PRODUÇÃO ENZIMÁTICA DE BIODIESEL UTILIZANDO DIFERENTES ÓLEOS VEGETAIS COMO SUBSTRATOS EM SISTEMA DE ULTRASSOM

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1 PRODUÇÃO ENZIMÁTICA DE BIODIESEL UTILIZANDO DIFERENTES ÓLEOS VEGETAIS COMO SUBSTRATOS EM SISTEMA DE ULTRASSOM Enzymatic Production of Biodiesel in Ultrasound Bath Using Different Vegetable Oils as Substrates Juliana da Silva ZANATTA 1 Clarissa DALLA ROSA 1 RESUMO O objetivo deste estudo é avaliar a produção enzimática de biodiesel em sistema livre de solvente em banho de ultrassom em modo batelada, utilizando como substratos etanol, óleo de soja e óleo do fruto da macaúba. Um delineamento experimental Plackett & Burman foi realizado para o óleo de soja e um planejamento experimental foi realizado para o óleo de macaúba, a fim de maximizar a conversão de biodiesel para cada sistema. Conversões mais elevadas foram obtidas nos ésteres etílicos, 87,9% para o óleo de soja e 75,2% para o óleo de macaúba, demonstrando, assim, a utilização potencial do ultrassom para este sistema de reação. Palavras-chave: Óleo de soja; óleo de macaúba; Novozym 435; ultrassom. ABSTRACT The objective of this study is to evaluate the enzymatic production of biodiesel in solvent-free system in ultrasound bath in batch mode using as substrates ethanol and soybean oil and oil of the fruit of macauba. A Plackett & Burman experimental design was carried out for soybean oil and a experimental planning was conducted for macauba oil in order to maximize the biodiesel conversion for each system. Higher conversions in ethyl esters, 87.9% for soybean oil and 75.2% for macauba oil, were obtained, thus demonstrating the potential use of the ultrasound for this reaction system. Keywords: Soybean oil; macauba oil; Novozym 435; ultrasound. INTRODUÇÃO A possibilidade de escassez da oferta de combustíveis fósseis, assim como a crescente preocupação com o impacto ambiental decorrente da emissão de materiais poluentes provenientes da exaustão dos combustíveis derivados do petróleo, tem levado a pesquisas sobre diferentes fontes de combustíveis alternativos. Dentre esses combustíveis, o biodiesel derivado de fontes oleaginosas se destaca em virtude do seu elevado potencial como substituto dos combustíveis fósseis, uma vez que pode ser usado puro ou na forma de misturas com óleo diesel. Além disso, o biodiesel possui características semelhantes ao diesel convencional apresentando até melhores propriedades em virtude de ser um combustível renovável, biodegradável, atóxico e com baixo conteúdo de enxofre e de compostos aromáticos. 1 1 Departamento de Engenharia de Alimentos, URI Campus de Erechim, 997-, Erechim - RS, Brasil Vivências. Vol. 1, N.18: p , Maio/214 25

2 O processo de produção enzimática de biodiesel utilizando ultrassom vem como alternativa ao processo convencional de produção empregando-se agitação mecânica, uma vez que as cavitações (formação, aumento e implosão de bolhas no meio reacional) geradas pelo ultrassom, aumentam a miscibilidade entre os reagentes, fornecem energia necessária para a reação, reduzem o tempo de reação e a quantidade de reagentes e aumentam o rendimento e a seletividade da reação. 2 Tem sido relatado que o ultrassom exerce um efeito significativo sobre a transesterificação enzimática. A irradiação de ultrassom vem sendo estudada para produção de biodiesel utilizando enzimas, como a Novozym 435 2, bem como o uso de catalisadores ácidos ou básicos 3,4. No entanto, pouca investigação tem sido apresentada até a presente data sobre as aplicações da irradiação de ultrassom na produção de biodiesel catalisada por lipases. Yu et al. 2 estudaram a produção de biodiesel com óleo de soja e metanol em sistema de ultrassom utilizando como catalisador a enzima Novozym 435. Nas condições ótimas de % da energia ultrassônica ( W e frequência de irradiação de 4 khz), % de vibração, teor de água de,5%, razão molar de 1:1 álcool terc-amil/volume de óleo, razão molar 6:1 metanol/óleo, 6% de Novozym 435 e 4 ºC, rendimentos de 96% em ésteres metílicos de ácidos graxos foram obtidos. Nestas condições, a enzima não apresentou perdas de atividade durante os reciclos. A aplicação do ultrassom contribuirá para uma mistura de reação mais homogênea e facilitará a dispersão da lipase através do substrato, reduzindo a aglomeração de modo que a taxa de reação não diminui com o aumento da concentração de lipase. 5 No caso da catálise enzimática, embora as taxas de conversão de triglicerídeos em ésteres sejam mais lentas em comparação com a catálise alcalina, a catálise enzimática tem atraído muita atenção, pois é um processo de produção mais limpo e tem potencial para implementação industrial devido à simplicidade do processo e o uso de menor temperatura de reação. De fato, como mencionado por Nielsen et al. 6, a principal vantagem de um processo de produção de biodiesel enzimático é que os triglicerídeos, bem como ácidos graxos livres podem ser eficientemente transformados em biodiesel, e o glicerol como co-produto pode ser facilmente recuperado, com alta qualidade sem qualquer processo complexo. Embora o alto custo de produção de enzimas continua a ser o grande obstáculo para a comercialização do processo de catálise enzimática, tem se realizado estudos com o uso de solventes tolerantes, enzimas comerciais e não comerciais, novas tecnologias para a imobilização de lipases, para tornar o catalisador reutilizável para produção de biodiesel. 6 Batistella et al. 7 relataram a transesterificação do óleo de soja com etanol utilizando duas lipases comerciais imobilizadas (Lipozyme RM IM e Novozym 435) sob a influência da irradiação ultrassom, avaliou os efeitos da temperatura, da concentração de enzima e de água, razão molar óleo/ etanol e a potência da irradiação sobre a conversão da reação. Os resultados obtidos pelos autores mostram que a transesterificação enzimática assistida por ultrassom pode ser uma alternativa para o método alcalino convencional, alcançando conversões de 86,5% para irradiação ultrassônica de 1 W, razão molar (óleo/etanol) 1:3 temperatura de 57 ºC em um tempo de reação relativamente curto, de 4 h, usando 12,3% (p/p) de concentração da enzima Lipozyme IM RM como catalisador. Atualmente, 9% do biodiesel produzido no Brasil é obtido a partir do óleo extraído da soja. Com a crescente demanda da produção de biodiesel visando esta ser uma tecnologia limpa e renovável, a busca por fontes alternativas de óleos que venham a complementar a cadeia produtiva do biodiesel se faz necessária. Neste sentido, a palmeira macaúba apresenta-se como potencial para esta aplicação devido à sua elevada produção de óleo e composição química favorável à produção de biodiesel. Isto se deve ao alto teor de ácido oleico presente no óleo derivado da polpa, o qual representa entre 66-7% do óleo, dependendo do clima e das características de solo onde a palmeira é cultivada. 8 Em virtude do exposto, o presente trabalho busca avaliar a tecnologia de produção de Vivências. Vol. 1, N.18: p , Maio/214 26

3 biodiesel enzimático em sistema livre de solvente orgânico em banho de ultrassom utilizando dois óleos vegetais (soja e macaúba) e a enzima comercial Novozym 435 em modo batelada. PARTE EXPERIMENTAL Materiais Nas reações de transesterificação utilizou-se como substratos o óleo de soja comercial (Marca Soya) e o óleo do fruto da macaúba (Acrocomia aculeata (Jacq.) Lodd. ex Mart) obtido da Unidade de Beneficiamento Coco de Macaúba (Associação Comunitária dos Pequenos Produtores Rurais de Riacho D Antas e Adjacências COOPER RIACHÃO Montes Claros-MG), sem nenhum tratamento prévio; álcool etílico (Merck, 99,9% de pureza) e a enzima comercial Novozym 435, com atividade inicial de 47,9 U/g, produzida a partir da fermentação submersa de Candida antarctica, imobilizada em resina acrílica macroporosa de troca iônica, pela Novozymes Brasil/ Araucária-PR. Para a determinação da atividade enzimática os seguintes reagentes/solventes foram utilizados: acetona P.A ACS (Vetec, 99,5%), álcool etílico (Merck, 99,9 % de pureza) e hexano (Nuclear, P.A). Ácido láurico (Vetec, 98% CG) e álcool n-propílico normal (Nuclear, P.A 99,5%) foram utilizados como substratos para dosagem da atividade de esterificação das lipases. Aparato e procedimento experimental Os experimentos para produção enzimática de biodiesel em sistema livre de solvente orgânico foram realizados em um banho de ultrassom (Unique UltraSonicCleaner, modelo: USC- 18A, frequência de 4 KHz, potência de 132 W), utilizando os óleos de soja e macaúba. Para o óleo de soja realizou-se um delineamento de Plackett & Burman (PB-12) com 12 ensaios, apresentando ponto central em triplicata, onde foi avaliada a influência de cinco variáveis: temperatura 4, 55 e 7 ºC; razão molar (óleo/etanol) 1:3, 1:6,5 e 1:1; concentração da enzima Novozym 435 de 5 a 2% (m/m em relação aos substratos); potência de ultrassom (4, 7 e 1%) e concentração de água de % a 1% (m/m em relação aos substratos), mantendo-se fixo o tempo de reação em 1 hora. Para o óleo de soja, após estabelecida a melhor condição experimental, realizou-se um estudo cinético de 1 horas e posterior análise de reuso da enzima. Para o óleo do fruto da macaúba realizou-se um planejamento experimental de 11 ensaios com triplicata do ponto central, onde foi avaliada a influência de quatro variáveis: temperatura (4 à 7 ºC); razão molar óleo/etanol (1:3 à 1:1); concentração da enzima Novozym 435 (5 à 2% (m/m em relação aos substratos)) e potência do ultrassom (4 à 1%), mantendo-se fixo o tempo de reação em 9 minutos. Os resultados obtidos nas etapas anteriores foram analisados usando o software Statistica 7. Statsoft Inc., e através da análise do Gráfico de Pareto foi possível determinar as variáveis significativas e não significativas do processo. Após a realização dos planejamentos experimentais descritos anteriormente, para cada óleo vegetal, realizou-se um estudo cinético visando definir as condições experimentais que conduzissem à maior conversão em biodiesel. Os experimentos foram realizados à temperatura de 65 C, 132 W de potência, razão molar óleo/etanol de 1:9, concentração de enzima de 2% (m/m), durante 36 minutos. Diferentes concentrações de peneira molecular (4 Å, Sigma Aldrich) para absorção de água produzida no processo também foram testadas nesta etapa. As concentrações de peneira molecular utilizadas foram de 1, 2, e 1% em relação à massa total de substratos. Reações controle (sem a adição da enzima) também foram conduzidas com o objetivo de Vivências. Vol. 1, N.18: p , Maio/214 27

4 verificar a eficiência catalítica no processo. As cinéticas foram conduzidas até 24 minutos nesta etapa. Após a determinação da melhor concentração de peneira molecular a ser utilizada uma avaliação cinética foi realizada empregando os parâmetros: temperatura de 65 C, razão molar óleo/etanol de 1:9, 132 W de potência ultrassônica, concentração de enzima de 2% (m/m) em relação aos substratos, 1% de peneira molecular (m/m) em tempos de reação de 1, 3, 5, 7, 1, 15, 3, 6, 9, 12, 18, 24 e 36 minutos. Posteriormente, avaliou-se a possibilidade do reuso da enzima Novozym 435 para a produção de biodiesel com o óleo do fruto de macaúba em dois tempos diferentes de 3 minutos e de 9 minutos de reação, para a melhor condição estabelecida. Quantificação dos ésteres etílicos Para a quantificação de ésteres de ácidos graxos produzidos, as amostras foram previamente preparadas, transferindo-se 2 mg das mesmas para um balão volumétrico de 1 ml completando o volume até o menisco do mesmo com n-heptano. Após, transferiu-se uma alíquota de µl desta solução para um balão volumétrico de 1 ml e adicionou-se µl do padrão interno heptadecanoato de metila (C17:) (Sigma- Aldrich, 99,9%) na concentração de mg/l e completou-se o volume com n-heptano. As amostras de cada experimento foram preparadas em triplicata. A solução foi injetada (1 µl) em um cromatógrafo gasoso (GC) (Shimadzu 21), com injetor automático (Split) e detector de ionização de chama (FID). Utilizou-se a coluna capilar Rtx- WAX (3 m x,25 mm x,25 mm) nas condições cromatográficas descritas pela norma EN , do Comitê Europeu para Padronizações. A temperatura inicial da coluna foi 12 ºC permanecendo por 1 minuto, seguido pelo aquecimento de 15 ºC/min até 18 ºC permanecendo por 2 minutos, e novamente aquecendo 5 ºC/min até 2 ºC permanecendo assim por mais 2 minutos. Ar sintético e nitrogênio eram utilizados como gás de arraste e a temperatura do injetor e detector foi fixada em 2 C e a taxa de split de 1:. Este procedimento permitiu a determinação da conversão de triglicerídeos para ésteres etílicos. Quantificação do teor de água do óleo do fruto de macaúba A porcentagem de água presente na amostra de óleo antes e após a reação de transesterificação foi determinada pelo método de titulação em Karl Fischer utilizando o equipamento MettlerTodelo DL Graphix. Esse método está baseado na oxidação de SO 2 pelo I 2 em presença de água. RESULTADOS E DISCUSSÃO Estabilidade da enzima Novozym 435 A Figura 1 apresenta a estabilidade da enzima Novozym 435, quando esta foi submetida ao ultrassom a 132 W de potência e após armazenada em geladeira à 4ºC. Conforme resultados apresentados na Figura 1 pode-se verificar que o ultrassom não influencia no comportamento da enzima, visto que a mesma possui atividade enzimática inicial de 47,9 U/g e após o tratamento no ultrassom ela aumentou esta atividade e manteve a mesma em torno de U/g durante os 3 dias de monitoramento. Figura 1. Estabilidade da enzima Novozym 435, submetida ao ultrassom a 132 Watts de potência e armazenada em geladeira à 4ºC. Vivências. Vol. 1, N.18: p , Maio/214 28

5 Tempo (dias) Produção enzimática de biodiesel em sistema livre de solvente em banho de ultrassom: soja versus macaúba Para a avaliação da produção de biodiesel utilizando óleo de soja como substrato realizou-se um planejamento de experimentos utilizando o modelo proposto por Placket & Burman com 12 ensaios, com triplicata do ponto central, para avaliar o efeito das variáveis, temperatura, razão molar, concentração de enzima, concentração de água e potência de ultrassom, na produção enzimática de biodiesel utilizando como catalisador a enzima Novozym 435, em meio livre de solvente orgânico, mantendo-se fixo o tempo de 1 hora de reação. O parâmetro de temperatura utilizado nos testes cinéticos foi baseado na temperatura ótima de atuação da enzima (Novozym 435) fornecida pelo fabricante (Novozymes A/S), que é entre 6 7 C e em dados da literatura que sugerem outras temperaturas para a reação de transesterificação utilizando lipases. 2,7,1 As demais variáveis do processo foram levados em consideração os melhores 8,11-13 resultados do planejamento de experimentos e dados de outros trabalhos. A Tabela 1 apresenta a matriz do planejamento de experimentos e as respostas em termos de conversão de triglicerídeos para ésteres etílicos. A partir desta tabela pode-se verificar que o rendimento mais elevado foi obtido no experimento 1 (75,15%), correspondendo à temperatura mais elevada (7 ºC), razão molar entre os substratos de 1:3, 2% (m/m) de enzima e 52,8 W de potência de ultrassom. Tabela 1. Matriz do planejamento fatorial do tipo Plackett & Burman com 12 ensaios (PB-12) referente ao óleo de soja com a resposta em termos de teor em ésteres etílicos (%, m/m). Ensaio Temperatura (ºC) Razão molar óleo/etanol Concentração de enzima (%m/m) Potência de ultrassom (%) Conversão em ésteres (%) 1 7 1: , :1 5 4, : , : , :1 5 1, : ,6 Vivências. Vol. 1, N.18: p , Maio/214 29

6 7 4 1:1 2 4, : , :3 5 1, : , : , : , :6,5 12,5 7 5, :6,5 12,5 7 2, :6,5 12,5 7 3, Os dados obtidos na Tabela 1 foram tratados estatisticamente e o efeito das variáveis sobre o rendimento em ésteres pôde ser determinado. Os resultados são apresentados na forma de Gráfico de Pareto (Figura 2a). De acordo com esta figura pode-se observar que as variáveis concentração de água e razão molar apresentaram efeito significativo negativo, e as variáveis temperatura e concentração de enzima apresentaram efeito significativo positivo, considerando 9% de confiança. Por outro lado, a variável potência ultrassônica não apresentou influência significativa na conversão de triglicerídeos em ésteres etílico. Figura 2. (a) Gráfico de Pareto para a produção enzimática de biodiesel de soja utilizando Novozym 435 em sistema livre de solvente em banho de ultrassom em função das variáveis independentes. Concentração de água (% p/p) -4,27421 Concentração de enzima (% p/p) 2,3911 Temperatura (ºC) 2,26645 Razão molar óleo:etanol -1,23488 Potência ultrassonica (Watts), p=,1 Efeito Estimado (valor absoluto) O teor de água na reação pode ser um fator determinante no rendimento da síntese enzimática de biodiesel. 14 É consenso que um pouco de água é necessário para manter a enzima ativa em solventes orgânicos. Por outro lado, a água pode tomar parte na transesterificação, influenciando assim o equilíbrio. 15 As lipases possuem a característica única de atuar na interface entre uma solução aquosa e uma fase orgânica, por isso a atividade da lipase geralmente depende da área interfacial. A água facilita o aumento da área interfacial disponível, assim ajuda a manter a atividade da lipase. No entanto, o excesso de água pode tornar a lipase mais flexível e levar a algumas reações colaterais indesejadas, como a hidrólise, especialmente no processo de Vivências. Vol. 1, N.18: p , Maio/214 21

7 transesterificação. 16 A partir dos resultados obtidos na etapa anterior, para a transesterificação enzimática do óleo de soja em banho de ultrassom, realizou-se um planejamento de experimentos com 11 ensaios, e triplicata do ponto central, a fim de avaliar o efeito das variáveis, temperatura, razão molar óleo: etanol, concentração de enzima e potência de ultrassom na produção enzimática de biodiesel utilizando como substrato o óleo do fruto de macaúba e como catalisador a enzima Novozym 435, mantendo-se fixo o tempo de 9 minutos de reação, com base em testes e trabalhos desenvolvidos pelo grupo de pesquisa A Tabela 2 apresenta a matriz do planejamento de experimentos e as respostas em termos de rendimento em ésteres etílicos. A partir desta tabela pode-se verificar que o rendimento mais elevado foi obtido no experimento 7 (48,73%), correspondendo à temperatura de 4 ºC, razão molar entre os substratos de 1:1, 2% (m/m) de enzima e 52,8 W de potência de ultrassom. Os resultados também demonstram boa reprodutibilidade do ponto central com conversões entre 46,8 e 48,7%. Entretanto, analisando os resultados obtidos, percebe-se que não há uma diferença considerável no rendimento em ésteres etílicos obtidos a partir do experimento 5, quando concentrações de enzima acima de 5% foram utilizadas. Tabela 2. Matriz do planejamento fatorial com 11 ensaios apresentando a resposta em termos de rendimento em ésteres etílicos (%, m/m), em sistema livre de solvente em banho de ultrassom, utilizando óleo de macaúba e etanol como substratos e Novozym435 como catalisador. Ensaio Temperatura (ºC) Razão molar óleo/etanol Concentração de enzima (%m/m) Potência de ultrassom (%) 1 4 1: , : , : , : , : , : , : , : , :6,5 12,5 7 46, :6,5 12,5 7 47, :6,5 12,5 7 48,76 Conversão em ésteres (%) Os dados obtidos na Tabela 2 foram tratados estatisticamente e o efeito das variáveis sobre o rendimento em ésteres pôde ser determinado. Os resultados são apresentados na forma de Gráfico de Pareto (Figura 2b). Conforme apresentado nesta figura pode-se observar que variável concentração de enzima apresentou efeito significativo positivo, considerando 95% de confiança. As demais variáveis, temperatura, razão molar e potência ultrassônica não apresentaram influência significativa no rendimento em ésteres. Figura 2. (b) Gráfico de Pareto para a produção enzimática de biodiesel utilizando óleo do fruto de macaúba e Novozym 435 em sistema livre de solvente em banho de ultrassom em função das variáveis independentes. Vivências. Vol. 1, N.18: p , Maio/

8 Ao compararmos ambos os óleos investigados pode-se verificar que o óleo de soja apresentou 75,15% de conversão em biodiesel para razão molar (óleo de soja/etanol) 1:3, 7ºC e 2% (p/p) de enzima, enquanto que para o óleo de macaúba a conversão máxima foi de 48,73% para razão molar (óleo de macaúba/etanol) 1:1, 4ºC e 2% (p/p) de enzima. O óleo bruto extraído de plantas oleaginosas muitas vezes pode apresentar alto percentual de acidez devido aos danos qualitativos ocorridos no campo durante a colheita ou mesmo na sua forma de armazenamento. 17 Fortes e Baugh 18 determinaram a composição de ácidos graxos presentes no óleo da polpa de macaúba e verificaram que o ácido oleico (18:1) está presente em maior concentração 52,82%, seguido do ácido palmítico (16:) com 22,3%, esteárico (18:) com 5,75%, palmitoleico (16:1) com 5,28% e linoleico (18:2) com 4,69%, os outros ácidos graxos determinados pelos autores possuíam concentrações menores que 3%. A determinação do teor/índice de acidez do óleo tem o objetivo de expressar o estado de conservação do mesmo durante o armazenamento. Com o aquecimento e pela ação da luz ocorre a decomposição dos glicerídeos, que é acompanhada pela formação de ácidos graxos livres. 19 O óleo pode sofrer várias alterações onde ocorre a formação de polímeros, dímeros, triglicerídeos oxidados, etc. 2 Conforme Gonzalez 21, esses compostos formados não podem ser convertidos em ésteres, implicando em um decréscimo real do rendimento da reação. A partir do método de conversão quantitativa com BF 3, Gonzalez (212) 23 verificou o valor máximo de conteúdo de ésteres no óleo, ou seja, o valor de convertibilidade máxima para o óleo que, no caso do óleo de macaúba, foi de 8,1%. Em estudos recentes realizados, verificou-se que a convertibilidade máxima de triglicerídeos em ésteres do óleo de macaúba é de 75,4% e o índice de acidez é de 75, mg KOH/g. Estudo cinético Visando verificar a eficiência do banho de ultrassom no processo reacional foram realizados estudos comparativos entre os óleos de soja e o óleo do fruto da macaúba. A Figura 3 apresenta os dados em obtidos em relação à conversão em ésteres etílicos de óleo de soja e do óleo de macaúba durante a avaliação cinética do processo. Os experimentos foram realizados em um balão de ml, utilizando 2% (m/m) da enzima Novozym 435. Vivências. Vol. 1, N.18: p , Maio/

9 Figura 3. Conversão de triglicerídeos para ésteres etílicos obtidos na transesterificação enzimática do óleo de soja e macaúba em sistema livre de solvente em banho de ultrassom. Condição experimental para a soja: razão molar óleo/etanol de 1:3, temperatura de 7ºC e potência de ultrassom correspondente a 52,8 W. Condição experimental para o óleo de macaúba: razão molar óleo/etanol de 1:9, temperatura de 65ºC e potência de ultrassom correspondente a 132 Watts. 1 9 Conversão em Ésteres Etílicos (%) Óleo de Macaúba Óleo de Soja Tempo (min) De acordo com a Figura 3, pode-se observar que o rendimento em ésteres etílicos utilizando óleo de soja como substrato foi de aproximadamente 87,96% em 24 min de reação. Nos intervalos de tempos de 36 e 48 minutos observa-se uma pequena queda em relação ao teor de ésteres. Para o óleo do fruto da macaúba (Figura 3), conversões em torno de 7% foram observadas após 9 min de reação, utilizando as seguintes condições experimentais: razão molar óleo/etanol 1:9, temperatura 65ºC, 1% de peneira molecular (m/m), 2% da lipase comercial Novozym 435 em relação à massa dos substratos e potência máxima do ultrassom. Ao comparar estes resultados percebe-se que em tempos reacionais menores (15 e 3 minutos) o óleo do fruto da macaúba conduziu a conversões em ésteres maiores, entretanto em tempos reacionais superiores há 3 minutos com o óleo de soja obtiveram-se as melhores conversões. Isso se deve, provavelmente, às diferentes características físico-químicas dos óleos empregados neste estudo. Os resultados obtidos demonstram que ambos os óleos apresentam grande potencial para aplicação na produção de biocombustíveis derivados de óleos vegetais empregando tecnologia de ultrassom agregada à catálise enzimática. Reuso do biocatalisador A utilização de enzimas imobilizadas em reações de síntese apresenta como principal vantagem à possibilidade de reutilização das mesmas. Tendo como base este argumento, foram avaliados os ciclos de reutilização da enzima Novozym 435 na condição otimizada nas etapas anteriores da produção de ésteres etílicos. Devido ao custo elevado da enzima, a reutilização da mesma é um fator esencial para a produção de biodiesel em nível industrial. Os estudos de reutilização do catalisador foram realizados para investigar a estabilidade da enzima sob a radiação ultrassônica após sucessivos ciclos de uso. As Figuras 4(a), 4(b), e 5 apresentam os resultados experimentais de conversão de Vivências. Vol. 1, N.18: p , Maio/

10 ésteres etílicos e a respectiva atividade enzimática residual após cada ciclo para o óleo de soja e para o óleo de macaúba. Figura 4. (a) Atividade de esterificação da Novozym 435 após cada ciclo de uso de 1 hora para produção enzimática de biodiesel de soja em sistema livre de solvente em banho de ultrassom, utilizando razão molar (óleo / etanol) 1:3, 7ºC 2% (m/m) de enzima Novozym 435 e 52,8 Watts Conversão em Ésteres (%) Conversão em Ésteres Etílicos (%) Número de ciclos Figura 4. (b) Atividade de esterificação da Novozym 435 e conversão em ésteres a partir de óleo de macaúba após cada ciclo de 3 minutos de uso para produção enzimática de biodiesel em sistema livre de solvente em banho de ultrassom a 65ºC, razão molar óleo / etanol 1:9, 1% de peneira molecular (m/m), 2% (m/m) Novozym 435 e 132 Watts Conversão em Ésteres (%) Conversão em Ésteres Etílicos (%) Número de ciclos Analisando os resultados obtidos, pode-se afirmar através das Figuras 4(a) e 5 que a atividade enzimática diminui consideravelmente conforme cada etapa de reuso da enzima para ambos os óleo estudados quando o reuso foi realizado por um tempo mais longo. Pode-se verificar na Figura 4(b) que conforme a atividade de esterificação diminui, também se observa uma queda na conversão em ésteres etílicos. Por exemplo, no primeiro reuso obteve-se 46,1 U/g de atividade e Vivências. Vol. 1, N.18: p , Maio/

11 73,68% de ésteres etílicos. Já no segundo reuso obteve-se uma atividade de 29,5 U/g e 9,27% em ésteres etílicos. No terceiro e quarto ciclos obteve-se conversões em ésteres etílicos de 6,22% e 3,65%, respectivamente. Figura 5. Atividade de esterificação da Novozym 435 e rendimento em ésteres após cada ciclo de 12 minutos de uso para produção enzimática de biodiesel em sistema livre de solvente em banho de ultrassom nas condições experimentais: 65ºC, razão molar óleo de macaúba: etanol 1:9, 1% de peneira molecular (m/m), 2% (m/m) Novozym 435 e 132 Watts Conversão em Ésteres (%) Número de ciclos Conversão em Ésteres Etílicos (%) As Figuras 4(b) e 5 apresentam os resultados experimentais de conversão de ésteres etílicos e a respectiva atividade enzimática após cada ciclo. Conforme apresentado nas figuras acima, a enzima Novozym 435 manteve uma atividade significativa durante 8 ciclos no tempo de 3 minutos de exposição a irradiação do banho de ultrassom, perdendo gradativamente a sua atividade até atingir perda de 49% no oitavo ciclo em relação a sua atividade inicial. Para o tempo de exposição de 12 minutos o ultrassom afetou de forma drástica a atividade da enzima com perda de aproximadamente 76% já no segundo ciclo de reuso e perda quase total da atividade enzimática após 4 ciclos. O mesmo comportamento é observado em relação ao rendimento em ésteres. À medida que a atividade de esterificação diminui, também percebe-se uma queda no rendimento em ésteres etílicos chegando à 3,76% com atividade enzimática de 29,84 U/g após o oitavo ciclo nos tempos de 3 minutos e 22,84% em ésteres etílicos com atividade enzimática de apenas 2,39 U/g no quarto ciclo nos tempos de 12 minutos. Conforme Zhu et al. 24, baixas intensidades de ondas ultrassônicas favorecem o fluxo dos reagentes e substratos ao sítio ativo da enzima, favorecendo a reação. A aplicação de ultrassom para a síntese enzimática catalisada em uma fase não aquosa pode aumentar a atividade da enzima e também pode melhorar a transferência entre o substrato e o sítio ativo da enzima. No entanto, segundo os autores, a intensidade empregada e/ou o tempo de irradiação pode levar à inativação da enzima pelo colapso cavitacional. Esta queda na atividade é resultado do processo de produção de biodiesel enzimático em sistema livre de solvente. A hidrofobicidade dos solventes orgânicos influencia a atividade da Vivências. Vol. 1, N.18: p , Maio/

12 enzima e a especificidade dos substratos. Alguns autores relatam a redução ou até mesmo a perda da atividade enzimática em altas intensidades de ultrassom utilizando as enzimas α-quimotripsina e invertase. 25 O reuso do biocatalisador enzimático foi realizado para a condição otimizada, isto é, sem adição de água, e de acordo com Rahman et al. 26, a lipase em meio não aquoso muitas vezes sofre com reduzida atividade, seletividade e estabilidade. CONCLUSÕES Ao final deste trabalho conclui-se que o uso do ultrassom no processo de produção enzimática de biodiesel em sistema livre de solvente propiciou altas conversões em um tempo relativamente curto para o óleo do fruto de macaúba com conversões de 75,2% em tempo reacional de 3 minutos. Devido às características físico-químicas dos óleos, em tempos superiores a 3 minutos, o óleo de soja conduziu a melhores conversões. Ambos os óleos (macaúba e soja) agregados ao emprego da tecnologia de ultrassom e uso de catálise enzimática apresentaram significativo potencial para a produção de biocombustíveis. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem a CAPES (Brasil) e ao CNPq (Brasil) pelo apoio financeiro, à Novozymes (PR, Brasil) pelas amostras de lipase e às instituições de ensino (URI e UFSC) onde o trabalho foi desenvolvido pela infraestrutura disponibilizada. REFERÊNCIAS Demirbas, A.; Energy Policy. 27, 35, 9, Yu, D.; Tian, L.; Wu, H.; Wang, S.; Wang, Y.; Ma, D.; Fang, X.; Process Biochem., 21, 45, 519. Deshmane, V. G.; Gogate, P. R.; Pandit, A. B.; Ind. Eng. Chem. Res., 29, 48, Mahamuni, N. N.; Adewuyi, Y. G.; Energy Fuels, 29, 23, Liu, Y.; Jin, Q.; Shan, L.; Liu, Y.; Shen, W.; Wang, X.; Ultrason. Sonochem.,28, 15, 42. Nielsen, P.M., Brask, J., Fjerbaek, L.; Eur. J. Lipid Sci. Technol. 28, 11, 692. Batistella, L.; Lerin, L. A.; Brugnerotto, P.; Danielli, A. J.; Trentin, C. M.; Treichel, H.; Oliveira, J. V.; Oliveira, D.; Ultrason. Sonochem., 212, 19, 452. Hiane, P. A.; Ramos Filho, M. M.; Ramos M. I. L.; Macedo, M. L. R.; Brazilian J. of Food Technol., 25, 8, 256. STANDARD UNE-EN Fat and oil oil derivatives: Fatty Acid Methyl esters FAME) Determination of ester and linolenic acid methyl ester contents. Asociación Española denormalización y Certificación, Madrid, 23. Kruger, R. L.; Sychoski, M.; Ninow, J. L.; Corraza, M. L. Revista Ciências Exatas e Naturais. 211, 13, 331. Trentin, C. M.; Scherer, R. P.; Dalla Rosa, C.; Oliveira, D.; Oliveira, J. V. Resumo, 16 IUFoST. 16th World Congress of Food Science and Technology. Foz do Iguaçu PR, Agosto, 212. Popiolski, A. S; Dissertação de Mestrado, Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai e das Missões URI, Erechim, RS, Brasil, 211. Nogueira, B. M.; Carretoni, C.; Cruza, R.; Freitas, S.; Melo; P. A.; Costa, R.; Pinto, J. C.; Nele, M.; J. Mol. Catal. B: Enzym., 21, 67, 117. Antczak, M.S.; Kubiak, A.; Antczak, T.; Bielecki, S.; Renewable Energy, 29, 34, Vivências. Vol. 1, N.18: p , Maio/

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