hiperidricidade das brotações micropropagadas de L. angustifolia, apresentando efeito no enraizamento das brotações, pois afetou o comprimento e o número de raízes principais formadas, embora não tenha afetado o percentual de brotações enraizadas. As concentrações de 1320, 1760 e 2200 mg L -1 de CaCl 2 no meio de cultura MS, durante a fase de multiplicação, foram mais efetivas na redução da necrose apical e hiperidricidade das brotações de L. angustifolia, não interferindo na porcentagem de enraizamento. Termos para indexação: Alfazema, micropropagação, cálcio. ABSTRACT The apical necrosis and hyperhydricity which occur in in vitro cultured plantlets may turn micropropagation impracticable. These problems are frequently seen in micropropagation of lavender, complicating the establishment of an efficient propagation protocol. The objective of this work was to evaluate the effect of different concentrations of calcium chloride (CaCl 2 ) in the culture media on apical necrosis and hyperhydricity of Lavandula angustifolia Mill. micropropagated shoots. Shoots were sub-cultivated in MS media supplied with 1.0 µm of BAP and 440, 880, 1320, 1760, 2200 and 2640 mg L -1 CaCl 2. The same concentrations were used in the rooting media. Evaluations were performed each 40 days. A completely randomized design with four replicates and 10 shoots in each parcel was used. The increase of CaCl 2 concentration in the MS medium significantly reduced apical necrosis and hyperhydricity of L. angustifolia micropropagated shoots and the number of main roots formed. The most effective CaCl 2 concentrations against apical necrosis and hyperhydricity of L. angustifolia shoots during the multiplication phase were 1320, 1760 and 2200 mg L -1. There was no influence on rooting percentage. Index terms: Lavender, micropropagation, calcium. INTRODUÇÃO A Lavandula angustifolia Mill. (Lamiaceae), popularmente conhecida como lavanda ou alfazema, é considerada uma espécie medicinal e aromática de grande importância econômica por constituir uma fonte rica de componentes bioativos (GHELARDINI et al., 1999). Seu óleo essencial, que contém geraniol, furfurol, linalol, cariofileno, acetato de linalila e cumarinas (MARTINS et al., 2000), é amplamente utilizado na perfumaria, muito embora também seja empregado nas indústrias cosmética, alimentícia e farmacêutica (BOELENS, 1995; CHEMAT et al., 2006). Por exemplo, os compostos acetato de linalila e linalol, que são os dois mais importantes constituintes químicos do óleo essencial de L. angustifolia (JAGER et (Recebido em 02 de fevereiro de 2009 e aprovado em 31 de agosto de 2010) Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p , 2010

26 Reduçãoda necrose apical e hiperidricidade de plantas químicos do óleo essencial de L. angustifolia (JAGER et al., 1992), possuem propriedades sedativa (BUCHBAUER et al., 1991) e anestésica (GHELARDINI et al., 1999). Além disso, o linalol tem efeito antibacteriano (PATTNAIK, 1997) e inseticida (JAGER et al., 1992). Na propagação de L. angustifolia por sementes, observa-se desuniformidade no desenvolvimento das mudas e das plantas a campo devido à variabilidade natural resultante da propagação sexuada (BIASI & DESCHAMPS, 2009) e a propagação por estaquia tem sido dificultada pela baixa capacidade de enraizamento das estacas (CALVO & SEGURA, 1989). Uma alternativa para a propagação de L. angustifolia é a micropropagação, pois a sua aplicação tem possibilitado a obtenção de plantas, geneticamente idênticas à planta matriz, em larga escala e em curto espaço de tempo. Porém, seu sucesso depende do controle da morfogênese, a qual é influenciada por vários fatores como espécie, tipo de explante, componentes do meio nutritivo, reguladores de crescimento e ambiente de cultivo (CARVALHO et al., 2006). O desajuste no controle desses fatores pode causar desordens fisiológicas nas plantas cultivadas in vitro, dentre as quais estão a necrose apical, que prejudica o crescimento e pode causar a morte da planta e a hiperidricidade, caracterizada por plantas com baixos níveis de celulose e lignina, baixa resistência de parede celular (KEVERS & GASPAR, 1986), hipertrofia celular (VIEITEZ et al., 1985), baixo conteúdo de cálcio (KEVERS et al., 2004), folhas intumescidas e quebradiças (LESHEM et al., 1988) e reduzida taxa de sobrevivência em condições autotróficas (RADMANN et al., 2001). Essas desordens podem estar relacionadas com a deficiência de cálcio na planta in vitro. O cálcio é essencial para manter a integridade estrutural e funcional das membranas e da parede celular e sua deficiência leva à senescência precoce (MALAVOLTA, 2006). Esse nutriente depende da transpiração da planta para ser transportado, no xilema, até as regiões meristemáticas de crescimento ativo (BIDDULPH et al., 1959). Os frascos de cultura utilizados na micropropagação retêm alta umidade relativa, suprimindo a taxa de transpiração das brotações cultivadas in vitro, o que leva à deficiência de nutrientes menos móveis. Dessa forma, sugere-se que os sintomas de deficiência de cálcio na micropropagação estejam relacionados com sua mobilidade (BARGHCHI & ALDERSON, 1996). O enraizamento também é prejudicado pela deficiência de cálcio, que afeta particularmente os pontos de crescimento da raiz (VITTI et al., 2006). Protocolos de micropropagação de Lavandula spp., descritos anteriormente, relatam a ocorrência de hiperidricidade nas brotações (ANDRADE et al., 1999; DIAS et al., 2002; TSURO et al., 2000), porém não há indicações para a solução desse problema. Em estudos preliminares foram observadas necrose apical e hiperidricidade das brotações de L. angustifolia in vitro, limitando a obtenção de um protocolo eficiente. Diante disso, este trabalho teve como objetivo avaliar diferentes concentrações de cloreto de cálcio (CaCl 2 ) no meio de cultura sobre a necrose apical e hiperidricidade das brotações micropropagadas de L. angustifolia. MATERIAL E MÉTODOS Ápices caulinares de aproximadamente 5,0 mm de comprimento foram coletados de planta matriz de L. angustifolia (Provence Blue proveniente da França) mantida em vaso contendo solo como substrato em casade-vegetação, em março de A assepsia foi realizada pela lavagem por uma hora em água corrente, seguida pelo tratamento com Cercobin (2%) por 40 minutos, imersão em etanol (70%) por 20 segundos, hipoclorito de sódio (1%) combinado com Tween-20 (0,2%) por 20 minutos sob agitação e quatro lavagens em água deionizada e esterilizada, sendo este procedimento realizado em câmara de fluxo laminar. Após a assepsia, os ápices meristemáticos foram cultivados individualmente em frascos contendo 10 ml de meio de cultura MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962), 100 mg L -1 de mio-inositol, 30 g L -1 de sacarose, 0,5 µm de BAP, 6 g L -1 de ágar (Vetec ) e o ph foi ajustado para 5,8. Os meios de cultura foram esterilizados à temperatura de Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p , 2010

27 20 MACHADO, M. P. et al. 121 C durante 20 minutos e 1,5 atm. Para a manutenção das culturas in vitro, as brotações obtidas no cultivo inicial foram subcultivadas a cada 40 dias no mesmo meio de cultura anterior, porém suplementado com 1,0 µm de BAP. Brotações de 2,0 cm de altura, provenientes do cultivo inicial, foram cultivadas em frascos de 250 ml contendo 30 ml de meio de cultura MS, concentrações de 440, 880, 1320, 1760, 2200 e 2640 mg L -1 de CaCl 2, 100 mg L -1 de mio-inositol, 30 g L -1 de sacarose, 1,0 µm de BAP, 6 g L -1 de ágar (Vetec ) e o ph foi ajustado para 5,8. Os meios de cultura foram esterilizados à temperatura de 121 C durante 20 minutos e 1,5 atm. Foram realizadas duas avaliações a cada 40 dias. As variáveis analisadas foram altura das brotações (cm), número de folhas por brotação, número de brotação por explante, porcentagem de hiperidricidade e porcentagem de necrose apical. Na fase de enraizamento, as brotações cultivadas em meio de cultura de multiplicação com diferentes concentrações de CaCl 2 foram subcultivadas no mesmo meio de cultura descrito anteriormente, mas sem a adição de regulador de crescimento. Após 30 dias de cultivo, foram avaliados a altura das plantas, número de raízes principais, comprimento das raízes e porcentagem de enraizamento. Para todos os experimentos, o delineamento experimental foi em blocos ao acaso com quatro repetições e quatro frascos por parcela com cinco brotações por frasco. Os resultados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e as médias foram comparadas pelo teste de Duncan a 5% de probabilidade. Dados em porcentagem foram transformados em arc sen (x/100). O programa utilizado foi o ASSISTAT versão 7.5 beta (2008). RESULTADOS E DISCUSSÃO No primeiro subcultivo, as concentrações de CaCl 2 não influenciaram estatisticamente a altura das brotações e o número de brotações por explante (Tabela 1). Em estudos com Gypsophila paniculata L., observouse o crescimento lento das brotações com a utilização de 3520 mg L -1 de CaCl 2 no meio de cultura MS, sendo associado ao excesso de cálcio ou à toxidez de cloro (TAKANE et al., 1994). O número de folhas por brotação foi influenciado pelas concentrações de CaCl 2 nos dois subcultivos, sendo que as concentrações de 2640 mg L -1 e 1320 mg L -1 foram significativamente superiores no primeiro e segundo subcultivos, respectivamente (Tabelas 1 e 2). A altura das brotações sofreu efeito das concentrações de CaCl 2 no segundo subcultivo, sendo obtida a altura média de 1,7 cm na concentração original TABELA 1 - Efeito de CaCl 2 na altura, número de folhas e brotações por explante de L. angustifolia, no primeiro subcultivo, em meio de cultura MS suplementado com 1,0 µm BAP. CaCl 2 (mg L -1 ) Altura (cm) 1 Nº folhas 2 Brotações/explante ,8 ± 0,38 7,8 ± 0,29 e 3,1 ± 0, ,4 ± 0,31 11,0 ± 1,86 b 2,5 ± 0, ,4 ± 0,24 8,5 ± 0,95 d 3,0 ± 0, ,5 ± 0,26 9,7 ± 0,14 c 3,0 ± 0, ,3 ± 0,73 10,0 ± 2,30 c 3,0± 1, ,7 ± 0,39 12,5 ± 1,78 a 2,0 ± 0,34 CV(%) 18,06 3,82 26,35 1 Dados não diferem estatisticamente pela analise de variância. 2 Letras seguidas pela mesma letra na coluna não diferem estatisticamente pelo teste de Ducan a 5% de probabilidade. Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p , 2010

28 Reduçãoda necrose apical e hiperidricidade de plantas TABELA 2 - Efeito de CaCl 2 na altura, número de folhas e brotações por explante de L. angustifolia, no segundo subcultivo, em meio de cultura MS suplementado com 1,0 µm BAP. CaCl 2 (mg L -1 ) Altura (cm) 2 N folhas 2 Brotações/explante ,7 ± 0,24 c 5,1 ± 0,58 c 2,1 ± 0, ,9 ± 0,21 bc 5,2 ± 0,68 c 2,7 ± 0, ,7 ± 0,39 a 11,1 ± 1,23 a 2,3 ± 0, ,5 ± 0,19 c 8,0 ± 1,63 b 2,2 ± 0, ,9 ± 0,50 bc 9,0 ± 2,04 b 2,4 ± 0, ,4 ± 0,17 ab 8,0 ± 0,36 b 2,8 ± 0,48 CV(%) 16,05 17,21 17,45 1 Dados não diferem estatisticamente pela análise de variância. 2 Letras seguidas pela mesma letra na coluna não diferem estatisticamente pelo teste de Ducan a 5 % de probabilidade. de CaCl 2 do meio de cultura MS, e de 2,7 cm na concentração de 1320 mg L -1 (Tabela 2). Gypsophila paniculata apresentou crescimento reduzido quando cultivada em meio de cultura MS com 2640 mg L -1 de CaCl 2 (JUN TAKANE et al., 1994). Esse efeito do CaCl 2 não foi observado em L. angustifolia, nos dois subcultivos realizados, podendo ser observado pela altura das brotações e pelo número de folhas. A altura das brotações, no primeiro subcultivo, apesar de não haver diferença estatística significativa entre as médias, foi de 1,8 cm na concentração de 440 mg L -1 e 2,7 cm na concentração de 2640 mg L -1. O número de folhas no primeiro subcultivo foi maior na concentração de 2640 mg L -1 (aproximadamente 13 folhas por brotação), quando comparado com a concentração de 440 mg L -1 (aproximadamente 8 folhas por brotação). No segundo subcultivo, a altura das brotações e o número de folhas por brotação na concentração de 2640 mg L -1 foram estatisticamente maiores do que na concentração de 440 mg L -1 (Tabelas 1 e 2). No segundo subcultivo, as diferentes concentrações de CaCl 2 também não influenciaram o número de brotações por explante (Tabela 2). Foram observados sintomas de hiperidricidade nas brotações de L. angustifolia cultivadas in vitro (Figura 3A) em todos os tratamentos, porém foi verificada uma redução significativa da porcentagem de hiperidricidade nas concentrações mais elevadas de CaCl 2 em relação a concentração original do meio de cultura MS (440 mg L -1 ) nos dois subcultivos avaliados (Figura 1). A hiperidricidade é um fenômeno que afeta a anatomia, a morfologia e a fisiologia das plantas (ZIV, 1996), podendo inviabilizar o processo de micropropagação devido à baixa sobrevivência das plantas na aclimatização. A redução da hiperidricidade com o aumento do cálcio no meio de cultura pode estar relacionada com a razão Ca ++ + /NH 4 no meio, pois a hiperidricidade pode ser induzida por uma proporção inadequada desses dois nutrientes (ZIV et al., 1987). Em Dianthus caryophyllus L., observou-se uma redução na porcentagem de hiperidricidade das brotações quando foi utilizada a metade da concentração dos macronutrientes do meio de cultura mantendo-se somente a concentração normal de CaCl 2 (ZIV et al., 1987). Cuzzuol et al. (1995), trabalhando com a mesma espécie, eliminaram parcialmente a hiperidricidade com o aumento de cálcio no meio de cultura, enquanto a ausência de CaCl 2 aumentou a hiperidricidade em 50%. A porcentagem de necrose apical das brotações foi reduzida com o aumento de CaCl 2 no meio de cultura no primeiro e no segundo subcultivo (Figura 2). Esses resultados evidenciam que a necrose apical, ocorrida nas Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p , 2010

29 22 MACHADO, M. P. et al a Primeiro subcultivo a Segundo subcultivo Hiperidricidade (%) b b c b d Hiperidricidade (%) b b b c b CaCl2 (mg L -1 ) CaCl2 (mg L -1 ) FIGURA 1 Efeito de diferentes concentrações de CaCl 2 na porcentagem de hiperidricidade das brotações de L. angustifolia, no primeiro e segundo subcultivos. Barras: médias ± desvio padrão. Diferenças significativas (p < 0,05) pelo teste de Duncan entre os tratamentos estão indicadas por letras diferentes. Necrose Apical (%) a b Primeiro subcultivo c c CaCl 2 (mg L -1 ) c c Necrose Apical (%) a Segundo subcultivo b b b CaCl 2 (mg L -1 ) FIGURA 2 Efeito de diferentes concentrações de CaCl 2 na porcentagem de necrose apical das brotações de L. angustifolia, no primeiro e segundo subcultivos. Barras: médias ± desvio padrão. Diferenças significativas (p < 0,05) pelo teste de Duncan entre os tratamentos estão indicadas por letras diferentes. b b FIGURA 3 Brotações de L. angustifolia cultivadas in vitro. A) Brotações hiperídricas. B) Brotação com necrose apical (seta). C) Brotações normais. Barras: 10 mm. Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p , 2010

30 Reduçãoda necrose apical e hiperidricidade de plantas brotações de L. angustifolia in vitro (Figura 3B), pode estar relacionada com a deficiência do cálcio nas brotações. Abousalii & Mantell (1994) preveniram completamente a necrose apical de Pistacia vera com imersões periódicas das brotações em meio de cultura líquido suplementado com cálcio. O cálcio apresenta limitações, na sua translocação na planta intacta, que podem ser observadas também in vitro. Como o cálcio depende da transpiração da planta para seu transporte no xilema, as condições de alta umidade do ar que se estabelecem in vitro podem induzir deficiência de cálcio em partes aéreas. A micropropagação de espécies mais exigentes em cálcio pode requerer um aumento desse íon no meio de cultura (CALDAS et al., 1998; SHA et al., 1985). Os resultados sugerem que a necrose apical de L. angustifolia pode estar relacionada à deficiência de cálcio e que o problema pode ser reduzido com o aumento de cálcio no meio de cultura. Porém, o problema não foi eliminado, visto que, mesmo sob altas concentrações de cálcio, as condições in vitro não favoreceram a transpiração e, provavelmente, a absorção de cálcio (não houve diferença estatística). Assim, os resultados também podem sugerir a influência de outros fatores sobre a necrose apical e a senescência foliar como o acúmulo de etileno no interior do frasco, a sensibilidade da espécie a este acúmulo e a necessidade de estudar e controlar outros fatores, além do cálcio presente no meio de cultura, para eliminar completamente esse problema e de reduzir a umidade relativa no interior do frasco, favorecendo a transpiração das plantas e reduzindo o acúmulo de etileno. A altura das brotações cultivadas em meio de cultura de enraizamento, isento de regulador de crescimento, foi influenciada pelas diferentes concentrações de CaCl 2, sendo obtida a maior altura (3,8 cm) na concentração de 1320 mg L -1, diferindo estatisticamente da concentração de 440 mg L -1 (2,9 cm) (Tabela 3). O número de raízes principais e o comprimento das raízes principais foram influenciadas pelas concentrações de CaCl 2. Na concentração de 2200 mg L -1, houve uma redução no número de raízes, quando comparado com as demais concentrações. E foram obtidos os maiores comprimentos das raízes principais nas concentrações de 880 e 1320 mg L -1 (1,9 e 1,8 cm, respectivamente) (Tabela 3). TABELA 3 - Efeito de CaCl 2 na altura, número de raízes e comprimento das raízes principais de L. angustifolia, em meio de cultura MS isento de regulador de crescimento. CaCl 2 (mg L -1 ) Altura (cm) 2 N de raízes principais 2 Comprimento das Enraizamento (%) 1 raízes principais ,9 ± 0,08 c 1,8 ± 0,21 a 1,1 ± 0,16 bc 39, ,9 ± 0,32 c 1,9 ± 0,43 a 1,9 ± 0,26 a 22, ,8 ± 0,41 a 2,1 ± 0,63 a 1,8 ± 0,43 a 30, ,3 ± 0,09 b 2,2 ± 0,24 a 0,7 ± 0,08 c 37, ,4 ± 0,06 b 1,1 ± 0,25 b 1,3 ± 0,50 bc 31, ,6 ± 0,06 ab 2,0 ± 0,41 a 1,4 ± 0,42 ab 35,0 CV(%) 6,97 21,32 27,41 21,09 1 Dados não diferem estatisticamente pela análise de variância. 2 Letras seguidas pela mesma letra na coluna não diferem estatisticamente pelo teste de Ducan a 5 % de probabilidade. Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p , 2010

31 24 MACHADO, M. P. et al. Não houve efeito das diferentes concentrações de CaCl 2 na porcentagem de enraizamento (Tabela 3). CONCLUSÕES O aumento da concentração de CaCl 2 no meio de cultura MS reduziu significativamente a necrose apical e a hiperidricidade das brotações micropropagadas de L. angustifolia. O aumento na concentração de CaCl 2 apresentou efeito sobre o enraizamento, afetando o comprimento e o número de raízes principais formadas. A partir desse trabalho, sugere-se que mais estudos sejam realizados, para que os problemas de necrose apical e a hiperidricidade das brotações cultivadas in vitro de L. angustifolia sejam eliminados. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABOUSALII, A.; MANTELL, S. H. A pratical method for alleviating shoot-tip necrosis symptoms in in vitro shoot culture of Pistacia vera cv. Mateur. Journal of Horticultural Science, Ashford, v. 69, p , ANDRADE, L. B.; ECHEVRRIGARAY, S.; FRACARO, F.; PAULETTI, G. F.; ROTA, L. The effects of growth regulators on shoot propagation and rooting of common lavender (Lavandula Vera DC). Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Hauge, v. 56, p , BARGHCHI, M.; ALDERSON, P. G. Pistachio (Pistacia vera L.). In: BAJAJ, Y. P. S. (Ed.). Biotechnology in agriculture and forestry: trees II. Berlin: Springer-Verlag, p BIASI, L. A.; DESCHAMPS, C. Plantas aromáticas do cultivo à produção de óleo essencial. Curitiba: Layer, p. BIDDULPH, O. Translocation of inorganic solutes. In: STEWARD, F. C. (Ed.). Plant Physiology: a treatise. New York: Academic, v. 2. BOELENS, M. H. Chemical and sensory evaluation of Lavandula oils. Perfum Flavour, v. 20, p , BUCHBAUER, G.; JIROVETZ, L.; JAGER, W.; DIETRICH, H.; PLANK, C. Aromatherapy: evidence for sedative effects of the essential oil of lavender after inhalation. Z. Naturforsch, v. 46, p , CALDAS, L. S.; HARIDASAN, P.; FERREIRA, M. E. Meios nutritivos, In: TORRES, A. C.; CALDAS, L. S.; BUSO, J. A. Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. Brasília: Embrapa CNPH, v. 1, p CALVO, M. C.; SEGURA, J. In vitro propagation of Lavender. HortScience, Alexandria, v. 24, n. 2, p , CARVALHO, J. M. F. C.; SILVA, M. M. A.; MEDEIROS, M. J. L. Fatores inerentes à micropropagação. Campina Grande: Embrapa Algodão, p. (Documentos, 148). CHEMAT, F.; LUCCHESI, M. E.; SMADJA, J.; FAVRETTO, L.; COLNAGHI, G.; VISIONONI, F. Microwave accelerated steam distillation of essential oil from lavender: A rapid, clean and environmentally friendly approach. Analytica Chimica Acta, New York, v. 555, p , CUZZUOL, G. R.F.; GALLO, L. A.; ALMEIDA, M.; CROCOMO, O. J. Controle da vitrificação do cravo (Dianthus caryophyllus L.) in vitro. Scientia Agricola, Piracicaba, v. 52, n. 3, p , DIAS, M. C.; ALMEIDA, R.; ROMANO, A. Rapid clonal multiplication of Lavandula viridis L Hér through in vitro axillary shoot proliferation. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Hauge, v. 68, p , GHELARDINI, C.; GALOTTI, N.; SALVATORE, G.; MAZZANTI, G. Local anaesthetic activity of the essential oil of Lavandula angustiflia. Planta Medica, Stuttgard, v. 65, p , JAGER, W.; BUCHBAUER, G.; JIROVETZ, L.; FRITZER, M. Percutaneous absorption of lavender oil from a massage oil. Journal of the Society of Cosmetic Chemists, v. 43, p , JUN TAKANE, R. J.; MINAMI, K.; LUCCHESI, A. A.; ALMEIDA, M. de. Influência do cloreto de cálcio no crescimento de explantes de Gypsophila paniculata L. (Caryophyllaceae), cultivados in vitro. Scientia Agricola, Piracicaba, v. 51, n. 2, p , maio/ago KEVERS, C.; GASPAR, T. Vitrification of carnation in vitro: changes in water content, extracellular space, air volume and ion levels. Physiologie Vegétale, Paris, v. 24, n. 6, p , KEVERS, C.; FRANCK, T.; STRASSER, R. J.; DOMMES, J.; GASPAR, T. Hyperhydricity of micropropagated shoots: a Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p , 2010

32 Reduçãoda necrose apical e hiperidricidade de plantas typically stress-induced change of physiological state. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Hauge, v. 77, p , LESHEM, B.; WERKER, B.; SHALEV, D. P. The effect of cytokinins on vitrification in melon and carnation. Annals of Botany, London, v. 62, p , MALAVOLTA, E. Manual de nutrição de plantas. São Paulo: Agronômica Ceres, p. MARTINS, E. R.; CASTRO, D. M.; CASTELLANI, D. C.; DIAS, J. E. Plantas medicinais. Viçosa, MG: UFV, p. MURASHIGE, T.; SKOOG, F. Arevised médium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiologia Plantarum, Copenhagem, v. 15, p , PATTNAIK, S.; SUBRAMANYAM. Antibacterial and antifungal activity of aromatic constituents of essential oils. Microbios, v. 89, p , RADMANN, E. B.; BRAGA, E. J. B.; KARAN, M. A. L.; POSADA, M. A. C.; PETERS, J. A. Influência da densidade de fluxo na qualidade de plantas micropropagadas de Gypsophila paniculada L. Revista Brasileira de Agrociência, v. 7, n. 3, p , SHA, L.; MCCOWN, B. H.; PETERSON, L. A. Occorrence and cause of shoot-tip necrosis in shoot cultures. Journal of the American Society for Horticultural Science, Alexandria, v. 110, p , TSURO, M.; KODA, M.; INOUE, M. Efficient plant regeneration from multiple shoots formed in the leaf-derived callus of Lavandula vera, using the open culture system. Scientia Horticulturae, Amsterdam, v. 86, p , VIEITEZ, A. M.; BALLESTER, A. L.; SAN-JOSÉ, M. C.; VIEITEZ, E. Anatomical and chemical studies of vitried shoots of chestnut regenerated in vitro. Physiologia Plantarum, Copenhagen, v. 5, p , VITTI, G. C.; LIMA, E.; CICARONE, F. Cálcio, magnésio e enxofre. In: FERNANDES, M. S. Nutrição mineral de plantas. Viçosa, MG: Sociedade Brasileira de Ciência do Solo, p ZIV, M. In vitro hardening and acclimatization of tissue culture plants. In: WITHERS, L. A.; ALDERSON, P. G. (Eds.). Plant tissue culture and its agricultural applications. London: Butterworths, p ZIV, M.; SCHWARTZ, A.; FLEMINGER, D. Malfuctioning stomata in vitreous leaves of carnation (Dianthus caryophyllus) plants propagated in vitro, implications for hardening. Plant Science, Lucknow, v. 52, p , Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p , 2010

33 26 INDUÇÃO DE CALOS SANTOS, in vitro M. R. A A. dos PARTIR et al. DE SEGMENTOS FOLIARES DE Coffea canephora CV. CONILON In vitro INDUCTION OF CALLUS FROM LEAF SEGMENTS OF Coffea canephora CV. CONILON MAURÍCIO REGINALDO ALVES DOS SANTOS 1 ; MARIA DAS GRAÇAS RODRIGUES FERREIRA 1 ; ARÊSSA DE OLIVEIRA CORREIA 2 ; NEIDIANE FARIAS COSTA REIS 2 ; MANUEL DE SOUZA SANTOS 3 1 Pesquisador (a) Embrapa Rondônia BR 364, km 5,5, Zona Rural Porto Velho, RO mauricio@cpafro.embrapa.br; mgraca@cpafro.embrapa.br 2 Mestre Universidade Federal de Rondônia/UNIR BR 364 km 9,5, Laboratório de Biogeoquímica Ambiental Porto Velho, RO aressa_oliveira@yahoo.com.br; dianefarias@yahoo.com.br 3 Mestrando em Desenvolvimento Regional e Meio Ambiente Universidade Federal de Rondônia/UNIR BR 364 km 9,5, Laboratório de Biogeoquímica Ambiental Porto Velho-RO msscdas@gmail.com RESUMO A espécie Coffea canephora Pierre ex Froehner cv. Conilon possui características genéticas relevantes e que são de amplo interesse em programas de melhoramento vegetal. O objetivo desse trabalho foi avaliar a indução de calos em segmentos foliares de Coffea canephora cv. Conilon, visando a facilitar seu posterior desenvolvimento em embriões ou na formação de órgãos. Foram utilizados segmentos foliares dessa cultivar. Os explantes foram inoculados em meio MS 50% (sais e vitaminas) com diferentes concentrações de ANA (0,00, 5,37, 10,74 e 26,85 µm) e AIB (0,00, 4,92, 14,76 e 24,61 µm). Na ausência de reguladores de crescimento, não foi observada calogênese. O processo de indução de calos teve início na primeira semana de cultivo. Aos 20 e 30 dias após a inoculação, observouse grande variação na calogênese entre os tratamentos; aos 40 dias, houve grande manifestação de indução de calos, ou seja, todos os tratamentos com reguladores expressaram calogênese em 100% dos explantes. Termos para indexação: Café, reguladores de crescimento, calogênese. ABSTRACT Coffea canephora Pierre ex Froehner. species cv. Conilon presents relevant genetic characteristics for plant breeding programs. The objective of this study was to evaluate the callus formation from leaf segments of Coffea canephora cv. Conilon, in order to facilitate its development in embryos or organ formation. Leaf segments were used. The explants were inoculated in MS 50% (half strength salts and vitamins) with different concentrations of NAA (0.00, 5.37, and µm) and IBA (0.00, 4.92, and µm). The callus formation was not observed on growth regulators free media. The induction of callus initiated in the first week of culture. After 20 and 30 days, a great variation between the treatments was observed; after 40 days a great induction of callus occurred, that is, all the treatments with regulators induced callus formation in all the explants. Index terms: Coffee, growth regulators, callus formation. INTRODUÇÃO O gênero Coffea apresenta aproximadamente 100 espécies de cafeeiros, mas apenas cinco são cultivadas comercialmente, sendo que Coffea arabica L. (cafeeiro Arábica) e C. canephora Pierre ex Froehner. (cafeeiro Robusta) são as mais comercializadas (CARVALHO et al., 2001). No Brasil, a quase totalidade das lavouras cafeeiras, genericamente conhecidas por Robusta, pertence à cultivar Conilon, sendo o Espírito Santo o maior produtor nacional, destacando-se ainda os Estados de Rondônia, Minas Gerais, Mato Grosso, Bahia e Rio de Janeiro (MARTINS et al., 2006). Um levantamento efetuado pela Companhia Nacional de Abastecimento (CONAB) apontou que o Brasil produziu, em 2006, 33 milhões de sacas beneficiadas de café arábica e 9,5 milhões de sacas de robusta, representando 77,7 e 22,3% da produção nacional respectivamente (FASSIO & SILVA, 2007). O seu produto, embora de qualidade pouco inferior ao de C. arabica em relação à bebida, concorre no mercado internacional por ser cotado a um menor preço e por seu emprego em misturas e na indústria de café solúvel, já que permite alta extração de sólidos solúveis (ANDREOLI et al., 1993). Os programas de melhoramento genético do cafeeiro no Brasil têm alcançado êxito na obtenção de cultivares produtivas, elevando em cerca de 200% a produtividade atual em relação à primeira variedade (Recebido em 15 de maio de 2009 e aprovado em 31 de agosto de 2010) Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p , 2010

34 Indução de calos In vitro a partir de segmentos foliares plantada no Brasil. Entretanto, o tempo e os recursos gastos são fatores limitantes para o melhoramento do cafeeiro por meio de métodos convencionais, uma vez que, nos últimos anos, surgiram novos problemas como doenças, pragas, nematóides e maior exigência em qualidade pelo mercado consumidor (MENDES, 1997). Contudo, a micropropagação vegetal in vitro surge como uma alternativa viável e de curto prazo para a solução desses problemas (PALÚ et al., 2004). Coffea canephora cv. Conilon possui características genéticas relevantes e de amplo interesse em programas de melhoramento vegetal, como a resistência ao agente causador da ferrugem (Hemileia vastatrix Berk et Br.), a elevada capacidade produtiva e resistência à seca, devido ao grande desenvolvimento do seu sistema radicular, menor exigência em fertilidade, elevada resistência ao nematóide Meloidogyne exigua Gaeldi, 1887 e certo grau de tolerância a M. incognita (Kofoid and White 1919) Chitwood, 1949 (MARTINS et al., 2006). No Coffea canephora, a fecundação é cruzada, desse modo, as plantações apresentam-se desuniformes quando observadas características vegetativas (porte, arquitetura, ângulo dos galhos, formato e tamanho das folhas), de produção (produtividade, tamanho, formato e maturação dos frutos) e de susceptibilidade a doenças (PAULINO et al., 1985). Essa variabilidade dificulta os tratos culturais e reduz a produtividade. A qualidade do café Conilon pode ser aumentada com a utilização da micropropagação de plantasmatrizes selecionadas através de técnicas de cultura de tecidos vegetais in vitro (BRAGANÇA, 2001). Essas técnicas têm sido utilizadas com sucesso na multiplicação de espécies que apresentam dificuldades na propagação sexuada pois, além de possibilitarem a uniformidade genética do material, permitem a obtenção de um grande número de plantas em pouco tempo (SANTOS, 2008). Os trabalhos pioneiros em cultura de tecidos em cafeeiro foram publicados por Staritsky (1970), que obteve êxito na indução de calos a partir de folhas de várias espécies. Após esse período, muitos trabalhos foram realizados com a adoção de métodos e espécies diversas (SANTOS, 2008). A calogênese sofre influência de diversos fatores: tipo de explante, composição do meio nutritivo e condições físicas de incubação como luz e temperatura (PINTO & LAMEIRA, 2001). O índice de divisão celular dos calos pode elucidar as mudanças fisiológicas das células e auxiliar a otimização dos protocolos de regeneração e transformação genética (SERRA et al., 2000). O presente trabalho teve como objetivo avaliar a indução de calos em segmentos foliares de Coffea canephora cv. Conilon em relação a diferentes combinações de reguladores de crescimento, visando a facilitar seu posterior desenvolvimento em embriões somáticos ou formação de órgãos. MATERIAL E MÉTODOS Os experimentos foram realizados no Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais da Embrapa Rondônia de Porto Velho, utilizando segmentos foliares de plantas com seis meses de idade de Coffea canephora cultivar Conilon (clone nº 194, pertencente ao Programa de Melhoramento da Embrapa Rondônia). Foram coletadas folhas do segundo par dos ramos plagiotrópicos e a assepsia foi realizada por meio da lavagem com esponja estéril em água bidestilada estéril por 5 minutos, seguida de imersão em etanol a 70% (v/v) por 1 minuto e em solução de hipoclorito de sódio a 1,25% (v/v) por 30 minutos, com três enxágües em água bidestilada estéril. As folhas foram segmentadas em segmentos de 1 cm 2 de forma que todos os explantes contivessem uma porção da nervura central. Estes foram inoculados em meio contendo 50% dos minerais e vitaminas do meio MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962). O meio foi suplementado com 3% de sacarose e 0,8% de ágar. Utilizou-se as concentrações 0,00, 5,37, 10,74 e 26,85 µm de ácido naftalenoacético (ANA) e 0,00, 4,92, 14,76 e 24,61 µm de ácido indolbutírico (AIB), em esquema fatorial 4 x 4, totalizando 16 tratamentos. O ph foi ajustado para 5,8 ± 0,1 antes da autoclavagem a 120 C e 1 atm, durante 20 minutos. Após inoculação, os explantes foram mantidos no escuro, em sala de crescimento, a 25 ± 1ºC, por um período de 40 Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p , 2010

35 28 SANTOS, M. R. A. dos et al. dias. O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado com 16 tratamentos e 10 repetições. Observaram-se as variáveis, porcentagem de indução de calos (%IC) e porcentagem da área foliar coberta por células de calo (%AFCC). Foi utilizado o teste de Tukey a 5% para comparação das médias. RESULTADOS E DISCUSSÃO Nos segmentos foliares de C. canephora cultivados em meio de cultura sem reguladores de crescimento, não foi observada calogênese. O processo de indução de calos teve início na primeira semana de cultivo quando observaram-se pontos que se expandiam e recobriam a superfície dos explantes. A calogênese foi observada tendo início nos locais em que as nervuras foliares estavam em contato com o meio de cultura, o que se deve ao fato de que o procâmbio contém células meristemáticas (totipotentes) capazes de se diferenciar em outros tipos celulares (TAIZ & ZEIGER, 2004). Posteriormente, a formação de calos se expandiu para as bordas dos explantes e, a partir daí, para a região central dos mesmos (Figura 1). Os tratamentos contendo 26,85 µm de ANA em combinação com 14,76 ou 24,61 µm de AIB foram os primeiros a induzir a calogênese. A média da porcentagem de indução em 20 dias foi superior a 70% para todos os tratamentos com auxina (Figura 2). Aos 30 dias, os tratamentos que continham 4,92 µm de AIB (na ausência de ANA); 5,37 µm de ANA em combinação com 14,76 µm de AIB; e 10,74 µm de ANA (na ausência de AIB) apresentaram 87,7% de indução de calos; os demais tratamentos apresentaram 100% (Figura 3). Após 40 dias houve alta indução de calos, ou seja, todos os tratamentos com hormônio manifestaram 100% de calogênese. Este estudo demonstrou também que as concentrações mais altas de reguladores utilizadas em alguns tratamentos não tiveram efeito tóxico. A adição de auxinas ao meio é essencial para a formação de calos nessa cultivar. Resultados bastante inferiores foram obtidos por Maciel et al. (2003) que testaram combinações fatoriais de ácido diclorofenoxiacético (2,4-D) e cinetina para a indução de calos em explantes foliares de Coffea arabica cv. Obatã, atingindo o valor máximo de 20% no meio suplementado com 9,29 µm de cinetina, sem a adição de 2,4-D. Costa et al. (2008) verificaram que a adição da auxina ANA nas concentrações de 2,5 e 5,0 mg L -1 em Piper hispidinervum C. DC. possibilitou os maiores percentuais de formação de calos e que o tipo de explante usado teve forte influência sobre esta variável. Nessas concentrações de ANA, a formação de calos em segmentos foliares foi de 83,2 a 91,6%, valores significativamente superiores àqueles observados para os segmentos internodais, que resultaram em 43,1 e 49,6% de calogênese. FIGURA 1 Calos formados em segmentos foliares de Coffea canephora cv. Conilon após 20 (A) e 40 (B) dias de cultivo. Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p , 2010

36 Indução de calos In vitro a partir de segmentos foliares %IC Controle 4,92 AIB 14,76 AIB 24,61 AIB 5,37 ANA 5,37 ANA + 4,92 AIB 5,37 ANA + 14,76 AIB 5,37 ANA + 24,61 AIB 10,74 ANA 10,74 ANA + 4,92 AIB Concentrações (micromolar) FIGURA 2 Efeito dos tratamentos com auxina na indução de calos (IC) em segmentos foliares de Coffea canephora cv. Conilon, aos 10 e 20 dias de cultivo. 10,74 ANA + 14,76 AIB 10,74 ANA + 24,61 AIB 26,85 ANA 26,85 ANA + 4,92 AIB 26,85 ANA + 14,76 AIB 26,85 ANA + 24,61 AIB 10 dias 20 dias % IC dias 0 Controle 4,92 AIB 14,76 AIB 24,61 AIB 5,37 ANA 5,37 ANA + 4,92 AIB 5,37 ANA + 14,76 AIB 5,37 ANA + 24,61 AIB 10,74 ANA 10,74 ANA + 4,92 AIB 10,74 ANA + 14,76 AIB 10,74 ANA + 24,61 AIB 26,85 ANA 26,85 ANA + 4,92 AIB 26,85 ANA + 14,76 AIB 26,85 ANA + 24,61 AIB 40 dias Concentrações (micromolar) FIGURA 3 Efeito dos tratamentos com auxina na indução de calos (IC) em segmentos foliares de Coffea canephora cv. Conilon, aos 30 e 40 dias de cultivo. Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p , 2010

37 30 SANTOS, M. R. A. dos et al. Considerando que houve 100% de indução de calos após 30 dias nos tratamentos que continham 26,85 µm de ANA, na ausência de AIB ou em combinação com as concentrações de 4,92, 14,76 e 24,61 µm deste regulador, em comparação com outros resultados, pode-se constatar a eficiência dessa concentração para desenvolvimento de calos em segmentos foliares. Os tratamentos com 26,85 µm de ANA em combinação com 14,76 ou 24,61 µm de AIB foram os que promoveram a indução mais rápida, já observada com apenas 10 dias de cultivo. Esse estudo mostra também que os tecidos foliares de C. canephora cv. Conilon são altamente responsivos às auxinas para a indução de calos. Flores & Nicoloso (2006), ao estudar a indução de calos em explantes de Pfaffia tuberosa (Maq. ex DC.) Hicken, verificaram que explantes de origem foliar foram os que proporcionaram os melhores resultados quando cultivados em meio contendo 10,0 ìm da auxina 2,4-D. Dhar & Joshi (2005) cultivaram vários tipos de explantes de Saussurea obvallata (DC.) Sch. bip., e observaram significativa influência do tipo primário de explantes (hipocótilo, raízes, cotilédones e folhas) sobre a taxa de formação de calos, sendo as folhas a melhor fonte, com 100% de calogênese na presença de 1,0 ìm de ANA e 2,5 ìm de benzilaminopurina (BAP). Após 40 dias de inoculação, observou-se a %AFCC (Tabela 1). Os tratamentos que apresentaram explantes com porcentagens de AFCC acima de 25% são os que contém ANA (5,37, 10,74 e 26,85 µm). Na ausência de ANA, não se observou explantes com porcentagens acima de 25% da área foliar coberta por células de calo. TABELA 1 Porcentagem da área foliar coberta por células de calos (%AFCC) em segmentos foliares de Coffea canephora cv. Conilon, em função dos tratamentos com auxina, 40 dias após inoculação. Concentrações (µm) %AFCC* ANA AIB Sem indução 0-25% 25-50% 50-75% % a 0d , a , a , a ,37-0 9ab 1c 0 0 5,37 4,92 0 8bc 2b 0 0 5,37 14,76 0 9ab 1c 0 0 5,37 24,61 0 8bc 2b ,74-0 8bc 2b ,74 4,92 0 8bc 2b ,74 14,76 0 8bc 2b ,74 24,61 0 1d 8a 1b 0 26,85-0 8bc 2b ,85 4,92 0 8bc 2b ,85 14,76 0 7c 1c 2a 0 26,85 24,61 0 8bc 2b 0 0 *Valores seguidos por letras diferentes em cada coluna, diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey a 5%. Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p , 2010

38 Indução de calos In vitro a partir de segmentos foliares A interação entre duas auxinas mostrou-se importante no aumento da calogênese em explantes foliares de C. canephora. Os únicos tratamentos que apresentaram explantes com mais de 50% da AFCC foram 10,74 µm de ANA + 24,61 µm de AIB e 26,85 µm de ANA + 14,76 µm de AIB, sendo que o primeiro se destacou de todos os demais apresentando 90% dos explantes com mais de 25% da AFCC e 10% com AFCC acima de 50%. A interação entre os dois reguladores de crescimento se mostrou importante quanto a esta variável. É interessante observar que estas auxinas são geralmente reconhecidas por seu papel no enraizamento. Quanto à concentração de AIB, também se observou seu efeito na formação de calos, sendo que as concentrações utilizadas nesse estudo foram ideais para a indução de calo. A combinação de auxinas para indução de calos em anteras de C. arabica Rubi e Acaiá Cerrado foi testada por Palú et al. (2004), que observaram as maiores porcentagens de indução de calos na presença de 9,84 ìm de AIB, na ausência de 2,4-D, com 3,89 ìm de 2,4-D combinado com a concentração de 4,92 ìm de AIB e com 9,05 ìm de 2,4-D, na ausência de AIB. Porém, resultado diferente foi relatado por Santos (2008), quando comparou a atividade calogênica do explante foliar de C. canephora cv. Apoatã, cultivado na presença de diferentes concentrações de AIB, não observando diferença significativa entre os resultados. Contudo, utilizando AIB, independente de sua concentração, em combinação com 2,4-D na concentração de 4,52 µm, observou-se aumento de 19% na produção de calos. CONCLUSÃO Após as análises dos resultados, pode-se afirmar que os tecidos foliares de C. canephora cv. Conilon, clone 194, são altamente responsivos às auxinas para indução de calos. A presença de reguladores de crescimento no meio de cultura é essencial quanto a este aspecto e a interação entre as duas auxinas AIB e ANA é extremamente positiva para a calogênese em explantes foliares destas plantas. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANDREOLI, D. M. C.; GROTH, D.; RAZERA, L. F. Armazenamento de sementes de café (Coffea canephora L. cv. Guarini) acondicionadas em dois tipos de embalagens, após secagem natural e artificial. Revista Brasileira de Sementes, Brasília, v. 15, n. 1, p , BRAGANÇA, S. M.; CARVALHO, C. H. S. de; FONSECA, A. F. A. da; FERRÃO, R. G. EMCAPA 8111, EMCAPA 8121, EMCAPA 8131: variedades clonais de café Conilon para o Estado do Espírito Santo. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 36, n. 5, p , CARVALHO, L. de; SILVA, E. A. M.; CECON, P. R.; AZEVEDO, A. A.; MOSQUIM, P. R. Aspectos morfofisiológicos das cultivares de cafeeiro Catuaí Vermelho e Conilon. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 36, n. 3, p , COSTA, F. H. S.; SILVA, T. L.; PEREIRA, J. E. S. Influência de auxinas e tipos de explantes na indução de calos friáveis em Piper hispidinervum C. DC. Revista Ciência Agronômica, Fortaleza, v. 39, p , DHAR, U.; JOSHI, M. Efficient plant regeneration protocol through callus for Saussurea obvallata (DC.) Edgew. (Asteraceae): effect of explant type, age and plant growth regulators. Plant Cell Report, New York, v. 24, p , FASSIO, L. H.; SILVA, A. E. S. Importância econômica e social do café Conilon. In: FERRÃO, R. G.; FONSECA, A. F. A.; BRAGANÇA, S. M.; FERRÃO, M. A. G.; MUNER, L. H. de (Eds.). Café Conilon. Vitória: INCAPER, p FLORES, R.; NICOLOSO, F. T. Indução de calos e aspectos morfogenéticos de Pfaffia tuberosa (Spreng.) Pedersen. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, Botucatu, v. 8, n. 3, p , MACIEL, A. L. R.; PASQUAL, M.; PEREIRA, A. R.; REZENDE, J. C.; SILVA, A. B.; DUTRA, L. F. Embriogênese somática indireta em explantes foliares de Coffea arabica L. cv. Obatã. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 27, n. 1, p , MARTINS, C. C.; REIS, E. F.; BUSATO, C.; PEZZOPANE, J. E. M. Crescimento inicial do café Conilon (Coffea canephora Pierre ex Froehner) sob diferentes lâminas de irrigação. Engenharia na Agricultura, Viçosa, v. 14, p , Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p , 2010

39 32 SANTOS, M. R. A. dos et al. MENDES, A. N. G. Economia cafeeira: o agrobusiness. In: MENDES, A. N. G.; RUBENS, J. G. (Eds.). Cafeicultura empresarial: produtividade e qualidade. Lavras: UFLA/ FAEPE, v. 1, p MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and biossays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, Copenhagen, v. 15, p , PALÚ, E. G.; SILVA, A. B. da; PASQUAL, M. Calogênese in vitro em anteras de Coffea arabica L. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 28, n. 4, p , jul./ago PAULINO, A. J.; MATIELLO, J. B.; PAULINI, A. E. Produção de mudas de café Conilon por estacas: instruções técnicas sobre a cultura de café no Brasil. Rio de Janeiro: IBC/GERCA, p.. PINTO, J. E. B. P.; LAMEIRA, O. A. Micropropagação e metabólitos secundários in vitro de plantas medicinais. Lavras: UFLA/FAEPE, p. SANTOS, C. G. Indução e análise bioquímica de calos em segmentos foliares e nodais de Coffea canephora L. cv. Apoatã. Magistra, Cruz das Almas, v. 20, p , SERRA, A. G. P.; PAIVA, R.; PAIVA, P. D. O. Análises bioquímicas de calos formados de explantes foliares de castanha-do-brasil (Bertholletia excelsa H.B.K.). Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 24, n. 40, p , STARITSKY, G. Embryoid formation in callus culture tissue of Coffea. Acta Botanica Neerlandica, Netherlands, v. 19, n. 4, p , TAIZ, L.; ZEIGER, E. Fisiologia vegetal. 3. ed. Porto Alegre: Artmed, p. Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p , 2010

40 INDUÇÃO DE CALOS EM NERVURA MEDIANA DE FOLHAS NÃO EXPANDIDAS DE PUPUNHEIRA (Bactris gasipaes Kunth.) Indução de calos em nervura mediana de folhas CALLUS INDUCTION IN MID-RIB OF NON EXPANDED LEAVES OF PALM PEACH (Bactris gasipaes Kunth.) MAURÍCIO REGINALDO ALVES DOS SANTOS 1 ; MARIA DAS GRAÇAS RODRIGUES FERREIRA 1 ; ARÊSSA DE OLIVEIRA CORREIA 2 ; JOSILENE FÉLIX DA ROCHA 3 ; KEILA CRISTINA DE SOUZA CORREA 3 1 Pesquisador (a) Embrapa Rondônia BR 364, km 5,5, Zona Rural Porto Velho, RO mauricio@cpafro.embrapa.br; mgraca@cpafro.embrapa.br 2 Mestre Universidade Federal de Rondônia/UNIR BR 364 km 9,5, Laboratório de Biogeoquímica Ambiental Porto Velho, RO aressa_oliveira@yahoo.com.br 3 Graduanda em Ciências Biológicas Faculdade São Lucas/FSL BR 364, km 5,5, Zona Rural Porto Velho, RO josifelixrocha@yahoo.com.br; keila@hotmail.com RESUMO O objetivo deste trabalho foi induzir calos em segmentos de nervura mediana de folhas não expandidas do palmito de Bactris gasipaes Kunth., visando ao desenvolvimento de metodologia de propagação in vitro que permita a produção uniforme e em larga escala de mudas de variedades clonais dessa espécie. Os explantes foram inoculados em meio MS, acrescido de 3% de sacarose, 0,8% de agar e combinações dos reguladores de crescimento 2,4- D (0, 5, 10 e 20 µm) e 2iP (0, 9, 18 e 36 µm), em esquema fatorial 4 x 4, totalizando 16 tratamentos. Os cultivos foram mantidos no escuro a 24 ± 2º C. Aos 49 dias de cultivo, observouse indução de calos na maioria dos tratamentos empregados, sendo que os mais responsivos foram as combinações: 5 µm de 2,4-D + 18 µm de 2iP; 10 µm de 2,4-D + 18 µm de 2iP; e 20 µm de 2,4-D + 36 µm de 2iP, nas quais obteve-se indução de calos em todos os explantes. Observou-se também a porcentagem da área do explante coberta por células de calo, a qual foi maior no meio contendo 10 µm de 2,4-D + 18 µm de 2iP, onde a maioria dos explantes apresentava 50 a 75%, além de alguns explantes com 75 a 100% da área coberta por células de calos. Os calos obtidos neste trabalho serão subcultivados para testar combinações de reguladores visando à indução de brotações e posterior regeneração de plantas. Termos para indexação: reguladores de crescimento, calogênese. ABSTRACT The objective of this work was to induce callus in mid-rib segments of non expanded leaves from the heart of palm of Bactris gasipaes Kunth., in order to development an in vitro propagation system that allows the uniform production of plantlets on large scale of clonal varieties of these species. The explants were inoculated in MS medium, supplemented with 3% sucrose and 0.8% agar, with combinations of the growth regulators 2,4-D (0, 5, 10 and 20 µm) and 2iP (0, 9, 18 and 36 µm), in factorial design of 4 x 4, totalizing 16 treatments. The cultures were maintained in the dark at 24±2º C. After 49 days of culture, callus induction was observed in most treatments with the most responsive being the following combinations: 5 µm 2,4-D + 18 µm 2iP; 10 µm 2,4-D + 18 µm 2iP and 20 µm 2,4-D + 36 µm 2iP, with calli developed in all explantes. The percentage of the area of the explant covered with callus cells was also observed, which was higher in the medium with 10 µm 2,4-D + 18 µm 2iP, where the majority of the explants presented 50 to 75%, and some explants with 75 to 100%, of the area covered by callus cells. The callus obtained in this work will be subcultivated to test combinations of regulators in order to induce shoot growth and plant regeneration. Index terms: growth regulators, calogenesis. INTRODUÇÃO A pupunheira (Bactris gasipaes Kunth.) é uma espécie tropical, pertencente à família Arecaceae (Palmaceae), sendo também conhecida como palma doce ou pupunha no Brasil e pejibaye no Peru (BOVI, 1993). Trata-se de uma palmeira de grande interesse econômico, pois produz palmito de alta qualidade, podendo ser cultivada como cultura agrícola racional e rentável, da qual o palmito pode ser extraído anualmente (TOZETTI & CONTEL, 2003). O palmito da pupunheira pode substituir o da juçara (Euterpe edulis Mart.) e do açaí (E. oleracea Mart.), cujos estoques naturais já estão bastante reduzidos devido à exploração predatória (VILLACHICA, 1996). No interior da Amazônia, constitui-se em uma valiosa e versátil planta de subsistência. Tradicionalmente, os frutos são cozidos em água com sal durante 30 a 60 minutos, sendo em seguida descascados, partidos ao meio, extraída a semente e consumidos. Outro uso para os frutos cozidos (Recebido em 30 de julho de 2009 e aprovado em 31 de agosto de 2010) Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p , 2010

41 34 SANTOS, M. R. A. dos et al. são preparações culinárias caseiras ou fabricação de farinha e óleo de uso humano ou animal. Devido às suas múltiplas possibilidades de utilização, essa espécie vem despertando acentuado interesse por parte dos agricultores (BRASIL, 2002). Em virtude da excelente qualidade do palmito, seu cultivo é cada vez mais frequente, com plantios em escalas consideráveis no Pará, Acre, Rondônia e Mato Grosso. Além disso, a cultura encontra-se em intenso processo de disseminação fora da Amazônia, principalmente no Sudeste, sendo plantada em praticamente todo o Estado de São Paulo (ALMEIDA et al., 2005). Além de ser ecologicamente correto seu cultivo, ainda se tornou a principal fonte produtora de palmito, tanto para o mercado interno quanto para o mercado externo, por apresentar vantagens devido a características agronômicas importantes em relação às demais produtoras de palmito, tais como: precocidade, rusticidade, adaptabilidade e capacidade de perfilhamento ao longo dos anos, fácil processamento, boa produtividade e qualidade (FERNANDES et al., 2003; HERNANDEZ et al., 2001). A experimentação com palmeiras visando à produção de palmito é diferente daquela destinada a frutos. Devido à colheita periódica e constante, as plantas apresentam-se em permanente estágio vegetativo, e a velocidade com que a fitomassa cresce, após cada colheita, torna-se um indicador da produtividade e da vida econômica do cultivo. Variáveis relacionadas ao crescimento e à precocidade da planta são fundamentais, visto que o produto, palmito, nada mais é do que um conjunto de folhas imaturas envoltas pelas bainhas das folhas mais velhas (CLEMENT, 1995). Um dos problemas que tem dificultado a expansão da cultura no Brasil é a ausência de campos de produção de sementes onde sejam utilizadas plantas matrizes que tenham superioridade agronômica para produção de palmito (BERGO et al., 2002). Em termos de melhoramento genético, independentemente do produto almejado (palmito ou fruto), as formas convencionais de propagação são extremamente lentas, podendo comprometer a eficiência dos programas de melhoramento. O número limitado de perfilhos inviabiliza a obtenção de grandes populações genotipicamente idênticas às plantas selecionadas (ALMEIDA & ALMEIDA, 2006; SOUZA et al., 1996). Neste contexto, os métodos de propagação de plantas in vitro podem ser uma ferramenta extremamente promissora para subsidiar programas de melhoramento, pois a micropropagação envolve a propagação vegetativa em larga escala, uniforme e com alta qualidade fitossanitária. Dessa forma, pode-se clonar uma determinada planta que reúna características de interesse no melhoramento, sem as dificuldades apresentadas pela propagação convencional (GRATTAPLAGLIA & MACHADO, 1998). Pesquisadores de Costa Rica, Brasil e Peru estudam a viabilidade da obtenção de clones de pupunheira por meio de cultivo in vitro. Palmeiras, em geral, são difíceis de propagar dessa forma, com poucos genótipos se adaptando a este tipo de cultivo. O desenvolvimento de métodos de propagação vegetativa é essencial, tanto por técnicas in vitro como por métodos convencionais. Estes últimos devem ser aperfeiçoados, pois a taxa de sucesso é de apenas 10%. Os métodos in vitro são mais complicados, mas em médio prazo são mais importantes, porque têm potencial para multiplicar genótipos com maior rapidez, permitindo assim a instalação de ensaios de clones em todas as regiões produtoras do Brasil. Esses ensaios, por sua vez, identificarão genótipos adaptados a cada região, que podem ser distribuídos aos produtores de sementes, reduzindo a necessidade futura de se importarem sementes (CLEMENT & BOVI, 1999). A propagação por meio de cultura de tecidos vegetais pode ser feita por via direta ou indireta. Esta última ocorre por meio da formação de calos, que é considerada uma forma potencial de propagação em massa. O cultivo de calos pode ser utilizado para se estudar o desenvolvimento celular, explorar produtos provenientes do metabolismo primário e secundário e obter suspensões celulares e propagação via formação de gemas ou embriões somáticos (LANDA et al., 2000). Estudos com calos devem ser desenvolvidos para determinar as condições de cultura que os explantes requerem para sobreviver e crescer (SANTOS et al., 2005). A calogênese tem sido utilizada Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p , 2010

42 Indução de calos em nervura mediana de folhas para propagação em massa de diversas espécies por meio da formação de múltiplas brotações ou da embriogênese somática, respostas morfogênicas a partir das quais é possível produzir plântulas com excelentes carracterísticas agronômicas (TSURO et al., 2000). Potencialmente, a indução de calos ocorre em qualquer tecido vegetal, porém, são mais suscetíveis tecidos com células meristemáticas (totipotentes) capazes de se diferenciar em outros tipos celulares. A calogênese em folhas geralmente tem início nas nervuras foliares, o que se deve ao fato de que o câmbio vascular contém células meristemáticas (GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998; TAIZ & ZEIGER, 2004). O objetivo do presente trabalho foi estabelecer um protocolo eficiente para indução de calos em explantes de nervura mediana de folhas não expandidas do palmito de Bactris gasipaes, visando subsidiar o desenvolvimento de metodologia de propagação in vitro para a produção clonal da espécie. MATERIAL E MÉTODOS Os experimentos foram desenvolvidos no Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais da Embrapa Rondônia, em Porto Velho. As coletas de material vegetal foram realizadas na coleção de germoplasma de pupunheira mantida atualmente no Campo Experimental dessa Unidade. Retiraram-se duas camadas de bainhas que envolvem o palmito, o qual foi cortado em estruturas de aproximadamente 15 cm de comprimento x 5 cm de diâmetro. Esse material foi lavado em água corrente com auxílio de esponja e detergente e imerso em etanol a 70% (v/v) durante 1 minuto e em solução de hipoclorito de sódio a 1,25% (v/v) durante 20 minutos. Após esse procedimento, em câmara de fluxo laminar, os palmitos foram lavados três vezes em água destilada e autoclavada. Em seguida, o restante das bainhas e das folhas não expandidas do palmito foram retiradas até que ficasse somente a nervura mediana, utilizando-se os 7 cm acima do ponto onde inicia-se o ápice caulinar. A nervura mediana foi cortada em forma de cubos de aproximadamente 0,245 cm 3 (0,7 cm de largura, 0,7 cm de profundidade e 0,5 cm de altura), os quais foram inoculados em meio MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962) suplementado com 3% de sacarose, 0,8% de agar (Cial ), com a adição de combinações fatoriais de 2,4-D (0; 5; 10; 20 µm) e 2iP (0; 9; 18; 36 µm) (Tabela 1). O ph foi ajustado para 5,8 ± 0,1 antes da autoclavagem a 120 C e 1 atm durante 20 minutos. Os tratamentos foram dispostos em delineamento inteiramente casualizado em esquema fatorial 4 x 4, totalizando 16 tratamentos, com cinco repetições, sendo cada repetição representada por quatro tubos de ensaio contendo um explante cada. Após a inoculação, os explantes foram mantidos no escuro a 25 ± 1ºC. As avaliações foram realizadas, em intervalos de 7 dias, durante os 49 dias subseqüentes à inoculação, avaliando-se a porcentagem de indução de calos e a área de cada explante coberta por células de calo. Os dados foram submetidos à análise de regressão polinomial para avaliar a indução de calos em função das diferentes combinações de reguladores de crescimento utilizadas. As análises estatísticas foram realizadas com o auxílio dos programas SAS/Stat e SISVAR versão TABELA 1 Combinações de reguladores de crescimento (2,4-D e 2iP) utilizadas para indução de calos em explantes de nervura mediana de folhas de B. gasipaes. Tratamentos 2,4-D (µm) 2iP (µm) Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p , 2010

43 36 SANTOS, M. R. A. dos et al. RESULTADOS E DISCUSSÃO Nos segmentos de nervura mediana de B. gasipaes inoculados na ausência de reguladores de crescimento, ou seja, no tratamento controle, não foi observada calogênese (Figura 1). O processo de indução de calos teve início aos 30 dias de cultivo após a inoculação, sendo que os explantes apresentaram intumescimento, indicando desta forma o início do processo de indução de calos. Os fatores concentrações de 2,4-D e 2iP, isoladamente e em interação, afetaram significativamente (P<0,05) a variável porcentagem de indução de calos nos explantes. Na análise de regressão, o modelo que melhor se ajustou à relação porcentegem de indução de calos em função das combinações de reguladores foi o polinomial quadrático, com valores para R 2 variando de 0389 a 0,95. Aos 49 dias de cultivo, todos os tratamentos foram eficientes para a formação de calos, com exceção dos tratamentos 1 (sem reguladores de crescimento), 3 (10 µm de 2,4-D), 5 (9 µm de 2iP) e 9 (18 µm de 2iP), nos quais não foi observada indução de calos. Conforme pode-se observar, a combinação dos dois reguladores foi positiva para a indução de calos. Quando se utilizou apenas 2,4-D (0, 5, 10 e 20 µm), somente a concentração de 20 µm de 2,4-D induziu à formação de calos, em 65% dos explantes, não havendo indução nos outros três tratamentos. Da mesma forma, quando se utilizou 2iP isoladamente, apenas os tratamentos com 9 e 36 µm deste regulador levaram à formação de calos, mas em apenas 25% dos explantes. Os tratamentos 10 (5 µm de 2,4-D + 18 µm de 2iP), 11 (10 µm de 2,4-D + 18 µm de 2iP) e 16 (20 µm de 2,4-D + 36 µm de 2iP) resultaram em 100% de indução de calos (Figura 1), o que pode ser explicado devido ao fato dos níveis de citocininas e auxinas promoverem um balanço hormonal que pode estimular o crescimento da planta (PALÚ et al., 2004). Como se pode inferir pela observação dos resultados apresentados na Figura 1, o balanço hormonal indicado seria 18 µm de 2iP e concentrações entre 5 e 10 µm de 2,4-D y = -0,68x ,61x - 7,91 R 2 =0,89 Porcentagem de indução de calos (%) y = -0,33x ,16x + 28,41 R 2 =0,94 y = 0,14x 2-1,20x + 27,05 R 2 =0,94 y = 0,30x 2-2,78x + 1,77 R 2 =0,95 0 µm 2iP 9 µm 2iP Concentrações de 2,4 (µm) FIGURA 1 Efeito de concentrações de 2,4-D e 2iP sobre a porcentagem de indução de calos em B. gasipaes, 49 dias após a inoculação. Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p , 2010

44 Indução de calos em nervura mediana de folhas A porcentagem da área do explante coberta por células de calo comportou-se de maneira diferenciada nos tratamentos utilizados. Na maioria dos tratamentos, esta área correspondeu à faixa de 0 a 25%. Os tratamentos 15 (10 µm de 2,4-D + 36 µm de 2iP) e 16 (20 µm de 2,4-D + 36 µm de 2iP) apresentaram, em sua maioria, explantes com porcentagens na faixa de 25 a 50%. O tratamento 11 (10 µm de 2,4-D + 18 µm de 2iP) foi o mais eficiente, com base na porcentagem da área foliar coberta por células de calo, com porcentagens de 50 a 75% e alguns explantes com 75 a 100%. No tratamento controle, sem reguladores de crescimento, não houve desenvolvimento, ocorrendo necrose (morte celular) de todos os explantes (Tabela 2). Em todos os casos, os calos observados foram do tipo friável. As concentrações de cada um dos reguladores de crescimento determinam o tipo de calo induzido e sua distribuição no explante. Como relatado anteriormente, o tratamento 11, que combinou concentrações de 10 µm de 2,4-D + 18 µm de 2iP, resultou na maior porcentagem da área do explante coberta por células de calo. A morfogênese e o crescimento vegetal são regulados pela interação, pelo balanço entre reguladores de crescimento adicionados ao meio e pelos níveis endógenos, produzidos nas células cultivadas in vitro. Em geral, concentrações semelhantes de auxina e citocinina, no meio de cultura, promovem a formação de calos, entretanto, as respostas à interação dessas classes de reguladores podem variar de acordo com as condições da cultura, tipo de explante e genótipo da planta (CORDEIRO et al., 2007). Na calogênese, os reguladores de crescimento agem sobre a expressão gênica, de forma sinérgica ou não, fazendo com que, a partir de células de tecidos organizados e diferenciados, se forme uma massa de células com características meristemáticas cujo crescimento é, geralmente, muito rápido e irregular (SANTOS, 1998). A interação entre auxinas e citocininas, em concentrações similares, tem sido muito utilizada para a indução de calos em diversas espécies, embora alguns trabalhos relatem a utilização de altas concentrações de auxinas e baixas de citocininas, resultando em grande proliferação celular e posterior indução de calos, ou ainda a indução de calos apenas com auxinas no meio de cultivo (FLICK et al., 1983; GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998). Arias & Huete (1983) relatam que a auxina 2,4-D tem um efeito estimulador na formação de calos na pupunha. Em estudo realizado com ápices caulinares, segundo os autores, a formação de calos foi induzida por concentrações de 20 a 50 mg L -1 de 2,4-D em dois meses de cultivo. Após os dois meses iniciais, os explantes foram transferidos para meio sem reguladores e em alguns cultivos se observaram embriões que, aos cinco meses de desenvolvimento, geraram vários brotos apicais com um sistema radial. TABELA 2 Porcentagens da área do explante coberta por células de calo em relação às diferentes combinações reguladores de crescimento em explantes de B. gasipaes aos 49 dias de cultivo. Tratamentos T1* T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9* T10 T11 T12 T13 T14 T15 T16 Sem calos % % % % *100% de necrose dos explantes. Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p , 2010

45 38 SANTOS, M. R. A. dos et al. Ferreira & Pasqual (2008), trabalhando com a figueira cultivar Roxo de Valinhos, relatou a formação de calos em segmentos caulinares apenas nos tratamentos que continham auxinas. Por outro lado, Santos et al. (2000) verificaram a influência positiva da relação auxina/citocinina em ensaios envolvendo indução de calos em cultivares de cafeeiro, assim como Cunha & Ferreira (1996) e Gomes (1999), que observaram uma eficiente calogênese em explantes de Maclura tinctoria D. Don ex Stend. e Linun usitatissimum L., respectivamente, devido à interação entre esses reguladores. Vidal et al. (2005), trabalhando com explantes de cultivares de algodão em meio MS suplementado por combinações de 2iP e 2,4-D, observaram que, dentre os tratamentos testados, o que produziu maior número de explantes com calos foi a combinação de 0,1 mg L -1 de 2,4-D com 0,5 mg L -1 de 2iP. A interação da auxina 2,4-D com a citocinina 2iP mostrou importância na indução de calos para os explantes de B. gasipaes, sendo que os tratamentos mais responsivos (com maior porcentagem de indução de calos) foram aqueles que combinaram esses dois reguladores, obtendose 100% de indução. Nos tratamentos nos quais havia apenas citocinina ou apenas auxina, os explantes foram menos responsivos, mostrando que esses explantes, para maior obtenção de calos, dependem da combinação dos dois reguladores de crescimento. Os calos obtidos neste trabalho serão subcultivados para testar combinações de reguladores visando à indução de brotações e posterior regeneração de plantas, subsidiando o desenvolvimento de metodologia de propagação in vitro para a produção clonal de B. gasipaes. CONCLUSÕES Os resultados obtidos permitem concluir que, para indução de calos em nervura mediana de folhas não expandidas de pupunheira, foram eficientes as combinações: 5 µm de 2,4-D + 18 µm de 2iP; 10 µm de 2,4-D + 18 µm de 2iP; e 20 µm de 2,4-D + 36 µm de 2iP, nas quais obteve-se indução de calos em todos os explantes. A maior porcentagem da área do explante coberta por células de calo foi obtida no meio contendo 10 µm de 2,4-D + 18 µm de 2iP, no qual maior parte dos explantes apresentou 50 a 100% da área coberta por células de calos. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CNPq pelo financiamento da pesquisa e pela concessão de bolsa de Iniciação Científica. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALMEIDA, C. V.; YARA, R.; ALMEIDA, M. Fungos endofíticos isolados de ápices caulinares de pupunheira cultivada in vivo e in vitro. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 40, n. 5, maio ALMEIDA, M.; ALMEIDA, C. V. Somatic embryogenesis and in vitro plant regeneration from pejibaye adult plant leaf primordia. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 41, n. 9, p , set ARIAS, O.; HUETE, F. Propagación vegetativa in vitro del pejibaye (Bactris gasipaes H.B.K.). Turrialba, San José, v. 33, n. 2, p , ago BERGO, C. L.; MENDONÇA, H. A.; LEDO, F. J. S. Estimativa de parâmetros genéticos em progênies de meioirmãos de pupunheira (Bactris gasipaes Kunth, Palmae) na Amazônia Ocidental. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE FRUTICULTURA, 17., 2002, Belém. Anais... Belém: SBF, BOVI, M. L. A. Cultivo racional de palmito. Comunicação da Pesquisa Agropecuária, São Paulo, v. 11, n. 2, p , maio BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Políticas de Saúde. Coordenação Geral da Política de Alimentação e Nutrição. Alimentos Regionais Brasileiros. Brasília, p. CLEMENT, C. R. Growth and genetic analysis of pejibaye (Bactris gasipaes Kunth, Palmae) in Hawaii p. Thesis (Ph.D. in Horticulture) - University of Hawaii at Manoa, Honolulu, Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p , 2010

46 Indução de calos em nervura mediana de folhas CLEMENT, C. R.; BOVI, M. L. A. Melhoramento genético da pupunheira: conhecimentos atuais e necessidades. In: SEMINÁRIO DO AGRONEGÓCIO DE PALMITO DE PUPUNHA NA AMAZÔNIA, 1., 1999, Porto Velho. Anais... Porto Velho: Embrapa Rondônia, p CUNHA, A. C. G.; FERREIRA, M. F. Somatic embryogenesis, organogenesis and callus growth kinectis of flax. Plant Cell Tissue and Organ Culture, Dondrecht, v. 47, n. 1, p. 1-8, Jan FERNANDES, A. R.; CARVALHO, J. G.; CURI, N.; GUIMARÃES, P. T. G.; PINTO, J. E. B. P. Crescimento de mudas de pupunheira (Bractris gasepaes H.B.K.) sob diferentes níveis de salinidade. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 27, n. 2, p , mar./abr FERREIRA, E. A.; PASQUAL, M. Otimização de protocolo para micropropagação da figueira Roxo de Valinhos. Ciência Rural, Santa Maria, v. 38, n. 24, p , jul FLICK, C. E.; EVANS, D. A.; SHAP, W. R. Organogenesis. In: EVANS, D. A.; SHARP, W. R.; AMMIRATO, P. V.; YAMADA, Y. Hand of plant cell culture. New York: MacMillan, p GOMES, G. A. C. Propagação in vitro de Moreira (Maclura tinctoria) p. Dissertação (Mestrado em Fisiologia Vegetal) Universidade Federal de Lavras, Lavras, GRATTAPAGLIA, D.; MACHADO, M. A. Micropropagação. In: TORRES, A. C.; CALDAS, L. S.; BUSO, J. A. (Eds.). Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. Brasília: Embrapa-SPI; Embrapa-CNPH, p GRATTAPAGLIA, D.; MACHADO, M. A. Micropropagação. In: TORRES, A. C.; CALDAS, L. S. (Eds.). Técnicas e aplicações da cultura de tecidos de plantas. Brasília: ABCTP/EMBRAPA-CNPH, p HERNADEZ, F. B. T.; ALVES JUNIOR, J.; LOPES, A. S. Irrigação na cultura da pupunha. In:. Curso sobre cultivo, processamento e comercialização de palmito pupunha. Londrina: IAPAR, p LANDA, F. S. L.; PAIVA, R.; PAIVA, P. D. O.; BUENO FILHO, J. S. Indução in vitro de calos em explantes foliares de pequizeiro (Caryocar brasiliense Camb.).Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 24, p , dez Edição especial. MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A. revised medium for rapid growth and biossays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, Sweden, v. 15, p , PALÚ, E. G.; SILVA, A. B.; PASQUAL, M. Calogênese in vitro em anteras de Coffea arabica L. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 28, n. 4, p , jul./ago SANTOS, A. C. P.; CORDEIRO, A. T.; CAMPOS, M. R. C.; OTONI, W. C.; ZAMBOLIM, L. Calogênese em Coffea via cultura semi-sólida. In: SIMPÓSIO DE PESQUISA DOS CAFÉS DO BRASIL, 1., 2000, Brasília. Anais... Brasília: Embrapa Café; Minasplan, p SANTOS, B. R.; PAIVA, R.; MARTINOTTO, C.; NOGUEIRA, R. C.; PAIVA, P. D. O. Indução de calos friáveis em explantes foliares de Salix (Salyx humboldtiana Willd). Ciência Rural, Santa Maria, v. 35, n. 3, p , maio/jun SANTOS, M. R. A. Germinação, calogênese e caracterização de saponinas em Smilax japecanga Grisebach p. Dissertação (Mestrado em Fisiologia Vegetal) Universidade Federal de Lavras, Lavras, SOUZA, A. G. C.; SOUZA, N. R.; SILVA, S. E. L.; NUNES, C. D. M.; CANTO, A. C.; CRUZ, L. A. A. Fruteiras da Amazônia. Brasília: Embrapa-SPI, p. TAIZ, L.; ZEIGER, E. Fisiologia vegetal. 3. ed. Porto Alegre: Artmed, p. TOZETTI, A. D.; CONTEL, E. P. B. Padronização da isoenzima 6-fosfogluconato desidrogenase em pupunha (Bractris gasipaes H.B.K.). Revista Científica Eletrônica de Agronomia, São Paulo, v. 2, n. 4, dez TSURO, M.; KODA, M.; INOUE, M. Efficient plant regeneration from multiple shoots formed in the leaf-derived callus of Lavandula vera, using the open culture system. Scientia Horticulturae, Amsterdam, v. 86, n. 1, p , set VIDAL, M. S.; CARVALHO, J. M. F. C.; SANTOS, J. W.; PINHEIRO, M. P. N.; JERÔNIMO, J. F. Indução de calos a partir de embriões zigóticos imaturos em duas cultivares de algodão. Campina Grande: Embrapa Algodão-CNPA, p. (Comunicado técnico, 265) VILLACHICA, H. Frutales y hortalizas promisorios de la Amazonia. Lima: FAO, p. Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p , 2010

47 40 INFLUÊNCIA DE ANA E BAP SOUZA, E DA C. S. et MODALIDADE al. DE CULTIVO in vitro DE TAIOBAS (Xanthosoma sagittifolium (L.) SCHOTT) INFLUENCE OF NAA AND BAP AND METHODS FOR in vitro GROWTH OF TANNIA (Xanthosoma sagittifolium (L.) SCHOTT) CRISTINA SOARES DE SOUZA 1 ; FERNANDO LUIZ FINGER 2 ; ADILSON RICKEN SCHUELTER 3 1 Doutoranda em Genética e Melhoramento Universidade Federal de Viçosa/UFV Campus Universitário, Departamento de Fitotecnia Viçosa, MG cristina.souza@ufv.br 2 Professor Associado Universidade Federal de Viçosa/UFV Campus Universitário, Departamento de Fitotecnia Viçosa, MG ffinger@ufv.br 3 Pesquisador Cooperativa Central de Pesquisa Agrícola/COODETEC Rod. BR467 km Cascavel, PR adilson_schuelter@yahoo.com.br RESUMO Objetivou-se com o presente trabalho estabelecer protocolos rotineiros para propagar dois acessos (Roxa e BGH/ UFV5932) de taioba originados de brotos de rizoma, cultivados em meio semissólido e líquido, com diferentes concentrações de ANA e BAP. Para avaliar o crescimento das plântulas, foi determinado o número de brotações (NB), comprimento da parte aérea (CPA), comprimento da raiz (CR), bem como a matéria fresca total (MF) e a matéria seca total (MS). O comprimento das raízes foi estimulado por BAP, e o maior desenvolvimento da parte aérea foi obtido na presença da auxina ANA. O BAP induziu maior número de brotações, com maior produção de plântulas para o acesso BGH/UFV5932 na concentração de 8,88 µm em meio líquido com agitação e meio semissólido; e de 6,66 µm em meio líquido estacionário. Para a variedade Roxa, maior número de brotos foi obtido quando 6,66 µm foram aplicados em meio líquido com agitação e meio semissólido; e 4,44 µm foram acrescidos em meio líquido estacionário. A presença de citocinina no cultivo in vitro surte efeitos positivos na formação de raízes e brotos de taioba. O acesso BGH/UFV5932, em presença de BAP apresenta maior eficiência em gerar mudas, comparado a variedade Roxa. O meio líquido pode ser adotado para multiplicação in vitro de taioba. Termos para indexação: Taioba, Reguladores de crescimento, Propagação in vitro. ABSTRACT The objective of the present work was to establish protocols for the propagation of two accessions of tannia (Roxa and BGH/UFV 5932) from rhizome buds, grown in semisolid and liquid media containing different concentrations of NAA and BAP. Shoot number (NB), length of aerial portion (CPA), root length (CR), total fresh weight (MF) and total dry weight (MS) were determined in order to evaluate plantlet growth. Root length was stimulated by BAP, while the shoot growth was higher in the presence of NAA. BAP induced a larger number of shoots, with higher yield of plantlets for the accession BGH/UFV 5932 at concentration of 8.88 mm in liquid media under shaking and semisolid media; similar to 6.66 mm in liquid media without shaking. For the variety Roxa, the larger number of shoots was obtained using 6.66 M BAP in liquid media with shaking and in semisolid media; and 4.44 mm BAP in liquid media without shaking. The addition of cytokinin induced positive effects for in vitro growth of roots and shoots in tannia. The accession BGH/ UFV 5932, in the presence of BAP, presented higher efficiency in generating plantlets compared to the Roxa variety. The results indicate that liquid media may be used for in vitro multiplication of tannia. Index terms: Tannia, Growth regulators, In vitro propagation INTRODUÇÃO A espécie Xanthosoma sagittifolium (L.) Schott, originária das regiões tropicais da América do Sul e popularmente conhecida como taioba, é uma espécie monocotiledônea, pertencente à família Araceae e considerada hortaliça folhosa e herbácea rizomatosa (SEGANFREDO et al., 2001). As folhas e rizomas dessa planta são aproveitados na alimentação, sendo fonte de vitamina A e C, ferro, potássio, cálcio e manganês (OMOKOLO et al., 2003). No Brasil, apesar da cultura ser pouco explorada, há comércio regular de suas folhas nos Estados da Bahia, Rio de Janeiro, Minas Gerais e Espírito Santo, nos quais diversas variedades são cultivadas destacando-se a Taioba Comum, a Taioba Roxa e a BGH/ UFV A falta de órgãos de propagação tem dificultado a implantação das culturas de propagação vegetativa, uma vez que a propagação convencional por rizomas exige muito tempo, sendo onerosa pelo grande volume a transportar, e (Recebido em 01 de outubro de 2009 e aprovado em 31 de agosto de 2010) Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p.40-48, 2010

48 Influência de Ana e Bap e da modalidade de cultivo in vitro a necessidade de grandes áreas destinadas à produção dos órgãos de propagação (CARVALHO & CORDEIRO, 1990). Métodos alternativos de propagação rápida podem solucionar o problema dessa escassez e reduzir o tempo de produção, bem como os custos de produção. Além disso, uma nova demanda para folhas e material propagativo vem aumentando em países como os E.U.A. devido à grande presença de imigrantes brasileiros (MANGAN et al., 2008; SILVA, 2007). Esse novo mercado exigirá a produção de material originado de propagação assexual, principalmente de propagação in vitro, que provê uma produção em larga escala e de maneira rápida para atender às necessidades dos fazendeiros, com plantas uniformes e livres de doenças. Porém, as respostas para micropropagação variam grandemente em função do genótipo, estado fisiológico, concentrações endógenas de hormônios nos explantes e da composição do meio de cultivo (KOZAY et al., 1997). Assim, há a necessidade para desenvolver a composição do meio de cultivo ideal, com concentração ótima de nutrientes e reguladores de crescimento, devendo esse meio propiciar os nutrientes necessários ao metabolismo das células vegetais em cultivo para o crescimento e desenvolvimento dos tecidos (FOGAÇA et al., 2007). A adição de reguladores de crescimento ao meio de cultivo, em particular das auxinas e citocininas, estimula a formação de raízes laterais e adventícias e a formação de brotações, respectivamente (CARVALHO et al., 2006). O ácido naftalenoacético (ANA) é uma auxina sintética com capacidade de induzir a formação de raízes in vitro (LIMA et al., 2002). A 6-benzilaminopurina (BAP) é uma citocinina sintética extensamente usada em cultura de tecidos para estimular a formação de grande número de brotos, proporcionando assim, rápida multiplicação dos explantes (TORRES et al., 2001). A utilização desses fitorreguladores supre as deficiências naturais dos níveis endógenos observados em explantes desenvolvidos por micropropagação (CARVALHO et al., 2006). O objetivo deste trabalho foi estabelecer protocolos rotineiros para propagar dois acessos (Roxa e BGH/UFV 5932) de taioba originados de brotos de rizoma e cultivados em meio semissólido e líquido, com diferentes concentrações de ANA e BAP. Material Vegetal MATERIAL E MÉTODOS Rizomas de plantas maduras de taioba (Xanthosoma sagittifolium), cultivares Roxa e BGH/UFV 5932, provenientes do Banco de Germoplasma de Hortaliças da Universidade Federal de Viçosa (UFV), Viçosa, Minas Gerais, foram assepticamente lavados e seccionados para remoção das gemas, subsequentemente cultivados em meio de cultura MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962) em ausência de reguladores de crescimento. Cinco subcultivos foram realizados durante o período de doze meses visando obter as brotações empregadas no presente trabalho. Efeito do ANA no Enraizamento e Alongamento e do BAP nas Brotações Múltiplas de Taioba O delineamento experimental foi inteiramente casualizado em arranjo fatorial 2x3x9, sendo testadas duas variedades (Roxa e BGH/UFV 5932); três tipos de meio quanto à natureza física (semissólido, líquido estacionário e líquido com agitação) e nove concentrações de reguladores de crescimento (controle; ANA - 1,34; 2,68; 4,02 e 5,36 µm; BAP - 2,22; 4,44; 6,66 e 8,88 µm). As unidades experimentais foram constituídas de 1 brotação por repetição, totalizando 4 repetições. Após o quinto subcultivo, brotações das variedades Roxa e BGH/UFV 5932, com aproximadamente 2 cm, passaram por um processo de remoção da parte aérea e do sistema radicular (ARIMURA, 2000), sendo então, inoculadas em meio MS, variando-se a concentração de reguladores de crescimento e o tipo de meio quanto à natureza física. Os meios de cultura com natureza semissólida foram obtidos pelo emprego de Fitagel (2,3 g/l), em tubos de ensaio (22 x 150 mm), contendo 12 ml de meio. Os meios de cultura de natureza líquida (ausência de agente geleificante) foram mantidos na condição estacionária e com agitação (mesas agitadoras orbitais Modelos TE 140 e 109) em frascos de Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p , 2010

49 42 SOUZA, C. S. et al. vidro de 300 ml contendo 20 ml de meio de cultivo, eram completados à medida que as plantas íam crescendo. Não foi utilizado nenhum tipo de suporte das plantas e a velocidade de agitação dos tratamentos foi de 80 rpm. Em todos os experimentos, o ph dos meios foi ajustado a 5,7 ± 0,1 antes da autoclavagem. Conduziramse os experimentos em regime luminoso de 16 horas luz e 8 horas diárias de escuro à temperatura de 25 ± 1ºC e irradiância de µmol m -2 s -1. Variáveis Quantificadas Para avaliar o desenvolvimento das plântulas, após 60 dias de cultivo foram determinados o número de brotações (NB), o comprimento da parte aérea (CPA), o comprimento da raiz mais longa (CR), além da matéria fresca total (MF) e da matéria seca total (MS). Para essa última, as plântulas foram submetidas durante 72 horas em estufa com temperatura controlada de 65ºC. Análise Estatística Os dados foram submetidos à análise de variância pelo software Sisvar versão 5.1 (FERREIRA, 2008) e para a comparação das médias dos tratamentos utilizou-se do teste Scott-Knott a 5% de probabilidade. A transformação realizada em todas as variáveis foi raiz quadrada de (X + 1,0) (BIANCONI et al., 2008; GRAVINA et al., 2004). RESULTADOS E DISCUSSÃO Os coeficientes de variação, na análise de variância, oscilaram entre 30 e 50%, que podem ser considerados estatisticamente elevados (CLEMENTE & MUNIZ, 2000; STORCK et al., 2002). Porém, esse tipo de variação é comum em cultura de tecidos (RADMANN et al., 2003; RAMOS & CARNEIRO, 2007; REZENDE et al., 2008). Além disso, os dados não mostraram distribuição homogênea, sendo transformados pela equação: raiz quadrada de (X + 1,0) (BIANCONI et al., 2008; GRAVINA et al., 2004). Diferenças significativas foram encontradas para as concentrações de reguladores de crescimento para todos os caracteres morfológicos avaliados, para as variedades e meios de cultivo. A interação reguladores de crescimento x variedades x meios de cultivo, também foi estatisticamente significativa. A adição dos fitorreguladores auxina e citocinina ao meio de cultura é procedimento normal por promover o crescimento e o desenvolvimento organizados no tecido da planta (GASPAR et al., 1996). A presença de reguladores de crescimento, principalmente as citocininas, favorece o processo de microtuberização em Xanthosoma sagittifolium (OMOKOLO et al., 2003). Porém, durante as avaliações deste experimento, não foi observada formação de microrrizomas, provavelmente pela curta permanência das plântulas in vitro perfazendo 60 dias. O enraizamento está associado ao suprimento adequado de auxinas. Segundo Souza & Pereira (2007), um dos fatores mais importantes relacionados ao processo de formação de raízes adventícias in vitro é inerente à presença e/ou ausência de auxina. Naves (2003) detectou inibição da formação de raízes nos explantes de bromélias em meio de cultura com BAP, sendo estimuladas por ANA. Pathak et al. (2009), estudando o efeito de reguladores de crescimento na multiplicação e enraizamento in vitro de variedades de cana-de-açúcar, obtiveram até 95% de enraizamento utilizando ANA. Quirino et al. (1996) relataram que a presença de BAP prejudicou, sensivelmente, o crescimento das raízes, sendo os maiores comprimentos encontrados na ausência dessa citocinina. Entretanto, na variedade BGH/UFV 5932 mantida em meio líquido com agitação (Tabela 1), a raiz teve maior crescimento (19,25 cm) com 4,44 µm de BAP, além disso, em meio líquido na forma estacionária (Tabela 2) e em meio semissólido (Tabela 3), o meio basal promoveu alongamento das raízes (21,50 e 12,38 cm, respectivamente). Carneiro et al. (1999) não utilizou auxina em Cryptanthus sinuosus, Neoregelia cruenta e Quesnelia arvensis, obtendo enraizamento em meio MS. De acordo com Souza & Pereira (2007), há espécies que enraízam com facilidade e não necessitam da presença de auxinas, o que pode ser explicado pelo elevado nível endógeno desses fitohormônios. Na variedade Roxa foram observadas raízes maiores em presença de citocinina nas três formas de meio de cultura. Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p.40-48, 2010

50 Influência de Ana e Bap e da modalidade de cultivo in vitro Assim, quando a variedade Roxa foi crescida em meio líquido sob agitação (Tabela 4), a concentração de 2,22 µm de BAP foi mais eficiente (23,13 cm). Já em meio líquido estacionário (Tabela 5) e semissólido (Tabela 6) a melhor concentração foi 4,44 µm de BAP (19 e 12,13 cm, respectivamente). Pereira et al. (2000) obtiveram resultados similares na indução de raízes adventícias in vitro em plântulas de Echinodorus scaber Rataj. quando estas foram cultivadas em meio MS suplementado somente com a citocinina 6-benzilaminopurina (BAP) na concentração de 1,00 mg L -1. De acordo com Souza & Pereira (2007), a adição de citocininas ao meio de cultura também podem favorecer o enraizamento adventício. TABELA 1 - Variação das concentrações de Reguladores de Crescimento (RC) dentro da variedade de taioba BGH/UFV 5932 em meio Líquido sob Agitação (LA) para cada variável analisada [número de brotações (NB), comprimento da parte aérea (CPA), comprimento da raiz (CR), matéria fresca total (MF) e matéria seca total (MS)]. RC (µm) NB CPA CR MF MS Médias Médias Médias Médias Médias 0 1,00 c 6,75 a 7,63 b 1,56 b 0,10 b 1,34/ANA 2,00 c 8,13 a 17,88 a 3,74 a 0,22 a 2,68/ANA 2,00 c 9,13 a 17,75 a 4,17 a 0,21 a 4,02/ANA 3,00 c 4,13 b 2,00 c 1,02 b 0,06 b 5,36/ANA 5,00 b 3,88 b 0,00 d 1,25 b 0,06 b 2,22/BAP 4,00 b 7,13 a 3,88 c 1,63 b 0,11 b 4,44/BAP 4,00 b 8,38 a 19,25 a 3,19 a 0,17 a 6,66/BAP 7,00 a 4,50 b 0,00 d 1,46 b 0,08 b 8,88/BAP 8,00 a 6,25 a 3,00 c 2,27 b 0,14 a Valores seguidos da mesma letra na vertical não diferem a 5% de probabilidade pelo teste Scott-Knott. TABELA 2 - Variação das concentrações de Reguladores de Crescimento (RC) dentro da variedade de taioba BGH/UFV 5932 em meio Líquido Estacionário (LE) para cada variável analisada [número de brotações (NB), comprimento da parte aérea (CPA), comprimento da raiz (CR), matéria fresca total (MF) e matéria seca total (MS)]. RC (µm) NB CPA CR MF MS Médias Médias Médias Médias Médias 0 2,00 b 10,38 b 21,50 a 4,22 a 0,26 a 1,34/ANA 3,00 b 13,25 a 18,63 a 5,16 a 0,31 a 2,68/ANA 4,00 a 13,13 a 11,75 b 6,12 a 0,35 a 4,02/ANA 5,00 a 8,00 c 7,88 c 3,23 b 0,18 b 5,36/ANA 2,00 b 10,63 b 7,50 c 6,22 a 0,33 a 2,22/BAP 4,00 a 6,63 c 4,00 d 1,51 b 0,12 b 4,44/BAP 5,00 a 6,25 c 12,50 b 2,68 b 0,17 b 6,66/BAP 7,00 a 7,13 c 13,00 b 3,99 a 0,19 b 8,88/BAP 6,00 a 7,13 c 8,75 c 2,99 b 0,24 a Valores seguidos da mesma letra na vertical não diferem a 5% de probabilidade pelo teste Scott-Knott. Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p , 2010

51 44 SOUZA, C. S. et al. TABELA 3 - Variação das concentrações de Reguladores de Crescimento (RC) dentro da variedade de taioba BGH/UFV 5932 em meio Semissólido (S) para cada variável analisada [número de brotações (NB), comprimento da parte aérea (CPA), comprimento da raiz (CR), matéria fresca total (MF) e matéria seca total (MS)]. RC (µm) NB CPA CR MF MS Médias Médias Médias Médias Médias 0 1,25 c 12,88 a 12,38 a 5,23 a 0,27 a 1,34/ANA 3,00 b 6,20 d 4,68 b 2,44 b 0,13 b 2,68/ANA 7,25 a 7,13 c 3,45 b 2,76 b 0,16 b 4,02/ANA 6,25 a 8,88 b 2,25 b 3,02 b 0,17 b 5,36/ANA 4,25 b 4,08 d 0,00 c 0,81 c 0,06 b 2,22/BAP 6,75 a 7,00 c 5,45 b 2,75 b 0,15 b 4,44/BAP 5,50 a 5,75 d 3,38 b 2,42 b 0,12 b 6,66/BAP 6,50 a 4,83 d 2,00 b 1,45 c 0,09 b 8,88/BAP 8,00 a 4,63 d 0,88 c 1,39 c 0,09 b Valores seguidos da mesma letra na vertical não diferem a 5% de probabilidade pelo teste Scott-Knott. O uso do BAP foi importante pelo aumento na formação de brotos, em maior número nas variedades testadas, e contribuindo para o crescimento da variedade Roxa, pois, geralmente, quanto maior o número de brotações e o comprimento da parte aérea, maior é a síntese de fotoassimilados pela planta e, consequentemente, maior é a massa seca. Dessa forma, as concentrações que promoveram o aumento do número de brotações e o comprimento da parte aérea da BGH/UFV 5932 em meio líquido sob agitação (Tabela 1) foram 8,88 µm de BAP (8 brotações/explante) e 2,68 µm de ANA (9,13 cm), respectivamente. Em meio líquido estacionário (Tabela 2) foram 6,66 µm de BAP (7 brotações/ explante) e 1,34 µm de ANA (13,25 cm), respectivamente. Em meio semissólido (Tabela 3), o número de brotações foi incrementado por 8,88 µm de BAP (8 brotações/ explante). O comprimento da parte aérea foi maior no meio MS0 (12,88 cm), dispensando a aplicação de hormônio. Em meio de cultura isento de regulador de crescimento, Lima et al. (2002) também notaram maior comprimento da parte aérea em plantas de mandioca. Camolesi et al. (2010), testando o tratamento meio líquido x frasco de 500 ml na multiplicação in vitro de mudas de bananeira Maçã, observaram maior número de mudas por explante no final da multiplicação em meio suplementado com BAP. A concentração de auxina promotora do crescimento da parte aérea pode inibir o enraizamento da mesma planta. De acordo com Souza & Pereira (2007), a excessiva concentração de auxina no meio de cultura pode ser tóxica e também favorecer a formação de calos, comprometendo a rizogênese, bem como o crescimento da parte aérea, o que não foi observado neste experimento. Segundo esses autores, cada órgão vegetal pode requerer distintas concentrações de auxina. Concentrações de ANA acima do ótimo podem induzir a síntese de outro hormônio, o etileno, propiciando senescência. Na variedade Roxa, em meio líquido sob agitação (Tabela 4), com 6,66 e 8,88 µm de BAP e 1,34 µm de ANA, aumentaram o número de brotações (7 brotações/explante) e o comprimento da parte aérea (11 cm), respectivamente. Em meio líquido estacionário (Tabela 5), 4,44 e 6,66 µm de BAP (3 brotações/explante) e 2,68 µm de ANA (11,88 cm) e em meio semissólido (Tabela 6), 6,66 µm de BAP (5,75 brotações/ explante), aumentaram as brotações. Sem fitorregulador, o comprimento aéreo das plantas foi melhor (12,63 cm). Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p.40-48, 2010

52 Influência de Ana e Bap e da modalidade de cultivo in vitro TABELA 4 - Variação das concentrações de Reguladores de Crescimento (RC) dentro da variedade de taioba Roxa em meio Líquido sob Agitação (LA) para cada variável analisada [número de brotações (NB), comprimento da parte aérea (CPA), comprimento da raiz (CR), matéria fresca total (MF) e matéria seca total (MS)]. RC (µm) NB CPA CR MF MS Médias Médias Médias Médias Médias 0 6,00 a 7,63 b 15,25 b 2,13 b 0,10 b 1,34/ANA 1,00 c 11,00 a 13,88 b 5,02 a 0,27 a 2,68/ANA 4,00 b 9,13 b 13,00 b 4,06 a 0,25 a 4,02/ANA 2,00 c 10,88 a 11,00 b 4,99 a 0,28 a 5,36/ANA 0,00 d 10,13 a 14,00 b 4,63 a 0,31 a 2,22/BAP 0,00 d 9,00 b 23,13 a 4,74 a 0,18 b 4,44/BAP 6,00 a 9,75 a 20,00 a 4,67 a 0,31 a 6,66/BAP 7,00 a 7,50 b 13,00 b 3,10 b 0,17 b 8,88/BAP 7,00 a 8,00 b 14,63 b 3,44 b 0,23 a Valores seguidos da mesma letra na vertical não diferem a 5% de probabilidade pelo teste Scott-Knott. TABELA 5 - Variação das concentrações de Reguladores de Crescimento (RC) dentro da variedade de taioba Roxa em meio Líquido Estacionário (LE) para cada variável analisada [número de brotações (NB), comprimento da parte aérea (CPA), comprimento da raiz (CR), matéria fresca total (MF) e matéria seca total (MS)]. RC (µm) NB CPA CR MF MS Médias Médias Médias Médias Médias 0 0,00 b 5,00 c 4,63 c 1,65 b 0,14 b 1,34/ANA 0,00 b 6,13 c 1,38 d 1,36 b 0,10 b 2,68/ANA 0,00 b 11,88 a 12,00 b 5,15 a 0,32 a 4,02/ANA 0,00 b 11,63 a 14,25 b 5,99 a 0,37 a 5,36/ANA 0,00 b 8,25 b 9,63 b 2,27 b 0,14 b 2,22/BAP 1,00 b 9,88 b 11,50 b 5,01 a 0,28 a 4,44/BAP 3,00 a 11,50 a 19,00 a 4,42 a 0,27 a 6,66/BAP 3,00 a 5,25 c 0,00 d 1,18 b 0,11 b 8,88/BAP 2,00 a 3,75 c 0,63 d 0,74 b 0,06 b Valores seguidos da mesma letra na vertical não diferem a 5% de probabilidade pelo teste Scott-Knott. A obtenção de melhores resultados, em meio líquido, pode ser explicado pelo fato de que altas concentrações de ágar, ou meios muito consistentes, acabam limitando a difusão de nutrientes até o explante. Em meio líquido, a difusão de nutrientes é mais rápida do que em meio semissólido (SOUZA & PEREIRA, 2007), uma vez que, nos meios semissólidos, pode ocorrer a criação de gradientes na distribuição de nutrientes com o crescimento dos tecidos, o que não acontece em meios líquidos, por serem mais homogêneos (CAMOLESI et al., 2010). Em Musa sp., Lameira et al. (1990) observaram maior número de brotações em meio líquido quando comparado ao meio semissólido. Fráguas et al. (2009) observaram que, em abacaxi Gomode-mel, o meio MS líquido proporciona, além de maior Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p , 2010

53 46 SOUZA, C. S. et al. TABELA 6 - Variação das concentrações de Reguladores de Crescimento (RC) dentro da variedade de taioba Roxa em meio Semissólido (S) para cada variável analisada [número de brotações (NB), comprimento da parte aérea (CPA), comprimento da raiz (CR), matéria fresca total (MF) e matéria seca total (MS)]. RC (µm) NB CPA CR MF MS Médias Médias Médias Médias Médias 0 0,00 d 12,63 a 11,75 a 7,64 a 0,33 a 1,34/ANA 0,25 d 10,88 a 10,13 a 6,75 a 0,30 a 2,68/ANA 2,00 c 6,38 b 3,20 b 2,56 c 0,17 b 4,02/ANA 2,25 c 4,13 b 0,50 c 1,16 c 0,11 b 5,36/ANA 5,00 a 4,88 b 1,88 b 2,19 c 0,20 b 2,22/BAP 3,25 b 10,63 a 11,13 a 5,20 b 0,28 a 4,44/BAP 3,50 b 8,88 a 12,13 a 6,44 a 0,34 a 6,66/BAP 5,75 a 9,38 a 8,13 a 4,73 b 0,28 a 8,88/BAP 5,25 a 5,75 b 0,75 c 1,55 c 0,12 b Valores seguidos da mesma letra na vertical não diferem a 5% de probabilidade pelo teste Scott-Knott. número de brotações, maior indução de gemas e menor porcentagem de hiperhidricidade. Pereira & Fortes (2003) verificaram que houve maior eficiência na multiplicação de batata em condições in vitro quando se utilizou meio de cultura líquido. Em igual forma, em Zingiber officinale Roscoe, Arimura (2000) constatou maior comprimento das brotações em meio líquido na ausência de ANA e em meio semissólido com o nível de 2,63 µm ANA. Em meio líquido, neste experimento, a citocinina induziu mais a brotação e a auxina foi melhor no crescimento da parte aérea. Fogaça et al. (2007) também obtiveram maior investimento na parte aérea das plantas de taro cultivadas em meio desprovido de BAP, tendo o desenvolvimento reduzido, naquelas com presença do fitohormônio devido à sua ação que controla a orientação do fluxo de carboidratos solúveis e, dessa forma, intervém no desenvolvimento dos tubérculos. Em meio semissólido, o melhor crescimento da parte aérea foi com ausência de hormônio. Em meio líquido com agitação (Tabela 4) e em meio semissólido (Tabela 6), a variedade Roxa demonstrou ter maior potencial, exceto para indução de brotação, enquanto que, em meio líquido estacionário (Tabela 2), a BGH/UFV 5932 apresentou melhor desempenho para todas as variáveis. Melhores resultados para multiplicação e crescimento de material propagativo, em meio líquido com agitação contínua, também foram obtidos por Pereira & Fortes (2003) com a cultura da batata. Além da composição química, a consistência do meio pode influenciar no tipo de crescimento e na taxa de multiplicação de plantas in vitro, por isso deve ser bastante discutida. O meio líquido normalmente exige alguma forma de suporte (não utilizado neste experimento) ou agitação que fornecem o oxigênio necessário para a respiração do explante. Pereira & Fortes (2003) alertam para que a agitação do meio de cultura seja feita especialmente na primeira semana de cultivo, uma vez que é o período em que os explantes permanecem totalmente imersos no meio de cultura, o que pode influenciar o crescimento inicial. De acordo com Camolesi et al. (2010), os frascos de conserva de 250 ml e 500 ml podem ser utilizados em cultura de tecidos e permitem maior rendimento no trabalho. CONCLUSÕES A presença de citocinina no cultivo in vitro surte efeitos positivos na formação de raízes e brotos de taioba. O comprimento da parte aérea é maior em plantas de taioba, quando estimulado pela auxina ANA. Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p.40-48, 2010

54 Influência de Ana e Bap e da modalidade de cultivo in vitro O acesso BGH/UFV 5932, em presença da citocinina BAP, tem maior eficiência em gerar mudas, quando comparado a variedade Roxa. O meio líquido pode ser adotado para multiplicação in vitro de taioba, por propiciar maior enraizamento e número de brotações, bem como, melhor desenvolvimento da parte aérea. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ARIMURA, C. T.; FINGER, F. L.; CASALI, V. W. D. Efeito do ANA e do BAP sobre o brotamento de gengibre (Zingiber officinale Roscoe) em meio geleificado e líquido. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, Botucatu, v. 2, n. 2, p , BIANCONI, A.; GOVONE, J. S.; ZUBEN, C. J. V.; PIÃO, A. C. S.; PIZANO, M. A.; ALBERTI, L. F. Transformação de dados e implicações na utilização do teste de Kruskal- Wallis em pesquisas agroecológicas. Pesticidas: Revista de Ecotoxicologia e Meio Ambiente, Curitiba, v. 18, p , CAMOLESI, M. R.; FARIA, R. T.; NEVES, C. S. V. J.; MARTINS, A. N. Volume do frasco e consistência do meio de cultura na multiplicação in vitro da bananeira Maçã. Ciência Rural, Santa Maria, v. 40, n. 2, p , CARNEIRO, L. A.; ARAÚJO, R. F. G.; BRITO, G. J. M.; FONSECA, M. H. P. B.; COSTA, A.; CROCOMO, O. J.; MANSUR, E. In vitro regeneration from leaf explants of Neoregelia cruenta (R. Graham) L. B. Smith, na endemic bromeliad from Eastern Brazil. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Dordrecht, v. 55, n. 2, p , CARVALHO, E. F.; CORDEIRO, J. A. D. Um método alternativo e eficiente de propagação vegetativa de inhame (Colocasia esculenta (L.) Schott) e de taioba (Xanthosoma sagittifolium (L.) Schott). Acta Amazônica, Manaus, v. 20, p , CARVALHO, J. M. F. C.; SILVA, M. M. A.; MEDEIROS, M. J. L. Fatores inerentes à micropropagação. Campina Grande: Embrapa Algodão, p. (Documentos, 148). CLEMENTE, A. L.; MUNIZ, J. A. Estimativas de faixas de coeficientes de variação em leguminosas forrageiras para avaliação da precisão experimental. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 24, n. 3, p , FERREIRA, D. F. Sisvar: um programa para análises e ensino de estatística. Revista Científica Symposium, Lavras, v. 6, n. 2, p , FOGAÇA, C. M.; CORDEIRO, D. C. CORREIA, T. D.; LAURIANO, M. P.; SANT ANNA-SANTOS, B. F.; FINGER, F. L.; OTONI, W. C. Microtuberização de Colocasia esculenta L. Schott (Aracea) in vitro. Revista Brasileira de Biociências, Porto Alegre, v. 5, n. 1, p , Suplemento. FRÁGUAS, C. B.; DORNELLES, C. M. V.; LIMA, G. P. P. Benzilaminopurina a ácido naftaleno acético na indução e multiplicação in vitro de gemas de abacaxizeiro da cultivar IAC Gomo-de-mel. Ciência Rural, Santa Maria, v. 39, n. 6, p , GASPAR, T.; KEVERS, C.; PENEL, C.; GREPPIN, H.; REID, D. M.; THORPE, T. A. Plant hormones and plant growth regulators in plant tissue culture. In Vitro Cellular and Development Biology-Plant, Wallingford, v. 32, p , GRAVINA, G. A.; CECON, P. R.; SEDIYAMA, C. S. Transformação de dados nas estimativas de parâmetros genéticos da resistência dos cultivares de soja Uberaba e Bossier à Cercospora sojina Hara. Revista Ceres, Viçosa, v. 51, n. 294, p , KOZAY, T.; KUBOTA, C.; JEONG, B. R. Environmental control for the large-scale production of plants through in vitro techniques. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Dordrecht, v. 51, n. 1, p , LAMEIRA, O. A.; PINTO, J. E. B. P.; PASQUAL, M. In vitro propagation of banana from tissue culture. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 25, n. 11, p , LIMA, G. P. P.; BARSALOBRES, C.; PIZA, I. M. T.; CEREDA, M. P. Efeito do BAP e ANA e atividade da peroxidase em mandioca (Manihot esculenta Crantz cv mcol 22) cultivada in vitro. Revista Brasileira de Agrociência, Pelotas, v. 8, n. 2, p , MANGAN, F. X.; MENDONÇA, R. U.; MOREIRA, M.; NUNES, S. V.; FINGER, F. L.; BARROS, Z. J.; GALVÃO, H.; ALMEIDA, G. C.; ANDERSON, M. D. Production and marketing of vegetables for the ethnic markets in the United States. Horticultura Brasileira, Brasília, v. 26, n. 1, p. 6-14, Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p , 2010

55 48 SOUZA, C. S. et al. MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A. A revised medium for rapid growth and biossays with tabacco tissue culture. Physiologia Plantarum, Copenhagen, v. 15, n. 3, p , NAVES, V. C.; PAIVA, P. D. O.; PASQUAL, M.; PAIVA, L. V. Avaliação de diferentes concentrações dos meios de cultura MS e Knudson para a propagação in vitro de bromélia imperial. Revista Brasileira de Horticultura Ornamental, Campinas, v. 9, n. 2, p , OMOKOLO, N. D.; BOUDJEKO, J. J.; TAKADONG, T. In vitro tuberization of Xanthosoma sagittifolium L. Schott: effect of phytohormones, sucrose, nitrogen and photoperiod. Scientia Horticulturae, Amsterdam, v. 98, n. 4, p , PATHAK, S.; LAL, M.; TIWAN, A. K.; SHARMA, M. L. Effect of growth regulators on in vitro multiplication and rooting of shoot cultures in sugarcane. Sugar Tech, v. 11, n. 1, p , PEREIRA, F. D.; PINTO, J. E. B. P.; CARDOSO, M. G.; LAMEIRA, O. A. Propagação i vitro de chapéu-de-couro (Echinodorus cf. scaber RATAJ.), uma planta medicinal. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v. 24, p , Edição especial. PEREIRA, J. E. S.; FORTES, G. R. L. Protocolo para produção de material propagativo de batata em meio líquido. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 38, n. 9, p , QUIRINO, E. A.; TOMBOLATO, A. F. C.; AMBROSANO, G. M. B. Micropropagação de Alstroemeria aff inodora através de meristema apical. Revista Brasileira de Horticultura Ornamental, Campinas, v. 2, n. 1, p , RADMANN, E. B.; GONÇALVES, E. D.; FORTES, G. R. L. Concentrações de ácido indolbutírico e períodos de escuro, no enraizamento in vitro de amoreira-preta (Rubus sp.), cv. Ébano. Revista Brasileira de Fruticultura, Jaboticabal, v. 25, n. 1, p , RAMOS, T. V.; CARNEIRO, I. F. Multiplicação in vitro de cattleya x mesquitae pelo método de estiolamento de segmentos caulinares. Pesquisa Agropecuária Tropical, Goiânia, v. 37, n. 1, p , REZENDE, J. C.; PASQUAL, M.; CARVALHO, S. P.; PEREIRA, A. R.; VILLA, F. Influência do meio de cultura e concentração de ágar no crescimento e desenvolvimento de plântulas de café oriundas da embriogênese somática direta. Scientia Agraria, Curitiba, v. 9, n. 1, p , SEGANFREDO, R.; FINGER, F. L.; BARROS, R. S.; MOSQUIM, P. R. Influência do momento de colheita sobre a deterioração pós-colheita em folhas de taioba. Horticultura Brasileira, Brasília, v. 19, n. 3, p , SILVA, R. A. N. Produção e comercialização de hortaliças presentes na culinária brasileira no Estado de Massachusetts/EUA Disponível em: < Acesso em: 8 ago SOUZA, A. V.; PEREIRA, A. M. S. Enraizamento de plantas cultivadas in vitro. Revista Brasileira de Plantas Medicinais, Botucatu, v. 9, n. 4, p , STORCK, L.; DAL COL LÚCIO, A.; SANTOS, P. M.; CARVALHO, M. P.; CARDINAL, A. B. B. Precisão experimental em erva-mate (Ilex paraguariensis St. Hil.). Ciência Florestal, Santa Maria, v. 12, n. 1, p , TORRES, A. C.; BARBOSA, N. V. dos R.; WILLADINO, L.; GUERRA, M. G.; FERREIRA, C. F.; PAIVA, S. A. V. Meios e condições de incubação para a cultura de tecidos de plantas: formulações de meios para a cultura de tecidos de plantas. Brasília: Embrapa, p. (Circular técnica). Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p.40-48, 2010

56 STAINABILITY AND FLUOROCHROMATIC REACTION IN FRESH MICROSPORES AND POLLEN ISOLATED FROM Phaseolus vulgaris L. Stainability and fluorochromatic reaction COLORAÇÃO E REAÇÃO FLUOROCROMÁTICA EM MICRÓSPOROS E PÓLEN FRESCOS ISOLADOS DE Phaseolus vulgaris L. LIA ROSANE RODRIGUES 1, JORGE ERNESTO DE ARAUJO MARIATH 2 1 Researcher Fundação Estadual de Pesquisa Agropecuária Rua Gonçalves Dias, 570, Menino Deus Porto Alegre, RS liarr@ufrgs.br 2 Professor Federal University of Rio Grande do Sul/UFRGS Av. Bento Gonçalves, 9500, Setor 4, Prédio 43423, Sala Porto Alegre, RS jorge.mariath@ufrgs.br ABSTRACT In bean (Phaseolus vulgaris L.) microspore culture, the standardization of a viability test is a prerequisite to analyze the microspore and pollen responses to isolation procedure and to in vitro culture. While mature pollen viability can be estimated by means of germination tests, microspores and uninucleate pollen alive can not be scored by this way. In order to study and compare viability assays in bean microspores and pollen, stainability to aniline blue in lactophenol (ABL) and 2,5-diphenyl tetrazoliumbromide (MTT) were compared with fluoresceine diacetate (FDA) reaction. Androecium from 2mm buds (containing microspores and immature pollen) and 4.5mm buds (containing mature pollen) were excised under stereoscope. Five anthers from each bud were prepared to FDA reaction and the others five anthers from the same bud were squashed in ABL. Positive and negative reaction was scored in 32 glass slides under microscope in brightfield and fluorescence, totaling 3,837 observations. Similar test was conducted with MTT. Normality test, analysis of variance, correlation and regression analysis were performed on the data. Reaction to FDA were low with a mean of 18%. A mean of 90% of the microspores and pollen reacted to ABL. MTT stain was not successfully, probably because the steps required to reaction speed up the cell death, since bean pollen presents low longevity and high susceptibility. There was highly significant difference between ABL and FDA reactions, but not between microspores and pollen, indicating that results obtained in mature bean pollen are representative of the microspore viability. Index terms: Bean; stain; microspore; haplodiploidization; viability, Phaseolus vulgaris L. RESUMO No cultivo de micrósporos isolados de feijão (Phaseolus vulgaris L.), a padronização do teste de viabilidade é pré-requisito para a análise das respostas de micrósporos ao procedimento de isolamento e ao cultivo in vitro. Enquanto a viabilidade do pólen maduro pode ser estimada em testes de germinação, micrósporos e pólen imaturo vivos não podem ser contabilizados dessa maneira. Com o objetivo de estudar e comparar testes em micrósporos e pólen de feijão, a coloração em azul de algodão em lactofenol (AA) e em 2,5-difenil-tetrazólio-brometo (DTB) foi comparada com a reação ao diacetato de fluoresceína (FDA). No estereoscópio, foram excisados androceus de botões de 2mm (contendo micrósporos e pólen imaturo) e de botões de 4,5mm (contendo pólen maduro). Cinco anteras de cada botão foram preparadas para reação ao FDA e as outras cinco foram esmagadas em AA. Reações positivas e negativas foram avaliadas em 32 lâminas histológicas no microscópio em campo claro e fluorescência, totalizando 3837 observações. Testes similares foram conduzidos com DTB. Os dados foram submetidos aos testes de normalidade, análise de variância, correlação e regressão. A percentagem de reação ao FDA foi baixa, em torno de 18%. Ao AA reagiram, em média, 90% dos micrósporos e do pólen. A coloração em DTB não funcionou, provavelmente porque os passos requeridos à reação aceleraram a morte celular, uma vez que o pólen de feijão é pouco longevo e muito suscetível. Houve diferença altamente significativa entre as reações ao AA e ao FDA, mas não entre micrósporos e pólen indicando que os resultados obtidos em pólen maduro são representativos da viabilidade do micrósporo. Termos para indexação: Feijão, corante, micrósporo, haplodiploidização, viabilidade, Phaseolus vulgaris L. In vitro culture of isolated microspores and immature pollen contribute to basic and applied studies and to biotechnological tools development in the plant breeding (HÖFER et al., 1999; KYO & HARADA, 1986; RODRIGUES et al., 2004, 2006). Since cells must stay alive at the end of the isolating process, appropriate viability tests are necessary. Assessment of pollen viability is required in plant breeding programs to pollen conservation and storage, to germplasm exchange and to enable crosses between parental with pollen shed and gynophyte maturity asynchronous (DAFNI, 1992; GALLETA, 1983). (Recebido em 08 de dezembro de 2009 e aprovado em 31 de agosto de 2010) Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p , 2010

57 50 RODRIGUES, L. R. et al. However, while mature pollen viability can be estimated by means of germination tests, microspores and immature (unicellular) pollen alive can not be scored by this way. These two categories are in appropriate undifferentiated condition to induction to in vitro embryogenesis (PECHAN & SMYKAL, 2001). Microspores and immature pollen isolation protocols have been developed to numerous plant species (HÖFER et al., 1999; KYO & HARADA, 1986; RODRIGUES et al., 2006) and, in these cases, techniques to score pollen viability have been adapted. In the literature, pollen viability is estimated by various techniques. Initially, fixed material was stained, for example, in carmine (DAFNI, 1992) or in Alexander stain (ALEXANDER, 1980) associating viability to the protoplast presence. Presently, these tests are believed inconsistent, because protoplasts presence or typical morphology can not be considered as viability, mainly in cells already dead by immersion in fixative (RODRIGUES et al., 2005, 2006). Fluorochromatic reaction to fluoresceine diacetate (FDA) (HESLOP-HARRISON & HESLOP-HARRISON, 1970) is a well-established technique to viability determination in plant cells in culture (WIDHOLM, 1972). Alternatively, there are stain techniques to fresh pollen in light microscope, like aniline blue in lactophenol (ABL, cotton blue) (HAUSER & MORRISON, 1964) and 2,5- diphenyl tetrazolium bromide (MTT) (RODRIGUEZ-RIANO & DAFNI, 2000). Therefore, in order to quantify the microspore and pollen viability in bean [Phaseolus vulgaris L., 2n=2x=22 (KARPECHENKO, 1925)] stainability to ABL and MTT were compared with FDA reaction. Seeds of the cultivar BR IPAGRO 44 Guapo Brilhante of P. vulgaris germinated in vases containing 8 L commercial substrate in a greenhouse at Porto Alegre city, Rio Grande do Sul State (RS), Brazil (latitude 30º03 S and longitude W). Average air temperatures ranged from 14 to 30 o C. In the flowering, closed flower buds were collected between 8 and 9 h and placed in plastic vials at room temperature. Subsequently, bracts were removed and two groups of bud length (2 and 4.5 mm) were selected under stereomicroscope. Bud length choice considered that 2 mm buds present a high microspores and uninucleated pollen proportion and 4.5 mm buds present a high mature (binucleated) pollen proportion according to Rodrigues et al. (2007). Androecium from 2 and 4.5 mm buds were excised and conserved separately by few minutes in a previously tested 90 g L -1 sucrose solution. Five anthers from the same bud were squashed in FDA work-solution and incubated at 26±1 o C in darkness by 35 min according to Heslop-Harrison & Heslop-Harrison (1970). Immediately, the others 5 anthers were squashed in ABL modified by Hauser & Morrison (1964). Microspores and uninucleated pollen (from 2 mm buds) and mature pollen (from 4.5 mm buds) stained by ABL were scored in brightfield at DM Leica microscope. In the same way, positive and negative fluorochromatic reaction to FDA was scored under fluorescence by means of filter set. Similar test was conducted with MTT according to Rodriguez-Riano & Dafni (2000) in order to compare stainability and fluorochromatic reaction to FDA. The statistical design was entirely randomized, in a factorial design (two bud lengths and two reactions) with eight repetitions by each combination of treatments and a mean of 120 observations per glass slide, totaling 3,837 observations. Normality test, equal variance test, parametric analysis of variance (Tukey 5%), correlation analysis and regression analysis were performed on the data. Statistical tests were performed in absolute numbers, but presented in percentage. Since reactions do not show nuclei morphology, it was necessary to confirm binucleated condition of pollen from 4.5 mm buds. Anthers from four 4.5 buds were excised and gently compressed in gelled drops of germination modified medium from Farlow et al. (1979) [1200 ppm Ca (NO 3 ) 2.4H 2 O; 0.1% yeast extract; 15% sucrose; 2% agar with ph adjusted to 7.3 with KOH] under glass slides on moistened absorbent paper inside 9 cm Petri dish. Material was incubated at 16±1 o C in darkness by 4 h and, subsequently, 100 ìl of 4-6-diamidino- Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p , 2010

58 Stainability and fluorochromatic reaction phenylindole (DAPI) work-solution (COLEMAN & GOFF, 1985) were dropped under germination medium. After covered by coverglass, nuclei and nucleoli morphology was immediately analyzed in fluorescence microscope by means of filter set. The test was repeated and similar trends were obtained. Usually high microspore viability in vivo is related to microsporogenesis regularity. However, viability can be drastically diminished along the isolating procedure and along the in vitro culture time (RODRIGUES et al., 2006; WIDHOLM, 1972). In plant cell culture, the more recommendable microspore viability assay is fluorochromatic reaction to FDA (WIDHOLM, 1972) because FDA reaction requires active esterases and implies that the integrity of the cell membrane of the vegetative cell is preserved. In this technique, viable microspore presents yellow green fluorescence (HESLOP-HARRISON & HESLOP- HARRISON, 1970) (Figure 1C). In many species, elevated percentages of fluorochromatic reaction to FDA were recorded in fresh microspores and pollen, also in isolated populations in vitro, like 60-80% in Malus domestica Borkh. (HÖFER et al., 1999) and 100% in Nicotiana tabacum L. (KYO & HARADA, 1986). In bean (Table 1), reaction to FDA were low, with a percentage mean of 18 and amplitude 1.4 to 35.7%. Therefore, the low reaction could not be attributed to high male sterility, since it was recorded few atypical events in microsporogenesis and microgametogenesis in the same plant material form bean cultivar BR IPAGRO 44 (RODRIGUES et al., 2007). This response to FDA is not exclusive of bean. In Glycine max (L.) Merr., 28 to 45% of the microspores and uninucleate pollen presented fluorochromatic reaction to FDA before isolation in liquid culture medium (RODRIGUES et al., 2006). Despite this, soybean also presents regular meiosis (LAUXEN et al., 2003). TABLE 1 Percentage of Phaseolus vulgaris microspores and pollen grains with positive reaction to fluorescein diacetate (FDA) and aniline blue in lactophenol (ABL). Factors Means Significance Percentage Tukey test Reaction to FDA 18 B <0.001 ABL 90 A Categories from 2 mm buds mm buds 56 - General mean 54 Coefficient of variation (%) Means for Reaction x Categories 2 mm buds 4.5 mm buds FDA ABL Different letters indicate significant differences at p<0.05 level by Tukey test. Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p , 2010

59 52 RODRIGUES, L. R. et al. The low response from these species, contrasting with the meiosis regularity, could be due to the incubation conditions required to viability assay. It is possible that the exposition time to the work-solution be hurtful to enzymatic activity and cell membrane integrity. Microspores and pollen may be damaged before expired the incubation time of 35 min. Others disadvantages of the FDA reaction were the instability of the work-solution and the variation on the optimum moment of fluorescein retention by cell membrane, both already pointed by Heslop-Harrison & Heslop-Harrison (1970). In ABL reaction, viable pollen turned blue while non-viable pollen remained uncolored (Figure 1A). In Cucumis sativus L., 93% of the microspores and 96% of the pollen reacted to ABL, while 87 and 93%, respectively, reacted to FDA (VIZINTIN & BOHANEC, 2004). In bean, the difference between FDA and ABL was higher, since 90% of the microspores and pollen reacted to ABL. Similar percentage was recorded in the same material fixed and carmine stained (RODRIGUES et al., 2007) in which 93% of the observations corresponded to carmine stained category. Empty sporoderms and plasmolized pollen were considered non-stained. So, it is possible that ABL also only detected protoplasm presence, like carmine stain, with the disadvantage that ABL reaction do not allows nuclei visibility (Figure 1B), therefore do not permit inferences about microsporogenesis and microgametogenesis stages. In Cucumis sativus, the advantage of MTT over FDA were the higher contrast between viable and nonviable pollen, a faster protocol offering a longer time interval for sample examination and the fluorescence disposal (VIZINTIN & BOHANEC, 2004). In bean microspores and pollen, MTT reaction was not successfully, probably because the three steps required to MTT reaction damaged microspores and pollen. According to Rodriguez-Riano & Dafni (2000) and Vizintin & Bohanec (2004), the sample is put in a drop of reagent and allowed to dry; the reaction is enhanced by gently heating; followed by the addition of glycerol to the dried sample. This sequence of steps (drying, heating and glycerol addition) kill the majority of the cells. Only a small number of microspores and pollen reacted to MTT, but presented bright red unsatisfactory reaction. MTT technique indicated to these species is not feasible in bean. Bean microspore and pollen susceptibility to temperature was previously recorded in different conditions (PORCH & JAHN, 2001; SUZUKI et al., 2001; VARA PRASAD, et al. 2002; WEAVER & TIMM, 1988). Due to its low longevity under high temperature, the salt concentration and the period of incubation can not be standardized to bean pollen. Fluorochromatic reaction to DAPI allowed characterization of the pollen nuclei morphology and confirmed the exclusive presence of mature pollen in 4.5 mm flower buds (Figure 1E). In vitro germination medium from Farlow et al. (1979) inducted pollen tube emission (Figure 1F) but were observed frequent bursting in tube up to 50 µm and sporoderm disrupting, indicating that the medium do not offered the stigmatic conditions, including inappropriate osmotic potential. To further studies in bean microspore and pollen germination, mainly to score germination percentages, osmolarity of the medium and of the DAPI work-solution must be adjusted. Microspore and pollen number with positive reaction to ABL and FDA presented normal distribution and equal variance. Parametric analysis of variance (Table 1) detected highly significant difference between reactions, but not between categories from the two bud lengths, indicating that viability assays in pollen are representative of the microspore condition. In correlation tests (Table 2), correlation coefficient between categories from 2 mm and 4.5 mm was positive and highly significant, confirming that viability assays in 2 mm buds are representative of the pollen mature condition recorded by analysis of variance. So it was possible to estimate bean microspore viability by means of the pollen viability. On the other side, correlation coefficient between FDA and ABL reactions was negative and significant, indicating that categories from the same buds reacted inversely to each technique. Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p , 2010

60 Stainability and fluorochromatic reaction TABLE 2 - Correlation coefficients (r) of number of Phaseolus vulgaris microspores and pollen grains with positive reaction to FDA and ABL (ns= non-significant). Data cluster Factors correlated r Significance Reaction to FDA 2 mm x 4.5 mm ns Reaction to ABL 2 mm x 4.5 mm ns Categories from 2 mm buds FDA x ABL ns Categories from 4.5 mm buds FDA x ABL ns Both reactions 2 mm x 4.5 mm % Both categories FDA x ABL % FIGURE 1 - Fresh microspores and pollen grains stainability to aniline blue in lactophenol (ABL) in brightfield (A, B) and fluorochromatic reaction to fluorescein diacetate (FDA) (C, D) and to 4-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (E, F) recorded in Phaseolus vulgaris L. A) Stained (black arrows) and non-stained (white arrow) pollen in ABL. B) Lack of organellar and nuclear contrast in pollen stained in ABL. C) Positive (black arrows) and negative (white arrow) fluorochromatic reaction to FDA. D) Non-fluorescent polarized vacuole (arrow) in uninucleated pollen. E) Vegetative (V) and generative (G) nuclei in typical binucleated mature pollen from 4.5 mm floral bud. F) In vitro germination of bean pollen. Only the nucleolus from vegetative nucleous is visible (arrow). All bars correspond to 30 µm. Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.6, n.1, p , 2010