ESTUDO EPIDEMIOLÓGICO DO VÍRUS DA DIARREIA VIRAL BOVINA (BVDV) EM REBANHOS LEITEIROS NA REGIÃO NOROESTE DO RIO GRANDE DO SUL

Transcrição

1 UNIVERSIDADE REGIONAL DO NOROESTE DO ESTADO DO RIO GRANDE DO SUL DEPARTAMENTO DE ESTUDOS AGRÁRIOS CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CLÍNICA DE BOVINOS DE LEITE 0 Oldemar Heck Weiller ESTUDO EPIDEMIOLÓGICO DO VÍRUS DA DIARREIA VIRAL BOVINA (BVDV) EM REBANHOS LEITEIROS NA REGIÃO NOROESTE DO RIO GRANDE DO SUL Ijuí, RS 2018

2 1 Oldemar Heck Weiller ESTUDO EPIDEMIOLÓGICO DO VÍRUS DA DIARREIA VIRAL BOVINA (BVDV) EM REBANHOS LEITEIROS NA REGIÃO NOROESTE DO RIO GRANDE DO SUL Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso de Pós-graduação em Clínica de Bovinos de Leite, da Universidade Regional do Noroeste do Estado do Rio Grande do Sul (UNIJUÍ, RS), como requisito parcial para obtenção do título de Especialista em Clínica de Bovinos de Leite. Orientadora: Luciane R. V. Martins Ijuí, RS 2018

3 2 Oldemar Heck Weiller ESTUDO EPIDEMIOLÓGICO DO VÍRUS DA DIARREIA VIRAL BOVINA (BVDV) EM REBANHOS LEITEIROS NA REGIÃO NOROESTE DO RIO GRANDE DO SUL Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso de Pós-graduação em Clínica de Bovinos de Leite, da Universidade Regional do Noroeste do Estado do Rio Grande do Sul (UNIJUÍ, RS), como requisito parcial para obtenção do título de Especialista em Clínica de Bovinos de Leite. Aprovado em abril de 2018: MSc. Luciane R. V. Martins (UNIJUÍ) (Orientadora) Dr. Felipe Libardoni (UNIJUÍ) (Banca) Ijuí, RS 2018

4 3 AGRADECIMENTOS Com muito carinho agradeço a Professora Denise Fraga, coordenadora do curso de Especialização em Clínica de Bovinos Leiteiros da UNIJUÍ e a todos os professores pela dedicação e empenho para a realização do curso. Um agradecimento especial a minha orientadora, a professora Luciane Martins, pelo auxílio na definição dos temas e no encaminhamento deste projeto. A Médica Veterinária Ana Paula Huttra Kleemann, minha gratidão, sua prática na coleta de campo foi muito importante para o projeto. Aos colegas da Emater, Alexandre Dalbianco Griebler e Anselmo Alexandre Granetto, incansáveis extesionistas da Emater, que comprometidos com o sucesso dos produtores rurais, estiveram ativamente envolvidos no projeto e foram o elo de ligação do autor com as famílias participantes. A esposa Salete, meus filhos Felipe, Daniel e Julia, agradeço pelo amor incondicional, apoio e incentivo nas horas difíceis e principalmente pela oportunidade de estudo. Meus agradecimentos a equipe do Hospital Veterinário da Unijuí, que realizaram a manipulação das amostras coletadas, fruto da parceria agradeço à excelente qualidade do material enviado para análise. Agradeço especialmente ao Dr. Rudi Weiblen, professor titular do curso de medicina veterinária da UFSM, que com sua magnificência e conhecimentos sobre o tema pesquisado, qualificando o projeto com a análise laboratorial e interpretação de resultados. Um agradecimento especial aos produtores rurais participantes deste projeto e a seus familiares. Por fim, agradeço a todos os colegas do curso, que participaram da minha jornada acadêmica, grato pela oportunidade de convívio e aprendizado, que de alguma forma auxiliaram para a concretização deste objetivo.

5 4 RESUMO ESTUDO EPIDEMIOLÓGICO DO VÍRUS DA DIARREIA VIRAL BOVINA (BVDV) EM REBANHOS LEITEIROS NA REGIÃO NOROESTE DO RIO GRANDE DO SUL AUTOR: Oldemar Heck Weiller ORIENTADORA: Luciane R. V. Martins A investigação dos casos suspeitos de Diarreia Viral Bovina (BVD), a ocorrência de animais permanentemente infectados (PI) e transitoriamente infectados (TI) pelo vírus da diarreia viral bovina (BVDV) e os fatores de risco para a ocorrência da BVD tem sido um desafio constante e necessitam ser esclarecidos para definir as medidas de controle de maior efetividade. Neste sentido, Oo objetivo deste trabalho foi determinar o nível de exposição ao vírus dentro dono rebanho de duas propriedades com produção leiteira e a ocorrência de animais PI, avaliando o desempenho reprodutivo, as perdas produtivas e os principais fatores de risco para ocorrência da BVD. Foram testados 1921 animais de dois rebanhos bovinos leiteiros na região Noroeste do Rio Grande do Sul, com histórico de retornos ao cio, abortos e malformações fetais. A técnica utilizada foi a soroneutralização. A perda estimada de produção de leite em virtude da ineficiência reprodutiva variou de 6,9% a 33,8%. Pelos resultados sorológicos obtidos pode-se afirmar que o BVDV não é o agente causador dos problemas reprodutivos identificados clinicamente nos rebanhos analisados e os baixos títulos nos testes de soroneutralização descarta-se a possibilidade da ocorrência de animais PI nas duas propriedades. As diferentes práticas de manejo que são utilizadas pelos produtores da mesma região fazem variar os fatores de risco para a ocorrência das doenças reprodutivas. Comentado [C1]: Foram todos dos dois rebanhos? Comentado [C2]: Qual pode ser então? ver Comentado [C3]: Por qual motivo? Testou para PI? Baixos níveis sorológicos Palavras-chave: BVD. Reprodução Bovinos.

6 5 LISTA DE QUADROS Quadro 1 Situação epidemiológica dos rebanhos analisados Quadro 2 Situação epidemiológica da propriedade... 23

7 6 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Desempenho técnico e produtivo dos rebanhos analisados Tabela 2 Percentual (%) de título sorológico para BVDV nos animais analisados... 25

8 7 SUMÁRIO Comentado [C4]: Colocar como artigo... 1 INTRODUÇÃO REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ETIOLOGIA EPIDEMIOLOGIA PATOGENIA SINAIS CLÍNICOS DIAGNÓSTICO PROFILAXIA E CONTROLE METODOLOGIA RESULTADOS E DISCUSSÃO CONCLUSÃO BIBLIOGRAFIA APÊNDICE... 32

9 8 1 INTRODUÇÃO A produção do leite é o principal objetivo na pecuária leiteira e está diretamente vinculada com a reprodução. Para alcançar máximas produções com menores custos, as fêmeas leiteiras deverão ter parições em intervalos regulares de 12 meses. Ineficiências na reprodução leva a ineficiência na produção, comprometendo economicamente a atividade (RADOSTITS; GAY; HINCHCLIFF, 2007). Por ser a BVD (Diarreia Viral Bovina) uma doença que causa perdas econômicas em todo o mundo, tem sido objeto de uma série de esquemas que visam o seu controle ou erradicação. A patogenia da BVD é complexa, com infecção pré ou pós-gestação, com diferentes quadros clínicos (MEGID; RIBEIRO; PAES, 2016). O DVBV (Vírus da Diarreia Viral Bovina) possui distribuição mundial e é considerado um dos principais patógenos de bovinos. A infecção e as enfermidades associadas à BVD têm sido descritas no Brasil desde os anos 60 (FLORES et al., 2005). Levantamentos epidemiológicos realizados pela Embrapa, nomeadamente através do Estudo da Situação Epidemiológica e Fatores de Risco para Problemas Reprodutivos em Bovinos Leiteiros localizados em diferentes Mesorregiões do Estado do Rio Grande do Sul (EPIREP), vem mostrando a ocorrência do BVDV e sua correlação com problemas reprodutivos e no aumento do intervalo entre partos em bovinos leiteiros (SOUZA et al., 2017). Neste estudo os autores identificaram uma incidência do vírus da BVD de 30,0% nos rebanhos leiteiros situados na Mesorregião Noroeste do Rio Grande do Sul. Entre os fatores de risco para a ocorrência da Diarreia Viral Bovina (BVD) tem relevância a maior susceptibilidade dos animais jovens, a introdução de animai PI (permanentemente persistentemente infectado), a falha de um programa de vacinação e a diversidade antigênica do BVDV (RADOSTITS; GAY; HINCHCLIFF, 2007). Como no Brasil as vacinas são ainda questionadas quanto a sua proteção, pois existem diferentes genótipos do vírus para a BVD, o controle e a erradicação da BVD dependerá da identificação dos rebanhos com infecção ativa, eliminação dos animais PI do rebanho e o desenvolvimento de medidas para prevenir a introdução Comentado [C5]: Quais intervalos? 12 meses

10 9 da infecção dentro dos rebanhos nos quais a infecção foi eliminada (MEGID; RIBEIRO; PAES, 2016). Para consolidação de abordagens preventivas na medicina veterinária é fundamental conhecer o grau de incidência, os sintomas sinais clínicos e apresentações subclínicaos, os riscos associados à manifestação das doenças e principalmente identificar os portadores, vetores e veículos responsáveis pela disseminação e manutenção e disseminação dos agentes patogênicos no rebanho (RADOSTITS; GAY; HINCHCLIFF, 2007). Este estudo teve o objetivo de conhecer a status imunológico dos animais, a situação epidemiológica, a perda estimada da produção de leite em função das falhas reprodutivas e identificar os principais fatores de risco para a ocorrência da BVD em duas propriedades leiteiras na Região Noroeste do Rio Grande do Sul. Comentado [C6]: Vetores? portadores, vetores e veículos

11 10 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 ETIOLOGIA O BVDV pertence à família Flaviviridae, gênero Pestivírus, que abriga dois outros vírus antigenicamente relacionados: o vírus da Peste Suína Clássica e o vírus da Doença da Fronteira ou Boer Border Disease dos ovinos. Devido a esta semelhança pode ocorrer infecção cruzada entre espécies, o que compromete a acurácia dos métodos de diagnóstico sorológico (BAKER, 1995; RADOSTITS; GAY; HINCHCLIFF, 2007). Entre os Pestivírus dos ruminantes existem dois biótipos distintos, o biótipo não citopatogênico (NCP) e o biótipo citopatogênico (CP). Somente o tipo nãocitopatogênico (NCP) atravessa a placenta, invadindo o feto na fase de imunocompetência do mesmo,e entre 40 a 120 dias, estabelecendo infecção persistente, crucial para a disseminação do vírus (RADOSTITS; GAY; HINCHCLIFF, 2007). Além da diferença em produzir ou não citopatologia, os biótipos apresentam diferenças moleculares na proteína não estrutural NS2-3. Os isolados NCP produzem somente a NS2-3, enquanto que os isolados CP expressam a NS2-3 e também a sua região carboxi-terminal ou NS3 como uma proteína separada (TAUTZ et al., 1996). Dentre as diversas características dos Pestivirus, a mais marcante é o seu elevado grau de variabilidade antigênica, observado principalmente, entre as amostras de BVDV (ROEHE et al., 1998). Em virtude da alta frequência de mutação responsável pela grande diversidade antigênica do BVDV, é possível identificar três grupos antigênicos distintos a partir de isolados de campo, BVDV-1, BVDV-2 e BVDV-3 (MEGID; RIBEIRO; PAES, 2016). Os vírus isolados tipo I são usados nas vacinas e testes diagnósticos. Os isolados tipo 2 são predominantemente encontrados no soro de animais PI ou que morreram em consequência da doença da hemorrágica (RADOSTITS; GAY; HINCHCLIFF, 2007). Comentado [C7]: Por qual motivo se torna PI? 2.2 EPIDEMIOLOGIA

12 11 O BVDV infecta naturalmente bovídeos, caprinos, ovinos, suídeos, camelídeos e cervídeos, de todas as idades (MEGID; RIBEIRO; PAES, 2016). Os ovinos podem ser infectados naturalmente e a transmissão do BVDV dos bovinos para ovinos foi demonstrada (RADOSTITS; GAY; HINCHCLIFF, 2007). Em suínos a infecção por Pestivírus causa doença reprodutiva e reação falsa positiva ao vírus da Peste Suína Clássica (LOKEN, 1995). As infecções por BVDV são endêmicas nas populações de bovinos. Conforme sugerido por Lazzari, Bartholomei e Piccinin (2008) estimou-se que a prevalência mundial média de anticorpos em animais adultos seja em torno de 60%, já a porcentagem de animais persistentemente infectados foi estimada entre 1 a 2% do rebanho global de bovinos (HOUE, 2003). No Rio Grande do Sul os primeiros estudos sorológicos da infecção no Brasil datam do início da década de 70 (WIZIGMANN; VIDOR; RICCI, 1971). Ao realizar triagem em rebanhos com problemas reprodutivos no RS buscando animais PI, Oliveira (1996) detectou 1,2% (12/1240) de amostras positivas (leucócitos, soro) para o vírus. Botton et al. (1998), detectando anticorpos em 19 (1,36%) e vírus em 11 (0,79%) examinando amostras de soro de 1396 fetos coletados em matadouros. Entre os anos de 1995 e 2004, no Rio Grande do Sul, foram coletadas amostras de sangue bovino de propriedades espalhadas por, aproximadamente 100 municípios e a prevalência observada foi de 39,33% (FLORES et al., 2005). A transmissão pode ocorrer de modo horizontal, por contato direto (secreções oronasais, cópula, biotécnicas de reprodução e aerossóis) ou por contato indireto (uso de agulhas hipodérmicas, imobilizador nasal, instrumentos para colocação de brincos e para castração, infusões orais, bem como durante a palpação retal). Pode ocorrer também por via vertical (transplacentária) (MEGID; RIBEIRO; PAES, 2016). A transmissão horizontal do BVDV para gado soronegativo mostrou ocorrer após apenas uma hora de contato direto com um único animal PI (TRAVEM et al., 1991). O potencial de transmissão indireto depende da estabilidade do vírus fora do hospedeiro. As partículas virais podem permanecer viáveis no ambiente natural por 3 horas a 35ºC, 3 a 7 dias a 20ºC e 3 semanas a 5ºC (RADOSTITS; GAY; HINCHCLIFF, 2007). Comentado [C8]: Algum pode se tornar portador? Comentado [C9]: E de ovinos para bovinos? Comentado [C10]: Tudo isso?!?!?!

13 12 Entre os fatores de risco para ocorrência da doença relacionados com os animais está a idade e fase de gestação. Entre os fatores ambientais estão a introdução de animais PI no rebanho, falhas na vacinação ou um programa de vacinação inadequado e entre os riscos relacionados ao patógeno está a diversidade antigênica (RADOSTITS; GAY; HINCHCLIFF, 2007). Da mesma forma, o contato de animais entre propriedades vizinhas através das cercas e a circulação na propriedade de pessoas, produtores, veterinários, assistentes técnicos e vendedores constitui-se de um risco potencial para a disseminação das diferentes enfermidades. As práticas de vacinação, venda de terneiros machos recém-nascidos, a forma de criação dos animais, a densidade populacional e o tipo de instalação, comparada a um sistema de criação a pasto, faz variar o número de animais PI em um rebanho (HOUE, 1995). A principal fonte de infecção são os bovinos PI (permanentemente persistentemente infectados), considerados os responsáveis pela manutenção do vírus na natureza, cuja prevalência é de aproximadamente 1% (MEGID; RIBEIRO; PAES, 2016). Os animais PI eliminam o BVDV em suas secreções e excreções ao longo da vida e é a principal fonte da transmissão do vírus. Os bovinos transitoriamente infectados (TI) são considerados como uma fonte menos importante de disseminação da doençadoença. (LARSON et al., 2005). Os animais TI eliminam o vírus, em menores quantidades, somente durante a fase aguda da doença dede outra forma os animais PI geralmente têm uma viremia muito alta e persistente e o BVDV é derramado ao longo da vida (BROCK et al., 1991; BEZEK; STOFREGEN; POSSO, 1995; BROCK et al., 1998). Após um curto período de incubação, animais transitoriamente (agudamente) infectados se tornam virêmicos e o vírus podem ser derramados nas secreções corporais e excreções dos dias 4 a 15 após a infecção (DUFFEL et al., 1985; BROWNLIE et al., 1987). A importância das infecções agudas na transmissão e manutenção de BVDV dentro de um rebanho ou população não deve ser subestimado (HOUE, 1995). Surtos superagudos da BVD podem ocorrer em animais imunocompetentes atingindo 40% de morbidade e 20% de mortalidade (RADOSTITS; GAY; HINCHCLIFF, 2007). Comentado [C11]: Diferença PI e TI? ok

14 13 A soroconversão entre bovinos sem animais PI indica que a transmissão de animais transitoriamente (agudamente) infectados ocorre, embora a propagação seja mais lenta (MEYLING; HOUE; JENSEN, 1990; MOERMAN et al., 1993). Infecções mistas de BVDV e outro patógeno (por exemplo, vírus infeccioso da rinotraqueíte bovina, Vírus Respiratório Sincicial Bovino, Pasteurella haemolytica, rotavírus, espécies de coronavírus e Salmonella) potencializam a ocorrência de doenças mais graves (MEGID; RIBEIRO; PAES, 2016). 2.3 PATOGENIA O vírus pode ser isolado do corrimento nasal, saliva, sêmen, fezes, urina. Lágrima e leite, sendo que cada um dos quais permite ampla disseminação do vírus (RADOSTITS et al., 2002). A transmissão do BVDV se dá por contato direto entre animais, por contato indireto através de moscas sugadoras, fômites e por via transplacentária (HOUE, 1995). A porta de entrada do BVDV são as mucosas oral, nasal, ocular e genital. A soroconversão pode ocorrer aproximadamente 16 dias após-infecção e os anticorpos persistem por anos. O BVDV infecta granulócitos, macrófagos, células mielóides apresentadoras de antígeno, linfócitos B, linfócitos T CD4+ e CD8+. Causa apoptose de leucócitos mononucleares, interfere na ação das citocinas, reduz a resposta de anticorpos e diminui o número de linfócitos T e B (MEGID; RIBEIRO; PAES, 2016). A base para a patogênese de infecções mistas pode ser a imunossupressão consequente à leucopenia transitória e possivelmente devido a uma disfunção de neutrófilos (HOUE; LIMDBERG; NOENNIG, 2006). Em vacas gestantes primoinfectadas pelo BVDV poderá ocorrer o comprometimento do embrião ou do feto, que se infectam pela via transplacentária durante a viremia. A inflamação de um ou ambos os ovários compromete a fecundação, causando perdas embrionárias e fetais (MEGID; RIBEIRO; PAES, 2016). O biótipo NCP não causa citopatologia na cultura celular, enquanto o biótipo CP faz. É o biótipo não citopatogênico que persiste na população bovina (principalmente dentro dos bezerros PI) e, posteriormente, dá origem ao biótipo

15 14 citopatogênico. Isso ocorre através de uma variedade de eventos de mutações espontaneamente. O biótipo citopatogênico também pode surgir através da recombinação com outras cepas do BVDV (HOUE; LIMDBERG; NOENNIG, 2006). O BVDV raramente infecta os fetos de bovinos soropositivos. Apenas durante a viremia de infecções agudas ou persistentes em gestantes seronegativas é que o vírus invade o placentoma e replica no trofoblasto antes de atravessar para o feto. Na ovelha, o BVDV demonstrou danos o endotélio vascular materno dentro de 10 dias de vida. A infecção e os detritos celulares resultantes são ingeridos pelo trofoblasto fetal e isso foi considerado um mecanismo da transferência de vírus da ovelha para a prole, mas também pode dar origem a placentites que leva ao alto nível de aborto após infecção por Pestivirus (HOUE; LIMDBERG; NOENNIG, 2006). A Infecção durante o primeiro trimestre (0 a 1210 dias) da vida fetal pode resultar em abortos, danos congênitos ou o nascimento dos bezerros PI, durante o segundo trimestre (111 a 180/200 dias) pode haver danos congênitos e perda fetal. Durante o terceiro trimestre o feto é imunocompetente e capaz de montar uma ativa imunidade de resposta ao vírus (HOUE; LIMDBERG; NOENNIG, 2006). O tempo necessário para a passagem de vírus em bovinos gestantes para feto é variável, mas os abortos devidos a BVDV foram mostrados experimentalmente para ocorrer dentro de 10 a 18 dias da infecção intramuscular (RADOSTITS; GAY; HINCHCLIFF, 2007). Infecção experimental do útero com o biotipo citopatogênico não resulta em abortos ou bezerros PI, por isso é duvidoso se este biótipo pode até estabelecer no primeiro feto (HOUE; LIMDBERG; NOENNIG, 2006). Segundo Radostits et al. (2002), não há evidências de que os vírus citopatogênicos possam produzir infecções persistentes. Comentado [C12]: PI dias ok 2.4 SINAIS CLÍNICOS A maioria das infecções por BVDV é assintomática, entretanto, cepas de alta virulência produzem manifestações clínicas graves, quando da presença de fatores predisponentes (MEGID; RIBEIRO; PAES, 2016). No diagnóstico clínico os sinais variam desde o início brando até severa doença hemorrágica fatal. Na infecção aguda, existe inevitavelmente uma pirexia, uma leucopenia de cerca de 3 a 7 dias após a infecção e uma recuperação limitada

16 15 de vírus do sangue e secreções nasais durante os primeiros três a 10 dias (HOUE; LIMDBERG; NOENNIG, 2006). Clinicamente a BVD pode ser dividida em doença aguda transitória e doença das mucosas. Na doença aguda transitória os sinais clínicos podem incluir hipertermia, inapetência, prostração, linfadenopatias, corrimento nasal, diarreia aquosa e diminuição na produção de leite (MEGID; RIBEIRO; PAES, 2016). Na síndrome hemorrágica que ocorre na doença aguda transitória, causada por cepas não citopatogênicas, resulta em diarreia sanguinolenta, epistaxe e petéquias na boca, esclera e vagina. Úlceras oronasais, na coroa do casco e região interdigital também podem ser observadas (MEGID; RIBEIRO; PAES, 2016). Na doença das mucosas, que ocorre apenas em animais PI, os sinais característicos são diarreia aquosa escura, lesões erosivo-ulcerativas e depleção grave dos tecidos linfoides, que leva os animais a morte em poucos dias (MEGID; RIBEIRO; PAES, 2016). A infecção transplacentária pode causar morte embrionária (reabsorção) e fetal (4 a 6 semanas) causando abortamento poucos dias após a infecção (MEGID; RIBEIRO; PAES, 2016). A morte embrionária precoce, infertilidade e repetição de cios nas vacas são sequelas frequentes da infecção por Pestivírus durante a gestação (MCGOWAN et al., 1993), e defeitos congênitos podem ocorrer quando a infecção fetal se dá entre 100 a 150 dias de gestação (MEGID; RIBEIRO; PAES, 2016). O BVDV provoca retardo significativo no crescimento intrauterino em muitos dos tecidos fetais, em particular a central sistema nervoso (SNC), sistema esquelético e timo. Hipomielinização no SNC, associado a hipoplasia cerebelar, também foi observada. Lesões oculares, principalmente cataratas, foram observados em infecções a campo e experimental por BVDV (HOUE; LIMDBERG; NOENNIG, 2006). Entre as anomalias congênitas podem ser citadas a ocorrência de hipoplasia cerebelar, microcefalia, hidroencefalia, mielinização deficiente da medula espinhal, atrofia ou displasia de retina, catarata, microftalmia, bragnatismo, artrogripose e hipotricose (MEGID; RIBEIRO; PAES, 2016). 2.5 DIAGNÓSTICO

17 16 O teste de escolha em uma situação particular dependerá da idade do animal que está sendo testado, se o animal está vivo ou morto, se o veterinário só está interessado em identificar animais PI ou se os animais transitoriamente infectados (TI) também são de interesse (LARSON et al., 2005). O isolamento viral é o teste diagnóstico de excelência e o método recomendado pela OIE (Organização Mundial de Epizootias) em casos de comércio internacional (OIE, 2009). O isolamento viral tem alta sensibilidade e especificidade, quando comparado com os demais métodos de diagnóstico, contudo necessita de cultivo celular, é laborioso, demorado e de alto custo (MEGID; RIBEIRO; PAES, 2016). Os diagnósticos imunoenzimáticos permitem a detecção direta ou indireta do BVDV e resultados em poucas horas, contudo, falso-negativos podem ocorrer se o kit reagente não for adequado para o vírus da região (MEGID; RIBEIRO; PAES, 2016). O ELISA é um teste imunoenzimático que permite mensurar a prevalência da BVD em rebanhos leiteiros e como teste de rotina (RADOSTITS; GAY; HINCHCLIFF, 2007). O ELISA não é capaz de diferenciar entre infecção persistente. Para o gado com resultados de teste positivos, uma segunda amostra deve ser obtida e testada 3 a 4 semanas depois (NJAA et al., 2000; CORNISH et al., 2005). O método de diagnóstico molecular para a detecção do RNA viral após transcrição reversa (RT), pela técnica de reação em cadeia pela polimerase qualitativa (RT_PCR) e quantitativa (qrt_pcr) tem sido mundialmente adotada para o diagnóstico da BVD (MEGID; RIBEIRO; PAES, 2016). A análise molecular pode ser realizada em amostras de tecidos in natura, fixados em formol, ou diretamente do leite, soro, plasma, sangue e sêmen (MEGID; RIBEIRO; PAES, 2016). A prova de imunohistoquímica é uma ferramenta de detecção sensível e específica para os antígenos de BVDV em bovinos a partir de biópsias de pele. Uma das principais vantagens da utilização do teste imunohistoquímico IHC é a possibilidade de identificação de animais PI e sua vasta aplicabilidade, já que é possível testar animais jovens sem que haja a interferência de anticorpos maternos no resultado (SALIKI; DUBOVI, 2004; FLORES, 2007; RADOSTITS; GAY; HINCHCLIFF, 2007).

18 17 O teste de soroneutralização é o mais comumente utilizado e permite quantificar a concentração de anticorpos. Em geral são utilizadas cepas citopáticas do BVDV no teste de neutralização de vírus (VN), entre as quais, as cepas NADL, Singer ou Oregon C24 (MEGID; RIBEIRO; PAES, 2016). A demonstração do anticorpo BVDV fornece uma visão sobre o nível de exposição ao BVDV dentro do rebanho. O diagnóstico em um grupo ou nível de rebanho é importante parte da fase de avaliação inicial de um programa de controle da doença (HOUE; LIMDBERG; NOENNIG, 2006). A soropositividade ao teste de soroneutralização viral indica exposição prévia ao agente viral, por isso em rebanhos onde a vacinação é praticada o valor epidemiológico do teste é limitado, servindo apenas para verificar o status sorológico, a eficácia da vacina e a possível circulação viral no rebanho. Por serem soronegativos, animais PI não são identificados em triagens sorológicas (SALIKI; DUBOVI, 2004; RADOSTITS; GAY; HINCHCLIFF, 2007). Os testes confirmatórios para o estado de PI através do isolamento do vírus (VI) ou PCR de sangue ou soro 3 a 4 semanas após são importantes se um rebanho tiver muitos bovinos PI e a exposição BVDV é extremamente alta, o que pode resultar em testes de gado de TI falsos positivos para o status de PI (MILLER et al., 2004). Deve ser feito o diagnóstico diferencial da BVD para a febre catarral maligna, febre aftosa, estomatite vesicular, varíola bovina, rinotraqueíte infecciosa bovina/vulvovaginite pustular infecciosa (IBR/IPV), língua azul, brucelose, leptospirose, campilobacteriose, língua azul, neosporose, micoplasmose, ureoplasmose, vírus sincicial respiratório bovino e parainfluenza 3, salmonelose, colibacilose, rotavirose e coronavirose (MEGID; RIBEIRO; PAES, 2016). O melhor método de teste para usar em uma situação particular dependerá da idade do animal, se o animal está vivo ou morto, se o veterinário só está interessado em identificar animais PI ou se os animais TI (agudamente infectados) também são de interesse. Além disso, considerações econômicas, como a probabilidade de encontrar um animal PI em uma dada população (prevalência esperada), o custo da presença de um animal PI e o risco econômico de vender um animal PI para um cliente, afetará a estratégia de teste BVD (LARSON et al., 2004). Comentado [C13]:??? duas coletas com estes intervalos? Daí sim! Ok não foi feito

19 PROFILAXIA E CONTROLE Comentado [C14]: Qual significado de uma sorologia positiva? E os títulos? A estratégia mais efetiva para bloquear o ciclo da infecção é imunizar as fêmeas antes da estação reprodutiva, para evitar a infecção transplacentária (MEGID; RIBEIRO; PAES, 2016). A detecção do animal PI é a parte central de todas as estratégias de controle e erradicação; porém muitos rebanhos podem se beneficiar de uma erradicação e programa de vacinação (RADOSTITS; GAY; HINCHCLIFF, 2007). Uma possibilidade importante para minimizar o potencial surgimento de animais PI é separar os terneiros de fêmeas suspeitas ou recém-compradas até que elas e suas respectivas crias possam ser testadas para BVD (MILLER et al., 2004). Como o BVDV é um dos principais causadores de pneumoenterites neonatais em bezerros com menos de 20 dias, como medida de prevenção é necessário o fornecimento adequado de colostro, boas condições de higiene, manejo e conforto animal (MEGID; RIBEIRO; PAES, 2016). Nos rebanhos livres de BVD situados em regiões endêmicas, a vacinação é recomendada e importante para diminuir a possibilidade de surgimento de surtos da doença, o que provocaria grandes perdas econômicas para o produtor. Também se recomenda a vacinação para rebanhos que apresentam sorologia positiva ou casos compatíveis com a patologia clínica da doença. Esta prática também é recomendada para rebanhos que possuem alta rotatividade de animais (FLORES, 2003). A proteção induzida por vacinas é individual e influenciada por fatores como idade, imunocompetência, presença de anticorpos maternos e tipo de vacina administrada (QUINN et al., 2005). A imunoprofilaxia vacinal é parte integrante do controle da BVD, mas não é suficiente se praticada de forma isolada. É necessário ainda o isolamento dos animais doentes e a eliminação dos animais persistentemente infectados (MEGID; RIBEIRO; PAES, 2016). A vacinação e a erradicação são duas rotas para o controle das perdas associadas ao BVDV. No entanto, elas não devem ser consideradas estratégias opostas. A erradicação sozinha leva a um rebanho que, embora livre de BVDV, é vulnerável à reintrodução do vírus. Os programas de vacinação fornecem proteção ao rebanho, mas a vacinação não alterará o status de animais PI, que já estão no

20 19 rebanho antes do início do programa de vacinação, nem a possibilidade de um animal PI ser introduzido no rebanho (HOUE; LIMDBERG; NOENNIG, 2006). Para controlar e erradicar esta doença são necessárias ações conjuntas de manejo, saneamento ambiental, educação sanitária, vigilância epidemiológica e viabilidade de diagnóstico. São também necessárias infraestrutura adequada e recursos financeiros para que o controle seja efetivo (THRUSFIELD, 2004).

21 20 3 METODOLOGIA Foram escolhidas duas propriedades leiteiras, situadas na região Noroeste do Rio grande do Sul, que fazem parte da Rede Leite, que e possuem históricos de problemas reprodutivos nos bovinos leiteiros, como: repetição de cio com intervalos irregulares, abortos e o nascimento de terneiros fracos, nascimento de terneiros malformados e mumificados. As propriedades selecionadas adotam estratégias sanitárias diferentes, sendo que uma usualmente vacina o rebanho para BVDV e outra não faz a vacinação. Foram realizadas entrevistas semiestruturadas com as duas propriedades participantes para levantamento da situação epidemiológica e dos dados técnicos e produtivos dos rebanhos. Os questionários foram previamente testados com outros produtores para facilitar a aplicação. As informações coletadas com os produtores rurais, através do preenchimento do questionário epidemiológico 1 (APÊNDICE A), composto por 30 perguntas, as quais buscavam informações sobre identificação, localização e tamanho da propriedade, a raça predominante e o número de animais, sistema de exploração, tipo de alimentação utilizada, produção total de leite e produtividade dos animais, sistema de cobertura utilizado, da ocorrência de problemas reprodutivos como repetição de cios, abortos, malformações, nascimento de terneiros mortos ou mumificados, da existência de diagnóstico para doenças reprodutivas, se realiza vacinação e em que frequência utiliza vacinas, data da última vacinação e vacina utilizada, se existe o contato com animais de outras propriedades, da existência de barreiras sanitárias ou restrição de acesso para pessoas e animais, da presença de outros animais (além de bovinos) na propriedade, se realiza o controle de roedores e animais silvestres, do acesso de animais a áreas alagadas, cuidado durante o parto, tipo de assistência recebida, os critérios utilizado para o descarte de animais, data de nascimento dos animais, data do último parto, data da última inseminação e número de partos dos animais. As amostras de sangue, dos 11 animais selecionados para a coleta na propriedade A e dos 08 animais selecionados para a coleta na propriedade B, de fêmeas bovinas com idades superiores a 6 meses, foram coletadas através de venopunção da jugular ou coccígea. Foi coletado 10 ml de sangue em tubos estéreis individuais, sem anticoagulante, através do sistema a vácuo com agulhas Comentado [C15]: Sorologia na vacinada?!?! Comentado [C16]: Qual critério de seleção?

22 21 (25 mm x 0,8 mm (21g)). As amostras de sangue foram centrifugadas a rpm/10 min para a separação do soro e estes armazenados sob refrigeração, por 24 horas, para posteriormente serem encaminhadas, sob refrigeração, para o laboratório que realizou os exames. A Soroneutralização (SN) para vírus da Diarreia Viral Bovina (BVDV), com a cepa viral Singer (aproximadamente 100TCID50), foi o exame utilizado para o diagnóstico da BVD nas propriedades analisadas.

23 22 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO Segundo James (2005), a aquisição e disponibilidade de dados continua a ser a principal restrição à aplicação de técnicas disponíveis em epidemiologia e economia veterinária, especialmente a nível populacional. Conforme observado no quadro 1, os dados levantados através da pesquisa semiestruturada registraram a ocorrência de repetição de cio, abortos e má formação fetal nos dois rebanhos analisados, problemas recorrentes em inúmeros rebanhos da região, o que reafirma a pertinência da pesquisa proposta. Quadro 1 Situação epidemiológica dos rebanhos analisados Faz vacinação Última vacinação Situação epidemiológica Tipo de vacina Reposição Má formação fetal Abortos Contato animais vizinhos Produtor A Não Não Não Própria Sim Sim Não Produtor B Sim Mais de 6 Sim Sim Sim meses Viva modificada tipo 1 e 2 Própria e de fora da propriedade Comentado [C17]: Diferencia vacinado de infectado? Fonte: Autor. A decisão do produtor A de realizar a reposição do plantel de fêmeas leiteiras somente a partir dos animais da propriedade reduziu o risco da introdução do vírus. A localização desta propriedade, sem contato dos animais entre potreiros, cria uma barreira efetiva para evitar a introdução do vírus na propriedade via contato direto focinho-focinho. Entretanto, o fato do produtor não realizar um programa de vacinação para a BVD constituição em um risco potencial para o aparecimento de novos casos e conforme Flores (2003), rebanhos não vacinados situados em regiões endêmicas ficam sujeitos a ocorrência de graves surtos e deveriam ser vacinados. A decisão do produtor B de realizar a reposição dos animais também a partir da aquisição de animais de outras propriedades e o fato dos animais da propriedade terem contato direto com animais das propriedades vizinhas são dois fatores que aumentam o risco da circulação do BVDV a partir de animais infectados de outras propriedades. Estudos realizados por Brum et al. (2002), em ovinos e bovinos, avaliando a proteção conferida por vacinas compostas por vírus vivo modificado com BVDV-2 Comentado [C18]: Usar termos técnicos Comentado [C19]: Recomendaria testar animais antes de serem introduzidos nas propriedades?

24 23 (tipo 2), esta conferiu maior proteção fetal, mesmo com titulações mais baixas. Portanto, o tipo de vacina utilizada pelo produtor B é uma escolha adequada, uma vez que a proteção fetal aumenta a efetividade no programa de controle da doença. Em função do intervalo entre vacinações, o programa de vacinação utilizado na propriedade B mostra-se inadequado para garantir altos níveis de proteção antigênica, fato comprovado pelos resultados sorológicos apresentados no quadro 2. Os distintos procedimentos sobre a adoção da vacinação para a BVD, onde a propriedade A não vacina os animais e a propriedade B vacina, reafirma as observações de Souza (2015), que cita diferentes modos de proceder, com respeito a BVD, de produtores de leite em uma mesma região. Comentado [C20]: Qual motivo? No quadro 2 não tem sorologia Quadro 2 Situação epidemiológica da propriedade Produtor A Produtor B Fonte: Autor. Sistema de criação Semiconfinado Semiconfinado Utiliza pastagem Situação epidemiológica Outros animais na propriedade Barreira sanitária Piquete parição Acesso a áreas alagadas Controle de roedores e animais silvestres Sim Sim Não Não Não Sim Sim Sim Não Sim Não Sim Conforme demonstra o quadro 2, observa-se que nas duas propriedades estão sendo adotados diversas práticas recomendadas visando reduzir o risco da ocorrência das doenças. O isolamento das áreas alagadas e com água parada e o controle de roedores e animais silvestres tem grande relevância no controle de doenças reprodutivas. Da mesma forma, a utilização do piquete de parição pelo produtor B e o acompanhamento do parto, com fornecimento adequado de colostro, é fundamental para melhorar a proteção imunológica dos animais recémnascidos, práticas estas que o produtor A não adota. O inquérito epidemiológico vem de encontro às afirmações de diferentes autores que citam que para que alcançar uma boa efetividade no controle das doenças reprodutivas é necessário a implementação de diferentes ações de manejo, saneamento ambiental e vigilância sanitária, e que estas não são utilizadas da mesma forma pelo conjunto de produtores de uma mesma região. Comentado [C21]: Quais? Comentado [C22]: Citar

25 24 O sistema de criação semi-intensivo, com suplementação de concentrado e acesso dos animais aos piquetes com pastagem, ainda predominante na Mesorregião Noroeste ddo Rio Grande do Sul, possivelmente vem contribuindo para a menor disseminação do BVDV nesta região, fato constatado em estudos, apresentados em boletim, técnico por Souza et al. (2017). Comentado [C23]: Por que menor em semi-intensivo? Tabela 1 Desempenho técnico e produtivo dos rebanhos analisados Índices técnicos e produtivos Raça * Vacas ** Idade *** DEL Dias vazio Litros/ IPa vaca/dia Produtor A Jersey 21 4, ,83 14,4 Produtor B Holandesa 36 4, ,06 22,2 Legenda: * Vacas em lactação, ** Idade em anos, *** DEL: dias em lactação, **** IPa: Intervalo entre partos em meses. Fonte: Autor. Segundo Smith e Legates (1962), as vacas de alta produção têm mais dificuldades para conceber do que as de baixa produção. Esta observação foi confirmada comparando os dados de produção e intervalo entre partos entre as duas propriedades e que estão mostradas na tabela 1, onde o intervalo entre partos das vacas Jersey do produtor A foi de 12,83 meses e o intervalo entre parto das vacas holandesas do produtor B foi de 16,06 meses, sendo as médias de produção leite/vaca/dia de 14,4 e 22,2 litros, respectivamente. Conforme proposto por Ferreira e Teixeira (2000), é possível estimar as perdas de produção de leite levando-se em consideração o intervalo entre partos através da seguinte equação: VPL = (IPa IPd)/IPd x 100, onde VLP = variação na produção de leite (%), IPa = intervalo entre-partos atual, IPd = intervalo de parto desejado. Analisando os índices técnicos apresentados na tabela 1, para o produtor A estima-se uma perda de produção de apenas 6,9% em função do intervalo entre partos, podendo afirmar que o índice reprodutivo tem pequeno impacto na média da produção de leite do rebanho. Na propriedade B estima-se que o impacto do intervalo entre partos esteja ocasionando uma perda de 33,8% da produção, o que equivale a 270 litros diários. Nesta propriedade se observa o grande impacto dos baixos índices reprodutivos sobre a eficiência produtiva do rebanho. Comentado [C24]: E a influência racial? Comentado [C25]: Excelente!

26 25 Tabela 2 Percentual (%) de título sorológico para BVDV nos animais analisados % animais Propriedade A % animais Propriedade B Titulação < 1: > , ,5 37,5 12,5 12,5 0 Fonte: Autor. Os títulos sorológicos notadamente muito baixos na propriedade A mostram a ausência de anticorpos de proteção para o BVDV, que se deve pela não utilização de vacinas para BVD e da ausência de vírus circulante na propriedade. Conforme citado por Radostits, Gay e Hinchcliff (2007), rebanhos que apresentam resultados sorológicos negativos podem ser resultado da ausência de animais PI na propriedade. A ocorrência de abortos na propriedade A sem a presença de anticorpos para o vírus da BVD vem de encontro ao que foi relatado por Souza (2015), onde o BVDV não foi o principal agente associado aos abortos na Região Noroeste do Rio Grande do Sul. O título sorológico para BVDV na propriedade B deve-se provavelmente a resposta imunitária frente à vacina utilizada, uma vez que, conforme Anzielo (2015), a imunogenicidade do BoHV-1 da maioria das vacinas comerciais produz uma adequada imunização dos animais quando são utilizadas de maneira correta. Os resultados identificados neste trabalho e demonstrados na tabela 2 mostram, apesar do pequeno número de propriedades estudadas, que provavelmente o BVDV não está homogeneamente distribuído na Região Noroeste do Rio Grande do Sul e ainda está ausente em várias propriedades leiteiras, reafirmando uma menor prevalência do BVDV na região, conforme constatado por Souza (2015). Comentado [C26]: BVDV e BoHV-1?!?!?! Comentado [C27]: Não pode afirmar isso provavelmente

27 26 5 CONCLUSÃO Apesar da existência de diferentes técnicas para o diagnóstico da BVD, o teste de soroneutralização mostra-se muito válido, conforme afirmam Houe, Limdberg e Noennig (2006), especialmente como teste inicial das campanhas para classificar o status do rebanho, sendo também útil como testes de acompanhamento para identificar animais PI individuais em rebanhos infectados e para o contínuo monitorando para confirmar o status BVDV-free. Com relação ao risco para a ocorrência da BVD, observamos que na propriedade A o sistema utilizado é semi-intensivo, com menor número de animais por hectare, que a propriedade utiliza pastagens para a alimentação dos animais, o que diminui o contato doa animais nariz com nariz, a reposição dos animais de produção se dá a partir da produção própria e os animais não tem contato com animais dos vizinhos. A não ocorrência destes fatores risco na propriedade A diminui a probabilidade da ocorrência da doença e explicaria a baixa titulação para BVDV apesar desta estar na mesma mesorregião da propriedade B. As medidas de controle sanitário adotadas pelas propriedades estudadas temas medidas de controle sanitário adotadas pelas propriedades estudadas têm se mostrado suficientes para evitar a introdução do BVDV no rebanho A embora o deixe susceptível ao surgimento de surtos de BVD que causariam elevadas perdas econômicas. As medidas de controle sanitário mostram-se insuficientes para a proteção do rebanho da propriedade B frente ao risco de perdas em função do BVDV uma vez que existe vírus circulantes na propriedade e parte do rebanho apresenta títulos sorológicos insuficientes para uma adequada proteção. Observamos que na propriedade B existe a presença de anticorpos anti- BVDV o que remete às duas possibilidades. A primeira é que esteja ocorrendo a circulação do vírus na propriedade e a segunda é que esta titulação seja resultante da resposta frente a vacina utilizada. O esquema de vacinação observado nos rebanhos analisados mostrou deficiência no que diz respeito ao uso e frequência das vacinações. Na propriedade A a ausência de titulação anti-bvdv, estando está localizada em região endêmica para o BVDV, aumenta o risco da ocorrência de surtos e grandes perdas econômicas. Na propriedade B o programa de vacinação adotado não garante

28 27 suficiente proteção para os animais, especialmente para as fêmeas em período de reprodução. Os exames sorológicos (soro-neutralização) realizados nas propriedades A e B descartam a possibilidade da presença de animais persistentemente infectados (PI) nas criações pelo vírus da diarreia viral bovina (BVDV). A grande maioria dos animais foi negativa ou apresentou títulos baixos não caracterizando assim a presença de uma infecção persistente. A causa dos problemas reprodutivos deve ser atribuída provavelmente a outros agentes. Pelos resultados sorológicos obtidos pode-se afirmar que o BVDV não é o agente etiológico causador dos problemas reprodutivos nos rebanhos analisados. A baixa titulação no teste de soroneutralização constatada nos dois rebanhos estudados não justificou a utilização de outros métodos de diagnóstico para BVD, a fim de conhecer o status sanitário dos animais ou a existência de animais PI. Com base neste estudo as medidas de controle e prevenção devem também ser direcionadas para as outras possíveis causas dos problemas reprodutivos, sem negligenciar o impacto negativo que a BVD pode causar na reprodução.

29 28 BIBLIOGRAFIA ANZILIEROL, D. et al. Resposta sorológica aos herpesvirus bovino tipos 1 e 5 e vírus da diarreia viral bovina induzida por vacinas comerciais. Ciência Rural, 45(1):58-63, jan BAKER, J. C. The clinical manifestations of bovine viral diarrhea infection. Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract, 11: , BEZEK, D. M.; STOFREGEN, D.; POSSO, M. Effect of cytopathic bovine viral diarrhea virus (BVDV) superinfection on viral antigen association with platelets, viremia, and specific antibody levels in two heifers persistently infected with bvdv. J Vet Diagn Invest, 7: , BOTTON, S. A. et al. Antigenic characterization of Brazilian isolates of bovine viral diarrhea virus (BVDV) with monoclonal antibodies and by cross-neutralization. Braz. J. Med. Biol. Res., 31: , BROCK, K. V. et al. Changes in levels of viremia in cattle persistently infected with bovine viral diarrhea virus. J Vet Diagn Invest, 10:22-26, BROCK, K. V. et al. Quantification of bovine viral diarrhea virus in embryo transfer flush fluids collected from a persistently infected heifer. J Vet Diagn Invest, 3:99-100, BROWNLIE, J. et al. Pathogenesis and epidemiology of bovine virus diarrhoea virus infection of cattle. Annls Rech Vet, 18: , BRUM, M. C. S. et al. Proteção fetal frente a desafio com o vírus da diarreia viral bovina (BVDV) em ovelhas prenhes imunizadas com duas amostras de vírus atenuadas experimentalmente. Pesquisa Veterinária Brasileira, 22(2):64-72, CORNISH, T. E. et al. Comparison of ear notch immunohistochemistry, ear notch antigen-capture-elisa, and buffy coat virus isolation for detection of calves persistently infected with bovine viral diarrhea virus. J Vet Diagn Invest, 17: , DUFFELL, S. J.; HARKNESS, J. W. Bovine virus diarrhea mucosal disease infection in cattle. Vet Rec, 117: , FERREIRA, A. M.; TEIXEIRA, N. M. Estimativas de mudanças na produção de leite com a variação do intervalo de partos em rebanhos bovinos. Revista Brasileira de Reprodução Animal, 24: , FLORES, E. F. et al. A infecção pelo vírus da diarreia viral bovina (BVDV) no Brasil histórico, situação atual e perspectivas. Pesq. Vet. Bras., 25: , 2005.

30 FLORES, E. F. Vírus da diarreia viral bovina (BVDV). Arq. Inst. Biologia, 65:3-9, HOUE, H. Economic impact of BVDV infection in dairies. Biologicals, 31: , HOUE, H. Epidemiology of bovine viral diarrhea virus. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Pratice, 11: , HOUE, H.; LIMDBERG, A.; NOENNIG, V. Test strategies in bovine viral virus control and erradication campaigns in Europe. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 18(5): , JAMES, A. The state of veterinary epidemiology and economics. Preventive Veterinary Medicine, 67(2-3):91-99, feb LARSON, R. L. et al. Bovine viral diarrhea (BVD): review for beef cattle veterinarians. Bov Pract, 38:93-102, LARSON, R. L. et al. Considerations for bovine viral diarrhea (BVD) testing academy of veterinary consultants (AVC) ad hoc BVD committee. Bov Pract, 39(2):96-100, LAZZARI, F. C.; BARTHOLOMEI, L.; PICCININ, A. Diarreia viral bovina. Rev. Cient. Eletr. Med. Vet., 6:10, LOKEN, T. Ruminant pestivirus infections in animals other than cattle and sheep. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice, 3: , MEGID, J.; RIBEIRO, M. G.; PAES, A. C. Doenças infecciosas em animais de produção e companhia. 1. ed. Rio de Janeiro: Roca, MEYLING, A.; HOUE, H.; JENSEN, A. M. Epidemiology of bovine virus diarrhea virus. Rev. Sci. Tech. Off. Int Epiz., 9:75-93, MILLER, M. A. et al. Effect of delayed or prolonged fixation on immunohistochemical detection of bovine viral diarrhea virus in ear-notch biopsies. PROC 47th ANNUAL MEETING, AMERICAN ASSOCIATION OF VETERINARY LABORATORY DIAGNOSTICIANS. Greensboro, North Carolina, MOERMAN, A. et al. A long term epidemiological study of bovine viral diarrhea infections in a large herd of dairy cattle. Vet Rec, 132: , NJAA, B. L. et al. Diagnosis of persistent bovine viral diarrhea virus infection by immunohistochemical staining of formalin-fixed skin biopsy specimens. J Vet Diagn Invest, 12: ,

31 OIE. Manual of diagnostic test and vacines for terrestrial animal Available from: < Access on: 20 out QUINN, P. J. et al. Microbiologia veterinária e doenças infecciosas. 1. ed. Porto Alegre: Artmed, RADOSTITS, O. M. et al. Clínica veterinária: um tratado de doenças dos bovinos, ovinos, suínos, caprinos e equinos. 9. ed. Rio de Janeiro: Guanabara, RADOSTITS, O. M.; GAY, C. C.; HINCHCLIFF, K. W. Veterinary medicine: a textbook of the diseases of cattle, horses, sheep, pig and goats. 10. ed. Edinburgh: Saunders Elsevier, p. ROEDER, P. L.; HARKNESS, J. W. BVD virus infection: prospects for control. Vet Rec, 118: , ROEHE, P. M. et al. A situação do vírus da diarreia viral bovina no país. In: SIMPÓSIO INTERNACIONAL SOBRE HERPES VÍRUS BOVINO (TIPO 1 E 5) E VÍRUS DA DIARREIA VIRAL BOVINA (BVDV), 1998, Santa Maria. Anais. Santa Maria: Laboratório de Virologia, SALIKI, J. T.; DUBOVI, E. J. Laboratory diagnosis of bovine viral diarrhea virus infections. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Pratice, 20(1):69-83, SMITH, J. W.; LEGATES, J. E. Relation of days open and days dry to lactation milk and fat yields. Journal of Dairy Science, 45: , SOUZA, G. N. et al. Situação epidemiológica e fatores de risco para problemas reprodutivos em bovinos leiteiros localizados em diferentes mesorregiões do Estado do Rio Grande do Sul 2016/2017. Juiz de Fora: Embrapa Gado de Leite, p. (Embrapa Gado de Leite. Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento, 36). TAUTZ, N. et al. Cytopathogenicity of a pestivirus correlates with a 27-nucleotide insertion. Journal of Virology, 70(11): , THRUSFIELD, M. Epidemiologia veterinária. 2. ed. São Paulo: Roca, THUR, B.; ZLINSKY, K.; EHRENSPERGER, F. Immunohistochemical detection of bovine viral diarrhea virus in skin biopsies: a reliable and fast diagnostic tool. Zentralblatt Veterinaermedizin B, 43: , TRAVEN, M. et al. Primary bovine viral diarrhea virus infection in calves following direct contact with a persistently viraemic calf. J Vet Med B, 38: ,