UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ

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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR ANÁLISES GENÔMICAS (GISH) E CITOGENÔMICAS COMPARATIVAS EM ESPÉCIES DO GÊNERO Passiflora L. GONÇALO SANTOS DA SILVA ILHÉUS BAHIA - BRASIL Setembro de 2017

2 GONÇALO SANTOS DA SILVA ANÁLISES GENÔMICAS (GISH) E CITOGENÔMICAS COMPARATIVAS EM ESPÉCIES DO GÊNERO Passiflora L. Tese apresentada à Universidade Estadual de Santa Cruz como parte das exigências para a obtenção do título de doutor em Genética e Biologia Molecular. Área de Concentração: Genética e Biologia Molecular. ILHÉUS BAHIA - BRASIL Setembro de 2017

3 S586 Silva, Gonçalo Santos da. Análises genômicas (GISH) e citogenômicas comparativas em espécies do gênero Passiflora L. / Gonçalo Santos da Silva. Ilhéus, BA: UESC, xi, 105 f. : il. Orientadora: Margarete Magalhães de Souza. Tese (doutorado) Universidade Estadual de Santa Cruz. Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular. Inclui referências. 1. DNA. 2. Mapeamento cromossômico. 3. Genética vegetal. I. Título. CDD

4 GONÇALO SANTOS DA SILVA ANÁLISES GENÔMICAS (GISH) E CITOGENÔMICAS COMPARATIVAS EM ESPÉCIES DO GÊNERO Passiflora L. Tese apresentada à Universidade Estadual de Santa Cruz como parte das exigências para a obtenção do título de doutor em Genética e Biologia Molecular. Área de Concentração: Genética e Biologia Molecular. APROVADA: 29 de setembro de 2017 Prof a. Dr a. Eliana Regina Forni Martins (UNICAMP) Prof a. Dr a. Fernanda Amato Gaiotto (UESC) Prof a. Dr a. Fátima Cerqueira Alvim (UESC) Prof a. Dr a. Patrícia Nayara Caldas S. Rocha (PMI) Prof a. Dr a. Margarete Magalhães de Souza (UESC Orientadora)

5 DEDICATÓRIA Dedico este trabalho aos meus pais Raimundo e Teresinha, por todo o amor que existe entre nós. ii

6 AGRADECIMENTOS À Deus, pelo dom da vida. Aos meus pais Raimundo e Teresinha, por todo amor, apoio e incentivo durante a minha vida acadêmica. À profª. Drª. Margarete Magalhães de Souza, pela orientação, dedicação, apoio no desenvolvimento deste trabalho e pelos valiosos ensinametos transmitidos. Às Profª. Drª. Fabienne Micheli e Ioná Araujo pela coorientação e suporte durante o doutorado. À Cláusio, pela amizade, pelos conselhos e pela disponibilidade em me auxiliar durante o mestrado e doutorado. Um exemplo que levarei para a minha vida profissional! À Vanessa, por ter se aventurado comigo no mundo do DNA repetitivo. Tivemos uma longa caminhada! À Drª. Sarah Gomes de Oliveira, pelo auxílio com o RepeatExplorer. Aos amigos que o LAMEP me proporcionou (Vivi, Ritinha, Jona, Ritão, Manu, Pedro, Jôsie, Analu, Matu e Aline), com o apoio de vocês essa caminhada se tornou mais fácil. À Dani, pela amizade que existe entre nós e por ter sempre me proporcionado momentos felizes ao longo dessa caminhada. Aos amigos, Thay, Pati e Joedson pela amizade que tornou os meus dias na UESC mais felizes. Aos amigos Jonson e Robson, pela amizade e companheirismo. Aos amigos do Programa de Pós Graduação em Genética e Biologia molecular, pela amizade adiquirida ao longo desses anos. Às secretárias do Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia molecular, Fábricia, Mara e Kátia pela total disponibilidade em resolver as questões burocráticas. Ao técnico de campo Roberto, por toda ajuda na casa de vegetação. À toda minha família, por sempre estarem ao meu lado. iii

7 À Universidade Estadual de Santa Cruz, em especial ao Programa de Pós Graduação em Genética e Biologia Molecular. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB), pela concessão da bolsa de estudos. Muito Obrigado! iv

8 ÍNDICE EXTRATO... viii ABSTRACT... x INTRODUÇÃO... 1 REVISÃO DE LITERATURA Família Passifloraceae e gênero Passiflora Filogenia molecular do gênero Passiflora Citogenética e citogenômica no gênero Passiflora Hibridação Genomica In Situ: origem e evolução de planta Hibridação Genomica In Situ em Passiflora DNA repetitivo: DNA satélite e elementos transponíveis DNA ribossomal 45S (DNAr 45S) CAPÍTULO 1: Relações genômicas entre Passiflora edulis f. flavicarpa e espécies próximas (subgêneros Decaloba e Passiflora) Resumo Abstract Introdução Material e Métodos Material vegetal Preparo de lâminas Extração do DNA e preparo da sonda Hibridação Genomica In Situ (GISH) Fotodocumentação Resultados Discussão Conclusões Agradecimentos Referências CAPÍTULO 2: Low-coverage genome sequencing to identify 45S rdna in Passiflora L. and its chromosomal localization in plants Abstract v

9 1. Introduction Materials and Methods Plant material Extraction of genomic DNA and Next Generation Sequencing (NGS) Identification of the 45S rdna sequences and bioinformatics analysis S rdna amplification Slide preparation Fluorescent In Situ Hybridization (FISH) Quantification of GC content and double staining with fluorochromes CMA 3 and DAPI Image analysis Results Discussion Conclusions Supplementary Materials Acknowledgments Author Contributions Conflicts of Interest References CAPÍTULO 3 Caracterização citogenômica do DNA repetitivo e mapeamento cromossômico comparativo em Passiflora L. usando dados de sequenciamento de baixa cobertura Resumo Abstract Introdução Material e Métodos Material vegetal Extração de DNA genômico e sequenciamento de nova geração Identificação do DNA repetitivo e anotação Preparo de sonda Preparo de lâminas Hibridação in situ Fluorescente Análise de imagem vi

10 3. Resultados Discussão Conclusões Agradecimentos Referências CONCLUSÕES GERAIS REFERÊNCIAS COMPLEMENTAS vii

11 EXTRATO SILVA, Gonçalo Santos da. Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, setembro de Análises genômicas (GISH) e citogenômicas comparativas em espécies do gênero Passiflora L.. Orientadora: Margarete Magalhães de Souza. Coorientadoras: Fabienne Micheli; Ioná Santos Araújo. O gênero Passiflora compreende espécies de relevância econômica, sendo utilizadas para diversos fins, entre eles, produção de frutos, culinária, ornamentação de interiores e exteriores, e uso medicinal. No entanto, no gênero Passiflora as análises citogenéticas e citogenômicas ainda são muito incipientes. Nesse âmbito, o conhecimento da estrutura e organização citológica do genoma, bem como a localização cromossômica de sequências de interesse possibilitará obter avanços importantes para o estudo das relações entre as espécies e na seleção de plantas para o melhoramento. Esse trabalho objetivou investigar a origem evolutiva de P. edulis f. flavicarpa e as relaçãoes genômicas entre as espécies dos subgêneros Decaloba e Passiflora com P. edulis f. flavicarpa bem como identificar, caracterizar e mapear o DNA repetitivo (DNA ribossomal, DNA satélite e elementos tranponíveis) em espécies de Passiflora. No capítulo 1: A origem evolutiva de P. edulis f. flavicarpa e as relaçãoes genômicas entre diversas espécies dos subgêneros Decaloba e Passiflora com P. edulis f. flavicarpa foi investigada. Para o preparo de lâminas, ápices de raízes das espécies foram coletados e pré-tratados com 8-Hidroxiquinolina (8-HQ) e as lâminas foram preparadas pela técnica de esmagamento e mantidas a -20 ºC até a aplicação da Hibridação Genômica In Situ (GISH). Para a investigação da origem de P. edulis f. flavicarpa e análise das relações das espécies dos subgêneros Decaloba e Passiflora com P. edulis f. flavicarpa por meio da GISH, os DNAs genômicos das espécies P. biflora, P. capsularis, P. cervii, P. coriacea, P. micropetala, P. morifolia, P. rubra, P. suberosa, P. alata, P. cincinnata, P. coccinea, P. edulis f. edulis, P. edulis f. flavicarpa, P. ligularis, P. nitida, P. vitifolia, P. foetida e P.sublanceola foram extraidos, e utilizados no preparo de sondas para subsequente mapeamento cromossômico em P. edulis f. flavicarpa. Não foram verificados indícios de que P. edulis f. flavicarpa originou-se por hibridação e foi constatado que as espécies do subgênero Passiflora são muito próximas de P. edulis f. flavicarpa, enquanto que as espécies do subgênero Decaloba possui uma relação muito distante, devido ao baixo nível de DNA compartilhado. No capítulo 2: Foi realizada a identificação do DNAr 45S a partir de dados de viii

12 sequenciamento de baixa cobertura pelo RepeatExplorer em P. alata, P. cincinnata e P. edulis e posterior mapeamento cromossômico através da Hibridação In Situ Fluorescente (FISH) em espécies de Passiflora e a hibridação heterologa em Cucumis melo e Citrus Sunki. Paralelamente foi realizada a quantificação do conteúdo GC nos genes ribossomais e bandamento CMA 3 /DAPI para verificar a relação das regiões ricas em GC com os genes ribossomais 45S. O isolamento do gene ribossomal 26S permitiu a localização cromossômica do locus de DNAr 45S nas espécies de Passiflora, além da localização desse sítio em outras espécies de angiospermas, mostrando que essa nova sonda obtida a partir do isolamento do gene ribossomal 26S pode ser utilizada com sucesso em espécies de plantas. A quantificação do conteúdo GC permitiu evidenciar que os genes ribossomais são as regiões mais ricas em GC (52-63%) no genoma das espécies de Passiflora, quando comparada com o conteúdo de GC dos retrotransposons (38-40%) e da porção gênica (45%). Sendo observado que as bandas CMA + 3 estão restritas aos locus de DNAr 45S. No capítulo 3: A identificação e caracterização do DNA repetitivo foi realizada no RepeatExplorer utilizando dados de sequenciamento de baixa cobertura de P. alata, P. cincinnata e P. edulis e posterior mapeamento cromossômico. Foi observado, que a maior proporção do genoma dessas espécies é composto de DNA repetitivo, 74,70% do genoma de P. alata, 66,86% do genoma de P. edulis e 62,24% do genoma de P. cincinnata, sendo que os retrotransposons LTR (Gypsy e Copia) compõem a maior proporção e o DNA satélite representa apenas uma pequena proporção do genoma. O mapeamento cromossômico dos retrotransposons LTR mostrou que esses elementos repetitivos possuem uma distribuição dispersa ao longo dos cromossomos, enquanto o DNA satélite foi mapeado na região subtelomérica. Essa distribuição sugere que esses elementos repetitivos desempenham papéis importantes na estrutura e organização do genoma das espécies do gênero Passiflora. Além disso, o fato dessas espécies possuírem o mesmo número cromossômico (2n = 18) e tamanho dos genomas diferentes evidenciou que o aumento do tamanho do genoma está relacionado com o ganho de DNA repetitivo. Palavras-chave: DNA repetitivo, FISH, Mapeamento cromossômico, RepeatExplorer ix

13 ABSTRACT SILVA, Gonçalo Santos da. Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, setembro de Genomic (GISH) and cytogenomic comparative analyzes in species of the genus Passiflora L.. Advisor: Margarete Magalhães de Souza. Co-Advisor: Fabienne Micheli; Ioná Santos Araújo. The genus Passiflora comprises species of economic relevance, being used for various purposes, among them, fruit production, culinary, interior and exterior ornamentation, and medicinal use. However, in the genus Passiflora the cytogenetic and cytogenetic analyzes are still very incipient. In this context, the knowledge of the structure and cytological organization of the genome, as well as the chromosomal localization of sequences of interest, will make it possible to obtain important advances in the study of the relations between the species and in the selection of plants for breeding. This work aimed to investigate the evolutionary origin of P. edulis f. flavicarpa and the genomic relationships between the species of the subgenera Decaloba and Passiflora with P. edulis f. flavicarpa as well as to identify, characterize and map repetitive DNA (ribosomal DNA, satellite DNA and transposable elements) in Passiflora species. In chapter 1: The evolutionary origin of P. edulis f. flavicarpa and the genomic relationships among several species of the Decaloba and Passiflora subgenera with P. edulis f. flavicarpa was investigated. For slide preparation, root apices of the species were collected and pretreated with 8-Hydroxyquinoline and the slides were prepared by the crushing technique and maintained at -20 ºC until the application of Genomic In Situ Hybridization (GISH). For the investigation of the origin of P. edulis f. flavicarpa and analysis of the relationships of the species of the Decaloba and Passiflora subgenera with P. edulis f. flavicarpa through GISH, the genomic DNAs of the species P. biflora, P. capsularis, P. cervii, P. coriacea, P. micropetala, P. morifolia, P. rubra, P. suberosa, P. alata, P. cincinnata, P. coccinea, P. edulis f. edulis, P. edulis f. flavicarpa, P. ligularis, P. nitida, P. vitifolia, P. foetida and P.sublanceola were extracted and used in the preparation of probes for subsequent chromosome mapping in P. edulis f. flavicarpa. There was no evidence that P. edulis f. flavicarpa originated by hybridization and it was found that the species of the Passiflora subgenus are very close to P. edulis f. flavicarpa, whereas the species of the Decaloba subgenus has a very distant relation, due to the low level of shared DNA. In x

14 Chapter 2: Identification of the 45S rdna was performed from low coverage genome sequencing data in P. alata, P. cincinnata and P. edulis, and later chromosome mapping by In Situ Fluorescent Hybridization (FISH) in species of Passiflora and heterologous hybridization in Cucumis melo and Citrus Sunki. In parallel, quantification of GC content in ribosomal genes and CMA 3 /DAPI banding was performed to verify the relationship of GC rich regions with 45S ribosomal genes. Isolation of the 26S ribosomal gene allowed the chromosomal localization of the 45S rdna locus in Passiflora species, as well as the localization of this site in other angiosperm species, showing that this new probe obtained from the isolation of the 26S ribosomal gene can be successfully used in plant species. The quantification of the GC content showed that ribosomal genes are the richest regions in GC (52-63%) in the genome of Passiflora species, when compared to the GC content of the retrotransposons (38-40%) and the gene portion (45%). It is observed that the CMA + 3 bands are restricted to the 45S rdna locus. In Chapter 3: Identification and characterization of repetitive DNA was performed in the RepeatExplorer using low coverage genome sequencing data of P. alata, P. cincinnata and P. edulis and subsequent chromosome mapping. It was observed that the highest proportion of the genome of these species is composed of repetitive DNA, 74.70% of the genome of P. alata, 66.86% of the genome of P. edulis and 62.24% of the genome of P. cincinnata, with LTR retrotransposons (Gypsy and Copia) making up the largest proportion and satellite DNA representing only a small proportion of the genome. The chromosomal mapping of the LTR retrotransposons showed that these repetitive elements have a dispersed distribution along the chromosomes, while the satellite DNA was mapped in the subtelomeric region. This distribution suggests that these repetitive elements play important roles in the structure and organization of the genome of the Passiflora species. In addition, the fact that these species have the same chromosomal number (2n = 18) and different genome size, was evidenced that the increase of the genome size is related to the gain of repetitive DNA. Key-words: Repetitive DNA, FISH, Chromosome mapping, RepeatExplorer xi

15 INTRODUÇÃO O gênero Passiflora compreende espécies de grande importância ecológica e econômica, com vários representantes endêmicos da flora brasileira (BERNACCI et al., 2003). A importância econômica se estende desde a utilização direta de espécies, como P. edulis Sims (maracujá-azedo), P. alata Curtis (maracujá-doce) e P. cincinnata Mast (maracujá do mato) para a indústria alimentícia e consumo in natura até a utilização de diversas espécies silvestres como plantas ornamentais. Entre as espécies de maior interesse econômico destaca-se P. edulis, que ocupa mais de 95% da área plantada no Brasil, que é destinada ao mercado de frutas e à indústria de sucos (MELETTI, 2011). Esses fatos são relevantes para o agronegócio e agricultura familiar no Brasil, sendo um forte gerador de renda para o país (MANICA, 2005; IBGE, 2015). Embora no Brasil o maracujá seja conhecido principalmente pelo consumo do fruto, grande parte do germoplasma silvestre pode ser utilizado na ornamentação, como é feito na Europa (VANDERPLANK, 2000; ABREU et al., 2009). O marucujá também pode ser utilizado como matéria prima para a indústria farmacêutica, devido à presença de um composto denominado passiflorina, que funciona como um calmante natural (FAUSTINO et al., 2010). Os maracujazeiros são considerados ornamentais devido à sua beleza única, com flores exóticas e folhagens diversificadas, e desde sua introdução no velho mundo, em 1625, as passifloras têm sido usadas para decorar estufas e jardins europeus e americanos (ABREU et al., 2009). Muitas espécies são utilizadas para ornamentação de pérgulas, muros, dentre outros (VANDERPLANK, 2000). Diversos estudos já foram realizados no sentido do conhecimento da diversidade cariotípica e genética de espécies silvestres e cultivadas do gênero Passiflora (MELO et al., 2001; SILVA et al., 2014; MELO et al., 2017). Contudo, apesar das contribuições que as análises cariotípicas promoveram para a compreensão da diversidade no gênero, pouco se conhece sobre a estrutura genômica e distribuição da heterocromatina. A carência de dados relacionados à organização genômica e estrutural da cromatina limitam a localização de genes, contigs e sequências repetitivas, que podem ser aplicáveis à análise sintênica e na colinearidade entre genomas de espécies do mesmo gênero. Tais abordagens têm sido realizadas em espécies com grande importância econômica, como por exemplo, Solanum 1

16 lycopersicum L. (tomate) e S. tuberosum L. (batata) promovendo a localização física de sequências e a comparação da sua distribuição entre mapas físicos (TANG et al., 2008). Em P. edulis, um estudo recente analisou sequências inseridas em BACs (Bacterial Artificial Chromossome), sendo observado que 19,6% dessas sequências correspondem a DNA repetitivo (SANTOS et al., 2014). Diante disso, uma caracterização global do DNA repetitivo de espécies pertencentes ao gênero Passiflora, será de grande utilidade para o entendimento da estrutura e organização do genoma dessas espécies, que associada ao mapeamento cromossômico permitirá obervar a distribuição do DNA repetitivo ao longo do genoma. Além disso, essas informações poderão ser úteis ao melhoramento de passifloras, auxiliando na seleção de genótipos de interesse. Em plantas com genomas grandes, as sequências moderadamente e altamente repetitivas podem chegar a 90% (LEITCH et al., 1998). Atualmente, a citogenética associada à genômica e algumas ferramentas de bioinformática têm permitido a investigação de sequências repetitivas em genomas de eucariotos (MEHROTRA; GOYAL, 2014). Várias ferramentas de bioinformática têm sido desenvolvidas para análises de sequências repetitivas. Recentemente, foi desenvolvida uma pipeline, denominada RepeatExplorer, que caracteriza elementos repetitivos e identifica sequências moderada e altamente repetitivas em genomas de plantas superiores (NOVÁK et al., 2013). Tendo em vista a necessidade de conhecer a estrutura e organização dos genomas de espécies pertencentes ao gênero Passiflora, esse estudo objetivou elucidar a origem evolutiva de P. edulis f. flavicarpa e as relaçãoes genômicas entre as espécies dos subgêneros Decaloba e Passiflora com P. edulis f. flavicarpa, bem como identificar, caracterizar e mapear o DNA repetitivo (DNA ribossomal, DNA satélite e elementos tranponíveis) em espécies de Passiflora. Nesse sentido, esse estudo permitiu uma melhor compreenção sobre a estrutura e organização do genoma em espécies do gênero Passiflora, possibilitando a obtenção de avanços na cultura do maracujá. 2

17 REVISÃO DE LITERATURA 1. Família Passifloraceae e gênero Passiflora Pertencente à ordem Malpighiales, a família Passifloraceae é composta por cerca de 650 espécies, distribuídas em 17 gêneros (BERNACCI et al., 2013a). As espécies desta família são, em geral, lianas com gavinhas, que habitam os trópicos e subtrópicos, no entanto algumas espécies podem ser arbustos ou árvores (BERNACCI et al., 2013a). Quatro dos 17 gêneros, aceitos atualmente para a família Passifloraceae, ocorrem no Brasil: Ancistrothrysus Harms, Mitostemma Mast., Dilkea Mast. e Passiflora L, com 149 espécies (BERNACCI et al., 2013b). No entanto, com a descoberta de novas espécies, esse número continua crescendo, tais como Passiflora kikiana Cervi & Linsingen (CERVI; LINSINGEN, 2010), P. cristalina Vanderpl. & Zappi (VANDERPLANK; ZAPPI, 2011) P. cacao Bernacci & M. M. Souza (BERNACCI; SOUZA, 2012) e P. pottiae Cervi & Imig (CERVI; IMIG, 2013). As principais características das espécies que compõem a família Passifloraceae, são a presença de gavinhas axilares utilizadas para sustentação em outras árvores, glândulas nos pecíolos e na superfície foliar, flores que apresentam cores variadas, com pétalas e sépalas em número de cinco, androceu com cinco estames e gineceu composto de três estiletes, folhas alternas simples, sementes ariladas. Além dessas características todas as espécies dessa família apresentam flores com uma corona, que é a caracteristica morfológica mais marcante na família (KILLIP, 1938). A maioria das espécies são auto-incompatíveis (AKAMINE; GIROLAMI, 1957) e dependem da ação de polinizadores, entre eles as mamangavas (Xylocopa spp.), que são os agentes polinizadores mais eficientes para as passifloráceas (RUGGIERO, 1980), beija-flores (Ensifera ensifera) (LINDBERG; OLESEN, 2001), morcegos, vespas e abelhas (BERNACCI et al., 2013a). No entanto, a abelha africana Apis mellifera prejudica a polinização, sendo considerada uma praga em lavouras de maracujazeiros (P. edulis f. edulis e P. edulis f. flavicarpa), uma vez que, devido ao seu pequeno porte não consegue realizar uma polização eficiente, danificando a flor na busca pelo néctar, causando prejuízos nas lavouras de maracujá (BRUCKNER et al., 2005). O gênero Passiflora, com 525 espécies, é o maior dentro da família Passifloraceae (CERVI; IMIG, 2013), sendo o Brasil, um importante centro de diversidade do grupo, onde são encontradas 137 espécies (BERNACCI et al., 2013b). Na Bahia, o gênero Passiflora é 3

18 representado por cerca de 31 espécies, com uma ampla distribuição, ocorrendo praticamente em todos os biomas do Estado, porém, a Chapada Diamantina e a Floresta Atlântica do Sul do Estado são consideradas os principais centros de diversidade (NUNES; QUEIROZ, 2006). Dentro do gênero Passiflora, existe um grande interesse econômico/agronômico por várias espécies, principalmente para o mercado de frutas. Sendo as espécies P. alata (maracujá-doce), P. cincinnata (maracujá do mato) e P. edulis (maracujá-azedo) as mais importantes no Brasil e a espécie P. ligularis (granadilla) a mais importante na Colômbia. Esses dois países são os mais tradicionais no cultivo do maracujá (FALEIRO; JUNQUEIRA, 2016). Para fins medicinais, as espécies mais utilizadas são P. caerulea e P. incarnata, uma vez que algumas espécies possuem uma alta concentração de um composto denominado passiflorina, um calmante natural (ULMER; MACDOUGAL, 2004). As espécies de maracujazeiro também podem ser utilizadas para a produção de cosméticos (cremes, óleos e perfumes) (PENHA, 2012) e para o mercado de plantas ornamentais, devido à beleza única de suas flores (ABREU et al., 2009). No Brasil, a espécie P. edulis ocupa a primeira posição na produção de maracujá, sendo essa frutífera uma importante geradora de renda para o país. Os dados do ano de 2015 mostraram que a produção de maracujá foi de ha de área colhida e t de produção, com um rendimento de 13,66 t/há. A maior parte da produção de maracujá ocorre na região Nordeste (64.9% da produção), sendo o Estado da Bahia o maior produtor da região Nordeste (42.81% da produção) (IBGE - Produção Agrícola Municipal, 2015). Essa produção coloca o Brasil como maior produtor e consumidor mundial de maracujá, uma vez que a exportação desse fruto para os países europeus e latino-americanos ainda é incipiente (FALEIRO; JUNQUEIRA, 2016). Apesar da grande importância econômica e ecológica do maracujá para o Brasil, no último levantamento sobre espécies ameaçadas da flora do país, foram incluídas seis espécies de maracujá em risco de extinção: P. hatschbachii Cervi, P. imbeana Sacco, P. ischnoclada Harms, P. margaritae Sacco, P. urubiciencis Cervi e P. setulosa Killip (BERNACCI et al., 2013a). Essas espécies estão em risco de extinção devido aos avanços das fronteiras agrícolas, principalmente na região Centro-Norte (FALEIRO; JUNQUEIRA, 2016). O processo de urbanização e expanção da agricultura tem sido um grande problema para muitas espécies de plantas, reduzindo a diversidade genética e o tamanho populacional (FERREIRA, 2005). A consevação do germoplasma ex situ tem sido uma solução para manter conservardos os 4

19 recursos genéticos e permitir o acesso futuro a essas espécies silvestres (ABREU et al., 2009). No Brasil existem diversas instituições científicas e de pesquisa que mantem bancos de germoplasmas de maracujá, sendo elas: EMBRAPA Cerrados, EMBRAPA Mandioca e Fruticultura, EMBRAPA Semi-Árido, Instituto Agronômico de Campinas (IAC), Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC), Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro (UENF), Instituto Agrnômico do Paraná (IAPAR), Empresa de Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural de Santa Catariana, Universidade Federal de Viçosa (UFV), Universidade do Estado do Mato Grosso (UEMG) e Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia (UESB) (FALEIRO; JUNQUEIRA, 2016). 2. Filogenia molecular do gênero Passiflora O gênero Passiflora foi estabelecido por Linnaeus em 1753, em que foram descritas 22 espécies e a primeira classificação infragenérica foi feita por Killip (1938), em que 355 espécies foram organizadas em 22 subgêneros. Posterior a essa classificação foi adicionado um novo subgênero (ESCOBAR, 1989) e mais recentemente uma nova classificação infragenérica, baseada em caracteres morfológicos e ecológicos, foi proposta, com apenas quatro subgêneros: Astrophea (DC.) Mast. (57 espécies), Decaloba (DC.) Rchb. (220 espécies), Deidamioides (Harms) Killip (13 espécies), Passiflora (240 espécies) (FEUILLET; MACDOUGAL, 2004). As análises de filogenia molecular, baseadas em marcadores plastidiais e nucleares, estão mais de acordo com as últimas proposições morfológicas, corroborando total ou parcialmente essa última classificação infragenérica (MUSCHNER et al., 2003; YOUCKTENG; NADOT, 2004; HANSEN et al., 2006; MUSCHNER et al., 2012). A primeira filogenia molecular em Passiflora utilizou três marcadores moleculares: os espaçadores internos transcritos do DNA ribossomal (ITS1 e ITS2), a região espaçadora plastidial entre os genes de RNA tranportador de leucina e fenilalanina (trnl e trnf) e o gene plastidial que codifica a pequena proteína ribossomal 4 (rps4). Nessa análise foram utilizadas 61 espécies, representando 11 dos 23 subgêneros propostos por Killip (1938) e Escobar (1989). Essa filogenia suportou fortemente três (Astrophea, Decaloba e Passiflora) dos quatro subgêneros propostos por Feuillet e MacDougal (2004), no entanto, a posição de subgênero Deidamioides permaneceu indefinida (MUSCHNER et al., 2003). 5

20 Em outra análise de filogenia molecular foi utilizado o gene nuclear que codifica a glutamina sintase expressa no cloroplasto (ncpgs) em 90 espécies, reconhecendo oito subgêneros em Passiflora, denominados Astrophea, Deidamioides, Dysosmia, Granadilla (=Passiflora), Plectostemma (=Decaloba) Polyanthea, Tetrapathea e Tryphostemmatoides. Dos oito subgêneros reconhecidos nessa filogenia, quatro estão de acordo com a classificação proposta por Feuillet e MacDougal (2004), no entanto, os resultados sugeriram a manutenção de quatro subgêneros adicionais propostos por Killip (1938). Nesse trabalho foi observada uma forte relação entre a posição filogenética de diferentes clados e o número cromossômico. O clado 1 (subgênero Astrophea), com n = 12; o clado 2 (subgênero Decaloba), com n = 6 e o clado 3 (subgênero Passiflora) com n = 9. O subgênero Dysosmia, com um número cromossômico variável, n = 9-11, foi considerado como um subgênero separado proximamente relacionado ao subgênero Passiflora (YOUCKTENG; NADOT, 2004). Hansen et al. (2006) analisaram a relação filogenética utilizando dois marcadores cloroplastídicos: gene rpoc1 e os genes de RNA tranportador de leucina e treonina (trnl e trnt). Nessa análise foram utilizadas 61 espécies, representado os 22 subgêneros propostos por Killip (1938) e os quatro subgêneros propostos por Feuillet e MacDougal (2004). Os resultados dessa análise filogenética suportaram a redução dos 22 subgêneros de Killip (1938) para os quatro subgêneros de Feuillet e MacDougal (2004), suportando fortemente a monofilia desses quatro subgêneros. Além disso, foi observado que a evolução no gênero Passiflora está relacionada com o número cromossômico, o subgênero Passiflora com o número ancestral n = 9; o subgênero Decaloba com o número ancestral n = 6 e os subgêneros Astrophea e Deidamioides com n = 12. Na última e mais abrangente análise filogenética em Passiflora, foram investigadas 106 espécies, representado os quatro subgêneros de Feuillet e MacDougal (2004). Foram analisados oito marcadores moleculares: os genes rbcl e rps4, o intron do trnl, os espaços intergênicos dos genes trnl e trnf do genoma plastidial, os introns b/c do gene nad1 e os intros d/e nad5 do genoma mitocrondral e uma porção do gene de DNAr 26S. Nessa análise, o gênero Passiflora foi fortemente suportado como monofilético. Da mesma forma três subgêneros (Astrophea, Decaloba e Passiflora) também foram fortemente suportados, no entanto o subgênero Deidamioides emergiu como parafilético, pois P. tryphostemmatoides apareceu como grupo irmão de Astrophea. Os autores apontaram que esses resultados devem ser considerados com cautela, pois nessa análise foi incluída apenas uma espécie da secção 6

21 Tryphostemmatoides, no entanto, sugerriram uma revisão na classificação infragenérica, colocando Tryphostemmatoides como um novo subgênero (MUSCHNER et al., 2012). 3. Citogenética e citogenômica no gênero Passiflora No gênero Passiflora as técnicas citogenéticas clássicas e moleculares têm sido aplicadas para a compreensão das relações entre as espécies trazendo avanços significativos ao estudo citotaxonômico (MELO et al., 2001, MELO; GUERRA, 2003), evolutivo (VIANA; SOUZA, 2012) e o melhoramento genético (SANTOS et al., 2012; MELO, 2014; MELO et al., 2017). As espécies de Passiflora já analisadas apresentam diferentes números cromossômicos, podendo ser agrupadas de acordo com o número básico (x), sendo x = 6, x = 9, x = 10 e x = 12 (MELO et al., 2001; MELO; GUERRA, 2003). O número básico x = 6 é considerado ancestral dentro do gênero e os demais números básicos são considerados secundários (MELO et al., 2001), porém x = 12 também tem sido considerado como número básico ancestral (HANSEN et al., 2006). Na literatura há vários trabalhos usando dados citogenéticos e moleculares acerca do número básico ancestral para Passiflora (STOREY, 1950; RAVEN, 1975; MORAWETZ, 1986; SNOW; MACDOUGAL 1993; MELO et al., 2001; MELO; GUERRA, 2003; HANSEN et al., 2006; SOUZA et al., 2008). A nível cariotípico, além da descrição de passifloras consideradas diplóides com 2n = 12, 2n = 18, 2n = 20 e 2n = 22 (MELO et al., 2001; SOUZA et al., 2008), também já foram descritos citótipos tetraplóides (2n = 4x = 24), sendo x = 6 (KNIGHT, 1991; BRUNER, 1998; MELO; GUERRA, 2003), hexaplóides (2n = 6x = 36) também com x = 6 (MELO; GUERRA, 2003) ou octaplóides (2n = 8x = 72) e x = 9 (SNOW; MACDOUGAL, 1993; MELO et al., 2001; MELO; GUERRA, 2003). A utilização de técnicas convencionais tem revelado parâmetros cariotípicos comuns aos representantes de determinados níveis taxonômicos de subgênero, série e secção, como por exemplo, a ocorrência de taxa com 2n = 12 e 2n = 18 em espécies do subgênero Decaloba e Passiflora, respectivamente (MELO et al., 2017). Apesar da contribuição da citogenética clássica para estudo do gênero Passiflora, o número cromossômico foi identificado em apenas 13% das espécies já documentadas de acordo com o IPCN chromosome number (GOLDBLATT; JOHNSON, 2011). Contudo, o número de espécies avaliadas está sendo 7

22 ampliado gradualmente com a inclusão de novos dados cariotípicos obtidos pela aplicação de técnicas citogenéticas clássicas e moleculares (VIANA; SOUZA, 2012; MELO et al., 2017). Em passifloras, o simples estabelecimento do número cromossômico pode auxiliar o melhoramento genético através da seleção de espécies para o planejamento de hibridações interespecíficas, uma vez que a seleção de espécies com números cromossômicos diferentes pode levar ao insucesso do cruzamento (CONCEIÇÃO et al., 2011). Além do número cromossômico obtido pela coloração citogenética convencional, a aplicação de outras técnicas citogenéticas clássicas tem auxiliado o estudo genético do gênero, por exemplo, a utilização do bandamento C para a localização da heterocromatina constitutiva e subsequente identificação e delimitação entre as espécies P. edulis e P. cacao Bernacci & Souza (VIANA; SOUZA, 2012). A localização de satélites (constrição secundária) nos cariótipos das passifloras pode ser realizada através da simples coloração com fluorocromos base-específicos CMA 3 e DAPI, uma vez que as bandas CMA + 3 são restritas aos satélites (MELO et al., 2014). A identificação de blocos CMA + 3 /DAPI - tem revelado pouca variação em número, mas grandes variações na localização e posição desses blocos, demonstrando que a aplicação de fluorocromos possibilita uma análise comparativa entre espécies (MELO et al., 2001; MELO et al., 2014). A contribuição da citogenética molecular para a análise comparativa entre espécies e para o apoio a programas de melhoramento é uma atividade incipiente em espécies e híbridos do gênero Passiflora. Todavia, trabalhos realizados com a aplicação da Hibridação In Situ Fluorescente (FISH) (MELO; GUERRA 2003; SOUZA et al., 2010; COELHO et al., 2016; MELO et al., 2017; SILVA et al., 2017 in press) e Hibridação Genômica In Situ (GISH) (MELO et al., 2015; COELHO et al., 2016; MELO et al., 2017; SILVA et al., 2017 in press) foram conduzidos com sucesso em espécies e híbridos de Passiflora. O mapeamento físico de sequências de DNAr 45S e 5S tem revelado a existência de variações em número e localização em função do nível taxonômico e do número cromossômico, permitindo a utilização desta informação na taxonomia e no estudo evolutivo do gênero, contudo esses marcadores citológicos não revelam modificações cromossômicas estruturais (MELO; GUERRA, 2003; VIANA; SOUZA, 2012). Em Passiflora verificou-se a relação entre o número de sítios de hibridação de sondas para DNAr 45S e o nível de ploidia de muitas espécies (MELO; GUERRA, 2003). 8

23 Apenas um trabalho realizando uma abordagem citogenômica, visando à construção de um mapa físico, foi relizado em Passiflora. Nesse trabalho oito genes obtidos a partir de uma biblioteca genômica inserida em BACs e sequenciados pela técnica de BAC-ends foram mapeados em P. edulis utilizando a metodologia de BAC-FISH. O gene ERS2 (Ethylene response sensor; BAC198H23) foi mapeado no braço longo do cromossomo 1. O gene ACO1 (1-Aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase; BAC134H15) foi mapeado no braço curto do cromossomo 3. Os genes CYCD1 (Cyclin-dependent protein kinase regulator) e G3PD (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; BAC125I23 e 215I08, respectivamente) foram mapeados no braço curto do cromossomo 4. Os genes EMB2765 (Embryo defective2765), LOX (Lipoxygenase), MIPS (Myo-inositol 1-phosphate synthase) e NDID (NADP-dependent isocitrate dehydrogenase) apresentaram padrões de hibridação dispersos, preferencialmente nas regiões pericentroméricas e subteloméricas na maioria dos cromossomos, indicando a presença de DNA repetitivo nesses BACs (SANTOS et al., 2014). 4. Hibridação Genômica In Situ: origem e evolução de plantas A técnica de GISH, que surgiu a partir de uma modificação da FISH, se tornou uma das ferramentas mais versáteis da citogenética molecular atualmente. Diferentemente da FISH, que utiliza sequências específicas como sondas (ex.: DNAr 45S e 5S, DNA satélite, elementos transponíveis, sequências teloméricas e genes de cópia única), a GISH utiliza o DNA genômico total de uma espécie como sonda. Dessa forma, essa ferramenta pode ser utilizada para identificação dos genomas parentais em híbridos artificiais ou naturais, na origem e evolução de alopoliploides e no melhoramento de plantas (SILVA; SOUZA, 2013) Para investigar a origem de uma espécie híbrida ou alopoliploide, o DNA genômico total de uma provável espécie doadora é transformada em sonda e hibridada na espécie em análise. O fato da GISH permitir identificar os genomas que deram origem ao híbrido ou alopoliploide torna essa ferramenta muito informativa (visual) na compreenção da origem e evolução de plantas (SILVA; SOUZA, 2013). Camellia reticulata, conhecida mundialmente pelas suas características ornamentais, apresenta uma série poliploide variando de 2n = 2x = 30, 2n = 4x = 60 a 2n = 6x = 90, com o número básico x = 15. Essa espécie foi investigada em relação à presença desses números cromossômicos diferentes. Atrevés da GISH, com a utilização das espécies diploides C. 9

24 reticulata, C. pitardii and C. saluenensis (2n = 2x = 30) que fazem parte do complexo C. saluenensis-pitardii-reticulata foi observada a natureza alopoliploide de C. reticulata com 2n = 60 e 2n = 90. C. reticulata alotetraploide (4x) surgiu da hibridação entre C. reticulata (2x) e C. pitardii (2x) e C. reticulata alohexaploide (6x) surgiu de uma hibridação subsequente entre C. reticulata alotetraploide (4x) e C. saluenensis (2x) (LIU; GU, 2011). O amendoim cultivado (Arachis hypogaea, 2n = 4x = 40, AABB), já era estabelecido como uma espécie alotetraploide. No entanto, através da GISH foi possível encontrar seus prováveis ancestrais diploides. Das sete espécies silvestres próximas analisadas, A. duranensis (genoma A) e A. ipaensis (genoma B) mostraram ser as melhores candidatas como doadoras de genomas, pois apresentaram o padrão de hibridação mais intenso e uniforme quando testada contra o conjunto de cromossomos correspondente (SEIJO et al., 2007). A espécie diploide Emilia sonchifolia (2n = 2x = 10) e a espécie alotetraploide E. fosbergii (2n = 4x = 20), que ocorre na América tropical e subtropical, são as únicas duas espécies de Emilia que ocorrem no Brasil. E. fosbergii apresenta um cariótipo bimodal (10 cromossomos grandes e 10 cromossomos pequenos), sendo os 10 cromossomos pequenos similares aos 10 cromossomos de E. sonchifolia. Na GISH, quando foi utilizada o DNA E. fosbergii como sonda e o DNA de E. sonchifolia como bloqueio (1:30), apenas o lote de cromossomos maiores marcaram intensamente, indicando que os 10 cromossomos menores são oriundos de E.sonchifolia (MORAES; GUERRA, 2010). A relação filogenética entre a manga (Mangifera indica L.) e oito espécies de Mangifera foi observada atraves da comparação do padrão de hibridação do DNA genômico marcado (sonda) das oito espécies nos cromossomos de M. indica. De acordo com o número de sítios de hibridações e intensidades dos sinais, as oito espécies foram divididas em quatro grupos: As espécies do grupo 1 (M. sylvatica, M. flava e M. caloneura), apresentaram sinais de hibridação intensos distribuídos em todos os cromossomos, indicando que essas espécies compartilham muitas sequências em comum. As espécies do grupo 2 (M. cochinchinensis e M. foetida) apresentaram um menor numero de sítios e a intensidade dos sinais de hibridação foram menos intensos quando comparados com o grupo 1. A espécie do grupo 3 (M. gracilipes) apresentou sinais de hibridação fracos. As espécies do grupo 4 (M. griffithii e M. macrocarpa) não apresentaram sinais de hibridação. Dessa forma, as espécies do grupo 1 possuem uma relação muito próxima com M. indica, enquanto as espécies do grupo 4 possuem uma relação muito distante (NISHIYAMA et al., 2006). 10

25 5. Hibridação Genômica In Situ (GISH) em Passiflora O primeiro relato em periódico indexado a respeito do estabelecimento e da aplicação da técnica de GISH em Passiflora foi realizado por MELO et al. (2015), utilizando sonda genômica paterna para a identificação de híbridos F 1 (HD13-133, P. sublanceolata vs. P. foetida e HD15-101, P. gardineri vs. P. gibertii) e híbridos RC 1 (HD e HD18-113, P. sublanceolata vs. HD13-133). Nesse trabalho a técnica de GISH foi aperfeiçoada para permitir a identificação dos híbridos. Para isso diferentes concentrações de DNA de bloqueio, que atuam bloqueando o DNA repetitivo compartilhado entre as espécies genitoras, foram testadas (20X, 40X, 60X e 100X) em relação à sonda. A concentração de DNA de bloqueio de 100X foi a mais eficiente na diferenciação dos genomas parentais, pois quanto menor era a concentração de DNA de bloqueio, maior era a hibridação em todos os cromossomos, não sendo possível identificar o lote cromossômico de cada genitor. Isso ocorreu devido ao fato dessas espécies serem muito próximas e compartilharem uma grande quantidade de DNA repetitivo. Em um híbrido obtido pela EMBRAPA entre duas espécies de grande interesse econômico e agronômico (P. edulis vs. P. cincinnata) não foi possível identificar um lote cromossômico (nove cromossomos) de cada espécie. Sendo identificados três lotes cromossômicos: oito cromossomos oriundos de P. edulis (completamente marcados pela sonda), seis cromossomos parcialmente marcados e quatro cromossomos sem marcação. Esses resultados provavelmente foram obtidos devido à utilização de uma baixa concentração de DNA de bloqueio, pois a hibridação parcial de alguns cromossomos pode ter acontecido, devido ao fato dessas espécies serem próximas e compartilharem uma grande quantidade de DNA repetitivo (COELHO et al., 2016). Recentemente a técnica de GISH em híbridos interespecíficos permitiu não apenas a identificação/confirmação de híbridos artificiais F 1 e RC 1 envolvendo as espécies P. sublanceolata (Genoma-S) e P. foetida (Genoma-F) com potencial ornamental, mas também foi utilizada para a visualização de recombinações cromossômicas em plantas RC 1 e na elucidação da origem da triploidia em um híbrido RC 1. Foram observadas diferenças nos números e nas origens das recombinações cromossômicas (MELO et al., 2017). Da mesma forma, a GISH permitiu a identificação dos genomas materno e paterno em oito híbridos obtidos do cruzamento entre P. gardineri vs. P. gibertii, (SILVA et al., 2017 in press). 11

26 6. DNA repetitivo: DNA satélite e elementos transponíveis O DNA repetitivo são sequências que estão representadas em múltiplas cópias, podendo chegar a milhares de cópias no genoma (MEHROTRA; GOYAL, 2014). A porção do DNA repetitivo em angiospermas pode corresponder até 90% do tamanho do genoma destes organismos (LEITCH et al., 1998). Inicialmente o DNA repetitivo pode ser dividido em duas classes, sequências repetitivas dispersas (elementos tranponíveis) e em tandem (DNA satélite, DNAr 45S e 5S e telômeros), considerando os mecanismos de evolução e distribuição ao longo do genoma para essa classificação (SLAMOVITS; ROSSI, 2002). O DNA satélite, levando-se em consideração o tamanho do monômero (unidade de repetição) e o seu arranjo no genoma, pode ser classificado em três grupos distintos: microssatélites (2-5 bp), variando de unidades de repetição; minissatélites (6-100 bp), com as unidades de repetição variando de 0,5 a 30 kb; e DNA satélite, com o tamanho do monômero variando entre pb na maioria das plantas e animais e as unidades de repetição podendo chegar a 100 Mb (MEHROTRA; GOYAL, 2014). Os DNAs satélites receberam essa denominação a partir do seu isolamento, que inicialmente era realizado em bandas após o gradiente gerado por centrifugação (TEK et al., 2005). As características principais do DNA satélite são a elevada distribuição em tandem de monômeros e sua localização na heterocromatina (PLOHL, 2010). Os tamanhos dos monômeros de sequências satélites que apresentam um comprimento variável, geralmente entre pb, pode estar relacionado com número de pares de base necessários a contornar um nucleossomo. O mapeamento físico do DNA satélite em diversas espécies vegetais demostraram que essas sequências estão geralmente localizadas em regiões heterocromáticas centroméricas ou pericentroméricas. Contudo, a distribuição subtelomérica e intersticial também têm sido relatadas (PLOHL, 2010). A função do DNA satélite é pouco conhecida, exceto pela participação destas sequências na estruturação e organização cromossômica. A existência de genes ou fatores de transcrição em regiões de DNA satélites é escassa, com pouca ou nenhuma ativação gênica (MEHROTRA; GOYAL, 2014). Por outro lado, essas regiões são responsáveis pela regulação da transcrição de genes adjacentes a heterocromatina, como observado em Drosophila (ZHIMULEV et al., 1986). O DNA satélite, como unidade repetitiva está associado a diversas funções organizacionais, participando de eventos citológicos, como por exemplo, a 12

27 movimentação cromossômica, condensação centromérica, pareamento, rearranjo e recombinação cromossômica e a interação entre a cromatina e suas proteínas associadas (MEHROTRA; GOYAL, 2014). Os elementos tranponíves são uma classe de DNA repetitivo com a característica única de movimentação genômica, podendo influenciar a expressão gênica e a expressão de determinadas características fenotípicas. O início das pesquisas com os elementos de transposição se deu na década de 40 por Bárbara McClintock e seus trabalhos com milhos, demostrando que a estrutura genética não é estática, mas susceptível a modificações não necessariamente relacionadas a mutações, quebrando assim um dogma da biologia na época (McCLINTOCK, 1956). No entanto, apenas em 1970 com a descoberta que existiam elementos capazes de remover-se e inserir-se em outros locais no genoma de bactérias e moscas das frutas causando alterações, foi possível identificar os elementos transponíveis como os maiores constituintes dos genomas (BIÉMONT; VIEIRA, 2006) Apesar dos efeitos deletérios da inserção de elementos de transposição em sequências codificantes, esses elementos móveis são responsáveis pela regulação gênica em resposta ao ambiente e a fatores epigenéticos, particularmente em função a estresses ambientais sendo de interesse do melhoramento genético (GRANDBASTIEN et al., 2005; SLOTKIN; MARTIENSSEN, 2007). Os elementos tranponíveis são classificados em duas classes, quanto ao mecanismo de transposição (enzimologia), com a presença ou ausência de um RNA intermediário no processo de transposição. Os elementos tranponíveis da classe I utilizam um RNA intermediário no processo de tranposição, sendo conhecidos como retroelementos ou retrotransposons, e os da classe II, em que o processo de transposição ocorre na forma de DNA, sendo conhecidos como transposons de DNA (WICKER et al., 2007). Nos elementos da classe I, em que a tranposição é feita pela enzima trancriptase reversa, o mecanismo de tranposição é conhecido como copia e cola e nos elementos da classe II, em que a tranposição é feita pela enzima DNA transposase, o mecanismo de tranposição é conhecido como recorta e cola (JURKA et al., 2007) Em plantas os elementos tranponíveis compõem a maior porção do DNA repetitivo, podendo chegar a 80% ou mais no genoma (WICKER et al., 2007). Devido à grande diversidade e variabilidade dos elementos transponíveis, modo de inserção, organização e enzimologia, as classes de elementos tranponíveis podem ser classificadas em subclasse, 13

28 ordem, superfamília, família e subfamília (WICKER et al., 2007). A primeira subdivisão dos retrotransposons da classe I é em relação à presença de LTRs (Ex.: Ty1-Copia e Ty3-Gypsy) e os retrotransposons sem LTRs (Ex.: LINEs e SINEs). Em plantas, os retrotransposons das superfamílias Copia e Gypsy são os mais abundantes e diversificados, representando a maior parte do DNA repetitivo disperso nos genomas (MARCO; MARIN, 2005; WICKER, 2007; KEJNOVSKY et al., 2012) Aspectos genômicos-evolutivos são os principais responsáveis pelo acúmulo de sequências repetitivas em plantas superiores. O acúmulo destas sequências durante o processo evolutivo das angiospermas é fato constatado pelo pequeno conteúdo genômico observado em plantas ancestrais em comparação com as espécies atuais, o que sugere o acúmulo e aumento do genoma ao longo de toda história evolutiva (MEHROTRA; GOYAL, 2014). As variações relacionadas à organização genômica, tipo de sequência de nucleotídeos e localização cromossômica do DNA repetitivo entre os taxa de um determinado gênero são importantes para a compreenção dos eventos evolutivos que representam as distâncias filogenéticas entre as espécies, sendo desta forma, fatores relevantes no estudo genômicocomparativo e na sintenia e coliearidade entre espécies (HAN et al., 2009; KOO et al., 2010; ZHANG et al., 2012; MEHROTRA; GOYAL, 2014). As modificações relacionadas ao DNA repetitivo ocorrem rapidamente em monômeros, os quais são duplicados com o passar do tempo evolutivo, sendo essas alterações específicas para uma espécie ou um grupo taxonômico (KOO et al., 2010). Por outro lado, famílias de DNA satélite se mostram conservadas em alguns gêneros (ANAMTHAWAT-JÓNSSON; HESLOP-HARRISON, 1992). As sequências repetitivas em tandem se originam por mutação de novo e recombinações anormais resultando em duplicações de blocos de DNA repetitivo. Neste caso, as recombinações desiguais são consideradas o mecanismo inicial da duplicação/multiplicação do DNA satélite. De modo geral, após a amplificação de monômeros de DNA satélites, as sequências são inseridas em uma nova região genômica (MEHROTRA; GOYAL, 2014). Devido à rápida modificação em número de cópias e em localização a caracterização do DNA satélite é ideal para a visualização de modificações cromossômicas estruturais em plantas. As informações sobre o DNA repetitivo geralmente são desconsideradas ou sumarizadas em projetos visando o estudo genômico de alta-resolução, limitando as inferências em torno da participação e organização da heterocromatina na composição do 14

29 cariótipo e o estabelecimento de mapas físicos com a inclusão de informações referentes ao DNA repetitivo (PLOHL, 2010). Antes do uso das ferramentas de bioinformática que atualmente estão disponíveis, a maior limitação da inclusão dos dados obtidos de sequenciamento genômico era a identificação do DNA satélite pela presença de monômeros em tandem de baixa variabilidade, dificultando o alinhamento e a obtenção de longos contigs para a avaliação e mapeamento (PLOHL, 2010). No entanto, o sequenciamento do DNA satélite contribuiu para o estudo de genes de alguns organismos (NAKAGI et al., 2004; HOSKINS et al., 2007). A atual disponibilidade de softwares e algoritmos específicos para a análise do DNA repetitivo (NOVÁK et al., 2013), plataformas de análise e de servidores de informação genômica (GOECKS et al., 2010) e bancos de dados de DNA repetitivo, permitem a identificação de sequências repetitivas e outra análise de dados de sequenciamento sem a necessidade da inclusão de informações adicionais ou genomas de referência (NOVÁK et al., 2013). Dados de sequenciamento genômico de última geração têm sido utilizados para a identificação e caracterização do DNA repetitivo (NOVÁK et al., 2010), DNA satélite e de elementos transponíveis (GONZÁLEZ; DEYHOLOS, 2012) em espécies importantes, como Pisum sativum L., Glycine max L. (NOVÁK et al., 2010), Linum usitatissimun L. (GONZÁLEZ; DEYHOLOS, 2012), Solanum tuberosum L. (TORRES et al., 2011) e Olea europeae L. (BARGHINI et al., 2014). O sequenciamento de baixa cobertura genômica tem sido uma excelente estratégia para a identificação de sequências repetitivas. Desta forma, a conveniência da utilização de pouca informação de sequenciamento torna a análise bioinformática menos trabalhosa e demorada. Vários estudos já utilizaram o sequenciamento genômico de baixa cobertura para a identificação de DNA repetitivo, satélites e elementos transponíveis (SVEINSSON et al., 2013; BARGHINI et al., 2014). 7. DNA ribossomal 45S (DNAr 45S) O DNA ribossomal 45S, geralmente referido como DNAr 45S, é um tipo de DNA repetititivo codificante, organizado em tandem, presente em eucariotos, repetidos de dezenas a milhares de vezes. A sua nomenclatura é devido ao coeficiente de sedimentação, em unidades de Svedberg (S). Cada unidade de repetição do DNAr 45S é composta pelas regiões trancritas e não trancritas. As regiões transcritas compreendem o espaçador trancrito externo 15

30 (ETS), os três genes ribossomais (18S, 5.8S e 26S) e os dois espaçadores internos (ITS): ITS1 entre os genes 18S e 5.8S e ITS2 entre os genes 5.8S e 26S. A região não transcrita é composta pela região intergênica (IGS), localizada entre duas unidades de repetição (KOVARIK et al., 2004; EICKBUSH; EICKBUSH, 2007). As regiões gênicas (18S, 5.8S e 26S) é altamente conservada entre diferentes organismos, enquanto as regiões ETS, ITS e IGS são bastante variáveis (LOUGHNEY et al., 1983). Em plantas, alguns autores tem adotado a nomenclatura de DNAr 35S (KOVARIK et al., 2008; GARCIA et al., 2010), além disso, o gene ribossomal maior tem recebido a nomenclatura de 25S, 26S ou 28S (APPELS et al., 1980; UNFRIED; GRUENDLER, 1990; HANSON et al., 1996). Devido a sua alta conservação, o DNAr 45S é um dos marcadores mais utilizados na citogenética de plantas, sendo utilizados em análises comparativas, citotaxonômicas e evolutivas (PEDROSA-HARAND; GUERRA, 2004). Em Passiflora, o DNAr 45S tem sido o marcador mais utilizado, já tendo sido mapeado citogeneticamente em diversas espécies e utilizados em análises comparativas e citotaxonômicas. Nesse trabalho, para padronizar nós adotamos a nomenclatura de 45S e o gene ribossomal maior de 26S, pois é a mais utilizada. 16

31 CAPÍTULO 1: Relações genômicas entre Passiflora edulis f. flavicarpa e espécies próximas (subgêneros Decaloba e Passiflora) Gonçalo Santos Silva, Margarete Magalhães Souza, Cláusio Antônio Ferreira de Melo Resumo A investigação da origem de P. edulis f. flavicarpa e as relações filogenéticas entre algumas espécies próximas no gênero Passiflora (subgêneros Decaloba e Passiflora) foram estabelecidas com a aplicação da Hibridação Genômica In Situ (GISH) baseada no nível de homologia genômica. Os DNAs genômicos de 18 espécies foram utilizadas como sondas, as quais foram hibridadas nos cromossomos de P. edulis f. flavicarpa. Através da técnica de GISH com as sondas das espécies do subgênero Passiflora não foi possível identificar lotes cromossômicos específicos de nenhuma das espécies analisádas. Por outro lado, as sondas das espécies P. edulis f. edulis, P. alata, P. cincinnata, P. coccinea, P. nitida, e P. vitifolia produziram hibridações intensas e uniformes em todos os cromossomos. Sondas genômicas das espécies P. ligularis, P. foetida e P. sublanceolata produziram hibridação mais intensa em quatro sítios teloméricos, correspondentes ao lócus de DNAr 45S, e hibridação dispersa menos intensa ao longo de todos os cromossomos. Quando foram utilizadas as sondas das espécies do subgênero Decaloba: P. biflora, P. capsularis, P. cervii, P. coriacea, P. micropetala, P. morifolia, P. rubra e P. suberosa, a hibridação foi restrita aos sítios de DNAr 45S. Os resultados sugerem que as espécies do subgênero Passiflora compartilham muitas sequências repetitivas, sendo que o genoma das espécies P. ligularis, P. foetida e P. sublanceolata possuem menor relação de similaridade com P. edulis f. flavicarpa. As hibridações restritas aos sítios de DNAr 45S com as sondas das espécies do subgênero Decaloba indicam que esses dois subgêneros divergiram há muito tempo na escala evolutiva do gênero, uma vez que a proporção de DNA repetitivo em comum decresce com divergência evolutiva entre as espécies. Palavras-chave: DNA repetitivo, Evolução, GISH, Relações filogenéticas. 17

32 Abstract The investigation of the origin of P. edulis f. flavicarpa and the phylogenetic relationships between relatives species in Passiflora genus (Decaloba and Passiflora subgenera) were established with the application of Genomic In Situ Hybridization (GISH) based on the level of genomic homology. Genomic DNA from 18 species were used as probes, which were hybridized on P. edulis f. flavicarpa chromosomes. It was not possible to identify specific chromosome subset through the GISH technique with the probes of the species of the Passiflora subgenus. On the other hand, the probes of species P. edulis f. edulis, P. alata, P. cincinnata, P. coccinea, P. nitida, and P. vitifolia produced intense and uniform hybridizations on all chromosomes. Genomic probes of P. ligularis, P. foetida and P. sublanceolata produced more intense hybridization at four telomeric sites, corresponding to the 45S rdna locus, and less intense dispersed hybridization across all chromosomes. When the probes of the species of Decaloba subgenus were used: P. biflora, P. capsularis, P. cervii, P. coriacea, P. micropetala, P. morifolia, P. rubra and P. suberosa, the hybridization was restricted to the sites of 45S rdna. The results suggest that the species of the Passiflora subgenus share many repetitive sequences, and the genome of the species P. ligularis, P. foetida and P. sublanceolata have a lower smilarity relation with P. edulis f. flavicarpa. Hybridizations restricted to the 45S rdna sites with the probes of species of the Decaloba subgenus indicate that these two subgenera have diverged a long time on the evolutionary scale of the genus, since the proportion of repetitive DNA in common decreases with evolutionary divergence between species. Key-words: Repetitive DNA, Evolution, GISH, Phylogenetic relationships. 18

33 1. INTRODUÇÃO Passiflora L., o maior gênero da família Passifloraceae, compreende mais de 525 espécies (CERVI; IMIG, 2013), distribuídas especialmente na região neotropical (ULMER; MACDOUGAL, 2004). A presença de uma corona e um androginóforo confere às flores das espécies desse grupo uma beleza única, que atrai os olhares de horticultores e colecionadores apaixonados por passifloras. Dessa forma, atualmente, além da produção de frutos, as passifloras silvestres são amplamente cultivadas como plantas ornamentais, pois além de sua beleza, apresentam uma ampla diversidade de formas e cores (HANSEN et al., 2006). O gênero Passiflora foi estabelecido por Linnaeus em 1753, em que foram descritas 22 espécies e a primeira classificação infragenérica foi feita por Killip (1938), em que 355 espécies foram organizadas em 22 subgêneros. Posterior a essa classificação foi adicionado um novo subgênero por Escobar (1989) e mais recentemente Feuillet e MacDougal (2004) propuseram uma nova classificação infragenérica, baseada em caracteres morfológicos, com apenas quatro subgêneros: Astrophea (DC.) Mast. (57 espécies) Decaloba (DC.) Rchb. (220 espécies) Deidamioides (Harms) Killip (13 espécies) Passiflora (240 espécies). As filogenias moleculares, baseadas em marcadores plastidiais e nucleares, estão mais de acordo com as proposições morfológicas feitas por Feuillet e MacDougal (2004), corroborando total ou parcialmente essa última classificação infragenérica (MUSCHNER et al., 2003; YOUCKTENG; NADOT, 2004; HANSEN et al., 2006; MUSCHNER et al., 2013). A primeira filogenia molecular em Passiflora suportou fortemente três (Astrophea, Decaloba e Passiflora) dos quatro subgêneros propostos por Feuillet e MacDougal (2004), no entanto, a posição de subgênero Deidamioides permaneceu indefinida (MUSCHNER et al., 2003). Em sua análise de filogenia molecular Youckteng e Nadot (2004), reconheceram oito subgêneros em Passiflora, denominados Astrophea, Deidamioides, Dysosmia, Granadilla (=Passiflora), Plectostemma (=Decaloba) Polyanthea, Tetrapathea e Tryphostemmatoides. Quatro destes estão de acordo com a classificação proposta por Feuillet e MacDougal (2004), no entanto, os resultados sugeriram a manutenção de quatro subgêneros adicionais propostos por Killip (1938). No referido trabalho foi observada uma forte relação entre a posição filogenética de diferentes clados e o número cromossômico. O clado 1 (subgênero Astrophea), com n = 12; o clado 2 (subgênero Decaloba), com n = 6 e o clado 3 (subgênero Passiflora) com n = 9. O subgênero Dysosmia, com um número cromossômico variável, n = 9-11, foi considerado 19

34 como um subgênero separado proximamente relacionado ao subgênero Passiflora (YOUCKTENG; NADOT, 2004). Hansen et al., (2006) analisou a relação filogenética e a evolução do número cromossômico e suportou fortemente a monofilia dos quatro subgêneros propostos por Feuillet e MacDougal (2004). Passiflora com o número acentral n = 9; Decaloba com o número ancestral n = 6 e os subgêneros Astrophea e Deidamioides com n = 12. Na análise filogenética feita por Muschner et al., 2013, três subgêneros (Astrophea, Decaloba e Passiflora) foram bem suportados, no entanto o subgênero Deidamioides, como descrito por Feuillet e MacDougal (2004) emergiu como parafilético, pois P. tryphostemmatoides apareceu como grupo irmão de Astrophea. Os autores sugeriram uma revisão na classificação infragenérica, colocando Tryphostemmatoides como um novo subgênero. A espécie P. edulis f. flavicarpara, conhecida como maracujá amarelo ou azedo, é a espécie economicamente mais importante dentro do gênero Passiflora, sendo responsável por mais de 95% da área plantada no Brasil, que é o maior produtor e consumidor mundial de maracujá (MELETTI et al., 2005). No entanto, a origem dessa forma amarela do maracujá ainda permanece obscura, sendo apontada por Pope (1935) como uma provável espécie híbrida entre a forma roxa do maracujá (P. edulis f. edulis) e outra espécie, possivelmente, P. ligularis. A origem incerta dessa forma amarela do maracujá também foi apontada por Killip como sendo um híbrido ou um mutante silvestre (VANDERPLANK, 2000). Até então, essa hipótese da origem híbrida dessa forma do maracujá não foi testada no âmbito cariotípico, e os prováveis genomas parentais permanecem obscuros. Dentre as ferramentas de citogenética molecular, a Hibridação Genômica In Situ (GISH) consiste na melhor ferramenta para verificar a origem e os seus prováveis parentais (SILVA; SOUZA, 2013). A técnica de GISH é eficiente para a distinção de genomas, mas também tem sido utilizada para a identificação de híbridos naturais e artificiais, sendo necessário o uso de DNA de bloqueio, ou para verificar as relações genômicas entre diferentes espécies, pois detecta predominantemente as sequências de DNA repetitivo que compõe a maior parte do genoma de plantas (SILVA; SOUZA, 2013). Na análise da relação genômica, o DNA genômico de uma espécie é hibridado nos cromossomos de outra espécie próxima ou distantemente relacionada sem a aplicação de DNA de bloqueio (WANG et al., 2016). Os sinais de hibridação não apenas representam as sequências de DNA em comum, mas também mostra a homologia genômica entre duas espécies (RAINA; RANI, 2001). A GISH tem sido amplamente utilizada 20

35 para ilustrar as relações filogenéticas entre diferentes espécies de plantas (TAKAHASHI et al., 1999; MARKOVA et al., 2007; SEIJO et al., 2007; LIU; GU, 2011; MAO et al., 2012; WANG et al., 2016). Esse trabalho objetivou investigar a origem de P. edulis f. flavicarpa bem como verificar as relações genômicas das espécies dos subgêneros Decaloba e Passiflora com P. edulis f. flavicarpa por meio da GISH. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Material vegetal As espécies utilizadas no presente trabalho foram mantidas no Banco Ativo de Germoplasma (BAG-Passifloras), localizado no Campus da Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC), no município de Ilhéus, Bahia, Brasil (long W, lat S, alt 78m) (Tabela 1). 21

36 Tabela 1. Espécies de Passiflora investigadas e sua posição taxonômica de acordo com classificação infragenérica (FEUILLET; MACDOUGAL, 2004), número cromossômico, origem geográfica no Brasil, doador e número do acesso Subgênero Superseção Secão/Serie Espécie n 2 n Localidade (acesso) Decaloba Decaloba Decaloba P. biflora Lam. - - Embrapa Cerrados, DF (549) Decaloba Xerogona P. capsularis L (AMORIM et al., 2014) UFPR (518) Decaloba Xerogona P. cervii Milward-de-Azevedo - - Camacãn, BA (542) Cieca - P. coriacea Juss (MELO et al., 2014) IAC, 492) - - P. micropetala Mart. ex. Mast (MELO et al., 2014) Belém, PA (521) Bryonioides P. morifolia Mast (MELO et al., 2001) Planaltina, DF (547) Decaloba Xerogona P. rubra L (AMORIM et al., 2014) Camacãn, BA (501) Cieca P. suberosa L (SOUZA et al, 2008) BAG-UESC (526) Passiflora Laurifolia Quadrangularis P. alata Curtis 9 18 (SOUZA et al, 2003) UENF Passiflora Passiflora P. cincinnata Mast (SOUZA et al, 2008) Iguaí, BA (535) Coccinea - P. coccinea Aubl (SOUZA et al, 2008) Embrapa Cerrados, DF (528) Passiflora Passiflora P. edulis f. edulis Sims 9 18 (MELO et al., 2001) Livramento de N. Senhora, BA Passiflora Passiflora P. edulis f. flavicarpa Deg (MELO et al., 2003) Mogi das cruzes, SP Laurifolia Tiliifolia P. ligularis Juss (SOUZA et al, 2008) BAG-UESC Laurifolia Laurifoliae P. nitida Kunth 9 18 (SOUZA et al, 2008) Rio de Janeiro, RJ (516) Coccinea - P. vitifolia Kunth 9 18 (MELO et al., 2014) Miranda, MG (481) Stipulata Dysomia P. foetida L (MELO et al., 2017) BAG-UESC (490) Stipulata Dysomia P.sublanceola(Killip) MacDougal (BELO et al., 2015) Embrapa Cerrados, DF (220) 22

37 2.2 Preparo de lâminas Ápices de raízes de P. edulis f. flavicarpa com aproximadamente um centímetro foram coletadas de estacas colocadas para enraizar em sacos contendo areia lavada. As amostras foram pré-tratadas com 8-hidroxiquinolina a 0,002 M por 1 h em temperatura ambiente (TA) e mais 21 h a ± 8-10 ºC. Após lavadas duas vezes em água destilada e fixadas em Carnoy (etanol:ácido acético glacial [3:1], v/v; JOHANSEN, 1940) por 3 h em TA, as amostras foram mantidas a -20 C por pelo menos 24 h ou até sua utilização. Para preparação das lâminas foi seguido o protocolo proposto por Guerra e Souza (2002). Ápices de raízes foram lavados duas vezes em água destilada e incubadas com 15 μl da solução enzimática celulase 2% e pectinase 20% (w/v) por 80 minutos a 37º C. Após a incubação as raízes foram lavadas com água destilada com o auxílio de uma pipeta de Pasteur para a retirada da enzima, e após lavadas em água destilada, foi adicionado 10 μl de ácido acético 45% sobre a raiz. Com o auxílio de agulhas e sob microscópio estereoscópico, as raízes foram maceradas e adicionada uma lamínula sobre o material. Com o auxílio de uma agulha de ponta grossa e papel de filtro o material citológico foi espalhado sobre a lâmina e com o auxílio de papel de filtro a lamínula foi apertada gentilmente com o dedo para espalhamento dos cromossomos. As lâminas foram congeladas em nitrogênio líquido por cerca de 6 minutos e a lamínula foi retirada com o auxílio de um bisturi e secas ao ar. As lâminas com boas preparações metafásicas foram mantidas a -20 C até a aplicação da GISH. 2.3 Extração do DNA e preparo da sonda O DNA genômico das 18 espécies foi extraído usando o protocolo proposto por Doyle e Doyle (1990), com algumas modificações para Passiflora (VIANA et al., 2006). Após a extração o DNA foi fragmentado com o auxílio de um sonicador, gerando fragmentos acima de 200 pb, mas com predominância de fragmentos entre a 200 a 1000 pb. A verificação do tamanho dos fragmentos clivados foi realizada por eletroforese em gel de agarose 2% (Pronadisa) utilizando como parâmetro o marcador ladder 100 pb (NEB, new england biolabs). A marcação da sonda foi realizada por Nick translation com Digoxigenina-16-dUTP (Roche Diagnostics ), na concentração final de 1 μg de DNA clivado, seguindo o protocolo proposto pelo fabricante. 23

38 2.4 Hibridação Genômica In Situ (GISH) A técnica de GISH seguiu o protocolo proposto por Schwarzacher e Heslop-Harrison (2000) e Souza et al (2010), com modificações feitas por Melo et al (2015). Lâminas contendo as preparações citológicas foram secas em estufa (Nova Etica, 403-5N) a 37 C pelo tempo mínimo de 1 h. Após aplicação de 50 µl de RNase (Sigma ) a 1 µg/ml em tampão 2xSSC (cloreto de sódio [Sigma ] a 0,3 M; citrato de sódio [Sigma ] a 0,03 M), as lâminas foram incubadas em câmara úmida por 1 h a 37 C. As lâminas foram imersas em 2xSSC em TA duas vezes por 5 min cada; 50 µl de ácido hidrocloridrico (HCl; Vetec) a 10 mm foi adicionado sobre as metáfases por 5 min, e após retirada do HCl, foi adicionado 50 µl de pepsina (Sigma ) [pepsina a 10 mg/ml; HCl a 10 mm (1:100 v/v)] e as lâminas foram incubadas em câmara úmida por 20 min a 37 C. As etapas de lavagens citadas a seguir foram realizadas em plataforma agitadora (Biomixer, Mos-1) a 120 rpm. As lâminas foram lavadas em 2xSSC em TA duas vezes por 5 min cada, imersas em paraformaldeído (Sigma ) a 4% em TA por 10 min, e novamente lavadas em 2xSSC duas vezes por 5 min cada. As preparações citológicas foram desidratadas em etanol 70% e etanol 96% por 5 min cada. Após a secagem das lâminas em TA por 30 min, foi adicionada a mistura de hibridação com o volume final de 15 µl, contendo formamida (Sigma ) 50%, dextran sulfato (Sigma ) 10%, 2xSSC, dodecil sulfato de sódio (SDS; Bioagency) 0,13% e 50 ng da sonda. A mistura de hibridação foi aquecida a 75 C por 10 min em termociclador (Eppendorf, Mastercycler) e transferida imediatamente para gelo pelo tempo mínimo de 5 min. As lâminas contendo a mistura de hibridação foram desnaturadas em termociclador (Techne, TC-412), contendo um adaptador para lâminas, a 75 C por 10 min e incubadas overnight a 37 C em câmara úmida. Após a hibridação, as lâminas foram imersas em 2xSSC em TA por 5 min para a remoção das lamínulas. Os banhos pós-hibridação a seguir foram realizados em banho-maria (Marconi, MA093/1/E) com agitação, a 42 ºC, com duas imersões em 2xSSC por 5 min cada, duas em 0,1xSSC por 5 min cada, e mais duas imersões em 2xSSC por 5 min cada. As lâminas foram imersas em solução com 4xSSC/Tween 20 (Sigma ) a 0,2% em TA por 5 min e tratadas com 50 µl de albumina de soro bovino, Fração 5 (BSA; Sigma ) a 5%. A sonda foi detectada com 0,7 μl anti-digoxigenina-rodamina (Roche ) mais 19,3 μl de BSA 5% por lâmina As lâminas contendo os anticorpos para a detecção foram incubadas em câmara úmida por 1 h a 37 C. Para a remoção do excesso de anticorpo, foram realizados três banhos por 5 min cada com 24

39 4xSSC/Tween20 a 0,2% em TA. As lâminas foram brevemente imersas em 2xSSC e as preparações citológicas foram simultaneamente montadas e contracoradas com Vectashield Antifade Mounting Medium DAPI (H-1200). As lâminas foram estocadas a C até a análise Fotodocumentação A análise e fotodocumentação foram realizadas com a utilização do microscópio de epifluorescência Olympus BX41 equipado com câmera digital de 5MP Olympus DP25 e com o software DP2-BSW. As hibridações detectadas com anti-digoxigenina-rodamina foram visualizadas com o filtro U-MWG (exitation nm/dichroic cutoff 570nm/emission > 590nm). A contracoloração com DAPI foi detectada com filtro U-MWU (exitation nm/dichroic cutoff 400nm/emission > 420nm) As sobreposições Rhodamine/DAPI foram realizadas no photoshop software SC5. 3. RESULTADOS 3.1 Origem de P. edulis f. flavicarpa A GISH aplicada com a utilização do DNA genômico de P. edulis f. edulis marcado com digoxigenina nos cromossomos de P. edulis f. flavicarpa produziu sinais de hibridação intensos e uniformes em todos os cromossomos, mesmo quando foi utilizado o DNA de bloqueio 100x mais concentrado que a sonda (Fig 1A). No entanto, quando foi utilizado a sonda do DNA genômico de P. ligularis revelou-se maior intensidade de hibridação, apenas em correspondência ao DNAr 45S, e uma hibridação dispersa menos intensa ao longo de todos os cromossomos (Fig 1B). 25

40 Figura 1. GISH em cromossomos metafásicos de Passiflora edulis f. flavicarpa (2n = 18) hibridado com DNA genômico total de (A) P. edulis f. edulis (2n = 18), (B) P. ligularis (2n = 18). As setas verdes indicam os sítios de DNAr 45S. Barra = 10 μm. 3.2 Padrão de hibridação em P. edulis f. flavicarpa com as espécies dos subgêneros Decaloba e Passiflora A GISH utilizando o DNA genômico das espécies do subgênero Passiflora (n = 9): P. edulis f. flavicarpa (Fig. 2A), P. alata (Fig. 2B), P. cincinnata (Fig. 2C), P. coccinea (Fig. 2D), P. nitida (Fig. 2E), e P. vitifolia (Fig. 2F) como sonda, relevou hibridação intensa e uniforme em todos os cromossomos de P. edulis f. flavicarpa. Figura 2. GISH em cromossomos metafásicos de Passiflora edulis f. flavicarpa (2n = 18) hibridado com DNA genômico total de espécies do subgênero Passiflora (n = 9): (A) P. edulis f. flavicarpa, (B) P. alata, (C) P. cincinnata, (D) P. coccinea, (E) P. nitida, (F) P. vitifolia. Barra = 10 μm. 26

41 A técnica de GISH utilizando o DNA genômico das espécies do subgênero Passiflora (n = 11): P. foetida (Fig. 3A-B) e P. sublanceolata (Fig. 3C-D) como sonda, revelou sinais dispersos menos intensos distribuídos ao longo de todos os cromossomos de Passiflora edulis f. flavicarpa, com a presença de blocos pericentroméricos e quatro sítios teloméricos marcados mais intensamente, correspondentes aos sítios de DNAr 45S. Finalmente, quando foi utilizado o DNA genômico das oito espécies do subgênero Decaloba (n = 6): P. biflora, P. capsularis, P. cervii, P. coriacea, P. micropetala, P. morifolia, P. rubra, P. suberosa como sonda, os sinais de hibridação foram restritos aos quatro sítios teloméricos, correspondentes aos sítios de DNAr 45S, presentes no pares sete e nove (Figura 4). Figura 3. GISH em cromossomos metafásicos de Passiflora edulis f. flavicarpa (2n = 18) hibridado com DNA genômico total de espécies do subgênero Passiflora (n = 11): (A-B) P. foetida, (C-D) P. sublanceolata. (A, C) DAPI, (B, D) Rodamina. As setas verdes indicam os sítios de DNAr 45S. Barra = 10 μm. De acordo com o padrão de hibridação, as espécies estudadas foram divididas em três grupos: O grupo 1 foi formado por P. edulis, P. alata, P. cincinnata, P. coccinea, P. nítida e P. vitifolia, que apresentaram um padrão de hibridação intenso e uniforme em todos os cromossomos e estão mais proximamente relacionadas com P. edulis f. flavicarpa; o grupo 2 foi formado por P. ligularis, P. foetida e P. sublanceolata que apresentarm um padrão de hibridação menos intenso e disperso com quatro sítios teloméricos marcados mais 27

42 intensamente (DNAr 45S) e o grupo 3 que foi formado pelas espécies pertencentes ao subgênero Decaloba, com sinais de hibridação restritos aos sítios de DNAr 45S. Figura 4. GISH em cromossomos metafásicos de Passiflora edulis f. flavicarpa (2n = 18) hibridado com DNA genômico total de espécies do subgênero Decaloba (n = 6) (A-C) P. biflora, (D-F) P. capsularis, (G-I) P. cervii, (J-L) P. coriacea (M-O) P. micropetala, (P-R) P. morifolia, (S-U) P. rubra, (V-X) P. suberosa. (A, D, G, J, M, P, S, V) DAPI, (B, E, H, K, N, Q, T, W) Rodamina, (C, F, I, L, O, R, U, X) Sobreposição DAPI/Rodamina. Barra = 10 μm. 28

43 4. DISCUSSÃO A técnica de GISH detecta predominantemente sequências de DNA repetitivo que compõe a maior parte do genoma de plantas (SILVA; SOUZA, 2013), que pode representar mais de 80% em algumas angiospermas (WICKER et al., 2007). Essa ferramenta é bastante informativa em análises evolutivas de plantas, pois fornece o perfil da homologia genômica entre diferentes espécies, compreendendo principalmente o DNA repetitivo compartilhado entre as espécies (TAKAHASHI et al., 1999). Como a espécie P. edulis f. flavicarpa (maracujá amarelo ou azedo) é supostamente apontada como híbrida por Pope (1935) e E. P. Killip (VANDERPLANK, 2000), era esperado que o DNA genômico de uma ou outra espécie parental hibridasse em um lote cromossômico, como mostrado para outras espécies híbridas (SEIJO et al., 2007, LIU; GU, 2011; SILVA; SOUZA, 2013). Nos resusltados mostraram que nenhuma das sondas foi capaz de identificar um lote cromossômico como esperado, dessa forma com a GISH não foi possível a descriminação entre os dois prováveis parentais, P. edulis f. edulis (maracujá-roxo) e P. ligularis (granadilla), ou qualquer outra das espécies próximas analisadas. A sonda de P. edulis f. edulis resultou em um padrão de hibridação uniforme em todos os cromossomos, mesmo quando foi utilizado um DNA de bloqueio 100x mais concentrado que a sonda. Esses resultados mostram que essas duas formas do maracujá tem uma origem em comum, o que indica ser a mesma espécie. Além disso, P. ligularis apresentou um padrão de hibridação dispersa ao longo dos cromossomos diferente das outras espécies 2n = 18, que apresentaram um padrão de hibridação similar ao de P. edulis f. edulis. A espécie P. ligularis é originária da região andina, ocorrendo em uma região com altitude variando entre a e temperatura variando entre 15 e 18 C (BERNAL- PARRA et al., 2014). A menor quantidade de DNA compartilhado (hibridação menos intensa e dispersa) entre P. ligularis e P. edulis f. flavicarpa mostra uma relação mais distante quando comparada com as espécies nativas do Brasil (hibridação intensa e uniforme), provavelmente, é devido ao fato dessa espécie ter se adaptado em uma região com altitude e temperatura completamente diferente das espécies que ocorrem no Brasil. Corroborando com essa hipótese, observa-se que o cultivo dessa espécie em regiões de baixa altitude e temperatura mais elevada não é bem sucedido, como na região Nordeste do Brasil (VANDERPLANK, 2000). Observa-se também que o cruzamento interespecífico envolvendo essas duas espécies não pode ser realizado com sucesso (OCAMPO et al., 2016). O sucesso no cruzamento pode 29

44 ser uma mensuração indireta da similaridade cromossômica e genômica entre as espécies (OCAMPO; D EECKENBRUGGE, 2017). Provavelmente, essa espécie divergiu a mais tempo de P. edulis f. flavicarpa e das demais espécies analisadas nesse trabalho, compartilhando um ancestral mais remoto com essas espécies. Como observado nesse trabalho, a proporção de DNA repetitivo compartilhado diminui com a divergência evolutiva entre as espécies (MARKOVA et al., 2007). A relação entre as espécies do gênero Passiflora é refletida na variação do número cromossômico entre os grupos taxonômicos. As espécies com 2n = 12, 18 e 22 apresentam padrões de hibridações diferentes. No subgênero Passiflora todas as espécies com 2n = 18 nativas do Brasil hibridaram intensamente ao longo de todos os cromossomos de P. edulis f. flavicarpa, enquanto as espécies com 2n = 22 hibridaram dispersamente ao longo dos cromossomos e mais intensamente nos sítios de DNAr 45S. As espécies com 2n = 12 (subgênero Decaloba) apresentaram sítios de hibridação restritos ao DNAr 45S. O padrão de hibridação das espécies nativas do Brasil, com 2n = 18, mostrou que essas espécies são filogeneticamente próximas e compartilham muitas sequências de DNA repetitivo em comum. Claramente essas espécies possuem um ancestral recente, com exceção de P. ligularis. As análises filogenéticas baseadas em marcadores moleculares suportam fortemente a monofilia do grupo com n = 9 (subgênero Passiflora), em que diferentes marcadores plastidiais e nucleares têm agrupado as espécies com o mesmo número cromossômico (YOUCKTENG; NADOT, 2004; HANSEN et al., 2006; MUSCHNER et al., 2012). Da mesma forma, os resultados de GISH desse trabalho sustentam a monofilia desse grupo, além de mostrar que as espécies desse grupo são muito próximas com base na grande quantidade de DNA repetitivo compartilhado. Esses resultados associados à filogenia molecular mostram que a evolução no gênero Passiflora está relacionada à evolução do número cromossômico, sendo n = 9 o número ancestral do subgênero Passiflora (MUSCHNER et al., 2013). As espécies do subgênero Passiflora com 2n = 22 apresentaram um padrão de hibridação diferente das espécies com 2n = 18, compartilhando uma menor quantidade de DNA repetitivo com P. edulis f. flavicarpa. Esse padrão de hibridação dispersa com a presença de bandas (sítios) pericentroméricas mais intensas corresponde às bandas C previamente reportadas por Viana e Souza (2012). Essas bandas podem ser resultado da hibridação ao DNA altamente repetitivo das regiões heterocromáticas pericentroméricas (SHE 30

45 et al., 2007). Esse padrão de hibridação diferente entre as espécies com 2n = 18 e 22 mostra que as espécies 2n = 22 são mais divergentes evolutivamente de P. edulis f. flavicarpa, e consequentemente, não compartilham o mesmo ancestral das espécies com 2n = 18. Como observado, com a divergência evolutiva entre as espécies, o DNA repetitivo disperso compartilhado entre as espécies tende a diminuir primeiro, permanecendo o DNA altamente repetitivo da heterocromatina e o DNAr 45S (MARKOVA et al., 2007). Análises cariológicas previas mostraram que essas espécies, P. foetida e P. sublanceolata aparecem muito isoladas (MELO et al., 2001; MELO; GUERRA, 2003; BELO et al., 2015). Da mesma forma, a posicão de P. foetida, baseada na filogenia molecular, sempre foi problemática dentro do subgênero Passiflora (MUSCHNER et al., 2003; YOUCKTENG; NADOT, 2004). Tanto a filogenia molecular quanto os caracteres morfológicos coloca essa espécie em uma posição altamente divergente das demais (YOUCKTENG; NADOT, 2004, RAMAIYA et al., 2014). Adicionalmente, cruzamentos interespecíficos, que podem ser utilizados na inferência da similaridade genômica entre as espécies, não são bem sucedidos entre P. foetida e qualquer outra espécie do subgênero Passiflora com 2n = 18 (CONCEIÇÃO et al., 2011; OCAMPO et al., 2016), enquanto que os cruzamentos envolvendo P. foetida e P. sublanceolata podem ser realizados com sucesso (SANTOS et al., 2012, MELO et al., 2017). Dessa forma, a filogenia molecular feita por Youckteng e Nadot (2004) e os resultados de GISH desse trabalho suportam a manutenção dessas espécies em um subgênero separado (Dysosmia) proximamente relacionado à Passiflora. A relação entre os subgêneros Decaloba (2n = 12) e Passiflora (2n = 18) mostrou ser muito distante, pois os únicos sinais de hibridação observados usando as sondas genômicas de qualquer espécie de Decaloba foram restritos aos sítios de DNAr 45S em P. edulis f. flavicarpa. Claramente esses dois subgêneros compartilham poucas sequencias de DNA repetitivo em comum. A hibridação restrita ao DNAr 45S corresponde ao caráter dessas sequencias, que são altamente conservadas entre espécies e também entre subgêneros/gêneros (SOLTIS et al., 1999). A dicotomia entre os grupos n = 6 e n = 9 é bem conhecida entre pesquisadores de Passiflora a décadas (HANSEN et al., 2006). Na primeira evidencia molecular que suporta essa dicotomia foi observado que o intron rpoc1 está presente em todas as espécies com n = 9 e ausente nas espécies com n = 6 (DOWNIE et al., 1996). As demais filogenias moleculares suportam fortemente a monofilia desses dois grupos, com as espécies n = 6 restritas ao subgênero Decaloba (MUSCHNER et al., 2003; YOUCKTENG; 31

46 NADOT, 2004; HANSEN et al., 2006; MUSCHNER et al., 2013). Em uma análise biogeográfica foi verificado que o evento de divergência entre Decaloba e Passiflora ocorreu a 38,3 milhões de anos atrás (MUSCHNER et al., 2013). Os nossos resultados de GISH suportam fortemente essa dicotomia e mostram que as espécies desses dois grupos são muito distantes. 5. CONCLUSÕES A análise filogenética baseada no método de GISH em Passiflora favorece o entendimento das relações genéticas na origem de P. edulis f. flavicarpa e entre os subgêneros Decaloba e Passiflora. Sendo que essa análise está mais de acordo com a última classificação, baseada em caracteres morfológicos, proposta por Feuillet e MacDougal (2004) para o grupo e com as filogenias moleculares. Foi observado que a evolução em Passiflora está fortemente relacionada ao número cromossômico. Os resultados de GISH mostraram que três grupos analisados (n = 6, 9 e 11) possuem diferentes padrões de hibridação e que esse padrão está relacionado com a proximidade ou distância entre as espécies. As espécies dos grupos com n = 9 (Passiflora) e 11 (Dysosmia) são proximamente relacionadas, no entanto as espécies do grupo com n = 6 (Decaloba) mostraram ser muito distantes. Além disso, a GISH consiste em uma ferramenta visual, que mostra a quantidade de DNA repetitivo compartilhado entre as espécies. Sendo observado que as espécies do grupo com n = 9 compartilham muito DNA repetitivo. Já o grupo com n = 11, que está mais proximamente relacionado ao grupo com n = 9, compartilha além do DNA repetitivo disperso, uma maior quantidade de DNA repetitivo da heterocromatina e o DNAr 45S, enquanto o grupo com n = 6 compartilha apenas o DNAr 45S com o grupo n = 9, ou seja, através da técnica de GISH foi possível observar que a proporção do DNA repetitivo compartilhado, conforme observado para outras espécies, diminui gradualmente com a divergência evolutiva entre as espécies de Passiflora. 6. AGRADECIMENTOS À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) pela concessão da bolsa de estudo. Ao CNPq pela bolsa de produtividade concedida à Prof. Dra Margarete Magalhães Souza. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior 32

47 (CAPES) e FAPESB pelo suporte financeiro. À Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC) pela infranestrutura. À Mauro Peixoto pela doação de alguns exemplares de espécies de Passiflora. 33

48 7. REFERÊNCIAS AMORIM, J. S.; SOUZA, M. M.; VIANA, A. J. C.; CORREA, R. X.; ARAUJO, I. S.; AHNERT, D. Cytogenetic, molecular and morphological characterization of Passiflora capsularis L. and Passiflora rubra L. Plant Systematics and Evolution, v. 300, p , BELO, G. O.; SOUZA, M. M.; SOUZA, V. O.; MELO, C. A. F. Reproductive and cytogenetic characterization in Passiflora sunlanceolata. Biologia, v. 70, p , BERNAL-PARRA, N.; OCAMPO-PEREZ, J.; HERNANDEZ-FERNANDEZ, J. Caracterizacion y analisis de la variabilidad genética de la granadilla (Passiflora ligularis juss.) en Colombia empleando marcadores microsatélites. Revista Brasileira de Fruticultura, v. 36, p , CERVI, A. C.; IMIG, D. C. A new species of Passiflora (Passifloraceae) from Mato Grosso do Sul, Brazil. Phytotaxa, v. 103, p , CONCEIÇÃO, L. D. H. C. S.; BELO, G. O SOUZA, M. M.; SANTOS, S. F.; CERQUEIRA- SILVA, C. B. M.; CORRÊA, R. X. Confirmation of cross-fertilization using molecular markers in ornamental passion flower hybrids. Genetics and Molecular Research, v. 10, p , DOWNIE, S. R.; LLANAS, E.; KATZ-DOWNIE, D. S. Multiple Independent Losses of the rpoc1 Intron in Angiosperm Chloroplast DNA's. Systematic Botany, v. 21, p , DOYLE, J. J.; DOYLE, J. L. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, v. 12, p , ESCOBAR, L. K. A new subgenus and five new species in Passiflora (Passifloraceae) from South America. Annals of the Missouri Botanical Garden, v. 76 p , FEUILLET, C.; MACDOUGAL, J. M. A new infrageneric classification of Passiflora. Passiflora, v. 14, p. 1-4, GUERRA, M.; SOUZA, M. J. Como observar cromossomos: um guia de técnica em citogenética vegetal, animal e humana. São Paulo:Funpec, 2002, 131 p. 34

49 HANSEN, A. K.; GILBERT, L. E.; SIMPSON, B. B.; DOWNIE, S. R.; CERVI, A. C.; JANSEN, R. K. Phylogenetic relationships and chromosome number evolution in Passiflora. Systematic Botany, v. 31, p , JOHANSEN, D. A. Plant microtechnique. New York: Mc Graw Hill, p. 523,1940 KILLIP, E.P. The american species of Passifloraceae. Field Museum of Natural History, v.19, p , LIU, L-Q.; GU, Z-J. Genomic in situ hybridization identifies genome donors of Camellia reticulata (Theaceae). Plant Science, v. 180, p , MARKOVA, M.; MICHU, E.; VYSKOT, B.; JANOUSEK, B.; ZLUVOVA, J. An interspecific hybrid as a tool to study phylogenetic relationships in plants using the GISH technique, Chromosome Research, v. 15, p , MAO, S.; HAN, Y.; WU, X.; AN, T.; TANG, J.; SHEN, J.; LI, Z. Comparative genomic in situ hybridization (cgish) analysis of the genomic relationships among Sinapis arvensis, Brassica rapa and Brassica nigra. Hereditas, v. 149, p MELETTI, L. M. M.; SOARES-SCOTT, M. D.; BERNACCI, L. C.; PASSOS, I. R. S. Melhoramento genético do maracujá: passado e futuro. In: FALEIRO, F.G.; JUNQUEIRA, N. T. V.; BRAGA, M. F. (Eds.) Maracujá: germoplasma e melhoramento genético. Planaltina, DF: Embrapa Cerrados, p. MELO, N. F.; CERVI, A. C.; GUERRA, M. Karyology and cytotaxonomy of the genus Passiflora L. (Passifloraceae), Plant Systatics and Evolution, v. 226, p , MELO, N. F.; GUERRA, M. Variability of the 5S and rdna sites in Passiflora L. with species with distinct base chromosome numbers. Annals of Botany, v. 92, p , MELO, C. A. F.; SILVA, G. S.; SOUZA, M. M. Establishment of genomic in situ hybridization (GISH) technique for analysis in interspecific hybrids of Passiflora. Genetics and Molecular Research, v. 14, p , MELO, C. A. F.; SOUZA, M. M.; ABREU, P. P.; VIANA, A. J. C. Karyomorphology andgc-rich heterochromatin pattener in Passiflora (Passifloraceae) wild species from Decaloba and Passiflora subgenera. Flora, v. 11, p ,

50 MELO, C. A. F.; SOUZA, M. M.; SILVA, G. S. Karyotype analysis by FISH and GISH techniques on artificial backcrossed interspecific hybrids involving Passiflora sublanceolata (Killip) MacDougal (Passifloraceae). Euphytica, v. 213, p. 161, MUSCHNER, V. C.; LORENZ, A.P.; CERVI, A. C.; BONATTO, S.L.; SOUZA-CHIES, T. T.; SALZANO, F. M.; FREITAS, L. B. A first molecular phylogenetic analysis of Passiflora (Passifloracae). American Journal of Botany, v. 90, p , MUSCHNER, V. C.; ZAMBERLAN, P. M.; BONATTO, S. L.; FREITAS, L. B. Phylogeny, biogeography and divergence times in Passiflora (Passifloraceae). Genetics and Molecular Biology, v. 35, p , OCAMPO, J.; ARIAS, J. C.; URREA, R. Interspecific hybridization between cultivated and wild species of genus Passiflora L. Euphytica, v. 209, p , OCAMPO, J.; D EECKENBRUGGE, G. Morphological characterization in the genus Passiflora L.: an approach to understanding its complex variability. Plant Systematic and Evolution, v. 303, p , 2017 POPE, W. T. The edible passion fruti in Hawaii. Hawaii Agricultural Experiment Station Circular, v. 88, p. 1-18, RAINA, S. N.; RANI, V. GISH technology in plant genome research, Methods Cell Science, v. 23, p , RAMAIYA, D. S.; BUJANG, J. S.; ZAKARIA, M. H. Genetic Diversity in Passiflora Species Assessed by Morphological and ITS Sequence Analysis. The Scientific World Journal, v P. 1-11, 2014 SCHWARZACHER, T.; HASLOP-HARRISON, P. Practical in situ Hybridization. Oxford: Bios Scientific Publishers, p. 250, SANTOS, E. A.; SOUZA, M. M.; ABREU, P. P.; CONCEIÇÃO, L. D. H. C. S. Confirmation and characterization of interspecific hybrids of Passiflora L. (Passifloraceae) for ornamental use. Euphytica, v. 184, p ,

51 SEIJO, G.; LAVIA, G. I.; FERNÁNDEZ, A.; KRAPOVICKAS, A.; DUCASSE, D. A.; BERTIOLI, D. J.; MOSCONE, E. A. Genomic relationships between the cultivated peanut (Arachis hypogaea, Leguminosae) and its close relatives revealed by double GISH. American Journal of Botany, v. 94, p , SHE, C.; LIU, J.; DIAO, Y.; HU, Z.; SONG, Y. The Distribution of Repetitive DNAs Along Chromosomes in Plants Revealed by Self-genomic in situ Hybridization. Journal of Genetics and Genomics, v. 34, p , SILVA, G. S.; SOUZA, M. M. Genomic in situ hybridization in plants. Genetics and Molecular Research, v. 3, p , SOLTIS, P. S.; SOLTIS, D. A.; WOLF, P. G.; NICKRENT, D. E.; CHAW, S. M.; CHAPMAN, R. L. The phylogeny of land plants inferred from 18S rdna sequences: pushing the limits of rdna signal? Molecular Biology and Evolution, v. 16, p , 1999; SOUZA, M. M., PEREIRA, T. N. S., SILVA, L. C., REIS, D. S. S., SUDRÉ, C. P. Karyotype of six Passiflora species collected in the state of Rio de Janeiro. Cytologia, v. 68, p , SOUZA, M. M.; PEREIRA, T. N. S.; VIEIRA, M. L. C. Cytogenetic studies in some species of Passiflora L. (Passifloraceae): a review emphasising Braziliam species. Braziliam archives of Biology and Technology, v. 51, p , SOUZA, M. M.; URDAMPILLETA, J. D.; FORNI-MARTINS, E. R. Improvements in cytological preparations for fluorescent in situ hybridization in Passiflora. Genetics and Molecular Research, v. 9, p , TAKAHASHI, C.; MARSHALL, J. A.; BENNETT, M. D.; LEITCH, I. J. Genomic relationships between maize and its wild relatives. Genome, v. 42, p , ULMER, T.; MACDOUGAL, J.M. Passiflora: Passionflowers of the world. Portland:Timber Press,p. 430, VANDERPLANK, J. Passion flowers. 3ª ed. Cambridge: The MIT Press, p.224,

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53 Manuscrito submetido à revista GENES (Fator de impacto 3.6) CAPITULO 2: Low-coverage genome sequencing to identify 45S rdna in Passiflora L. and its chromosomal localization in plants Gonçalo S. Silva 1, Margarete M. Souza 1*, Vanessa de C. C. Pamponet 1, Sarah G. de Oliveira 2, Fabienne Micheli 1,3, Cláusio A. F. de Melo 1 1 Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC), Ilhéus, BA, Brasil; goncaloss21@hotmail.com (G.S.S); van_cgc@yahoo.com.br (V.C.C.P); clausiomelo@gmail.com (C.A.F.M) 2 Departamento de Botânica, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo (USP), São Paulo, SP, Brasil; sarahg.oliveira@gmail.com 3 CIRAD, UMR AGAP, F Montpellier, France; fabienne.micheli@cirad.fr (F.M) * Correspondence: souzamagg@yahoo.com.br; Tel.: Academic Editor: name Received: date; Accepted: date; Published: date Abstract: 5S and 45S rdna genes, which are repeated in tandem, may be characteristic for a particular species or genus and may be used for comparative and evolutionary analyses. This work aimed to identify the 45S rdna from sequencing data for later chromosome mapping in plants. Low coverage sequencing was performed on Passiflora alata, P. cincinnata and P. edulis. Nine clusters (CLs) of 45S rdna have been identified. Neighborjoining tree with the CLs of 45S rdna using MEGA7 was constructed in order to verify the similarities showed that CL116 (P. alata), CL71 (P. cincinnata) and CL116 (P. edulis) have high similarity across the three species, which was also observed through alignment. In the database, these three CLs were similar to the 26S ribosomal gene of Populus tremuloides, Salix interior and Averrhoa carambola (98% identity). 26S rdna was mapped for P. edulis, P. bahiensis, a backcross hybrid (P. sublanceolata vs. HD13), Citrus sunki and Cucumis melo. In P. edulis was observed a chromosomal pair with heteromorphic 26S rdna site, 39

54 evidenced in the same way with CMA 3. Probe presented in this work will be useful for studies on karyotype variation, cytotaxonomy and evolution in Passiflora. Keywords: Chromosome; Heteromorphic 45 rdna; Molecular cytogenetics; Next generation sequencing 1. Introduction Repetitive DNAs (transposable elements and in tandem repeats) form the largest portion of the plant genome, reaching up to 80% in certain angiosperms [1], and this fraction of the genome is responsible for the high and variant DNA content (C-value ) reported among plant species at various taxonomic levels. Currently, low coverage genomic sequencing followed by bioinformatics analysis through the RepeatExplorer pipeline performs the identification and characterization of repetitive DNA in eukaryotes [2], setting up an excellent research strategy for repetitive DNA in plant species. The chromosomal mapping for localization of these repetitive elements in the genome of plants has already been carried out for different species such as Silene latifolia Poir. and Raphanus sativus L., whose repetitive DNA mapping revealed the distribution profile of the different types of satellite DNAs, indicating a participation in percentage of these elements in the genome [3,4]. Satellites and different transposable elements (Gypsy, Copy, LINE) have been mapped for Coccinia grandis (L.) Voigt [5]. 45S rdna (18S-5.8S-25S/26S) was mapped for Cycas revoluta Thunb [6]. Ribosomal DNA is responsible for the transcription of ribosomal RNA whose participation is fundamental in the constitution of the ribosome, present in all living organisms. The 5S and 45S rdna are distributed in tandem and form clusters of intra-, interspecific and/or intergeneric specificity, and can be used for comparative and evolutionary analyses across the different taxonomic levels [7]. The rdna locus is known as an ideal marker for the 53 karyotype study, with variation in the position and number of 45S rdna repeats (site length), which are the main parameters that aid in these analyses, thus assisting in the resolution of questions about genomic and evolutionary relationships between species and plant genera [8]. 5S and 45S rdna have been used to aid in the delimitation between 40

55 Passiflora cacao Bernacci and M. M. Souza and P. edulis Sims, supporting the interpretation that these two species represent different genotypes [9]. Chromosomal analyses have aided in understanding the evolutionary relationships in Passiflora L. [10-12]. The basic chromosome numbers x = 6 and x = 9 appear as the most common in wild and cultivated species of the genus. However, a cytotaxonomic study suggested that the number x = 9 was derived from x = 6 by polyploidy, followed by descending disploidy [10]. The analysis in several species of the genus based on the 5S and 45S rdna sites showed that in the species belonging to the group with x = 9, the number of ribosomal sites is higher, thus reinforcing the hypothesis of origin by polyploidy of this group [11]. In Passiflora, the application of CMA 3 (chromomycin A 3 ) and DAPI (4',6-diamidine-2- phenylindole) fluorochromes to verify GC-rich (CMA + ) and AT-rich (DAPI + ) regions, respectively, revealed that CMA + /DAPI - are related to 45S rdna and satellites, suggesting richness in the guanine and cytosine bases of these regions [9,10,12,13]. In this sense, the use of dual staining with fluorochromes CMA 3 and DAPI, in the same way as for 45S rdna, may be useful in evolutionary and cytotaxonomic studies in Passiflora [12]. Results obtained in previous studies in the genus point out that a more detailed analysis of the GC content in the genome and the amount of GC in the ribosomal genes could help in the understanding of this relationship between the CMA + + bands and the 45S rdna. In other plant genera, CMA 3 bands are not restricted to the 45S rdna sites; in Citrus L. and Cucumis L. for example, they are also present in the centromeric region, which is composed of satellite DNA [14,15]. The objective of this work was to identify the 45 rdna sequence from the Next Generation Sequencing (NGS) data by bioinformatics analysis with RepeatExplorer pipeline, mapping by fluorescent in situ hybridization (FISH) in P. edulis and testing heterologous hybridization in other plant species. In parallel, quantification of the percentage of GC within the ribosomal genes was performed in order to verify how much GC is needed for the detection of CMA 3 fluorescence in GC-rich regions in contrast to the DAPI counterstained, and to analyze the relation of the regions rich in GC with the 45S rdna. 41

56 2. Materials and Methods 2.1. Plant material The species P. alata Curtis (2n = 18), P. cincinnata Mast. (access 504, 2n = 18) and P. edulis (2n = 18) are kept in the Germplasm Active Bank (BAG-Passifloras), located in the Campus of the State University of Santa Cruz (UESC), in the municipality of Ilhéus, Bahia, Brazil (long 39 10"W, lat 14 39"-S, alt 78m). The seeds of Cucumis melo L. have been donated by the Federal University of Rio Grande do Norte (UFERSA), in the municipality of Mossoró, Rio Grande do Norte, and the seeds of Citrus sunki (Hayata) hort. ex Tanaka have been donated by the Brazilian Agricultural Research Corporation (EMBRAPA), Cruz das Almas, Bahia, Brazil Extraction of genomic DNA and Next Generation Sequencing (NGS) Genomic DNA was extracted using the protocol proposed by Doyle e Doyle [16] with some modifications for Passiflora [17]. The genomic DNA was purified with the addition of 10% sodium acetate (3M, ph 5.2) and 200% final volume of anhydrous ethanol at -20 o C. Quantification of the genomic DNA was performed by Qubit dsdna BR (Q32850) quantification kit on Qubit (Thermo Scientific ) and the purity of the samples was checked for 260/230 and 260/280 ratios on Nanodrop equipment (Termo Scientific ). Genomic DNA was used to construct the genomic libraries for each species. Nextera DNA Sample Preparation Kit (Illumina ref ) was used for the genomic library elaboration with Nextera index kit (Illumina ref ). The protocol used for the construction of the libraries followed the recommendations of the manufacturer, whose stages consist in the marking and fragmentation of 50 ng of genomic DNA for each species; purification of fragments using the GFX PCR DNA and Gel Band Purification KIT purification (GE Health Care Life Sciences); amplification and binding of the indexes (specific for each library/species) and purification by magnetic beads (AMpure XP beads GE Helthcare Life Sciences). Genomic libraries have been previously quantified using the Qubit dsdna BR quantification kit (Q32850). However, the use of the KAPA Library Quantification Kit 42

57 IlluminaPlatforms Kit (KR0405) was required for the final quantification by qpcr of the presequencing genomic libraries. Preparation of the qpcr reactions followed the protocol proposed by the manufacturer of the KAPA quantification kit in ABI Prism Real-Time PCR (Applied Biosystems ). Qualitative evaluation of the libraries was inferred by the analysis of the dissociation curve of the graph obtained after the qpcr, where the existence of dimer of adapters was also evaluated [18]. Sequencing was carried out in the Molecular Marker Laboratory of the Biotechnology and Genetics Center (UESC, Ilhéus, Brazil), conducted in the Illumina Miseq using the sequencing kit MiSeq kit reagent V3 600 cycles (Illumina ref ) Identification of the 45S rdna sequences and bioinformatics analysis A total of ,594, ,900 and ,782 paired-end sequence reads (average reads size 300 bp) have been obtained for P. alata, P. cincinnata and P. edulis, respectively. With a genomic coverage of 2.8x for P. alata (1C = 2.156,49 Mpb, [19]), 3.5x for P. cincinnata (1C = 1.359,42 Mpb, [20]) and 2.2x for P. edulis (1C = 1.545,24 Mpb, [21]). For identification of the 45S rdna, the RepeatExplorer pipeline was used, implemented in the Galaxy server [2,22]. Reads were quality filtered, using a cut-off of 30, trimmed and filtered by size (100 bp) to obtain high quality reads. Interlaced paired reads have been randomly sampled to cover 5% of the genome for each species: 1.078,246 (P. alata), 735,945 (P. cincinnata) and 772,620 (P. edulis). Reads clustering was performed with a minimum overlap of 55% and a similarity of 90%. Assembly of the contigs into clusters representing repeats with abundance > 0.01% was used to identify clusters of 45S rdna and examined in silico. Dendrogram was created using the Molecular Evolutionary Genetics Analysis software (MEGA7) [23] by the Neighbor-Joining (NJ) method with 1000 randomizations, in order to verify the similarity between the contigs. The sequences have been compared to the database through the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) to verify similarity. After the bioinformatics analyses, these sequences were used for primer design by Primer3Plus [24]. 43

58 S rdna amplification Genomic DNA from P. edulis was used as a template for amplification by PCR. 26S rdna sequence was amplified using the primers pairs: Pe26S-rDNA-F 5'- GGCTGAATCTCAGTGGATCG-3' and Pe26S-rDNA-R 5'-GCTGTCGGTGGACTG CTC- 3'. PCR program for 26S rdna amplification consisted of 4 minutes at 94 C for initial denaturation, followed by 30 cycles of 1 minute at 94 C, 1 minute at 56 C and 2 minutes at 72 C. In the last cycle, the final extension at 72 C was extended for 10 minutes. Size of the 26S rdna fragment was approximately 1.3 kb. Purified PCR product was marked with biotin-16-dutp (Roche Diagnostics ) by Nick Translation. 5S rdna and telomeric probes used to control hybridization in the FISH experiment have been obtained by PCR using primer pairs 5'-GTGCGATCATACCAG C(AG)(CT)TAATGCACCGG-3' and 5'- GAGGTGCAACACGAGGACTTCCCAGGA GG-3' for 5S rdna, which was designed for the 5S rdna sequence of Glicine max L. [25] and used for the first time in Passiflora by Melo and Guerra [11] and 5'-AAATCCCAAATCCCAAATCCCAAATCCCAAATCC CAAATCCC-3' and 5'-TTTAGGGTTTAG GGTTAGGGTTTAGGGTTTAGCGTTTAGG-3' for telomeric loci [13], and digoxigenin-11-dutp marked (Roche Diagnostics ) by Nick Translation Slide preparation In Passiflora, root apices of approximately one centimeter have been collected from cuttings and pretreated with M 8-hydroxyquinoline (8-HQ; Merck ) for 1h at room temperature (RT), and another 21h at + 8 to 10 C. For Cucumis melo and Citrus sunki, roots of approximately one centimeter have been obtained from seeds placed to germinate in petri dishes with moistened filter paper. The roots of C. melo were pretreated with M 8- hydroxyquinoline (8-HQ; Merck ) for 2h at RT. The roots of C. sunki were pretreated with M 8-hydroxyquinoline (8-HQ; Merck) for 23h at + 8 to 10 C. After washing twice in distilled water and fixed in Carnoy II (anhydrous ethanol (Merck ): glacial acetic acid (Merck [3: 1], v/v) for 3h at RT, the samples were kept at -20 C for at least 24 hours or until used. To prepare of the slides, the root apices were washed twice in distilled water and incubated with 15 μl of the enzymatic solution 2% cellulase (Sigma ) and 20% pectinase 44

59 (Sigma ) (w/v) for 80 minutes at 37 C for all species. Enzyme was removed with the aid of a micropipette, and after washing in distilled water, 10 μl of 45% acetic acid (Merck ) was added to the root. With the aid of needles and under a stereoscopic microscope, the roots were macerated, covered with a coverslip and pressed gently with filter paper, frozen in liquid nitrogen for about 6 minutes to remove the coverslip, made with the aid of a stylus, and airdried. Slides with good metaphase preparations were maintained at -20 C until the CMA 3 /DAPI banding and FISH Fluorescent In Situ Hybridization (FISH) The treatment of the slides for FISH followed the protocol proposed by Schwarzacher and Heslop-Harrison [26] and Souza et al. [27], with modifications made by Melo et al. [28]. Slides containing the cytological preparations were dried at 37 C for the minimum time of 1h. After application of 50 μl of RNase (Sigma ) at 1 μg/ml in 2xSSC buffer (0.3 M sodium chloride (Sigma ), 0.03 M sodium citrate (Sigma), the slides were incubated in humid chamber for 1h at 37 C. Slides were immersed in 2xSSC at RT twice for 5 minutes each; 50 μl of 10 mm hydrochloric acid (HCl; Vetec) was added over the metaphases for 5 minutes, and after removal of the HCl, 50 μl of pepsin (Sigma ) [10 mg/ml pepsin; 10 mm HCl (1:100 v/v)] and the slides were incubated in humid chamber for 20 minutes at 37 C. The following washing steps were performed on a shaker platform (Biomixer, Mos-1) at 120 rpm. Slides were washed in 2xSSC at RT twice for 5 minutes each, immersed in 4% formaldehyde (Sigma) at RT for 10 minutes, and again washed in 2xSSC twice for 5 minutes each. The cytological preparations were dehydrated in 70% and 96% ethanol for 5 minutes each. After drying the slides at RT for 30 minutes, the hybridization mixture was added to the final volume of 15 μl (50% formamide (Sigma ), 10% dextran sulfate (Sigma ), 2xSSC (Salt, sodium citrate, Sigma), 0.13% Sodium dodecyl sulfate (SDS; BioAgency) and 50 ng of the probe. The hybridization mixture was heated at 75 C for 10 minutes in thermal cycler (Eppendorf, Mastercycler) and transferred immediately to ice for the minimum time of 5 minutes. The slides containing the hybridization mixture were denatured in a thermal cycler (Techne, TC-412) containing a slide adapter at 75 C for 10 minutes and incubated overnight in humid chamber at 37 C. After hybridization, the slides were immersed in 2xSSC at RT for 5 minutes for removal of the coverslips. The following post-hybridization baths were 45

60 performed in a water-bath (Marconi, MA093/1/E) at 42 C, with two immersions in 2xSSC for 5 minutes each, two in 0.1xSSC for 5 minutes each and two in 2xSSC for 5 minutes each. Slides were immersed in solution with 4xSSC/0.2% Tween 20 (Sigma ) at RT for 5 minutes and treated with 50 μl 5% Bovine serum albumin, Fraction 5 (BSA; Sigma ). Biotin-16-dUTP labeled probe was detected with 0.7 μl of Avidin-Fluorescein isothiocyanate (FITC; Vector) plus 19.3 μl of 5% BSA per slide. Digoxigenin-11-dUTP labeled probe were detected with 0.7μl anti-digoxigenin-rhodamine (Roche ) plus 19.3μl 5% BSA per slide. Slides containing the antibodies were incubated in umid chamber for 1h at 37 C. For removal the excess of antibody, three baths were performed for 5 minutes each with 4xSSC/0.2% Tween20 at RT. Slides were briefly immersed in 2xSSC and cytological preparations were simultaneously mounted and counterstained with Vectashield Antifade Mounting Medium with DAPI (H- 1200) and stored at + 8 to 10 C until analysis Quantification of GC content and double staining with fluorochromes CMA 3 and DAPI Quantification of GC content was performed using Oligo Calc: Oligonucleotide Properties Calculator software [29]. For dual staining with fluorochromes CMA 3 and DAPI, slides were aged for three days prior to staining. CMA 3 /DAPI double staining followed the protocol proposed by Guerra and Souza [30], with modification of the CMA 3 concentration, which consisted of the application of 15 μl CMA 3 (0.25 mg/ml) on the slides for one hour, then washed with distilled water and dried. Subsequently, 15μl of DAPI (0.5 mg/ml) was applied to each slide for half an hour. Slides were washed with distilled water, dried and mounted with 15 μl of the glycerol/macllvaine (1:1 v/v) mounting medium using a 20 x 20 mm coverslip and aged for three days prior to analysis Image analysis Analysis and photodocumentation were performed using the Olympus BX41 epifluorescence microscope equipped with Olympus DP25 5MP digital camera and the DP2- BSW software. CMA 3 was detected with the U-MWB filter (excitation nm/dichroic cutoff 500 nm/emission > 515 nm) and DAPI with the U-MWU filter (exitation nm/dichroic cutoff 400 nm/emission > 420 nm). Hybridizations detected with avidin-fitc 46

61 were visualized with the U-MWB filter (excitation nm/dichroic cutoff 500 nm/emission > 515nm) and the hybridizations detected with anti-digoxigenin-rhodamine were visualized with the U-MWG filter (excitation nm/dichroic cutoff 570 nm/emission > 590 nm). CMA 3 /DAPI and FITC/Rhodamine/DAPI overlaps for 26S and 5S rdna and telomeric sites were performed in photoshop software SC5. 3. Results 3.1. Identification of 45S rdna Clusters 45S rdna clusters (CLs) that comprised more than 0.01% of the genomic reads obtained by genomic sequencing in Illumina MiSeq have been identified: two CLs in P. alata (CL108 and CL116, 0.28% of the genome), three CLs in P. Cincinnata (CL70, CL71 and CL130, 0.75% of the genome) and four CLs in P. edulis (CL108, CL116, CL117 and CL119, 0.62% of the genome). The linear layout of the graph shows that each cluster is formed by only one region of the 45S rdna repeat unit (Figure 1). When all genes (18S, 5.8S and 26S) that make up the 45S rdna are present in the cluster, the graph shows a circular shape, which reflects the in tandem organization of the multiple copies of the repeat unit of the rdna. Dendrogram constructed to verify the similarity of the sequences has divided the clusters into two welldefined larger groups (Figure 2). When these sequences were compared to the database, it was possible to verify that the sequences of group A showed high similarity with the ribosomal 26S gene, and the sequences of group B presented high similarity with the 18S ribosomal gene (Table 1). The e-value = 0.0 for all CLs showed that the alignment was highly reliable. Within group A, the clusters were divided into two groups: A 1 and A 2. Within group A 1, there was no separation between the three sequences (Pc CL71, Pa CL116 and Pe CL116). Within group B, the clusters were divided into two groups: B 1 and B 2. For the sequences of group A 1, in which there was no separation between the three, their alignment was carried out by the Clustal Omega software and the region for the sequence with 100% similarity for the three species was used for the design of the primers (Figure 3). In the DNA database, these three sequences were similar to the 26S rdna of Populus tremuloides, Salix indoor and Averrhoa carambola (98% of identity). 47

62 Figure 1. Layouts of the graphs for 26S rdna detected in the graph-based clustering analysis. Figure 2. Neighbor-joining tree reconstructed based on 45S rdna sequences from P. alata (Pa), P. edulis (Pe) and P. cincinnata (Pc). The bootstrapping value of each branch is shown in front of the node. 48

63 Figure 3. Aligned 26S rdna sequences from P. alata (Pa), P. edulis (Pe) and P. cincinnata (Pc). 49

64 3.2. Chromosomal localization of 26S rdna Chromosomal mapping for 26S ribosomal genes revealed clear, reproducible and unambiguous hybridization sites (Figures 4 and 5). In P. edulis, four hybridization sites have been observed for 26S rdna (Figure 4A-C), with the presence of a chromosomal pair with heteromorphic 26S rdna site in relation to the size, as observed for all analyzed metaphases of this species. Figure 4. Fluorescent in situ hybridization (FISH) and double staining with fluorochromes CMA 3 and DAPI in mitotic metaphase of Passiflora edulis (2n = 18). A-C FISH, A 26S rdna, B 5S rdna, C overlapping 26S/5S rdna, D-F double staining with fluorochromes CMA 3 and DAPI, D CMA 3 E DAPI, F CMA 3 /DAPI overlapping. Bar = 10 μm. Heterologous hybridization of the probe developed for 26S rdna was tested in other species belonging to the Passiflora genus, a species of the Citrus genus and a species of the Cucumis genus. Within the Passiflora genus, the probe was tested on P. bahiensis Klotzsch and a backcross hybrid (P. sublanceolata (Killip) J. M. MacDougal vs. HD13 hybrid). Four 26S rdna sites have been detected for P. bahiensis (Figure 5 A-C), and six 26S rdna sites have been detected for the backcross hybrid (Figure 5 D-F). In the Citrus genus, the C. sunki species presented two 26S rdna sites (Figure 5 G-I) and in the Cucumis genus, the Cucumis melo species presented four 26S rdna sites (Figure 5 J-L). 50

65 Figure 5. Fluorescent in situ hybridization (FISH) on mitotic metaphase chromosomes of species from the Passiflora, Citrus and Cucumis genus. A-C Passiflora bahiensis (2n = 18), A 26S rdna, B 5S rdna, C overlapping 26S/5S rdna, D-F Backcross hybrid (P. sublanceolata vs. HD13 hybrid; 2n = 22), D 26S rdna, E 5S rdna, F overlapping 26S/5S rdna, G-I Citrus sunki (2n = 18), G 26S rdna, H 5S rdna, I overlapping 26S/5S rdna, J- L Cucumis melo (2n = 24), J 26S rdna, K Telomeric probe, L overlapping 26S/Telomeric. Bar = 10 μm. 51

66 3.3. GC quantification of ribosomal genes and CMA 3 /DAPI banding GC content analysis of ribosomal genes showed that the amount of GC varied between 52% and 63% (Table 1). The double staining with fluorochromes CMA 3 and DAPI showed the presence of four CMA + 3 /DAPI - bands, located exactly in the same positions as the rdna sites (Figure 4 D-F). Heteromorphic pair detected by FISH was also evidenced in the same way for double staining with fluorochromes CMA 3 and DAPI. Table 1. GC content of the ribosomal genes for Passiflora alata, P. cincinnata and P. edulis. Species Cluster Size (pb) GC (%) Classification GenBank Acession P. alata CL S rdna MF P. alata CL S rdna MF P. cincinnata CL S rdna MF P. cincinnata CL S rdna MF P. cincinnata CL S rdna MF P. edulis CL S rdna MF P. edulis CL S rdna MF P. edulis CL S rdna MF P. edulis CL S rdna MF Discussion Advances in sequencing techniques and emergence of bioinformatics softwares and platforms for data analysis have allowed research involving cytogenomics to progress more rapidly. Consequently, our understanding of genome organization, chromosome structure, function and sequence variation has broadened the analysis of karyotypes, subsidizing comparative and evolutionary analyses involving species of different taxonomic levels. The results obtained in this work demonstrate that low coverage genomic sequencing and bioinformatic analysis associated with cytogenetics allowed the identification and subsequent in situ localization of 26S loci in Passiflora, which are currently considered the most useful chromosome marker in the comparative cytogenetics among Passifloras, supporting evolutionary and taxonomic studies on the genus. Among Passiflora, the question of which is 52

67 the basic chromosome number within the genus and the evolutionary events that occur in its establishment is still not completely understood, but there is an indication of polyploidy followed by descending disploidy [10,11]. The use of 5% of the genome of the Passiflora species was sufficient to identify rdna in the three analyzed species. The use of a random sample of the genome (0.5-5%) results in data consisting mainly of repetitive DNA, since non-repetitive regions are not adequately represented in this type of dataset [31]. Several studies have shown that sequencing of low genomic DNA coverage, followed by graphic-based clustering reads using RepeatExplorer, is sufficient and effective for identification and characterization of repetitive DNA [2,5,32,33]. This strategy of repetitive sequence identification has been carried out in several species of plants, such as Silene latifolia [3], Rhynchospora pubera (Vahl) Boeckler [34], Cycas revoluta [6], Coccinia grandis [5], subsidizing not only the description of the genomic richness of repetitive elements but also their in situ location. The amount of rdna in the genome (genomic proportion) among the three species, P. alata (0.28%), P. cincinnata (0.75%) and P. edulis (0.62%) shows that the amount of rdna repetition varies considerably within the genus. The number of repetitions different between species may be a common parameter in the genomic evolution of angiosperms, since variations in DNA content result mainly from variations in the repetitions of units for the various repetitive elements [35,36]. rdna was also very variable among different species in the Musaceae family, varying from 2.23% for Musa ornata Roxb. to 7.73% for M. beccarii N. W. Simmonds [32]. In S. latifolia, the genomic ratio for 45S rdna was 0.31% for the male and 0.44% for the female, with a genome ratio 1.4 times higher for the female [3]. In C. grandis, the variation in genomic ratio was lower for the individual male analyzed, with genomic proportion of 1.73% for the male and 1.67% for the female [5]. Until then, in Passiflora, in the species characterized for the 45S rdna sites have been used probes that need to be maintained and replicated in dependence of vectors inserted generally in Echerinchia coli T. Escherich. The probes that have already been used include the SK18S and SK25S probes containing the 18S and 25S genes of Arabidopsis thaliana (L.) Heynh, respectively [11,37]; the 9.1 kb rdna probe from maize (Zea mays L.) cloned into puc8 in EcoRI [38]; the rdna probe containing the 18S gene (1100pb) of Z. mays cloned into pgem -T Vector (Promega ) [39]; and the pta71 probe containing the 45S rdna from wheat (Triticum aestivum L.) [9,13,27,40]. However, these probes are not commercially 53

68 produced and the only way to obtain them is through donation between research groups, and thus need to be kept in the laboratory that use them frequently. In addition, the bacteria containing the plasmids with the probes need to be replicated periodically, because over time they expel the plasmids and the probe is lost in the laboratory. Consequently, the maintenance of these bacteria makes this methodology laborious and costly. Thus, the PCR methodology becomes much more advantageous, since whenever the production of the 26S rdna probe is necessary, it will be necessary only to amplify the gene, to purify it, to prepare the probe and to carry out the chromosomal mapping. In the present study, the results obtained by the chromosomal mapping for P. edulis are in agreement with those previously found and reported in different works, showing the presence of four hybridization sites for 26S rdna probe [37-39]. Obtaining the 1.3 kb probe from a PCR product showed the efficiency of this methodology for 26S rdna, since the marking was restricted to the ribosomal sites, and no nonspecific markings have been observed. In addition, the size of the probe produced was also a relevant factor, since very small probes may hybridize non-specifically. In Pinus L., a 1.8 kb 18S rdna probe showed hybridization sites by FISH with well-defined resolution and reproducible [41]. Already in Marchantia polymorpha L., the use of a 0.5 kb probe presented results completely different, with the presence of nine (male individual) and ten (female individual) rdna sites [42,43], whereas when using a pta71 probe, the presence of only two rdna sites had been observed [44,45]. The small size of the probe may have detected not only the expected rdna sites but also the presence of partially amplified non-functional 18S rrna genes, which may lead to erroneous interpretation as rdna sites [45]. Heteromorphy observed at the 26S rdna site in P. edulis has been recently reported [37]. On the other hand, this heteromorphism has not been observed in previous studies with this species [38,39], indicating the existence of different cytotypes. This alteration, in which only one chromosome has larger rdna hybridization site than the site of the other homologue, maybe a reflection of the crossing processes between the different accessions/cultivars that have been occurring with this species over time. In Brazil, this species has been improved over the years, both for productivity and for resistance to diseases, with the existence of several cultivars introduced in the fruit market. Consequently, this constant process of genetic improvement may be leading to changes in the genome, especially in the repetitive DNA content, which is associated with changes in genome size. In addition, 54

69 in the field, producers work with different cultivars in the same area, which may be favoring the crossing between genotypes with different karyotype characteristics, and thus favoring the appearance of new alterations, which have been observed in this study for 45S rdna. Ribosomal genes are formed by clusters repeated in tandem and their coding regions are highly conserved among species because they play multifunctional and essential roles in eukaryotes [14]. However, their highly repetitive organization makes these genes ideal for homologous recombination, thus, the number of repetitions, distribution and number of 45S rdna sites can vary greatly across different plant species [46,47]. In an access of Lolium rigidum Gaudin, although it is a unique and atypical condition between plants, the number and positions of rdna sites were different in all analyzed genotypes, showing that these sites may be subject to many changes under certain conditions [48]. In P. suberosa L., the only species of the Passiflora genus in which the presence of 5S and 45S rdna loci has been reported on the same chromosome, suggests that the increase in 45S rdna sites in this species occurred by the transposition of 45S rdna of the original chromosomes into the chromosomes that have the 5S rdna sites [11]. The variation in size and number of the 45S rdna sites may be a reflection of the fragility of the 45S rdna, since breaks and rearrangements often occur within the 45S rdna sites [8,49]. The emergence of fragile 45S rdna sites may be associated with epigenetics alteration and DNA damage [8]. In addition, it has been demonstrated that rdna clusters and neighboring regions are frequent targets for insertion of mobile elements [50]. The success in the chromosome mapping of Passiflora, Cucumis and Citrus for 26S rdna shows that this new amplified PCR probe can be used for comparative and evolutionary analyses in plants, including between genera and different botanical families. In Citrus and Cucumis, the use of 26S rdna may, like other cytological markers, aid in karyotypic differentiation because the small chromosome size, generally weakly stained, makes it difficult to compare karyotype among different species [14,51]. The presence of 5S- 26S rdna sites (adjacent sites) observed in C. sunki in this work is in agreement to results obtained for the family rutaceae, that is considered an ancestral condition within the subfamily Aurantioideae [14], showing the efficiency of this probe. The CMA + 3 /DAPI - bands restricted to 45S rdna sites show that ribosomal genes are the regions of the GC-rich Passiflora genome detected by CMA 3, corroborating GC richness in the 18S and 26S sequences isolated in this study (52-63%). The average value of GC content 55

70 in retrotransposons was around 38-40% (data not shown). For the gene portion of P. edulis, the first study on the structure and content of the genome, using BAC-end sequence (BES), was 45% for GC content [52]. The presence of CMA + 3 bands restricted to the 45S rdna sites is probably associated with the composition of the GC content this sequence, showing that only GC content above 50% can be detected by CMA 3. In addition, its in tandem structure, repeated thousands of times, may favor the detection of these sites by this fluorochrome. The average value of GC content can vary greatly and reflects significant characteristics in the composition of plant genomes. While in species of the Passiflora genus, the GC-rich regions detected by the fluorochrome CMA 3 are observed only in 45S rdna sites/satellite [9,10,12,13], in other genera, these regions are detected in other parts of the genome. In the Citrus genus, the distribution of 45S rdna and a satellite DNA (CsSat) of 181 bp [53] has been analyzed in relation to the CMA + 3 bands, and in the seven species (C. sinensis L. Osbeck, C. deliciosa Tenore, C. maxima (Burm. f.) Merr., C. medica L., C. reshni Hort. Ex + Tan., C. sunki, C. hystrix DC.) both rdna and CsSat probes hybridized only to the CMA 3 bands, which are the 45S rdna sites and centromeres, respectively [14]. In C. melo, the CMA + 3 bands have also been located in the centromeric regions and 45S rdna sites [15]. In this species, the centromere of all chromosomes is composed of a satellite DNA of 352 bp (CentM), which have been mapped by FISH [54]. Thus, it is probable that the centromeric regions of the species belonging to the Passiflora genus have a different composition, formed of another type of repetitive DNA that is not rich in GC. Therefore, a more detailed analysis about the type of DNA that composes the centromere of Passiflora species associated with in situ hybridization may help to understand the structure and genomic organization of this genus. 5. Conclusions Amplification of 26S rdna via PCR and FISH chromosomal mapping was successful in Passiflora and in other plant species. The amplification of the probe by PCR makes this methodology more advantageous when compared to the maintenance of the probe in vectors, which makes this technique expensive, laborious and passive of cumulative errors in function of the several steps of bacterial replication, extraction, quantification and marking of 56

71 plasmids. The probe presented in this work will be useful for studies on karyotype variation, cytotaxonomy and evolution in Passiflora. Information on the composition of the GC content of the Passiflora genome corroborates the relationship between CMA + 3 /DAPI - bands and 45S rdna sites observed in different species, and shows that ribosomal genes themselves are rich in GC. The presence of CMA 3 bands related to 45S rdna sites shows the usefulness of this fluorochrome in the identification of these sites in species of this genus. Supplementary Materials: All datasets supporting the conclusions of this article are included within the article. Acknowledgments: Thanks to UESC, CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) and FAPESB (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia) and CNPq for the financial support for research. FAPESB for the scholarships granted to the first author. Centro de Biologia Computacional e Gestão de informações Biotecnológicas (NBCGIB) by bioinformatic support. Author Contributions: Experiments conception and design: Gonçalo S. Silva, Margarete M. Souza. Sequencing data: Gonçalo S. Silva, Fabienne Micheli, Cláusio A. F. de Melo, Vanessa de C. C. Pamponet. RepeatExplorer analysis: Gonçalo S. Silva, Vanessa de C. C. Pamponet, Sarah G. de Oliveira. Cytogenetic experiments: Gonçalo S. Silva, Cláusio A. F. de Melo. Paper writing: Gonçalo S. Silva, Margarete M. Souza. Conflicts of Interest: The authors declare no conflict of interest. References 1. Wicker, T.; Sabot, F.; Hua-Van, A.; Bennetzen, J.L.; Capy, P.; Chalhoub, B.; Flavell, A.; Leroy, P.; Morgante, M.; Panaud, O.; Paux, E.; SanMiguel, P.; Schulman, A.H. A unified classification system for eukaryotic transposable elements. Nature 2007, 8, Novák, P.; Neumann, P.; Pech, J.; Steinhaisl, J.; Macas, J. RepeatExplorer: a Galaxybased web server for genome-wide characterization of eukaryotic repetitive elements from next-generation sequence reads. Bioinformatics 2013, 29, Macas, J.; Kejnovský, E.; Neumann, P.; Novák, P.; Koblížková, A.; Vyskot, B. Next Generation Sequencing-Based Analysis of Repetitive DNA in the Model Dioecious Plant Silene latifolia. PLoS ONE 2011, 6, e

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76 CAPÍTULO 3: Caracterização citogenômica do DNA repetitivo e mapeamento cromossômico comparativo em Passiflora L. usando dados de sequenciamento de baixa cobertura Gonçalo S. Silva, Margarete M. Souza, Vanessa de C. C. Pamponet, Sarah G. de Oliveira, Fabienne Micheli, Eduardo A. Costa, Cláusio A. F. de Melo Resumo As espécies Passiflora alata, P. cincinnata e P. edulis são muito importantes economicamente devido a utilização dos seus frutos para o consumo humano. Nesse trabalho analisamos a composição do DNA repetitivo do genoma dessas três espécies. A partir de dados de sequenciamento de baixa cobertura realizamos a clusterização e identificação do DNA repetitivo. Foi observado que, quantitativamente, o DNA repetitivo representa 74,70%, 66,86% e 62,24% do genoma das espécies P. alata, P. edulis e P. cincinnata, respectivamente. Os retrotransposons LTR Ty3/Gypsy representam a maior proporção dos genomas de P. alata e P. edulis e Ty1/Copia compreende a maior proporção do genoma de P. cincinnata. O mapeamento cromossômico por Hibridação In Situ Fluorescente (FISH) mostrou que os retrotransposons LTR possuem distribuição dispersa ao longo dos cromossomos, e o DNA satélite de 145 pb está localizado na região subtelomérica dos cromossômos, sugerindo que esses elementos podem desempenhar papéis importantes na estrutura e organização do genoma. Nesse trabalho foi obtida a primeira visão sobre a composição de DNA repetitivo global em Passiflora, mostrando que o aumento do genoma está relacionado com o ganho de DNA repetitivo, o que representa uma rota evolutiva importante nas espécies do gênero. Palavras-Chaves: Composição genômica, DNA satélite, FISH, Retrotransposons. 62

77 Abstract The species Passiflora alata, P. cincinnata and P. edulis are very important economically due to the use of their fruits for human consumption. In this work, we analyzed the composition of the repetitive DNA of the genome of these three species, from the data of low coverage sequencing we performed the clustering and identification of the repetitive DNA. It was observed that quantitatively the repetitive DNA represents 74.70%, 66.86% and 62.24% of the genome of the species P. alata, P. edulis and P. cincinnata, respectively. The Ty3/Gypsy LTR retrotransposons represents the highest proportion of the genomes of P. alata and P. edulis and Ty1/Copia represents the largest proportion of the P. cincinnata genome. Chromosomal mapping by fluorescente in situ hybridization (FISH) has shown that LTR retrotransposons have dispersed distribution along chromosomes, and 145 bp satellite DNA is located in the subtelomeric region of chromosomes, suggesting that these elements may play important roles in the structure and organization of the genome. In this work the first view on the composition of global repetitive DNA in Passiflora was obtained, showing that genome size is related to the repetitive DNA gain, which represents an important evolutionary route in the species of the genus. Key-words: Genomic composition, satellite DNA, FISH, Retrotransposons 63

78 1. INTRODUÇÃO Maracujazeiro são lianas trepadeiras, pertencentes ao gênero Passiflora L., que ocorrem nos trópicos e subtrópicos (BERNACCI et al., 2013). Muitas espécies de maracujá produzem frutos comestíveis, que podem ser consumidos in natura, na forma de sucos ou em diveros pratos culinários, além do seu uso para fins medicinais e ornamentais. Atualmente, baseados em dados morfológicos o gênero Passiflora está dividido em quatro subgêneros: Astrophea (DC.) Mast., Decaloba (DC.) Rchb., Deidamioides (Harms) Killip Passiflora (FEUILLET; MACDOUGAL, 2004). Sendo que as filogenias moleculares recentes corroboram total ou parcialmente essa classificação (MUSCHNER et al., 2003; YOUCKTENG; NADOT, 2004; HANSEN et al., 2006; MUSCHNER et al., 2012). No gênero Passiflora, as espécies de maior interesse econômico pertecem ao subgênero Passiflora. Sendo que no Brasil, P. alata Curtis, P. cincinnata Mast. e P. edulis Sims são as espécies mais importantes economicamente, utilizadas para produção de frutos (FALEIRO; JUNQUEIRA, 2016). No entanto, P. edulis se destaca devido a grande produção de frutos, ocupando mais de 95% da área plantada no Brasil (MELETTI, 2011), produzindo toneladas no ano de 2015 (IBGE, 2015). Devido ao grande interesse econômico, já foram lançadas no mercado diversas cultivares envolvendo essas espécies. Em plantas com genomas grandes, a sua maior proporção é composta por DNA repetitivo (Elementos tranponíveis e DNA satélite). No entanto, o processo de amplificação do DNA repetitivo ainda não está completamente compreendido (PUTEROVA et al., 2017). Recentemente, devido à maior disponibilidade de dados de sequenciamento de nova geração e a implementanção de ferramentas de bioinformática (NOVÁK et al., 2010; NOVÁK et al., 2013), tem sido possível realizar a caracterização global do DNA repetitivo em diversos genomas de plantas (MACAS et al., 2011; NOVÁK et al., 2014; MASCAGNI et al., 2017; USAI et al., 2017; ZHANG et al., 2017). Dessa forma, possibilitando a realização de análises comparativas dentro ou entre genomas (MACAS et al., 2011). Em P. edulis, um estudo prévio analisou sequências inseridas em BACs (Bacterial Artificial Chromossome), e foi observado que o DNA repetitivo correspondeu 19,6% das sequências (SANTOS et al., 2014). Em plantas, o DNA repetitivo evolui mais rapidamente do que as sequências gênicas, dessa forma os geneticistas e melhoristas de plantas podem encontrar nesse tipo de DNA, marcadores moleculares que permitem mapear 64

79 genes importantes, analisar a diversidade genética e estudar processos de especiação e evolução do genoma (NOVAK, et al., 2014). No subgênero Passiflora, o tamanho do genoma varia de 0,26 a 2,68 picogramas (1C) entre as espécies (SOUZA et al., 2004; PINTO et al., 2010; YOTOKO et al., 2011). Uma vez que as espécies desse subgênero possuem o mesmo número cromossômico, com 2n = 18, sugere-se que o aumento do tamanho do genoma nessas espécies está relacionado ao ganho de DNA repetitivo (FLAVELL et al., 1986), sendo essa uma rota evolutiva importante em Passiflora. O objetivo desse trabalho foi realizar análises de bioinformática a partir de dados de sequenciamento de baixa cobertura para verificar a composição do DNA repetitivo em Passiflora. Uma análise comparativa do DNA repetitivo foi realizada entre P. alata, P. cincinnata e P. edulis para verificar quais os principais grupos de DNA repetitivo que compoem o genoma dessas espécies e verificar a sua distribuição nos cromossomos. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1. Material vegetal As espécies de Passiflora alata (2n = 18), P. cincinnata (acesso 504, 2n = 18) e P. edulis (2n = 18) utilizadas no presente estudo, foram mantidas no Banco Ativo de Germoplasma (BAG-Passifloras), localizado no Campus da Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC), no município de Ilhéus, Bahia, Brasil (long W, lat S, alt 78m) Extração do DNA genômico e sequenciamento de nova geração (NGS) O DNA genômico foi extraído utilizando-se o protocolo proposto por Doyle e Doyle (1990), com algumas modificações para Passiflora (VIANA et al., 2006). Para purificação, o DNA genômico foi precipitado com a adição de 10% de acetato de sódio (3 M, ph 5,2) e 200% do volume final de etanol anidro a -20ºC. A quantificação do DNA genômico foi conduzida pelo kit de quantificação Qubit dsdna BR (Q32850) em Qubit (Termo Scientific ) e a pureza das amostras foi checada pela razão 260/230 nm e 260/280 nm em equipamento Nanodrop (Termo Scientific ). 65

80 O DNA genômico de cada espécie foi utilizado para a construção das bibliotecas genômicas. Para tal, foi utilizado o kit para a elaboração de biblioteca genômica Nextera DNA Sample Preparation (Illumina ref ) com o Nextera index kit (Illumina ref ). O protocolo utilizado para a construção das bibliotecas seguiu as recomendações do fabricante, cujas etapas consistem na marcação e fragmentação de 50 ng de DNA genômico de cada espécie; purificação dos fragmentos com a utilização do kit de purificação GFX PCR DNA and Gel Band Purification KIT (GE Healthcare Life Sciences); amplificação e ligação dos indexs (específicos para cada biblioteca/espécie) e purificação por beads magnéticas (AMpure XP beads GE Helthcare Life Sciences). As bibliotecas genômicas foram previamente quantificadas com a utilização do kit de quantificação Qubit dsdna BR (Q32850). Contudo, a utilização do kit de quantificação KAPA Library Quantification Kit IlluminaPlatforms (KR0405) foi necessária para a quantificação final por qpcr das bibliotecas genômicas pré-sequenciamento. O preparo das reações de qpcr seguiu o protocolo proposto pelo fabricante do kit de quantificação KAPA em termociclador de tempo real ABI Prism Real-Time PCR (Applied Biosystems ). A avaliação qualitativa das bibliotecas foi inferida pela análise da curva de dissociação do gráfico obtido após o qpcr, onde também foi avaliada a existência de dímero de adaptadores (RIRIE et al., 1997). O sequenciamento foi realizado no Laboratório de Marcadores Moleculares do Centro de Biotecnologia e Genética (CBG), conduzido no sequenciador Illumina Miseq com o uso do kit de sequenciamento MiSeq Kit reagente V3 600 ciclos (Illumina ref ), seguindo o protocolo de sequenciamento proposto pelo fabricante Identificação do DNA repetitivo e anotação Um total de , e reads paired-end (tamanho médios dos reads 300 pb) foram obtidos para P. alata, P. cincinnata e P. edulis, respectivamente. Com uma cobertura genômica de 2.8x para P. alata (1C = Mpb; YOTOKO et al., 2011), 3.5x para P. cincinnata (1C = Mpb; PINTO et al., 2010) e 2.2x para P. edulis (1C = Mpb; SOUZA et al., 2004). Para identificação do DNA repetitivo utilizamos a pipeline RepeatExplorer, que realiza clusterização comparativa baseada em gráficos, implementada no servidor Galaxy (NOVÁK et al., 2010; NOVÁK et al., 2013). Os reads 66

81 foram filtrados por qualidade, usando um cut-off de 30, trimados e filtrados por tamanho (100 pb) para obter reads de alta qualidade. Paired-reads entrelaçados foram amostrados aleatoriamente para cobrir 5% do genoma de cada espécie: (P. alata), (P. cincinnata) e (P. edulis). A clusterização dos reads foi realizada com uma sobreposição mínima de 55% e uma similaridade de 90%. A montagem dos contigs em clusters representando repetições com abundancia >0.01% foram considerados como DNA repetitivo. Para caracterização dos clusters (CLs), além do uso do banco de dados RepeatMasker, já disponível no RepeatExplorer, foi construído um banco de dados customizado, utilizando sequências repetitivas de bancos de dados públicos (Repbase, Plant Repeat Database e Centro Nacional de Informação Biotecnológica (NCBI), totalizando sequências. Após a análise pelo RepeatExplorer os clusters de foram examinados e anotados manualmente. Após a anotação, os domínios protéicos da transcriptase reversa (RT) dos retrotransposons LTR foram identificados usando a ferramenta Protein domain search (NOVÁK et al., 2013) e os monômeros dos satélites foram reconstruídos usando a ferramenta Tandem Repeat Analyser - TAREAN (NOVÁK et al. 2017). Para o mapeamento cromossômico, primers para os domínios RT dos retrotransposons LTR selecionados e monômeros do DNA satélite foram desenhados pela ferramenta Primer3plus (UNTERGASSER et al., 2007) 2.4. Preparo das sondas Para obtenção das sondas, O DNA template foi amplificado usando os primers específicos desenhados para domínio RT dos retrotransposons LTR selecionados (Tabela 1) e dos monômeros de DNA satélite de P. alata (PaSat_145 F: ATCGACGTTTCGCTTCAAAT, R: ACGGTGAGGTGCAGTGTTTT) e P. cincinnata (PcSat_145 F: GATCCGTGCAAAAG TCACCT, R: GCCGAAACTGGACGAAAAC). O programa de PCR para amplificação consistiu de 4 min a 94 C para desnaturação inicial, seguido por 30 ciclos de 1 min a 94 C, 1 min a 56 C e 2 min a 72 C. No último ciclo a extensão final a 72 C foi estendida por 10 min. Após a purificação, os produtos de PCR foram marcados com biotina-16-dutp (Roche Diagnostics ) via PCR ou digoxigenina-11-dutp via Nick Translation. 67

82 Tabela 1. Caracterização dos retrotransposons utilizados no mapeamento cromossômico. Espécie Cluster Proporção Classificação Primers (5-3 ) genômica (%) P. alata CL4 1,62 Ty3/Gypsy/Chromovirus F: CTGCAAGACGGTCCTCAACT R: GTTCGCTCCGGTTGTGTATT P. alata CL41 0,73 Ty3/Gypsy/Chromovirus F: AAATGCGACTCATGCTCCTC R: ACCGGTCCTGTTCGTGAAG P. alata CL57 0,56 Ty1/Copia/Angela F: TCTCTCGAATCCAGGTTGCT R: TCAAGCATGGTCCTTGACAG P. alata CL81 0,35 Ty3/Gypsy/Athila F: AGACGGGGATCACGGTTATT R:TCTTCTCAATGCAACGCTGT P. edulis CL15 1,03 Ty3/Gypsy/Chromovirus F: AGGGAGCAGCAGTATTTTCG R: GCTTGTCTCGGAGCGTTT P. edulis CL21 0,97 Ty1/Copia/Angela F: ATGGGCCTTAGTTGACTTGC R: CATGCAACCATATCTTGACTGA P. edulis CL61 0,47 Ty3/Gypsy/Athila F: CCTGTGCAATGTGTTCCAAA R: TCCCAATTCAGCACAAGGTT P. edulis CL82 0,29 Ty1/Copia/Maximus/SIRE F: GCATACTTTCCTTGTGTGATGAA R: GCTTGATGAAAATGGCATGA P. cincinnata CL6 1,22 Ty3/Gypsy/Chromovirus F: GCATACTTTCCTTGTGTGATGAA R: GCTTGATGAAAATGGCATGA P. cincinnata CL30 0,73 Ty3/Gypsy/Athila F: CCAGTGCAGTGTGTTCCAAA R: TGCCTTCTCGTACCATGAAAT P. cincinnata CL55 0,50 Ty1/Copia/Maximus/SIRE F: TTGGCATCCTCCAAATTGA R: GGGAACTTGTTAAAAGGCCTAAA P. cincinnata CL99 0,17 Ty3/Gypsy/Chromovirus F: GCTTAGCATAAAGCTTTTCACG R: AGCTTAAGCCCATGTGCAGT 68

83 2.5. Preparo das lâminas Raízes de P. alata, P. cincinnata e P. edulis, com aproximadamente um centímetro, foram coletadas de estacas acondicionadas em sacos contendo areia lavada e pré-tratadas com 8-hidroxiquinolina (Merck ) a 0,002 M por 1 h em temperatura ambiente (TA) e mais 21 h a + 8 a10 ºC. Após lavadas duas vezes em água destilada e fixadas em Carnoy (etanol anidro (Merck ):ácido acético glacial (Merck ) [3:1], v/v) por 3 h em TA, as amostras foram mantidas a -20 C por pelo menos 24 h ou até sua utilização. Para preparação das lâminas foi seguido o protocolo proposto por Guerra e Souza (2002). Ápices de raízes foram lavados duas vezes em água destilada e incubados com 15 µl da solução enzimática celulase (Sigma ) 2% e pectinase (Sigma ) 20% (w/v) por 80 minutos a 37º C para todas as espécies. A enzima foi retirada com o auxílio de micropipeta, e após lavadas em água destilada, foi adicionado 10 µl de ácido acético (Merck ) 45% sobre a raiz. Com o auxílio de agulhas e sob microscópio estereoscópico, as raízes foram maceradas, cobertas com uma lamínula e com o auxílio de uma agulha de ponta grossa o material citológico foi espalhado. Após o espalhamento, a lamínula foi pressionada gentilmente com o auxílio de papel de filtro para o espalhamento dos cromossomos, congeladas em nitrogênio líquido por cerca de 6 minutos para a retirada da lamínula, que foi realizada com o auxílio de estilete, e secas ao ar. As lâminas com boas preparações metafásicas foram mantidas a -20 C até a sua utilização na FISH Hibridação In Situ Fluorescente (FISH) O tratamento das lâminas para a FISH seguiu o protocolo proposto por Schwarzacher e Heslop-Harrison (2000) e Souza et al (2010), com modificações feitas por Melo et al (2015). Lâminas contendo as preparações citológicas foram secas em estufa a 37 C pelo tempo mínimo de 1 h. Após aplicação de 50 µl de RNase (Sigma ) a 1 µg/ml em tampão 2xSSC (cloreto de sódio [Sigma ] a 0,3 M; citrato de sódio [Sigma ] a 0,03 M), as lâminas foram incubadas em câmara úmida por 1 h a 37 C. As lâminas foram imersas em 2xSSC em TA duas vezes por 5 min cada; 50 µl de ácido clorídrico (HCl; Vetec) a 10 mm foi adicionado sobre as metáfases por 5 min, e após retirada do HCl, foi adicionado 50 µl de pepsina (Sigma ) [pepsina a 10 mg/ml; HCl a 10 mm (1:100 v/v)] e as lâminas foram incubadas em câmara úmida por 20 min a 37 C. As etapas de lavagens citadas a seguir foram realizadas em 69

84 plataforma agitadora (Biomixer, Mos-1) a 120 rpm. As lâminas foram lavadas em 2xSSC em TA duas vezes por 5 min cada, imersas em formaldeído (Sigma) a 4% em TA por 10 min, e novamente lavadas em 2xSSC duas vezes por 5 min cada. As preparações citológicas foram desidratadas em etanol 70% e etanol 96% por 5 min cada. Após a secagem das lâminas em TA por 30 min, foi adicionada a mistura de hibridação com o volume final de 15µl, sendo formamida (Sigma ) 50%, dextran sulfato (Sigma ) 10%, 2xSSC (cloreto de sódio, citrato de sódio; Sigma), dodecil sulfato de sódio (SDS; Bioagency) 0,13% e 50 ng da sonda. A mistura de hibridação foi aquecida a 75 C por 10 min em termociclador (Eppendorf, Mastercycler) e transferida imediatamente para gelo pelo tempo mínimo de 5 min. As lâminas contendo a mistura de hibridação foram desnaturadas em termociclador (Techne, TC-412), contendo um adaptador para lâminas, a 75 C por 10 min e incubadas overnight a 37 C em câmara úmida. Após a hibridação, as lâminas foram imersas em 2xSSC em TA por 5 min para a remoção das lamínulas. Os banhos pós-hibridação a seguir foram realizados em banho-maria (Marconi, MA093/1/E), a 42 ºC, com duas imersões em 2xSSC por 5 min cada, duas em 0,1xSSC por 5 min cada, e mais duas imersões em 2xSSC por 5 min cada. As lâminas foram imersas em solução com 4xSSC/Tween 20 (Sigma ) a 0,2% em TA por 5 min e tratadas com 50 µl de albumina de soro bovino, fração 5 (BSA; Sigma ) a 5%. As sondas marcadas com biotina-16- dutp foram detectadas com 0,7 μl de avidina-isotiocianato de fluoresceína (FITC; Vector ) mais 19,3 μl de BSA 5% por lâmina. As sondas marcadas com digoxigenina-11-dutp foram detectadas com 0,7 μl anti-digoxigenina-rodamina (Roche ) mais 19,3 μl de BSA 5% por lâmina. As lâminas contendo os anticorpos para a detecção foram incubadas em câmara úmida por 1 h a 37 C. Para a remoção do excesso de anticorpo, foram realizados três banhos por 5 min cada com 4xSSC/Tween20 a 0,2% em TA. As lâminas foram brevemente imersas em 2xSSC e as preparações citológicas foram simultaneamente montadas e contracoradas com Vectashield Antifade Mounting Medium com DAPI (H-1200). As lâminas foram estocadas a C até análise Análise de imagem A análise e fotodocumentação foram realizadas com a utilização do microscópio de epifluorescência Olympus BX41 equipado com câmera digital de 5MP Olympus DP25 e com o software DP2-BSW. As hibridações detectadas com avidina-fitc foram visualizadas com o 70

85 filtro U-MWB (excitation nm/dichroic cutoff 500nm/emission > 515nm) e as hibridações detectadas com anti-digoxigenina-rodamina foram visualizadas com o filtro U- MWG (excitation nm/dichroic cutoff 570nm/emission > 590nm). As sobreposições FITC/DAPI e rodamina/dapi foram relaizadas no software photoshop SC5. 3. RESULTADOS 3.1 Composição genômica O sequenciamento em plataforma Illumina MiSeq de P. alata, P. edulis e P. cincinnata seguido da clusterização de reads, baseado em gráficos pelo RepeatExplorer, permitiu a caracterização do DNA repetitivo nessas espécies. Para P. alata, reads foram agrupados em 219 clusters (com mais de 110 reads), correspondendo a 74,70% do genoma (Fig. 1A). Para P. edulis reads foram agrupados em 250 clusters (com mais de 78 reads), correspondendo 66,86% do genoma (Fig. 1B). Para P. cincinnata reads foram agrupados 263 clusters (com mais de 68 reads), correspondendo 62,24% do genoma (Fig. 1C). Embora alguns reads de DNA cloroplastídico possam ser resultado de inserções de cpdna no genoma nuclear (NUPTs), a maioria dos reads de DNA cloroplastidico provavelmente resultou da contaminação de cpdna, sendo excluído da análise. Nas três espécies foi observado que a maior parte de DNA repetitivo corresponde a retrotransposons LTR do tipo Ty3/Gypsy e Ty1/Copia (Tabela 2). No entanto, para P. alata e P. edulis, Ty3/Gypsy representou a maior proporção, enquanto em P. cincinnata Ty1/Copia representou a maior proporção. Dois clusters em P. alata (CL108 e CL116), quatro clusters em P. edulis (CL108, CL116, CL117 e CL119) e três CLs em P. cincinnata (CL70, CL71 e CL130) correspondeu ao DNAr 45S. Um cluster em cada espécie correspondeu ao DNAr 5S, CL175 em P. alata, CL229 em P. edulis e CL157 em P. cincinnata. Um DNA satélite foi identificado em cada espécie, CL144 em P. alata, CL 159 em P. edulis e CL201 e P. cincinnata. Os tipos de DNA repetitivo e sua proporção no genoma foram identificados em cada espécie (Tabela 2). Todos os retrotransposons representam 42,95% do genoma de P. alata, 41,25% do genoma de P. edulis e 40,34% do genoma de P. cincinnata. Dentro dos retrotransposons, Ty1/Copia representa 17,05% do genoma de genoma de P. alata, 16,70% 71

86 do genoma de P. edulis e 24,41% do genoma de P. cincinnata. Ty3/Gypsy representa 25,90% do genoma de P. alata, 24,55% do genoma de P. edulis e 15,93% do genoma de P. cincinnata. Nas três espécies o Ty1/Copia mais abuntante foi a família Angela, representando 9,73% do genoma de P. alata, 8,39% do genoma de P. edulis e 13,63% do genoma de P. cincinnata. O Ty3/Gypsy mais abundante foi a família Chromovirus, representando 15,75% do genoma de P. alata, 12,51% do genoma de P. edulis e 7,21% do genoma de P. cincinnata. O DNA transposon representa 0,02% do genoma de P. alata, 0,62% do genoma de P. edulis e 0,03% do genoma de P. cincinnata. O DNAr 45S e 5S representa 0,28% e 0,02% do genoma de P. alata, 0,62% e 0,01% do genoma de P. edulis e 0,75% e 0,05% do genoma de P. cincinnata, respectivamente. O DNA satélite representa 0,05% do genoma de P. alata, 0,04% do genoma de P. edulis e 0,02% do genoma de P. cincinnata. Figura 1. Proporção do DNA repetitivo e sequências de cópia única em Passiflora: (A) P. alata, (B) P. edulis, (C) P. cincinnata. 72

87 Tabela 2. Composição do DNA repetitivo em Passiflora alata, P. cincinnata e P. edulis Classificação Proporção no genoma (%) Tipo de Repetição Superfamília Família P. alata P. edulis P. cincinnata Retrotransposons LTR Ty1/Copia Angela 9,73 8,39 13,63 Tork 0,07 0,26 0,32 Maximus/SIRE 0,07 1,21 2,77 Bianca 0,00 0,00 0,02 Não classificado 7,18 6,84 7,67 Ty1/Copia total 17,05 16,70 24,41 Ty3/Gypsy Chromovirus 15,75 12,51 7,29 Athila 3,11 4,96 4,58 Não classificado 7,04 7,08 4,06 Ty3/Gypsy total 25,90 24,55 15,93 DNA transposon 0,02 0,62 0,03 Pararetrovirus 0,00 0,00 0,01 Em tandem DNAr 45S 0,28 0,62 0,75 DNAr 5S 0,02 0,01 0,05 Satélites 0,05 0,04 0,02 Não classificados 31,38 24,32 21,04 DNA repetitivo total 74,70 66,86 62,24 Cópia única 25, 30 33,14 37,76 73

88 3.2 Identificação de domínios RT em retrotransposons LTR O domínio da transcriptase reversa (RT) é o mais conservado dentro da poliproteína do retrotransposon, dessa forma todos os clusters que possuía o domínio RT foram identificados pela ferramenta Protein domain search e após a identificação, os domínios RT foram isolados dentro dos contigs para posterior mapeamento cromossômico. Em P. alata, entre os retrotransposons LTR da superfamília Ty3/gypsy que apresentaram o domínio RT, foram identificados dois clusters (CL4 e CL41) pertencentes à família Chromovirus e um cluster (CL81) pertencente à família Athila. Para os clusters (CL41 e CL81) foram identificados um contig contendo o domínio RT, enquanto que, para o CL4 foram identificados três contigs contendo domínios RT. Entre os retrotransposons da superfamília Ty1/Copia foi identificado um cluster (CL57) pertencente à família Angela (Figura 2). Figura 2. Layouts gráficos dos clusters (CLs) que apresentaram o domínio da trancriptase reversa (RT) em Passiflora alata: (A) CL4 Gypsy/Chromovirus, (B) CL41 Gypsy/Chromovirus, (C) CL57 Copia/Angela, (D) CL81 Gypsy/Athila. 74

89 Em P. edulis, entre os retrotransposons da superfamília Ty3/gypsy que apresentaram o domínio RT, foram identificados dois clusters (CL15 e CL18) pertencentes à família Chromovirus e um cluster (CL61) pertencente à família Athila. Para os clusters (CL15 e CL61) foi identificado um contig contendo o domínio RT, enquanto que, para o CL18 foram identificados dois contigs contendo domínio RT. O CL18 não foi utilizado para o mapeamento cromossômico nesse trabalho, pois já havia sido selecionado como retrotransposon possivelmente associado ao centrômero de P. edulis. Entre os retrotransposons da superfamília Ty1/Copia foi identificado um cluster (CL21) pertencente à família Angela e um cluster (CL82) pertencente à família Maximus/SIRE (Figura 3). Figura 3. Layouts gráficos dos clusters (CLs) que apresentaram o domínio da trancriptase reversa (RT) em Passiflora edulis: (A) CL15 Gypsy/Chromovirus, (B) CL21 Copia/Angela, (C) CL61 Gypsy/Athila, (D) CL82 Copia/Maximus/SIRE. Em P. cincinnata, entre os retrotransposons da superfamília Ty3/gypsy que apresentaram o domínio RT, foram identificados dois clusters (CL6 e CL99) pertencentes à família Chromovirus e um cluster (CL30) pertencente à família Athila. Para o cluster (CL6) foram identificados três contigs contendo o domínio RT, enquanto que, para os clusters 75

90 (CL30 e CL99) foi identificado apenas um contig contendo domínio RT. Entre os retrotransposons da superfamília Ty1/Copia foi identificado um cluster (CL55) pertencente à família Maximus/SIRE. Para esse CL foram identificados três contigs contendo o domínio RT (Figura 4). Figura 4. Layouts gráficos dos clusters (CLs) que apresentaram o domínio da trancriptase reversa (RT) em Passiflora cincinnata: (A) CL6 Gypsy/Chromovirus, (B) CL30 Gypsy/Athila, (C) CL55 Copia/Maximus/SIRE, (D) CL99 Gypsy/Chromovirus. 3.3 Identificação de DNA satélite Um satélite de 145 pb foi identificado em cada espécie. CL144 em Passiflora alata (PaSat_145), CL159 em P. edulis (PeSat_145) e CL201 em P. cincinnata (PcSat_145). Nas três espécies foi obsevado um layout circular característico de DNA satélite (Figura 5). No RepeatExplorer, satélites que possuem monômeros menores do que o tamanho dos reads utilizados para a clusterização (100 pb nessa análise) tendem a formar um gráfico esférico circular e aqueles que possuem monômeros maiores que o tamanho dos reads tendem a formar o um gráfico em forma de anel (DODSWORTH et al., 2015). O DNA satélite de P. 76

91 edulis não foi utilizado para o mapeamento cromossômico nesse trabalho, pois já havia sido selecionado como um satélite possivelmente associado ao centrômero nessa espécie. Figura 5. Layouts gráficos dos clusters de DNA satélite de 145 pb identificados em Passiflora: (A) CL144 P. alata, (B) CL159 P. edulis, (C) CL201 P. cincinnata. Para P. alata e P. cincinnata o tamanho e a sequência de nucleotídeos do monômero consenso foi reconstruído utilizando a ferramenta TAREAN que se baseia na análise de K- mers e representado pelo gráfico de DeBruijn (Figura 6). Os monômeros identificados nas duas espécies foram blastados contra o banco de dados de DNA (GenBank/NCBI) e não foi encontrada nenhuma similaridade significativa com as sequências satélites disponíveis no banco de dados. Figura 6. Grafos de DeBruijn mostrando o monômero consenso de 145 pb do DNA satélite em Passiflora: (A) P. alata, (B) P. cincinnata. 77

92 3.4 Localização cromossômica de retrotransposons e DNA satélites Para o mapeamento cromossômico dos retrotransposons LTR e satélites nas espécies, sondas representando a região da trancriptase reversa (RT) de cada retrotransposon e o monômero do DNA satélite foram utilizadas. Para os clusters de retrotransposons que apresentaram mais de um contig cotendo o domínio RT, foi isolado o domínio RT de apenas um contig para o mapeamento cromossômico, devido à alta similaridade entre os contigs de um mesmo cluster. Os retrotransposons mapeados apresentaram um padrão de hibridação disperso ao longo da maioria dos cromossomos nas três espécies, no entanto, os retrotransposons mais abundantes em proporção nos genomas apresentaram uma maior quantidade de sítios de hibridação nos cromossomos. Nas três espécies retrotransposons da família Chromovirus apresentaram a maior quantidade de sítios de hibridação nos cromossomos. Em P. alata, o CL4 (Gypsy/Chromovirus) apresentou a maior abundância de sítios de hibridação distribuídos ao longo de todos os cromossomos, com sinais de hibridação intensos (Figura 7A). Enquanto o CL41 (Gypsy/Chromovirus) apresentou sítios de hibridação menores e menos intensos ao longo dos cromossomos (Figura 7B). O CL57 (Copia/Angela) apresentou sítios de hibridação preferencialmente nas regiões pericentroméricas dos cromossomos (Figura 7C). O CL81 (Gypsy/Athila) apresentou sítios de hibridação fracos, estando ausente nos braços de alguns cromossomos (Figura 7D) 78

93 Figura 7. Mapeamento cromossômico de retrotransposons LTR em cromossomos metafásicos de Passiflora alata (2n = 18) usando Hibridação In Situ Fluorescente (FISH): (A) CL4 Gypsy/Chromovirus, (B) CL41 Gypsy/Chromovirus, (C) CL57 Copia/Angela, (D) CL81 Gypsy/Athila. Barra = 10µm. Em Passiflora. edulis, o CL15 (Gypsy/Chromovirus) apresentou a maior abundância de sítios de hibridação, com sinais isolados e intensos distribuídos ao longo de todos os cromossomos (Figura 8A). O CL21 (Copia/Angela) apresentou um padrão de hibridação com maior abundância em alguns cromossomos (Figura 8B). O CL61 (Gypsy/Athila) apresentou sítios de hibridação intensos, bem definidos e isolados entre si (Figura 8C). O CL82 Copia/Maximus/SIRE apresentou sítios de hibridação em maior quantidade nas regiões proximais e em menor quantidade nas regiões teloméricas dos cromossomos (Figura 8D). 79

94 Figura 8. Mapeamento cromossômico de retrotransposons LTR em cromossomos metafásicos de Passiflora edulis (2n = 18) usando Hibridação In Situ Fluorescente (FISH): (A) CL15 Gypsy/Chromovirus, (B) CL21 Copia/Angela, (C) CL61 Gypsy/Athila, (D) CL82 Copia/Maximus/SIRE. Barra = 10µm. Em P. cincinnata, o CL6 (Gypsy/Chromovirus) apresentou os maiores sítios de hibridação, no entanto apresentou um par cromossômico como único sítio de hibridação com marcação fraca (Figura 9A). O CL30 Gypsy/Athila apresentou a maior quantidade de sítios de hibridação, com sítios menores e bem definidos (Figura 9B). O CL55 (Copia/Maximus/SIRE) apresentou alguns cromossomos com sítios e hibridação maiores e alguns cromossomos com sítios menores e ausente em um cromossomo (Figura 9C). O CL99 (Gypsy/Chromovirus) apresentou a menor quantidade de sítios de hibridação (Figura 9D). 80

95 Figura 9. Mapeamento cromossômico de retrotransposons LTR em cromossomos metafásicos de Passiflora cincinnata (2n = 18) usando Hibridação In Situ Fluorescente (FISH): (A) CL6 Gypsy/Chromovirus, (B) CL30 Gypsy/Athila, (C) CL55 Copia/Maximus/SIRE, (D) CL99 Gypsy/Chromovirus. Barra = 10µm. O DNA satélite de 145 pb de P. alata e P. cincinnata foi mapeado nas regiões subteloméricas dos cromossomos. Em P. alata todos os cromossomos apresentaram sítios de DNA satélite. Quatro pares cromossômicos apresentaram sítios de DNA satélite em ambos os braços (pares 1, 3, 4 e 6) e cinco pares cromossômicos apresentaram sítios de DNA satélite em apenas um braço (pares 2, 5, 7, 8 e 9) (Figura 10A e C). P. cincinnata apresentou dois pares cromossômicos com sítios de DNA satélite em ambos os braços (pares 1 e 5), seis pares cromossômicos com sítios de DNA satélites em apenas um braço (pares 2, 4, 6, 7, 8, 9) e um par cromossômico sem a presença de sítios de DNA satélite (Figura 10B e D). No total, P. cincinnata apresentou uma menor quantidade de sítios de DNA satélite que está relacionado com a sua menor proporção no genoma quando comparado com P. alata. 81

96 Figura 10. Mapeamento cromossômico do DNA satélite de 145 pb em cromossomos metafásicos de Passiflora usando Hibridação In Situ Fluorescente (FISH): (A) CL144 P. alata (2n = 18), (B) CL201 P. cincinnata (2n = 18), (C) Cariograma de P. alata, D Cariograma de P. cincinnata. Barra = 10µm. 4. DISCUSSÃO A identificação de DNA repetitivo baseada na clusterização de reads e seu reflexo gráfico a partir de sequenciamento de baixa cobertura tem sido utilizada em uma ampla diversidade de plantas, uma vez que essa abordagem permite uma caracterização global do DNA repetitivo de um genoma, permitindo análises comparativas dentro ou entre genomas (MACAS et al., 2011). Este trabalho apresenta a primeira análise citogenômica comparativa envolvendo espécies do gênero Passiflora. Nós observamos que a maior porção do genoma das espécies analisadas é composto de retrotransposons LTR (Gypsy e Copia), como encontrado em outras espécies de plantas (MACAS et al., 2011; NOVÁK et al., 2014; MASCAGNI et al., 2017; USAI et al., 2017; ZHANG et al., 2017). A maior proporção de retrotransposons LTR, como observado nesse estudo, é uma característica comum em genomas de plantas superiores, onde os retrotransposons representam umas das principais forças na evolução do tamanho do genoma (HAWKINS et al., 2006; NEUMANN et al., 2006; TENAILLON et al., 2011). 82