Directigen Flu A+B For the Differentiated, Direct Detection of Influenza A and B Antigens

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1 Revisions Rev from Rev to ECO # SO Notes: 1. D Cat. Number lank (Sheet) Size : Length: 8.5 Width: 11 Number of Pages: 64 Number of Sheets: 16 Page Size: Length 8.5 Width 5.5 Final Folded Size: 8.5 x Style (see illustrations below): #5 #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 4. See Specification Control Number L006712J for Material Information 5. Ink Colors: Printed two sides X Yes No No. of Colors: 2 PMS# 284 lue, PMS# 254 Purple 6. Graphics are approved by ecton, Dickinson and Company. Supplier has the responsibility for using the most current approved revision level Label Design Date Proofer Date Checked y Date Part Number: L006712J ecton, Dickinson and Company 7 Loveton Circle Sparks, MD US Category and Description Sheet: 1 of 65 Package Insert, Directigen Flu & Scale: 1:1 COMPNY CONFIDENTL. THIS DOCUMENT IS THE PROPERTY OF ECTON, DICKINSON ND COMPNY ND IS NOT TO E USED OUTSIDE THE COMPNY WITHOUT WRITTEN PERMISSION

2 L006712J(0906)draft.qxd 10/11/2006 1:17 PM Page 1 Directigen Flu + For the Differentiated, Direct Detection of Influenza and ntigens English: pages 1 11 Italiano: pagine Français : pages Português: páginas Deutsch: Seiten Español: páginas 52 62! L006712J 2006/09 INTENDED USE The Directigen Flu + test is a rapid in vitro immunoassay membrane test for the direct and qualitative detection of influenza and viral antigens from nasopharyngeal wash, nasopharyngeal aspirate, nasopharyngeal swab, lower nasal swab, throat swab and bronchoalveolar lavage specimens of symptomatic patients. The Directigen Flu + test is a differentiated test, and therefore influenza viral antigens can be distinguished from influenza viral antigens in a single test. The test is to be used as an aid in the diagnosis of influenza and viral infections. ll negative test results should be confirmed by cell culture because negative results do not preclude influenza virus infection and should not be used as the sole basis for treatment or other management decisions. The Directigen Flu + test is not intended for detection of influenza C. SUMMRY ND EXPLNTION Influenza is an acute viral disease that is seasonal in incidence. The illness classically presents with sudden onset of fever, chills, headache, myalgias, and a non-productive cough. Clinical manifestations usually resolve within one week unless complications develop. Influenza or virus cause the majority of clinically significant disease, with influenza C virus being responsible only for mild, predominately upper respiratory tract illness. Patients who present with suspected influenza might benefit from treatment with antiviral agents. mantadine 1 and rimantadine 1 are available for both the prevention and treatment of influenza disease only. Zanamivir 1 and oseltamivir 1 are available for the treatment of both influenza and disease. In adults, therapy with these agents may reduce the severity and duration of illness if given within the first 48 h of onset of illness. Since the therapeutic options have expanded to include options for the treatment of influenza disease, it is important to rapidly distinguish influenza from influenza in order to allow physicians a choice in selective antiviral intervention. Moreover, since only amantadine and rimantadine have indications for influenza prophylaxis, it is important to determine if influenza is causing symptomatic disease in a particular institution (e.g., nursing home) or community, so that appropriate preventative intervention can be taken for susceptible individuals. It is therefore important to not only rapidly determine whether influenza is present, but also which type of influenza virus is present. Procedures used to diagnose influenza type and infections include rapid immunoassay, direct specimen immunofluorescence assay, reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), serologic assay, and culture isolation with confirmation. 2-8 Immunofluorescence assays entail staining of specimens immobilized on microscope slides using fluorescent-labeled antibodies for observation by fluorescence microscopy. 4,9,10 Culture methods employ initial viral isolation in cell culture, followed by hemadsorption inhibition, immunofluorescence, or neutralization assays to confirm the presence of the influenza virus The Directigen Flu + antigen detection test is an immunomembrane filter assay to detect influenza or antigens extracted from suitable specimens of symptomatic patients. Total test time is less than 15 min with reactivity determined by visual color development. ntigenic drift is not an issue with the Directigen Flu + test because the target antigens are the nucleoproteins, which are type-specific and are highly conserved The speed and workflow of Directigen Flu + make it applicable as a "STT" influenza and antigen detection test, providing rapid, relevant information to assist with the diagnosis of influenza. The use of Directigen Flu + to differentiate Flu from Flu infection can provide the opportunity for greater selectivity of antiviral intervention. PRINCIPLES OF THE PROCEDURE The Directigen Flu + test begins with the extraction of influenza or viral antigens from respiratory specimens. The extracted specimen is expelled through a filter assembly into each of two wells of a ColorPC test device. Influenza or antigens from viable or non-viable viral particles present in the specimen are non-specifically bound in a triangular shape to the membrane surface in the and wells as the specimen passes through the flow controller. Detection of antigen captured on the membrane is initiated after a membrane wash step. Monoclonal antibody conjugates (2) specific for influenza nucleoprotein antigen are added to the upper well of the test device. Monoclonal antibody conjugates specific for influenza nucleoprotein antigen is added to the lower well of the test device. The monoclonal antibody conjugates are bound to trapped antigen following their addition to the ColorPC membrane. The chromogen is then added after washing the membrane and allowed to incubate for five min. ddition of a reagent to stop further color development provides time during which results may be interpreted. Development of a purple triangle on the membrane in either the well or the well of the test device indicates a positive test for Flu or for Flu, respectively. Formation of a purple control dot only with no visible triangle formation indicates a negative test.

3 L006712J(0906)draft.qxd 10/11/2006 1:17 PM Page 2 KIT COMPONENTS ND REGENTS The following are included in the Directigen Flu + test kit. ColorPC Devices 20 Each device with flow controller unit, containing control dots of recombinant influenza (H1N1) and (Lee 40) antigens in the center of the respective and well membrane contained in a foil pouch with desiccant. Extraction Reagent E 9.9 ml Extraction, 1.6% mucolytic agent and 7.4 % detergents, with 0.2% sodium azide (preservative). Wash Reagent ml Wash, 50 mm Tris and rabbit IgG with 0.2% sodium azide (preservative). Detection Reagent ml Detection, anti-influenza monoclonal antibodies (mouse, clones 84 and 85)-alkaline phosphatase conjugate, with 0.2% sodium azide (preservative). Detection Reagent ml Detection, anti-influenza monoclonal antibody (mouse, clone.9)-alkaline phosphatase conjugate, with 0.2% sodium azide (preservative). Wash Reagent ml Wash, 5% butanol, 2 M urea and 100 mm Hepes with 0.2% sodium azide (preservative). Wash Reagent ml Wash, 50 mm Tris, 150 mm NaCl and 16 mm inhibitory agent with 0.2% sodium azide (preservative). Substrate Reagent ml Substrate, 0.73 mm chromogen. Stop Reagent ml Stop, 150 mm citric acid. Control +/- 2.0 ml Flu Positive and Flu Negative Control, influenza antigen (inactive recombinant nucleoprotein, H1N1) with 0.1% sodium azide (preservative). Control +/- 2.0 ml Flu Positive and Flu Negative Control, influenza antigen (inactive recombinant nucleoprotein, Lee 40) with 0.1% sodium azide (preservative). DispensTube Tubes 20 Tubes for specimen extraction and sample delivery into device. DispensTube Tips 20 Tips to filter sample when delivered into device. Warnings and Precautions: For in vitro Diagnostic Use. 1. If infection with a novel influenza virus is suspected based on current clinical and epidemiological screening criteria recommended by public health authorities, specimens should be collected with appropriate infection control precautions for novel virulent influenza viruses and sent to state or local health departments for testing. Viral culture should not be attempted in these cases unless a SL 3+ facility is available to receive and culture specimens. 2. Pathogenic microorganisms, including hepatitis viruses, Human Immunodeficiency Virus and novel influenza viruses, may be present in clinical specimens. Standard Precautions and institutional guidelines should be followed in handling, storing and disposing of all specimens and all items contaminated with blood and other body fluids. Prior to discarding, sterilize containers and other contaminated materials by autoclaving. 3. Differences in performance may be observed when this test is used on specimens from adults versus from children, but specific differences are not known. 4. Do not use reagents beyond the expiration date. 5. Do not mix reagents from different kit lot numbers or mix reagent bottle caps. 6. Do not reuse ColorPC device. Incubation times and temperatures other than those specified may give erroneous results. 7. Hold reagent bottles vertically (approximately one inch from the ColorPC membrane surface or tube), while gently dispensing one drop at a time, in quick succession to ensure proper drop delivery. 8. void contact of reagents with skin and mucous membranes. If reagents come into contact with these areas, flush with water and contact your physician. 9. Reagents contain sodium azide, which is harmful if inhaled, swallowed or in contact with skin. Contact with acids liberates very toxic gas. If there is contact with skin, wash immediately with plenty of water. Sodium azide may react with lead and copper plumbing to form highly explosive metal azides. On disposal, flush with a large volume of water to prevent azide build-up. 10. Use polyester or rayon-tipped swabs with an aluminum wire for nasopharyngeal swabs (NPS). It has been determined that calcium alginate swabs can not be used with Directigen Flu The Control +/- and Control +/- reagents have been prepared from recombinant cell cultures, not from viral cultures. Do not use the kit if the Control +/- and Control +/- reagents do not yield appropriate results. 12. Remove the ColorPC device from the foil pouch just prior to use. Do not use if desiccant is missing from pouch. Storage and Handling: Store at ambient or refrigerated temperatures (2-25ºC ). DO NOT FREEZE. SPECIMEN COLLECTION ND HNDLING Specimen Transport and Storage Transport fresh specimens to the laboratory as rapidly as possible in a suitable liquid transport system maintained on ice or refrigerated at 2 8 C. Process specimens as soon as possible after collection. If necessary, specimens may be stored at 2 8ºC for up to 72 h or at -20ºC for up to 7 days from time of collection. Fresh specimens are preferable to frozen, as decreased sensitivity may result. void multiple freeze-thaw cycles. Do not store specimens in selfdefrosting freezer. It is essential that correct specimen collection and preparation methods be followed. Do not centrifuge specimens prior to use with Directigen Flu +, as the removal of cellular material will adversely affect the sensitivity of the test. Specimens obtained early in the course of the illness will contain the highest virus titers. 2

4 L006712J(0906)draft.qxd 10/11/2006 1:17 PM Page 3 Transport Media: Use of the following transport media has been tested and found to be compatible with the Directigen Flu + test: Saline, Normal Sucrose phosphate Phosphate uffered Saline (PS) Trypticase Soy roth plus 0.5% S PS plus 0.5% gelatin Trypticase Soy roth plus 0.5% gelatin PS plus 0.5% ovine Serum lbumin (S) Earle's Minimum Essential Media (EMEM) Veal Infusion roth (VI) EMEM with 0.5% S VI plus 0.5% S EMEM with 1% S Viral Culturette EMEM with 0.5% Lactalbumin Hydrolysate M4 Medium EMEM with 1.0% Lactalbumin Hydrolysate M5 Medium Stuart s Medium CultureSwab (see "vailability") artels Medium Liquid mies Medium CultureSwab (see "vailability") Other transport media may be utilized if an appropriate qualification exercise is performed. s a precaution, all transport media should be qualified with Directigen Flu + prior to use. To qualify transport media, aliquots of media may be seeded with a known positive material (other than the kit Control +/ or Control +/-) and a known negative material, and tested with the assay. ppropriate results must be obtained. Specimen Collection and Preparation cceptable specimens include nasopharyngeal washes, nasopharyngeal aspirates, nasopharyngeal swabs, lower nasal (turbinate) swabs, throat swabs and bronchoalveolar lavages. Inadequate specimen collection, improper specimen handling and/or transport may yield a false negative result; therefore, training in specimen collection is highly recommended due to the importance of specimen quality to accurate test results. NOTE: Excessively mucoidal specimens may occasionally fail to be absorbed through the ColorPC membrane or may yield uninterpretable results. These specimens may either be diluted 1:4 with 0.9% saline or viral transport medium, or adjusted to a McFarland standard 1.0, mixed well, and a 200 µl aliquot retested. Procedure for use with Nasopharyngeal Washes and ronchoalveolar Lavages 1. Wash or lavage volumes of 2-3 ml are recommended. 2. Excessive wash or lavage volumes may result in decreased test sensitivity. 3. Process specimen as described in "Test Procedure." Procedure for use with Nasopharyngeal spirates 1. Nasopharyngeal aspirate specimens of less than 0.5 ml in volume must be dispersed in 2 ml of transport medium or saline prior to processing. 2. spirate specimens of greater than 0.5 ml require a transport medium or saline volume addition of greater than or equal to 4 ml. 3. Process specimen as described in "Test Procedure." Procedure for use with Nasopharyngeal, Lower Nasal, or Throat Swabs 1. Throat swab specimens may be processed without dilution in transport medium by direct extraction as described in "Test Procedure." Throat swabs may also be added to 1 2 ml of transport medium media or saline immediately after collection. 2. Nasopharyngeal and lower nasal swab specimens should be placed into 1 2 ml of transport medium or saline immediately after collection. 3. Mix the swab well in the transport medium or saline solution. 4. Remove as much liquid from the swab as possible. 5. Discard the swab into appropriate container. 6. Process specimen as described in "Test Procedure." PROCEDURES Materials Provided: See "Kit Components and Reagents" for materials provided. Materials Required ut Not Provided: The necessary equipment and labware for transport, storage, handling and allocation of specimens. Vortex mixer. Performance of Test: Review "WRNINGS ND PRECUTIONS," "SPECIMEN COLLECTION ND HNDLING" and "INTERPRETTION OF RESULTS." Reagents, specimens and ColorPC devices must be at room temperature (15 30 C) when used. TEST PROCEDURE Place a DispensTube in the designated area of the workstation.. ColorPC Device Preparation Remove a ColorPC device from its foil pouch immediately before use. Push down to ensure Flow Controller is seated snugly in both wells in the ColorPC device. 3

5 L006712J(0906)draft.qxd 10/11/2006 1:17 PM Page 4 E or E. Specimen Extraction ll samples, except throat swabs without transport media: Gently mix Reagent E, and dispense 8 drops of Reagent E into a DispensTube. Mix specimen well. Pipet 200 µl of specimen into the DispensTube. Throat swabs without transport media: Gently mix Reagent E, and dispense 16 drops of Reagent E into the DispensTube. Insert swab into DispensTube. Swirl swab while intermittently squeezing swab through the walls of the DispensTube for sec. Remove swab while squeezing to displace excess liquid. NOTE: Quality Control The Control +/- or Control +/- may be used in place of patient samples for quality control purposes. Dispense 8 drops of Reagent E into the DispensTube, followed by 4 drops of well-mixed Control +/- or Control +/-. Mix well. Follow Test Procedure to dispense extracted Control +/- in an alternating dropwise manner into both wells of a single test device. The Control +/- serves as the positive for control Flu as well as the negative control for Flu. Repeat procedure in a separate device with Control +/-. The Control +/- serves as the positive control for Flu as well as the negative control for Flu. Insert a DispensTube tip into the DispensTube. Vortex or mix thoroughly. NOTE: Do not use tips from other Directigen products. Invert the DispensTube and holding the tube on the upper half, away from the tip, gently squeeze. NOTE: Squeezing the tube close to the tip may result in ejection of the tip and leakage of contents from the tube. Dispense the extracted specimen dropwise (avoiding excess Drop bubble addition), alternating single drops between the and test wells until 4 drops have been added to each well of the ColorPC test device. Thus a total of 8 drops from each extracted specimen is added to a single test device. When testing extracted Controls, the extracted Control +/- must be added to both wells of a single ColorPC test device, and similarly, the extracted Control +/- must be added to both wells of a single ColorPC test device. llow specimen to absorb completely. If specimen fails to be absorbed into the device within five min, dilute as described in "Specimen Collection and Preparation" section and retest. C. Color Development Remove the Flow Controller. Discard as biohazard. 1 Reagent 1 - gently mix. dd 2 drops to each well. llow to absorb completely. 2 Reagent 2 - gently mix. dd 2 drops to the well only. Proceed immediately to Reagent 3 addition. 4

6 L006712J(0906)draft.qxd 10/11/2006 1:17 PM Page 5 3 Reagent 3 - gently mix. dd 2 drops to the well only. llow Reagents in and wells to absorb completely. llow to stand 2 min. 4 Reagent 4 - gently mix. dd 3 drops to each well. llow to absorb completely. 5 Reagent 5 - gently mix. dd 3 drops to each well. llow to absorb completely. 6 Reagent 6 - gently mix. dd 3 drops to each well. llow to absorb completely (NOTE: Membrane may turn yellow). llow to stand 5 min. 7 Reagent 7 gently mix. dd 2 drops to each well. llow to absorb completely. INTERPRETTION OF RESULTS Read the test in a well-lighted area and record the results. If necessary, the results may be read up to 9 h after adding Reagent 7 (Stop Reagent). positive result should be reported as positive for the presence of influenza and/or antigen. negative result should be reported as a presumptive negative for the presence of influenza / antigen. Positive Test for Flu (antigen present) - purple triangle (of any intensity) appears in the well on the ColorPC membrane and indicates influenza antigen was detectable in the specimen. This result does not identify any specific influenza virus subtype. The background area should be a light yellow to light purple color. purple control dot should be evident in the center of the triangle unless obscured by an intense positive reaction. Flu Positive Flu Negative Flu Positive Flu Negative Positive Test for Flu (antigen present) - purple triangle (of any intensity) appears in the well on the ColorPC membrane and indicates influenza antigen was detectable in the specimen. The background area should be a light yellow to light purple color. purple control dot should be evident in the center of the triangle unless obscured by an intense positive reaction. 5

7 L006712J(0906)draft.qxd 10/11/2006 1:17 PM Page 6 Negative Flu or Flu Negative Test for Flu or Flu (no antigen detected in the respective well or wells) - No purple triangle is visible in either the well, or the well, or both wells, indicating that influenza antigen, or influenza antigen, or both, were not detectable in the specimen. These results do not exclude influenza viral infection. purple control dot appears in either the well, the well, or in both wells on the ColorPC membrane indicating proper performance of test procedures and reagents. The background area should be a light yellow to light purple color. Uninterpretable Test - The test is uninterpretable either for Flu, or for Flu, or for both Flu and Flu, if neither a purple dot nor a purple triangle is visible in the respective well(s). ny incomplete triangle is also to be regarded as an uninterpretable test. If uninterpretable, the test should be repeated. The test result is also uninterpretable either for Flu, or for Flu, or for both Flu and Flu, if a white triangle appears on the ColorPC membrane and the entire surrounding background membrane is purple in color. muted control dot may be evident in the center of the white triangle. dditionally, the test result is Uninterpretable Flu and uninterpretable if the entire membrane area is purple and no control dot is observed. To correct these problems, dilute the sample 1:4 either in 0.9% saline or in transport media and repeat the test. Excessively mucoidal samples may fail to be absorbed through the ColorPC membrane or may yield uninterpretable results. These specimens may be diluted 1:4 with saline, mixed well, and retested. Quality Control: Each Directigen Flu + ColorPC device contains both internal positive and negative procedural controls. The appearance of a purple control dot in the and wells provides an internal positive procedural control that validates the immunological integrity of the device, proper reagent function, and assures that the correct test procedure was followed. Note: The control dot intensity may vary between and wells. The membrane area surrounding the triangle is the internal negative procedural control for the device. The lack of significant color development in this background area to obscure the triangle or control dot indicates that the test has been performed correctly. Liquid Positive Control +/- and Control +/- kit controls are also supplied with each kit. These controls are provided as a means of additional quality control to demonstrate a positive or negative reaction. t a minimum, the liquid controls should be run as a quality control procedure for each lot of each shipment received. The formation of a purple triangle on the membrane in the ColorPC device well when the Control +/- is tested, and in the device well when the Control +/- is employed, further indicate that the influenza antigen binding properties of the membrane are functional. The formation of only a purple control dot in the ColorPC device well when the Control +/- is employed is an appropriate Flu negative control result that indicates proper reagent function and that the correct test procedure was followed. Similarly, the formation of only a purple control dot in the well when the Control +/- is employed indicates an appropriate Flu negative control result. Do not use the kit if Control +/- and Control +/- do not give appropriate results. The liquid controls may also be used to demonstrate a low positive reaction. weaker positive reaction may be demonstrated by dilution of both Control +/- and Control +/- together into the same DispensTube (2 drops of Control +/- and 2 drops of Control +/- added to 10 drops of Extraction Reagent E). Performance of reagents and technique may also be evaluated by using specimens known to be positive or negative. Quality control requirements must be performed in accordance with applicable local, state and/or federal regulations or accreditation requirements and your laboratory's standard Quality Control procedures. It is recommended that the user refer to pertinent CLSI (formerly NCCLS) guidance and CLI regulations for appropriate Quality Control practices. LIMITTIONS OF THE PROCEDURE The etiology of respiratory infection caused by microorganisms other than influenza or viruses will not be established with this test. The Directigen Flu + test is capable of detecting both viable and non-viable influenza and virus particles. The Directigen Flu + test performance depends on antigen load and may not correlate with cell culture performed on the same specimen. Low levels of viral shedding may yield a false-negative result; therefore, a negative test result does not totally eliminate the possibility of an influenza, influenza, or both influenza and infection. s with all diagnostic procedures, the results obtained with the Directigen Flu + test should be used in conjunction with other clinical information available to the physician. Performance characteristics for influenza were established when influenza /H3 and /H1 were the predominant influenza viruses in circulation. When other influenza viruses are emerging, performance charcteristics may vary. Children tend to shed virus for longer periods of time than adults, which may result in differences in sensitivity between adults and children. Positive and negative predictive values are highly dependent on prevalence. False positive test results are more likely during periods of low influenza activity when prevalence is moderate to low. The validity of Directigen Flu + has not been proven for identification/confirmation of cell culture isolates and should not be utilized in this capacity. Performance of the test has not been established for monitoring antiviral treatment of influenza. EXPECTED VLUES The rate of positivity observed in influenza testing will vary depending on method of specimen collection, handling/transport system employed, detection method utilized, the time of year, age of the patient, geographic location, and most importantly, local disease prevalence. The prevalence of influenza varies from year to year. The prevalence in the past 3 years in the United States has ranged between 28 and 34%. 20 The incidence of influenza infection is more sporadic than influenza infection. In the 1999 through 2000 season in the U.S. the prevalence of influenza in those patients diagnosed with the flu was 99.6% as compared to a prevalence of 0.4% for influenza. 20 6

8 L006712J(0906)draft.qxd 10/11/2006 1:17 PM Page 7 ased on culture method, the prevalence observed in the U.S. during the clinical trial period for this product ranged between 0% to 33.9% for influenza and 0% to 16.2% for influenza. The average prevalence observed in the Directigen Flu + clinical trial study was 17.9% for influenza and 2.6% for influenza. PERFORMNCE CHRCTERISTICS The performance of the Directigen Flu + test was determined in a multi-center study conducted at six clinical centers and two physician office laboratories during the influenza season. The clinical centers were located in Canada, Hong Kong and geographically diverse areas in the United States. total of 1262 specimens, consisting of nasopharyngeal aspirate, nasopharyngeal wash, nasopharyngeal swab, lower nasal swab, nose/throat swab, throat swab, and bronchoalveolar lavage specimens from 1046 influenza symptomatic patients were evaluated with the Directigen Flu + test. t one clinical site, both nasopharyngeal swabs and lower nasal swabs were collected from each of 216 patients. The specimen populations included 58 frozen archived specimens consisting of preselected influenza positive, influenza positive and influenza / negative samples. Distribution of these frozen samples is designated for each data table provided below. The specimens evaluated in the study were collected and transported to the laboratory according to each laboratory s procedure. The following tests were performed on each specimen: Directigen Flu +, cell culture and direct specimen DF. ny remaining specimen was archived at or below -20ºC. Methods Cell Culture: For cell culture, a portion of the specimen was inoculated into Rhesus Monkey Kidney (RMK) or Madin- Darby Canine Kidney (MDCK) cells. Cells were examined for the appearance of cytopathic effects (CPE). Infected cells were confirmed for influenza or by direct fluorescent antibody (DF) staining. Specimens negative for CPE at fourteen days were stained for negative confirmation by DF. Direct Specimen DF: For direct specimen DF testing, a portion of each specimen was used to prepare a smear for examination by direct fluorescent antibody to influenza and. RT-PCR: RT-PCR was performed on all available specimens that were culture negative and direct specimen DF positive. In addition, a subset of specimens with other combinations of results was evaluated by RT-PCR. Clinical ccuracy For all specimens evaluated, the overall sensitivity of the Directigen Flu + test for influenza when compared to culture was 86.2% and for influenza was 80.8%. The overall specificity for influenza when compared to culture was 90.7% and for influenza was 99.5%. For influenza, there were 96 samples that were culture negative, Directigen positive. Direct specimen DF was positive for 77 of the 96 samples. RT-PCR was performed on 86 of the 96 specimens; a total of 78 specimens were positive by RT-PCR. The uninterpretable rate for the Directigen Flu + test was 0.08% for both influenza and influenza results. Nasopharyngeal spirates (NP): n=350 (one uninterpretable Directigen result is not included in the table nor in estimating performance characteristics) Cell Culture Results +/- -/+ -/- Directigen Flu + +/ * -/ ** -/ *Of the 26 specimens, 20/26 were positive by DF and 23/25 were positive by RT-PCR. **Of the 6 specimens, 6/6 were negative by DF and 5/5 were negative by RT-PCR. Nasopharyngeal Specimen (NP) includes: Nasopharyngeal Wash and/or Nasopharyngeal Swab n=512 Cell Culture Results +/- -/+ -/- Directigen Flu + +/ * -/+ 0 12** 0 -/- 13 5** 341 *Of the 41 specimens, 32/41 were positive by DF and 30/35 were positive by RT-PCR. ** Frozen (archived) specimens for influenza. Note: Of the 50 frozen archived specimens tested, 10/13 culture positive specimens were positive and 37/37 culture negative specimens were negative for influenza using the Directigen Flu + test. For influenza, 12/17 culture positive specimens were positive and 33/33 culture negative specimens were negative when tested with the Directigen Flu + test. Nose/Throat Specimens (NTS) include: Throat Swabs (TS) and /or Lower Nasal Swabs (LNS) n=389 Cell Culture Results +/- -/+ -/- Directigen Flu + +/ * -/ /- 17 1** 286 *Of the 29 specimens, 25/29 were positive by DF and 25/26 were positive by RT-PCR. **Frozen (archived) specimens for influenza. 95% C.I. Influenza Sensitivity 95.7% 44/ Specificity 91.4% 277/ Influenza Sensitivity 87.5% 28/ Specificity 98.1% 311/ % C.I. Influenza Sensitivity 88.5% 100/ Specificity 89.7% 358/ Influenza Sensitivity 70.6% 12/ Specificity 100% 495/ % C.I. Influenza Sensitivity 76.7% 56/ Specificity 90.8% 287/ Influenza Sensitivity 0.0% 0/ Specificity 100% 388/

9 L006712J(0906)draft.qxd 10/11/2006 1:17 PM Page 8 Note: Of the 5 frozen archived specimens tested, 3/3 culture positive specimens were positive and 2/2 culture negative specimens were negative for influenza using the Directigen Flu + test. For influenza, 0/1 culture positive specimens were positive and 4/4 culture negative specimens were negative when tested with the Directigen Flu + test. ronchoalveolar Lavage (L): n=11 95% C.I. Cell Culture Results +/- -/+ -/- Influenza Sensitivity N/** N/** N/** Specificity 100% 11/ Directigen Flu + +/ /+ 0 2* 0 Influenza Sensitivity 100% 2/ Specificity 100% 9/ / *Frozen (archived) specimens for influenza. **N/ = Not applicable Note: Of the 3 frozen archived specimens tested, 3/3 culture negative specimens were negative for influenza using the Directigen Flu + test. For influenza, 2/2 culture positive specimens were positive and 1/1 culture negative specimens were negative when tested with the Directigen Flu + test. Paired Specimen nalyses: t one clinical site, both nasopharyngeal swabs and lower nasal swabs were collected from each of 216 patients. ll of the specimens from this site were negative for influenza by both culture and the Directigen Flu + test. There were no statistically significant differences detected between specimen types for either the Directigen Flu + test or cell culture. Directigen Flu + nasopharyngeal swab + lower nasal swab % greement = 206/216 = 95.4% Cell Culture nasopharyngeal swab + lower nasal swab % greement = 200/216 = 92.6% nalytical Specificity and Cross-Reactivity The Directigen Flu + test was evaluated using a total of 90 microorganisms (58 bacteria, two yeasts and 30 viruses). acteria and yeast isolates were tested at concentrations of 10 7 to 10 8 CFU/mL. M. pneumoniae was tested at a concentration of > 10 8 CCU/mL. Viral isolates were tested at titers between 10 4 to TCID 50 /ml. Influenza C was tested at a titer of 1.6 X CEID 50 /ml. None of the microorganisms or viruses listed below gave a positive result in the Directigen Flu + test. Microorganism Panel cinetobacter baumannii Kingella kingae Prevotella oralis ctinobacillus suis Klebsiella pneumoniae Proteus mirabilis acteroides fragilis Lactobacillus casei Proteus vulgaris ordetella pertussis Lactobacillus fermentum Pseudomonas aeruginosa Candida albicans Lactobacillus plantarum Salmonella choleraesuis sub. minnesota Candida glabrata Legionella pneumophila Serratia marcescens Cardiobacterium hominis Listeria monocytogenes Staphylococcus aureus Chlamydia psittaci Moraxella catarrhalis Staphylococcus aureus-(cowen 1) Chlamydia trachomatis Mycobacterium avium Staphylococcus epidermidis Corynebacterium diphtheriae Mycobacterium intracellulare Streptococcus bovis II Group D Eikenella corrodens Mycobacterium tuberculosis Streptococcus mutans Enterococcus faecalis Mycoplasma orale Streptococcus oralis Enterococcus gallinarum Mycoplasma pneumoniae Streptococcus pneumoniae Escherichia coli Neisseria gonorrhoeae Streptococcus pyogenes Group Fusobacterium nucleatum Neisseria meningitidis Streptococcus sanguis Gardnerella vaginalis Neisseria mucosa Streptococcus sp. Group Haemophilus aphrophilus Neisseria sicca Streptococcus sp. Group C Haemophilus influenzae Neisseria subflava Streptococcus sp. Group F Haemophilus parainfluenzae Peptostreptococcus anaerobius Streptococcus sp. Group G Haemophilus paraphrophilus Porphyromonas asaccharolyticus Veillonella parvula 8

10 L006712J(0906)draft.qxd 10/11/2006 1:17 PM Page 9 Viral Panel denovirus Type 3 HSV Type 2 denovirus Type 5 Influenza C/Taylor/1233/47 denovirus Type 7 Measles virus Edmonston denovirus Type 18 Mumps virus Coronavirus Parainfluenza Type 1 Coxsackievirus Type 9 (Griggs) Parainfluenza Type 2 Coxsackievirus Type 5 (Faulkner) Parainfluenza Type 3 Coxsackievirus Type 6 (Schmitt) Rhinovirus Type 1 Coxsackievirus Type 21 (Kuykendall) Rhinovirus Type 2 Coxsackievirus Type 9 P.. (ozek) Rhinovirus Type 13 Cytomegalovirus D-169 Rhinovirus Type 16 Echovirus Type 2 Rhinovirus Type 37 Echovirus Type 3 RSV Echovirus Type 6 RSV HSV Type 1 VZV Interfering Substances The following substances were tested in the Directigen Flu + test and no interference was noted in the assay for any substance at the levels tested: whole blood (2%), 4 nasal sprays (25%), acetylsalicylic acid (20 mg/ml), 3 mouthwashes (25%), ibuprofen (10 mg/ml), oseltamivir (0.5 mg/ml), zanamivir (1 mg/ml), chlorpheniramine maleate (5 mg/ml), 4 throat drops (25%), guaifenesin (20 mg/ml), diphenhydramine hydrochloride (5 mg/ml), dextromethorphan hydrobromide (10 mg/ml), pseudoephedrine hydrochloride (20 mg/ml), acetaminophen (216 mg/ml), clemastine fumarate (0.35 mg/ml), phenylpropanolamine hydrochloride (20 mg/ml). nalytical Sensitivity The analytical sensitivity was established for a total of 13 influenza strains; 7 influenza and 6 influenza strains. Influenza Viral Strain Type Detection Limit (CEID 50 ) /PR/8/34 (H1N1) 8.2 X /FM/1/47 (H1N1) 5.9 X 10 2 /NWS/33 (H1N1) 1.6 X /Denver/1/57 (H1N1) 6.5 X 10 1 /Port Chalmers/1/73 (H3N2) 2.9 X 10 2 /Victoria/3/73 (H3N2) 3.3 X 10 4 /New Jersey/8/76 (H1N1) 2.1 X 10 2 /Lee/ X 10 6 /llen/ X 10 2 /Maryland/1/ X 10 1 /GL/1739/ X 10 3 /Taiwan/2/ X 10 2 /Hong Kong/5/ X

11 L006712J(0906)draft.qxd 10/11/2006 1:17 PM Page 10 Reactivity and Specificity of Influenza and Strains The Directigen Flu + test was evaluated using a panel of 62 influenza strains. ll of the human and animal influenza strains gave positive test results for Flu and negative test results for Flu. ll the human influenza strains gave positive test results for Flu and negative test results for Flu. ll known influenza hemagglutinin and neuraminidase subtypes are represented below. Influenza Virus Human Isolate Viral Type Influenza Virus Human Isolate Viral Type /PR/8/34 (H1N1) /Human/HongKong/481/97 (H5N1) 1/FM/1/47 (H1N1) /Human/HongKong/482/97 (H5N1) /NWS/33 (H1N1) /Human/HongKong/228156/97 (H5N1) 1/Denver/1/57 (H1N1) /Human/HongKong/229540/97 (H5N1) /New Jersey/8/76 (Hsw N1) (H1N1) /Human/HongKong/242095/97 (H5N1) /HongKong/9821/2000 (H1N1) /Human/HongKong/1073/99 (H9N2) /HongKong/2997/98 (H1N1) /Human/HongKong/1074/97 (H9N2) /HongKong/5405/2000 (H1N1) /Lee/40 /HongKong/6611/2000 (H1N1) /llen/45 /HongKong/15946/2000 (H1N1) /GL/1739/54 /HongKong/16051/2000 (H1N1) /Taiwan/2/62 /Port Chalmers/1/73 (H3N2) /Maryland/1/59 /Victoria/3/73 (H3N2) /HongKong/5/72 /HongKong/114313/2000 (H3N2) /Hong Kong/28637/2000 /HongKong/117393/2000 (H3N2) /Hong Kong/27254/2000 /HongKong/114591/2000 (H3N2) /Hong Kong/28636/2000 /HongKong/119563/2000 (H3N2) /Hong Kong/29130/2000 /HongKong/120277/2000 (H3N2) /Hong Kong/29276/2000 /Hong Kong/68012/2000 (H3N2) /Hong Kong/35952/2000 Influenza Virus nimal Isolate Viral Type Influenza Virus nimal Isolate Viral Type /Turkey/Kansas/4880/80 (H1N1) /Turkey/Ontario/6118/67 (H8N4) /sia/57 (H2N2) /Chicken/HongKong/G9/97 (H9N2) /Mallard/New York/6750/78 (H2N2) /Swine/HongKong/9/98 (H9N2) /swine/hongkong/5212/99 (H3N2) /Turkey/Wisconsin/66 (H9N2) /Turkey/England/69 (H3N2) /Quail/HongKong/G1/97 (H9N2) /Duck/HongKong/477/78 (H4N6) /Duck/HongKong/865/80 (H10N3) /Chicken/labama/75 (H4N8) /Chicken/Germany/N/49 (H10N7) /Turkey/Wisconsin/68 (H5N9) /Duck/Memphis/546/74 (H11N9) /Goose/HongKong/38/79 (H6N1) /Duck/lberta/60/76 (H12N5) /Turkey/Canada/63 (H6N8) /Gull/MD/704/77 (H13N6) /Turkey/Oregon/71 (H7N3) /Mallard/Gurjev/263/82 (H14N5) /Duck/HongKong/47/76 (H7N2) /Shearwater/W/2576/79 (H15N6) NOTE: Performance characteristics for detecting influenza virus from human specimens when non-/h3 and non- /H1 influenza virus subtypes are emerging as human pathogens have not been established. Reproducibility The reproducibility of the Directigen Flu + test was evaluated with a 20 sample panel that included two levels (low positive and high positive) of influenza, two levels (low positive and high positive) of influenza and negative controls. The low positive samples for both influenza and influenza were at or near the lowest visual detection limit for the Directigen Flu + test. The overall accuracy for the Directigen Flu + test was 95% for influenza and 98% for influenza. Physician Office Laboratory (POL) Reproducibility n evaluation of the Directigen Flu + test was conducted by five people at three POL sites with the same 20 sample panel described in previous reproducibility section. Two technologists, a phlebotomist, a receptionist and a medical assistant conducted the actual testing. The panel was evaluated on three successive days. The overall accuracy was 93% for influenza and 92% for influenza. VILILITY Cat. No. Description Directigen Flu + (Influenza and virus) kit, 20 Determinations L CultureSwab, Single Swab, Liquid Stuart, package of L CultureSwab, Single Swab, Liquid mies, package of 50. REFERENCES 1. Walsh, Paul, et al Physician s Desk Reference, Medical Economics Company, Inc., Montvale, NJ. 2. Kaiser, L., Couch, R.., Galasso, G.J., Glezen, W.P., Webster, R.G., Wright, P.F., and Hayden, F.G First international symposium on influenza and other respiratory viruses: summary and overview Kapalua, Maui, Hawaii, December 4-6, ntiviral Res., 42: Cox, N.J., and ender, C The molecular epidemiology of influenza viruses. Virology, 6: Todd, S.J., Minnich, L., and Waner, J.L Comparison of rapid immunofluorescence procedure with TestPack RSV and Directigen Flu for diagnosis of respiratory syncytial virus and influenza virus. J. Clin. Microbiol. 33:

12 L006712J(0906)draft.qxd 10/11/2006 1:17 PM Page McElhaney, J.E., Gravenstein, S., Krause, P., Hooton, J.W., Upshaw, C.M., and Drinka, P ssessment of markers of the cell-mediated immune response after influenza virus infection in frail older adults. Clin. Diag. Lab. Immunol. 5: Fan, J., Henrickson, K.J., and Savatski, L.L Rapid simultaneous diagnosis of infections with respiratory syncytial viruses and, influenza viruses and, and human parainfluenza virus types 1, 2, and 3 by multiplex quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction-hybridization assay (hexaplex). Clin. Infect. Diseases 26: Wright, K.E., Wilson, G..R., Novosad, D., Dimock, C., Tan, D., and Weber, J.M Typing and subtyping of influenza viruses in clinical samples by PCR. J. Clin. Microbiol. 33: Kendal,.P Influenza viruses. p In H. Lennette, (ed.), Laboratory Diagnosis of Viral Infections. Marcel Dekker, Inc., New York. 9. McQuillen, J., Madeley, C.R., and Kendal,.P Monoclonal antibodies for the rapid diagnosis of influenza and virus infections by immunofluorescence. Lancet. ii: Guenthner, S. H., and Linnemann, C.C., Jr Indirect immunofluorescence assay for rapid diagnosis of influenza virus. Laboratory Medicine 19: Minnick, L.L., and Ray, C.G Early testing of cell cultures for detection of hemadsorbing viruses. J. Clin. Microbiol. 25: Schmidt, N.J., Ota, M., Gallo, D., and Fox, V.L Monoclonal antibodies for rapid, strain specific identification of influenza virus isolates. J. Clin. Microbiol. 16: Shu, L.L., ean, W.J., and Webster, R.G nalysis of the evolution and variation of the human influenza virus nucleoprotein gene from 1933 to J. Virol. 67: Dowdle, W.R., Kendal,.P., and Noble, G.R Influenza Virus, p In Lennette, et. al. (ed.), Manual of Clinical Microbiology, 3rd ed., merican Society for Microbiology, Washington, D.C. 15. Kendal,.P., and Dowdle, W.R Influenza Virus, p In Lennette et. al. (ed.), Manual of Clinical Laboratory Immunology, 3rd ed., merican Society for Microbiology, Washington, D.C National Committee for Clinical Laboratory Standards pproved Guideline M29-2. Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections, 2nd ed. NCCLS, Wayne, Pa. 17. Garner, J.S Hospital Infection Control Practices dvisory Committee, U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention. Guideline for isolation precautions in hospitals. Infect. Control Hospital Epidemiol. 17: U.S. Department of Health and Human Services iosafety in microbiological and biomedical laboratories, HHS Publication (CDC) 4 th ed. U.S. Government Printing Office, Washington, D.C. 19. Directive 2000/54/EC of the European Parliament and of the Council of 18 September 2000 on the protection of workers from risks related to exposure to biological agents at work (seventh individual directive within the meaning of rticle 16(1) of Directive 89/31/EEC). Official Journal L262, 17/10/2000, p Covalciuc K., Webb K., and Carlson C Comparison of four clinical specimen types for detection of influenza and virus by optical immunoassay (FLU OI TEST) and cell culture methods. J.Clin. Microbiol. 37: Directigen Flu + Pour la détection directe et différenciée des antigènes de l'influenza de type et Français INDICTIONS Le test Directigen Flu + est un immuno-essai enzymatique in vitro rapide (EI) sur membrane pour la détection directe et qualitative d'antigènes du virus influenza de type et à partir d'échantillons de lavages rhinopharyngés, d'aspirations rhinopharyngées, d'écouvillonnages rhinopharyngés, d'écouvillonnages du cornet inférieur, d'écouvillonnages pharyngés et de lavages broncho-pulmonaire de patients symptomatiques. Le test Directigen Flu + est un test différentiel, et par conséquent les antigènes du virus influenza de type peuvent être distingués de ceux du virus influenza de type dans un seul test. Le test doit être utilisé comme outil d'aide au diagnostic des infections à virus influenza de type et. Tous les résultats négatifs doivent être confirmés par la culture sur cellules parce que les résultats négatifs n'excluent pas une infection par un virus influenza et ils ne doivent pas être utilisés comme seuls fondements du traitement ou autres décisions de gestion. Le test Directigen Flu + n'est pas conçu pour la détection de l'influenza de type C. RESUME ET EXPLICTION L'influenza est une maladie virale aiguë dont l'incidence est saisonnière. Les symptômes classiques de la maladie sont un soudain début de fièvre, des frissons, une céphalée, des myalgies et une toux non productive. Les manifestations cliniques se dissipent au bout d'une semaine généralement à moins que des complications n'apparaissent. Le virus influenza de type ou provoque la majorité des symptômes significatifs sur le plan clinique, alors que le virus influenza de type C n'est responsable que d'une infection modérée, concernant principalement les voies respiratoires supérieures. Les patients chez lesquels on suspecte une influenza peuvent bénéficier d'un traitement par antiviraux. L'amantadine et la rimantadine sont disponibles pour la prévention et le traitement de l'influenza de type seulement. Le zanamivir et l'oseltamivir sont disponibles pour le traitement de l'influenza de type et de type. Chez les adultes, un traitement par agents cités en second peut réduire la gravité et la durée de la maladie s'ils sont administrés durant les premières 48 h après le début de la maladie. Etant donné que les choix thérapeutiques se sont élargis et comprennent des options pour le traitement de l'influenza de type, il est important de distinguer rapidement l'influenza de type de l'influenza de type afin de permettre aux médecins de choisir le traitement 11

13 L006712J(0906)draft.qxd 10/11/2006 1:17 PM Page 12 antiviral approprié. De plus, étant donné que seules l'amantadine et la rimantadine ont des indications pour la prophylaxie de l'influenza, il est important de déterminer si l'influenza de type provoque une maladie symptomatique dans un établissement de soins (par exemple un service hospitalier de long séjour) ou une communauté particuliers, de sorte que des mesures préventives appropriées soient prises pour les individus sensibles. Il est par conséquent important non seulement de déterminer rapidement la présence ou non d'une influenza, mais également le type de virus influenza présent. Les méthodes utilisées pour diagnostiquer des infections à influenza de type et comprennent un immunodosage rapide, un dosage immunofluorescent direct de l'échantillon, une amplification en chaîne par polymérasetranscriptase inverse (RT-PCR), un dosage sérologique et un isolement en culture suivi d'une confirmation. 2-8 Les dosages immunofluorescents consistent en une coloration des échantillons immobilisés sous lames de microscope à l'aide d'anticorps marqués par fluorescence pour une observation sous microscopie fluorescente. 4,9,10 Les méthodes en culture utilisent initialement un isolement du virus à partir de cultures cellulaires, suivi de tests d'inhibition de la résorption sanguine, de l'immunofluorescence, ou de neutralisation pour confirmer la présence du virus influenza Le test de détection antigénique Directigen Flu + utilise une technique d'immunoenzymologie sur membrane pour détecter les antigènes de l'influenza de type ou extraits d'échantillons appropriés provenant de patients symptomatiques. La durée totale de réalisation du test est inférieure à 15 min, la réactivité étant déterminée par le développement d'une coloration visible à l'œil nu. Les antigènes cibles du test Directigen Flu + sont des nucléoprotéines spécifiques du type et très stables, ce qui élimine les problèmes de dérive antigénique La rapidité et la facilité d'utilisation du Directigen Flu + le rendent utilisable comme test de détection en urgence des antigènes de l'influenza de type et, fournissant une information rapide et pertinente d'aide au diagnostic de l'influenza. L'utilisation du Directigen Flu + pour différencier une infection à Flu d'une infection à Flu peut offrir l'opportunité d'être plus sélectif dans le choix des interventions antivirales. PRINCIPES DE L METHODE Le test Directigen Flu + commence par le prélèvement d'antigènes du virus influenza de type ou au niveau des voies respiratoires. L'échantillon prélevé est envoyé à travers un filtre dans chacun des deux puits d'un support de réaction ColorPC. Les antigènes de l'influenza de type ou provenant de particules virales viables ou non viables présentes dans l'échantillon se lient d'une manière non spécifique sous forme triangulaire à la surface de la membrane dans les puits et lorsque l'échantillon traverse le régulateur de débit. La détection d'un antigène capturé sur la membrane commence après une procédure de lavage de la membrane. Les conjugués d anticorps monoclonaux (2) spécifiques de l antigène de nucléoprotéine d influenza sont ajoutés au niveau supérieur du dispositif de test. Les conjugués d anticorps monoclonaux spécifiques de l antigène de nucléoprotéine d influenza sont ajoutés au puit inférieur du dispositif de test. Les anticorps monoclonaux conjugués sont liés à l antigène piégé la membrane du ColorPC. Le chromogène est alors ajouté après lavage de la membrane et incubé pendant cinq minutes. L'ajout d'un réactif destiné à stopper le développement d'une coloration laisse du temps que l'on peut consacrer à interpréter les résultats. L'apparition d'un triangle violet sur la membrane du puits ou du support de réaction indique un résultat positif pour Flu ou Flu, respectivement. La formation d'un point de contrôle violet uniquement sans aucune formation de triangle visible indique un résultat négatif. ELEMENTS ET RECTIFS DE L TROUSSE La trousse de test Directigen Flu + comprend : Supports d'analyse ColorPC 20 par trousse Chaque support d'analyse avec régulateur de débit, comprenant des points de contrôle constitués par les antigènes de l'influenza de type (H1N1) et de type (Lee 40) recombinants au centre de la membrane des puits et respectifs sont contenus dans une poche en aluminium avec un dessiccatif. Réactif E d'extraction 9,9 ml Extraction. 1,6 % d'agent mucolytique et 7,4 % de détergent, avec 0,2 % d'azoture de sodium (agent conservateur). Réactif 1 de lavage 5,1 ml Lavage. Solution Tris (50 mm) et IgG de lapin avec 0,2 % d'azoture de sodium (agent conservateur). Réactif 2 de détection 2,3 ml Détection. Phosphatase alcaline à des (souris, clones 84 et 85) spécifiques de l'influenza de type, avec 0,2 % d'azoture de sodium (agent conservateur). Réactif 3 de détection 2,3 ml Détection. Phosphatase alcaline conjuguée à des anticorps monoclonaux (souris, clone.9) spécifiques de l'influenza de type, avec 0,2 % d'azoture de sodium (agent conservateur). Réactif 4 de lavage 6,5 ml Lavage. utanol (5%), urée (2 M) et Hepes (100 mm), avec 0,2 % d'azoture de sodium (agent conservateur). Réactif 5 de lavage 10,5 ml Lavage. Tris (50 mm) et NaCl (150 mm) et agent inhibiteur (16 mm) contenant 0,2 % d'azide de sodium (agent conservateur). Réactif 6 pour substrat 5,8 ml Substrat. Chromogène (0,73 mm). Réactif 7 d'arrêt 4,1 ml Solution d'arrêt. cide citrique (150 mm). Contrôle +/ 2,0 ml Contrôle positif pour Flu et contrôle négatif pour Flu. ntigène de l'influenza de type (nucléoprotéine recombinante inactive, H1N1) avec 0,1 % d'azoture de sodium (agent conservateur). Contrôle +/ 2,0 ml Contrôle positif pour Flu et contrôle négatif pour Flu. ntigène de l'influenza de type (nucléoprotéine recombinante inactive, Lee 40) avec 0,1 % d'azoture de sodium (agent conservateur). Tubes DispensTube 20 par trousse Tubes servant au prélèvement et à la distribution d'échantillons dans le support d'analyse. Embouts DispensTube 20 par trousse Embouts servant à filtrer l'échantillon lorsqu'il est distribué dans le support d'analyse. 12

14 L006712J(0906)draft.qxd 10/11/2006 1:17 PM Page 13 vertissements et précautions : pour le diagnostic in vitro. 1. Si, sur la base des critères actuels cliniques et de dépistage épidémiologique recommandés par les autorités de santé publique, on soupçonne une infection avec un nouveau virus influenza de type, on doit prélever des échantillons en prenant les précautions de contrôle de l'infection appropriées pour des nouvelles races de virus influenza virulentes et les envoyer aux laboratoires de dépistage nationaux ou locaux pour des tests de confirmation. Dans de tels cas, une culture virale ne doit pas être tentée à moins de disposer d'une unité SL 3+ pour recevoir et mettre en culture les échantillons. 2. Des micro-organismes pathogènes, notamment les virus de l'hépatite, de l'immunodéficience humaine et des nouveaux virus influenza, sont susceptibles d'être présents dans les échantillons cliniques. Respecter les «Précautions standard» et les consignes en vigueur dans l'établissement pour manipuler, conserver et éliminer tout échantillon et tout objet contaminé avec du sang ou d'autres liquides organiques. vant de les jeter, stériliser à l'autoclave tous les récipients ainsi que tout le matériel contaminé. 3. Des différences de performance peuvent être observées lorsque ce test est utilisé sur des échantillons prélevés sur des adultes par rapport à ceux prélevés sur des enfants mais les différences spécifiques sont inconnues. 4. Ne pas utiliser les réactifs au-delà de la date de péremption. 5. Ne pas mélanger des réactifs provenant de trousses portant des numéros de lot différents, ni mélanger les capuchons des flacons de réactifs. 6. Ne pas réutiliser le dispositif ColorPC. Une durée ou une température d'incubation autre que celle indiquée peut donner des résultats erronés. 7. Pour une bonne distribution des réactifs, tenir les flacons de réactifs verticalement (à environ 2,5 cm du tube ou de la surface de la membrane ColorPC) et faire tomber rapidement les gouttes une à une. 8. Eviter tout contact des réactifs avec la peau et les muqueuses. En cas de contact, rincer abondamment à l'eau et consulter un médecin. 9. Les réactifs contiennent de l'azide de sodium qui est nocif en cas d'inhalation, d'ingestion ou de contact dermique. u contact d'un acide, un gaz très toxique est dégagé. En cas de contact avec la peau, laver immédiatement à grande eau. L'azide de sodium peut réagir au contact du plomb ou du cuivre des canalisations et former des azides métalliques très explosifs. Lors de l'élimination, faire couler un volume d'eau important pour éviter l'accumulation d'azides. 10. Utiliser des écouvillons à embout en polyester ou en rayonne muni d'un fil d'aluminium pour les écouvillonnages rhinopharyngés (NPS). Il a été déterminé que les écouvillons en alginate de calcium ne pouvaient pas être utilisés avec Directigen Flu Les réactifs de contrôle, Contrôle +/- et Contrôle +/-, ont été préparés à partir de cultures de cellules recombinantes et non de cultures virales. Ne pas utiliser la trousse si les réactifs de contrôle, Contrôle +/- et Contrôle +/-, ne donnent pas les résultats escomptés. 12. Ne sortir le dispositif ColorPC de sa poche en aluminium qu'au moment de l'utilisation. Ne pas utiliser s'il n'y a pas de dessicateur dans la poche. Conservation et manipulation : conserver à température ambiante ou de réfrigération (2 25 ºC). NE PS CONGELER. PRELEVEMENT ET MNIPULTION DES ECHNTILLONS Transport et conservation des échantillons : Transporter les échantillons frais au laboratoire aussi rapidement que possible dans un milieu de transport liquide adéquat maintenu dans de la glace ou à une température de réfrigération entre 2 et 8 C. Traiter les échantillons aussitôt que possible après le prélèvement. Si nécessaire, les échantillons peuvent être conservés à 2 8 ºC pendant au plus 72 h ou à -20 ºC pendant au plus 7 jours à compter de la date du prélèvement. Des échantillons frais sont préférables aux échantillons congelés qui peuvent entraîner une baisse de la sensibilité à la réaction. Eviter les cycles de congélation-décongélation répétés. Ne pas conserver les échantillons dans un congélateur à dégivrage automatique. Il est important d'utiliser des méthodes correctes de prélèvement et de préparation des échantillons. Ne pas centrifuger les échantillons avant utilisation avec le Directigen Flu +, la perte de matériel cellulaire risquant de diminuer la sensibilité du test. Les échantillons obtenus au début de la maladie contiendront la concentration de virus la plus élevée. Milieu de transport : les milieux de transport suivants ont été analysés et se sont révélés compatibles avec le test Directigen Flu + : Sérum physiologique normal ouillon de soja Trypticase plus 0,5 % de S Tampon phosphate salin (PS) ouillon de soja Trypticase plus 0,5 % de gélatine PS plus 0,5 % de gélatine Earle s Minimum Essential Media (EMEM) PS plus 0,5 % de sérum albumine bovine (S) EMEM avec 0,5 % de S ouillon d'infusion de veau (VI) EMEM avec 1 % de S VI plus 0,5 % de S EMEM avec 0,5 % d'hydrolysat de lactalbumine Viral Culturette EMEM avec 1,0 % d'hydrolysat de lactalbumine Milieu M4 Milieu de Stuart CultureSwab (voir "Matériel disponible") Milieu M5 Milieu liquide mies CultureSwab (voir "Matériel disponible") Milieu de artels Phosphate de saccharose D'autres milieux de transport peuvent être utilisés si une validation appropriée est réalisée. Par mesure de précaution, tous les milieux de transport devront être validés avec le test Directigen Flu + avant utilisation. Pour valider un milieu de transport, le milieu peut être ensemencé avec des échantillons positifs connus (autres que le 13

15 L006712J(0906)draft.qxd 10/11/2006 1:18 PM Page 14 Contrôle +/ ou le Contrôle +/ de la trousse) ou négatifs connus et testé. Des résultats appropriés doivent être obtenus. Prélèvement et préparation des échantillons Les types d'échantillons appropriés comprennent les lavages, les aspirations et les écouvillonnages rhinopharyngés, les écouvillonnages du cornet inférieur, les écouvillonnages pharyngés et les lavages broncho-pulmonaires. Un faux négatif risque d'être obtenu si le prélèvement, la manipulation ou le transport des échantillons a été mal effectué ; par conséquent compte tenu de l'importance de la qualité des échantillons sur l'exactitude des résultats du test, une formation au prélèvement des échantillons est fortement recommandée. REMRQUE : des échantillons excessivement muqueux peuvent occasionnellement ne pas être absorbés par la membrane du ColorPC ou entraîner des résultats impossibles à interpréter. Ces échantillons peuvent soit être dilués au quart (1:4) dans du sérum physiologique à 0,9 % ou dans un milieu de transport viral, soit ajustés au standard McFarland 1,0, puis bien mélangés et analysés de nouveau (aliquot de 200 µl). Procédure à suivre pour les lavages rhinopharyngés et broncho-pulmonaires 1. Il est recommandé d'utiliser des volumes de lavage de 2 3 ml. 2. Des volumes de lavage excessifs entraînent une baisse de sensibilité de la réaction. 3. Traiter l'échantillon comme décrit dans la section "Procédure de test". Procédure à suivre pour les aspirations rhinopharyngées 1. Les échantillons d'aspirations rhinopharyngées d'un volume inférieur à 0,5 ml doivent être mis en suspension dans 2 ml d'un milieu de transport ou d'un sérum physiologique avant traitement. 2. Les échantillons d'aspirations supérieurs à 0,5 ml nécessitent l'ajout d'un volume supérieur ou égal à 4 ml de milieu de transport ou de sérum physiologique. 3. Traiter l'échantillon comme décrit dans la section "Procédure de test". Procédure à suivre pour les écouvillonnages rhinopharyngés, pharyngés ou du cornet inférieur 1. Les échantillons d'écouvillonnages pharyngés peuvent être traités sans dilution dans un milieu de transport par prélèvement direct, comme décrit dans la section "Procédure de test". Les écouvillonnages pharyngés peuvent également être ajoutés à 1 2 ml de milieux de transport ou de sérum physiologique après leur prélèvement. 2. Les échantillons d'écouvillonnages rhinopharyngés et du cornet inférieur devront être ajoutés à 1 2 ml de milieu de transport ou de sérum physiologique après leur prélèvement. 3. ien agiter l'écouvillon dans le milieu de transport ou le sérum physiologique. 4. Extraire autant de liquide que possible de l'écouvillon. 5. Jeter l'écouvillon dans un récipient approprié. 6. Traiter l'échantillon comme décrit dans la section "Procédure de test". MÉTHODES Matériel fourni : voir la section "Eléments et réactifs de la trousse" pour le matériel fourni. Matériel requis mais non fourni : equipement et matériel de laboratoire utilisés pour le transport, la conservation, la manipulation et la répartition des échantillons. Mélangeur vortex. Exécution du test : revoir les sections "VERTISSEMENTS ET PRECUTIONS", "PRELEVEMENT ET MNIPULTION DES ECHNTILLONS" et "INTERPRETTION DES RESULTTS". Les réactifs, les échantillons et les supports d'analyse ColorPC doivent être à température ambiante (15 30 C) lors de leur utilisation. PROCEDURE DE TEST Placer un DispensTube dans le compartiment désigné du poste de travail.. Préparation du support d'analyse ColorPC Sortir un support d'analyse ColorPC de la poche en aluminium avant utilisation. ppuyer pour s'assurer que le régulateur de débit est bien fixé dans les deux puits au support d'analyse ColorPC.. Extraction de l'échantillon Pour tous les échantillons excepté pour les écouvillonnages pharyngés sans milieux de E ou E transport : Mélanger soigneusement le Réactif E et déposer 8 gouttes de Réactif E dans le DispensTube. ien mélanger l'échantillon. Prélever par pipette 200 µl de l'échantillon dans le DispensTube. Les écouvillonnages pharyngés sans milieux de transport : mélanger soigneusement le Réactif E et déposer 16 gouttes de Réactif E dans le DispensTube. Insérer l'écouvillon dans le DispensTube. Faire tourbillonner l'écouvillon tout en le pressant par intermittence à travers les parois du DispensTube pendant sec. Retirer l'écouvillon tout en le pressant pour refouler l'excès de liquide. 14

16 L006712J(0906)draft.qxd 10/11/2006 1:18 PM Page 15 REMRQUE : contrôle de qualité Le Contrôle +/ ou le Contrôle +/ peut être utilisé à la place des échantillons de patients pour la réalisation des contrôles de qualité. Déposer 8 gouttes de Réactif E dans le DispensTube, puis 4 gouttes de Contrôle +/ ou de Contrôle +/ bien mélangé. ien mélanger. Suivre la Procédure de test pour verser le Contrôle +/ extrait, goutte à goutte et en alternant, dans les deux puits d'un dispositif pour test unique. Le Contrôle +/ sert de contrôle positif pour le Flu et de contrôle négatif pour le Flu. Répéter la procédure, avec un autre dispositif, en utilisant le Contrôle +/. Le Contrôle +/ sert de contrôle positif pour le Flu et de contrôle négatif pour le Flu. Insérer un embout du DispensTube sur le dispositif DispensTube. giter au vortex ou bien mélanger. REMRQUE : ne pas utiliser les embouts provenant de différents produits Directigen. Retourner le DispensTube et maintenir le tube par sa partie supérieure, à distance de l'embout, et presser doucement. REMRQUE : si le tube est pressé à proximité de l'embout, ce dernier peut s'éjecter et il peut se produire une fuite du contenu du tube. Verser l'échantillon extrait, goutte à goutte (en évitant Gouttes l'addition excessive de bulles), en alternant les gouttes entre les puits d'analyse and jusqu'à ce que 4 gouttes aient été déposées dans chacun des puits du support d'analyse ColorPC u total, 8 gouttes provenant de chaque échantillon extrait sont donc déposées dans un seul support d'analyse. Lors de l'analyse des Contrôles extraits, le Contrôle +/ extrait doit être ajouté aux deux puits d'un seul support d'analyse ColorPC, et de même, le Contrôle +/ extrait doit être ajouté aux deux puits d'un seul support d'analyse ColorPC. ttendre l'absorption complète de l'échantillon. Si l'échantillon n'est pas absorbé dans les cinq min, le diluer comme indiqué au paragraphe "Prélèvement et préparation des échantillons" et effectuer un nouveau test. C. Développement de la coloration Retirer le régulateur de débit. Le jeter en le traitant comme un élément de risque biologique. 1 Réactif 1 Mélanger doucement. Déposer 2 gouttes dans chaque puits. ttendre l'absorption complète. 2 Réactif 2 Mélanger doucement. Déposer 2 gouttes dans le puits seulement. Procéder immédiatement à l'ajout du Réactif 3. 3 Réactif 3 Mélanger doucement. Déposer 2 gouttes dans le puits seulement. ttendre l'absorption complète des Réactifs dans les puits et. ttendre 2 min. 15

17 L006712J(0906)draft.qxd 10/11/2006 1:18 PM Page 16 4 Réactif 4 Mélanger doucement. Déposer 3 gouttes dans chaque puits. ttendre l'absorption complète. 5 Réactif 5 Mélanger doucement. Déposer 3 gouttes dans chaque puits. ttendre l'absorption complète. 6 Réactif 6 Mélanger doucement. Déposer 3 gouttes dans chaque puits. ttendre l'absorption complète (REMRQUE : La membrane peut devenir jaune). ttendre 5 min. 7 Réactif 7 Mélanger doucement. Déposer 2 gouttes dans chaque puits. ttendre l'absorption complète. INTERPRETTION DES RESULTTS Lire les analyses dans une zone bien éclairée et enregistrer les résultats. Si nécessaire, les résultats peuvent être lus jusqu'à 9 h après l'ajout du Réactif 7 (Réactif d'arrêt). Un résultat positif doit être rapporté comme positif pour mettre en évidence la présence de l antigène de l influenza et/ou. Un résultat négatif doit être rapporté comme présumé négatif pour mettre en évidence la présence de l antigène de l infuenza /. Test positif pour Flu (antigène présent) Un triangle violet (quelle qu'en soit l'intensité) Test positif pour Flu apparaî t dans le puits de la membrane du ColorPC et indique que l'antigène de l'influenza de type a été détecté dans l'échantillon. Ce résultat n'identifie aucun sous type spécifique de virus influenza. Le fond devra être de couleur jaune clair à violet clair. Un point de contrôle violet devrait pouvoir être observé au centre du triangle sauf s'il est masqué par une réaction positive intense. Test positif pour Flu (antigène présent) Un triangle violet (quelle qu'en soit l'intensité) apparaî t dans le puits de la membrane ColorPC et indique que l'antigène de l'influenza de type a été détecté dans l'échantillon. Le fond devra être de couleur jaune clair à violet clair. Un point de contrôle violet devrait pouvoir être observé au centre du triangle sauf s'il est masqué par une réaction positive intense. Test positif pour Flu Test négatif pour Flu ou Flu Test négatif pour Flu ou Flu (aucun antigène détecté dans le ou les puits respectifs) ucun triangle violet n'est visible ni dans le puits, ni dans le puits, indiquant que l'antigène de l'influenza de type, ou l'antigène de l'influenza de type, ou les deux, n'a pas été détecté dans l'échantillon. Ces résultats n'excluent pas une infection par un virus influenza. Un point de contrôle violet apparaît soit dans le puits, soit dans le puits, soit dans les deux à la fois sur la membrane du ColorPC indiquant une performance adéquate des procédures de test et des réactifs. Le fond doit être de couleur jaune clair à violet clair. 16

18 L006712J(0906)draft.qxd 10/11/2006 1:18 PM Page 17 Test non interprétable Le test est impossible à interpréter soit pour Flu, soit pour Flu, soit pour Flu et Flu, si ni un point violet ni un triangle violet n'est visible dans le (les) puits respectif(s). Tout triangle incomplet doit être de même considéré comme un résultat impossible à interpréter. Si le résultat est impossible à interpréter, le test devra être répété. Le résultat du test est de même impossible à interpréter soit pour Flu, soit pour Test non interprétable Flu, soit pour Flu et Flu, si un triangle blanc apparaît sur la membrane du ColorPC et si la totalité de la zone de fond est de couleur violette. Un point de contrôle voilé peut être observé au centre du triangle blanc. De plus, le résultat du test est impossible à interpréter si la totalité de la zone de la membrane est de couleur violette et aucun point de contrôle n'est observé. Faire une dilution au quart (1:4) de l'échantillon avec du sérum physiologique à 0,9 % ou du milieu de transport pour corriger ce problème, et refaire le test. Des échantillons excessivement muqueux peuvent ne pas être absorbés par la membrane ColorPC ou entraîner des résultats impossibles à interpréter. Ces échantillons peuvent être dilués au quart (1:4) dans du sérum physiologique, bien mélangés puis analysés de nouveau. Contrôle de qualité : chaque support d'analyse Directigen Flu + ColorPC possède des contrôles de procédure internes positifs et négatifs. L'apparition d'un point de contrôle violet dans les puits et représente le contrôle de procédure interne positif qui valide l'intégrité immunologique du support, l'action adéquate des réactifs et qui confirme que les procédures appropriées pour le test ont été suivies. REMRQUE : L intensité du point de contrôle peut varier entre les puits et. La zone de la membrane entourant le triangle représente le contrôle de procédure interne négatif intégré au support. L'absence d'une couleur significative dans cette zone permettant de masquer le triangle ou le point de contrôle indique que le test a été effectué correctement. Des contrôles positifs (Contrôle +/ et Contrôle +/ ) sont aussi inclus dans chaque trousse. Ces contrôles sont fournis en tant que moyens supplémentaires de contrôle de la qualité pour mettre en évidence une réaction positive ou négative. u minimum, ces contrôles devraient être analysés en tant que procédure de contrôle de la qualité de chacun des lots issus de chacune des expéditions reçues par le laboratoire. La formation d'un triangle violet sur la membrane dans le puits du support d'analyse ColorPC lors de l'analyse du Contrôle +/, et dans le puits lors de l'utilisation du Contrôle +/, démontre le bon fonctionnement des propriétés de fixation de l'antigène de l'influenza de cette membrane. La formation d'un point de contrôle violet seulement dans le puits du support d'analyse ColorPC lors de l'utilisation du Contrôle +/, correspond à un résultat de contrôle négatif adéquat de Flu qui démontre le bon fonctionnement du réactif et un suivi adéquat de la procédure de test. De même, la formation d'un point de contrôle violet seulement dans le puits lors de l'utilisation du Contrôle +/ démontre un résultat de contrôle négatif adéquat de Flu. Ne pas utiliser la trousse si le Contrôle +/ et le Contrôle +/ ne donnent pas des résultats appropriés. Les contrôles peuvent également être utilisés pour démontrer une réaction positive faible. Pour démontrer une réaction positive plus faible, on peut diluer à la fois le Contrôle +/ et le Contrôle +/ dans le même DispensTube (2 gouttes de Contrôle +/ et 2 gouttes de Contrôle +/ ajoutées à 10 gouttes de Réactif E d'extraction). La performance des réactifs peut également être évaluée en utilisant des échantillons positifs ou négatifs connus. Effectuer les contrôles de qualité conformément à la réglementation nationale et/ou internationale, aux exigences des organismes d'homologation concernés et aux procédures de contrôle de qualité en vigueur dans l'établissement. Il est recommandé à l'utilisateur de consulter les directives CLSI (anciennement NCCLS) et la réglementation CLI concernées pour plus d'informations sur les modalités de contrôle de qualité. LIMITES DE L METHODE L'étiologie des infections respiratoires dues à des micro-organismes autres que les virus influenza ou ne peut être établie par ce test. Le test Directigen Flu + peut détecter des particules de virus influenza de type et viables et non viables. Les performances du test Directigen Flu + dépendent de la charge en antigène et ne sont pas nécessairement corrélées aux résultats obtenus en culture cellulaire pour le même échantillon. Des faibles niveaux de développement viral peuvent donner un faux négatif ; par conséquent un résultat de test négatif n'élimine jamais complètement la possibilité d'une infection grippale de type, de type ou deux types et. Comme pour toute méthode diagnostique, les résultats obtenus avec le test Directigen Flu + doivent être interprétés conjointement avec les autres informations cliniques disponibles pour le médecin. Les caractéristiques de performance pour le type ont été établies lorsque les virus influenza /H3 et /H1 étaient les virus influenza de type prédominants. Lorsque de nouveaux virus influenza de type apparaissent les caractéristiques de performance peuvent varier. Les enfants ont tendance à incuber les virus pendant des périodes plus longues que les adultes, ce qui peut entraîner des différences de sensibilité entre les adultes et les enfants. Les valeurs positives et négatives de prédiction dépendent étroitement de la prévalence. Des résultats de test faussement positifs ont plus de chance d'être obtenus pendant les périodes de faible activité grippale, lorsque la prévalence est modérée à faible. La validité du test Directigen Flu + n'a pas été prouvée pour l'identification/la confirmation d'isolats de cultures cellulaires et ne doit donc pas être utilisée à ce titre. L'efficacité du test n'a pas été établie pour la surveillance du traitement antiviral de l'influenza. VLEURS ESCOMPTEES Le taux de résultats positifs observés pendant le dosage de l'influenza varie en fonction de la méthode de prélèvement des échantillons, du système de manipulation/transport, de la méthode de détection utilisée, de la période de l'année, de l'âge du patient, de la région géographique, et surtout, de la prévalence de la maladie dans la région. La prévalence de l'influenza varie d'une année à l'autre. u cours de ces 3 dernières années aux Etats-Unis, sa valeur était comprise entre 28 et 34 %. 20 L'incidence de l'infection à influenza de type est plus sporadique que celle de l'infection à influenza de type. u cours de la saison aux Etats-Unis, la prévalence de l'influenza de type chez les patients grippés était de 99,6 % par rapport à une prévalence de 0,4 % pour l'influenza de type. 20 asée sur une méthode en cultures, la prévalence observée aux Etats-Unis pendant la durée de l'essai clinique de ce 17

19 L006712J(0906)draft.qxd 10/11/2006 1:18 PM Page 18 produit était comprise entre 0 % et 33,9 % pour l'influenza de type et entre 0 % et 16,2 % pour l'influenza de type. La prévalence moyenne observée au cours de l'essai clinique du Directigen Flu + était de 17,9 % pour l'influenza de type et de 2,6 % pour l'influenza de type. CRCTERISTIQUES DE PERFORMNCE L'efficacité du test Directigen Flu + a été déterminée au cours d'une étude multicentrique conduite dans six centres d'investigation clinique et deux laboratoires de cabinets médicaux pendant la saison grippale de Les centres d'investigation clinique étaient situés au Canada, à Hong Kong et dans plusieurs régions géographiques des Etats-Unis. Un total de 1262 échantillons provenant d'aspirations rhinopharyngées, de lavages rhinopharyngés, d'écouvillonnages rhinopharyngés, d'écouvillonnages du cornet inférieur, d'écouvillonnages rhinolaryngés, d'écouvillonnages pharyngés, et de lavages broncho-pulmonaires de 1046 patients présentant des symptômes d'infection par influenza ont été évalués avec le Directigen Flu +. Les écouvillonnages rhinopharyngés et du cornet inférieur ont été prélevés chez chacun des 216 patients d'un établissement clinique. Les populations d'échantillons comprenaient 58 échantillons congelés et conservés composés d'échantillons présélectionnés positifs pour l'influenza de type, positifs pour l'influenza de type et négatifs pour l'influenza de type /. La répartition de ces échantillons congelés est indiquée dans chacun des tableaux ci-dessous. Les échantillons ont été prélevés et transportés au laboratoire conformément aux procédures propres à chaque laboratoire. Les tests suivants ont été effectués sur chacun des échantillons : Directigen Flu +, culture cellulaire et réaction d'immunofluorescence directe (DF) de l'échantillon. Tout échantillon restant a été conservé à 20 ºC ou à une température inférieure. Méthodes Culture cellulaire : pour chacune des cultures cellulaires, une partie de l'échantillon a été inoculée dans des lignées cellulaires de rein de singe Rhésus (RMK) ou de rein canin Madin-Darby (MDCK). Ces cellules ont été examinées pour y constater la présence ou non d'effets cytopathiques (CPE). La présence de cellules infectées a été confirmée pour l'influenza de type ou de type par coloration directe des anticorps fluorescents. Les échantillons négatifs ne présentant pas de CPE à quatorze jours ont été colorés pour confirmation par la DF. DF directe de l'échantillon : pour l'analyse directe de l'échantillon par DF, une partie de chacun des échantillons a été utilisée pour préparer un frottis afin d'être analysé par la réaction d'immunofluorescence directe contre l'influenza de type et de type. RT-PCR : la méthode RT-PCR a été appliquée à tous les échantillons disponibles dont les résultats des tests de culture était négatifs et dont les résultats des tests par DF directe étaient positifs. De plus, une sous-population d'échantillons comportant d'autres associations de résultats a été évaluée par la méthode RT-PCR. Précision clinique Pour tous les échantillons évalués, la sensibilité globale du test Directigen Flu + pour l'influenza de type par rapport aux cultures était de 86,2 % et de 80,8 % pour l'influenza de type. La spécificité globale de l'influenza de type par rapport aux cultures était de 90,7 % et pour l'influenza de type 99,5 %. Pour l'influenza de type, les résultats de cultures ont été négatifs pour 96 échantillons, et Directigen positifs. Le test DF de l'échantillon était positif pour 77 des 96 échantillons. La méthode RT-PCR a été appliquée à 86 des 96 échantillons ; un total de 78 échantillons se sont révélés positifs par cette méthode. Le taux de résultats impossibles à interpréter pour le test Directigen Flu + était de 0,08 % pour l'influenza de type et de type. spirations rhinopharyngées (NP) n=350 (un résultat du test Directigen impossible à interpréter n'est pas donné dans le tableau ni dans l'évaluation des caractéristiques de performance) Résultats des cultures cellulaires 95% IC +/- -/+ -/- Influenza Sensibilité 95,7 % 44/46 85,2 99,5 Directigen Flu + +/ * de type Spécificité 91,4 % 277/303 87,6 94,3 -/ ** Influenza Sensibilité 87,5 % 28/32 71,0 96,5 -/ de type Spécificité 98,1 % 311/317 95,9 99,3 *Sur les 26 échantillons analysés, 20/26 se sont révélés positifs par le test DF et 23/25 par la méthode RT-PCR. **Sur les 6 échantillons analysés, 6/6 se sont révélés négatifs par le test DF et 5/5 par la RT-PCR. L'échantillon rhinopharyngé (NP) comprend : Le lavage et/ou l'écouvillonnage rhinopharyngés n = 512 Résultats des cultures cellulaires 95 % IC +/- -/+ -/- Influenza Sensibilité 88,5 % 100/113 81,1 93,7 Directigen Flu + +/ * de type Spécificité 89,7 % 358/399 86,3 92,5 -/+ 0 12** 0 Influenza Sensibilité 70,6 % 12/17 44,0 89,7 -/- 13 5** 341 de type Spécificité 100 % 495/495 99,3 100 *Sur les 41 échantillons analysés, 32/41 se sont révélés positifs par le test DF et 30/35 par la méthode RT-PCR. ** Echantillons congelés (conservés) pour l'influenza de type. Remarque : sur les 50 échantillons congelés et conservés analysés, 10/13 échantillons montrant des résultats de culture positifs se sont révélés positifs et 37/37 échantillons montrant des résultats de culture négatifs se sont révélés négatifs pour l'influenza de type par le test Directigen Flu +. Pour l'influenza de type, 12/17 échantillons montrant des résultats de culture positifs se sont révélés positifs et 33/33 échantillons montrant des résultats de culture négatifs se sont révélés négatifs lorsqu'ils ont été analysés par le test Directigen Flu +. 18

20 L006712J(0906)draft.qxd 10/11/2006 1:18 PM Page 19 Les échantillons rhinolaryngés (NTS) comprennent : Les écouvillonnages pharyngés (TS) et / ou les écouvillonnages du cornet inférieur (LNS) n = 389 Résultats des cultures cellulaires 95 % IC +/- -/+ -/- Influenza Sensibilité 76,7 % 56/73 65,4 85,8 Directigen Flu + +/ * de type Spécificité 90,8 % 287/316 87,1 93,8 -/ Influenza Sensibilité 0,0 % 0/1 0,0 97,5 -/- 17 1** 286 de type Spécificité 100 % 388/388 99,1 100 *Sur les 29 échantillons analysés, 25/29 se sont révélés positifs par le test DF et 25/26 par la méthode RT-PCR. **Echantillons congelés (conservés) pour l'influenza de type. Remarque : sur les 5 échantillons congelés et conservés analysés, 3/3 échantillons montrant des résultats de culture positifs se sont révélés positifs et 2/2 échantillons montrant des résultats de culture négatifs se sont révélés négatifs pour l'influenza de type par le test Directigen Flu +. Pour l'influenza de type, 0/1 échantillon montrant des résultats de culture positifs s'est révélé positif et 4/4 échantillons montrant des résultats de culture négatifs se sont révélés négatifs lorsqu'ils ont été analysés par le test Directigen Flu +. Lavages broncho-pulmonaires (L) : n = 11 Résultats des cultures cellulaires +/- -/+ -/- Directigen Flu + +/ /+ 0 2* 0 -/ *Echantillons congelés (conservés) pour l'influenza de type. **N/ = Ne s'applique pas 95 % IC. Influenza Sensibilité N/** N/** N/ de type Spécificité 100 % 11/11 71,5 100 Influenza Sensibilité 100 % 2/2 15,8 100 de type Spécificité 100 % 9/9 66,4 100 Remarque : sur les 3 échantillons congelés et conservés analysés, 3/3 échantillons montrant des résultats de culture négatifs se sont révélés négatifs pour l'influenza de type par le test Directigen Flu +. Pour l'influenza de type, 2/2 échantillons montrant des résultats de culture positifs se sont révélés positifs et 1/1 échantillon montrant des résultats de culture négatifs s'est révélé négatif lorsqu'ils ont été analysés par le test Directigen Flu +. nalyses d'échantillons appariés : Les écouvillonnages rhinopharyngés et du cornet inférieur ont été prélevés chez chacun des 216 patients d'un établissement clinique. Tous les échantillons provenant de cet établissement se sont révélés négatifs pour l'influenza de type par le test en culture et le test Directigen lu +. ucune différence statistiquement significative n'a été détectée entre les types d'échantillons des tests Directigen Flu + et culture cellulaire. Directigen Flu + Ecouvillonnage rhinopharyngé + Ecouvillonnage du cornet inférieur % concordance = 206/216 = 95,4 % Culture cellulaire Ecouvillonnage rhinopharyngé + Ecouvillonnage du cornet inférieur % concordance = 200/216 = 92,6 % Spécificité analytique et réactivité croisée : Le test Directigen Flu + a été évalué en utilisant un total de 90 micro-organismes (58 bactéries, deux levures et 30 virus). Les isolats de bactéries et de levures ont été testés à des concentrations de 10 7 à 10 8 CFU/mL. M. pneumoniae a été testé à une concentration supérieure à 10 8 CCU/mL. Les isolats des virus ont été testés à des titres compris entre 10 4 et TCID 50 /ml. L'influenza de type C a été testée à un titre de 1,6 X CEID 50 /ml. ucun des microorganismes ou virus dont la liste figure ci-dessous n'a donné un résultat positif dans le test Directigen Flu +. 19