UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO DIRETORIA DE PESQUISA PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO DIRETORIA DE PESQUISA PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA RELATÓRIO TÉCNICO CIENTÍFICO Período: Agosto/2014 a Agosto/2015 () PARCIAL (x) FINAL IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO Título do Projeto de Pesquisa: Cooperação para a Inovação Científica e Tecnológica visando minimizar assimetrias entre programas de pós-graduação na área de alimentos. Nome do Orientador: Alessandra Santos Lopes Titulação do Orientador: Doutor em Tecnologia de Alimentos Faculdade de Engenharia de Alimentos FEA Unidade: ITEC (Instituto de Tecnologia) Laboratório:Laboratóriode Processos Biotecnológicos (LABIOTEC)

2 Título do Plano de Trabalho: Isolamento e diferenciação bioquímica das espécies de leveduras do gênero Saccharomyces e não Saccharomyces presentes no cacau amazônico. Nome do Bolsista: Mariano Henrique Coimbra Rodrigues Tipo de Bolsa: ( ) PIBIC/CNPq (x) PIBIC/UFPA ( ) PIBIC/INTERIOR ( ) PARD ( ) PIBIC/CNPq cota do pesquisador ( ) PIBIC/FAPESPA

3 SUMÁRIO IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO... 1 ISOLAMENTO E DIFERENCIAÇÃO BIOQUÍMICA DAS ESPÉCIES DE LEVEDURAS DO GÊNERO SACCHAROMYCES E NÃO-SACCHAROMYCES PRESENTES NO CACAU AMAZÔNICO INTRODUÇÃO JUSTIFICATIVA OBJETIVOS OBJETIVO GERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS MATERIAL E MÉTODOS MATERIAL FERMENTAÇÃO NATURAL DAS SEMENTES DE CACAU Coleta das Amostras Análises Microbiológicas Testes bioquímicos Caracterização físico-química das amostras RESULTADOS E DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS... 15

4 4 ISOLAMENTO E DIFERENCIAÇÃO BIOQUÍMICA DAS ESPÉCIES DE LEVEDURAS DO GÊNERO SACCHAROMYCES E NÃO-SACCHAROMYCES PRESENTES NO CACAU AMAZÔNICO Mariano Henrique Coimbra RODRIGUES; Alessandra Santos LOPES 1 INTRODUÇÃO Durante os últimos anos, o conhecimento sobre o processo de fermentação espontâneo das sementes de cacau aumentou consideravelmente no mundo (ARDHANA; FLEET, 2003; SCHWAN; WHEALS, 2004; JESPERSEN et al., 2005;NIELSEN et al., 2005, 2007b; CAMU et al., 2007; DE VUYST et al., 2008). Contudo, ainda faltam informações sobre a cultura do cacau em regiões com grande potencial de produção, como a Amazônica, devido principalmente à ampla diversidade microbiana e diversos fatores ligados a flora amazônica tais como o clima, o solo, a localização geográfica, a disponibilidade de nutrientes, bem como o método de fermentação utilizado. Um dos fatores cruciais para se conseguir um chocolate de boa qualidade é o processo fermentativo das sementes do cacau, que ocorre nas fazendas de forma natural. Esse processo é conduzido essencialmente por micro-organismos, dentre os quais os mais importantes são as leveduras e as bactérias acéticas. A fermentação quando conduzida de forma apropriada, possibilitará as condições ideais para o desenvolvimento das propriedades bioquímicas necessárias para a formação das características essenciais de um chocolate de qualidade (THOMPSON et al., 2001; SCHWAN; WHEALS, 2004; AFOAKWA et al., 2008; LIMA et al., 2011). A fermentação das amêndoas ainda é um processo tradicional e incontrolado, conduzido por uma ampla variedade de espécies nativas de leveduras, bactérias acéticas e bactérias lácticas (SCHWAN; WHEALS, 2004; LIMA et al., 2011). Para transformar a fermentação em um processo mais eficiente, é essencial conhecer como cada grupo microbiano contribui para o processo fermentativo e na qualidade do chocolate gerado (SALTINI et al., 2013). Dentre a população microbiana, as leveduras constituem a parte predominante nos primeiros dias de fermentação, uma vez que seu crescimento é favorecido na presença de açúcares fermentáveis (glicose, frutose e sacarose). Estas, além de contribuírem para o aroma e sabor característicos do chocolate, propiciam condições favoráveis para o crescimento de bactérias, bem como produzem compostos voláteis como álcoois, terpenos e cetonas (SCHWAN; WHEALS, 2004). As leveduras convertem os açúcares da polpa em etanol e excretam enzimas que degradam a polpa. Simultaneamente, a presença de ácido cítrico assimilado por bactérias

5 5 lácticas causam um leve aumento no ph da polpa, que juntos, com o aumento de oxigênio favorece o crescimento de bactérias acéticas. O etanol inicialmente formado pelas leveduras é oxidado em ácido acético pelas bactérias acéticas em um processo exotérmico, causando um aumento na massa fermentada, atingindo temperaturas de até 45º C ou mais (SCHWAN et al., 1995; CAMU et al., 2007; NIELSEN et al., 2007). O etanol e o ácido acético se difundem na polpa, onde juntos, com a elevação da temperatura, são responsáveis por quebrar a parede celular e liberação de enzimas endógenas importantes para a formação de precursores do sabor característico do chocolate como aminoácidos livres, peptídeos e açúcares menores. Além de serem responsáveis pela produção de etanol e pela liberação de enzimas que degradam a polpa, as leveduras são as principais produtoras de ésteres e álcoois superiores, muito relatados por contribuírem na complexa mistura de compostos voláteis que caracterizam o aroma do chocolate (ARDHANA,2003; SCHWAN; WHEALS, 2004; OWUSU et al.,2011). A ecologia microbiana da fermentação das amêndoas de cacau é complexa e envolve o crescimento sucessivo de várias espécies de leveduras, bactérias acéticas e lácticas (ARDHANA; FLEET, 2003; SCHWAN; WHEALS, 2004; DE VUYST et al., 2010; LIMA et al., 2011; THOMPSON et al., 2013), assim as leveduras Hanseniaspora guilliermondii e Hanseniaspora opuntiae geralmente são dominantes na parte inicial da fermentação, onde depois Saccharomyces cerevisiae,kluyveromyces marxianus,pichia membranifaciens e Pichia kudriavzevii são mais frequentemente relatadas (ARDHANA; FLEET, 2003;JESPERSEN et al., 2005 ;NIELSEN et al., 2005 ;DANIEL et al., 2009; GALVEZ et al., 2007). Dentre esta população, muitos estudos já têm destacado a importância do gênero Saccharomyces para a fermentação do cacau (PAPALEXANDRATOU et al., 2013; BATISTA et al., 2015), como sendo uma das mais predominantes; devendo muito isso à sua habilidade de substituir outras espécies microbianas, atribuído ao seu alto poder fermentativo e capacidade de resistir a condições cada vez mais adversas estabelecidas no meio à medida que se prossegue a fermentação. Estudos científicos sobre a fermentação natural do cacau amazônico e sobre a microflora atuante nesta região ainda são escassos. Assim o presente estudo visa apresentar dados sobre o processo de fermentação que fundamentem e incentivem futuros avanços na pesquisa e obtenção de um chocolate de excelência. 2 JUSTIFICATIVA As sementes do cacau são a principal matéria-prima na produção do chocolate. O plantio de cacau é feito em países tropicais ao redor do mundo, entre os quais Costa do

6 6 Marfim, Gana, Indonésia e Brasil são os maiores produtores. Por muitos anos a produção e comercialização do cacau tem sido base da economia de muitos estados brasileiros, principalmente a Bahia. Muitos estudos relacionados ao isolamento e caracterização bioquímica de leveduras do cacau já foram realizados na Costa do Marfim (SANCHEZ et al., 1985), Indonésia (ARDHANA; FLEET, 2003), Gana (DANIEL et al., 2009) e na Bahia, Brasil (SCHWAN et al., 1995; MOREIRA et al., 2013). Embora progressos significativos já tenham sido feitos na definição da diversidade de espécies microbianas associadas a fermentação do cacau (SCHWAN et al., 1995; ARDHANA; FLEET, 2003; NIELSEN et al., 2005, 2007; CAMU et al. 2007; DANIEL et al., 2009; PAPALEXANDRATOU et al., 2011), informações quantitativas sobre o perfil de crescimento de espécies individuais no processo ainda são escassas na região Amazônica. Estes dados quantitativos, aliados com a análise bioquímica apropriada são necessários para determinar quais espécies microbianas são mais importantes no processo fermentativo. Com esse conhecimento, será possível otimizar o processo de fermentação e, se necessário, selecionar espécies apropriadas. As leveduras exercem papel fundamental neste processo, sendo crucial para a formação do aroma característico do cacau, onde algumas espécies apresentam predominância nesse processo e, consequentemente, influenciam no sabor do chocolate obtido. Vários estudos têm destacado a importância de algumas espécies fundamentais neste processo (SANCHEZ et al., 1985; SCHWAN et al., 1995; ARDHANA; FLEET, 2003), em especial da espécie Saccharomyces cerevisiae, aparecendo como uma das mais importantes neste processo. Embora a região amazônica possua uma vasta diversidade microbiana, e o cacau esteja inserido como um dos principais produtos da cadeia produtiva da região, ainda não há estudos sobre o papel das leveduras no processo fermentativo do cacau amazônico, e acerca da grande importância exercida pelo gênero Saccharomyces, bem como suas características bioquímicas. Assim, as informações e conhecimentos obtidos nesta pesquisa apresentaram dados para melhor compreender a participação deste gênero neste processo, bem como compreender mais suas atividades bioquímicas e seus arranjos subsequentes, para através disso viabilizarnovos avanços relacionados à diversidade microbiana atuante no cacau amazônico e aprimorar a qualidade do chocolate produzido. 3 OBJETIVOS 3.1 OBJETIVO GERAL

7 7 Isolamento e diferenciação através de testes bioquímicos das espécies de leveduras do gênero Saccharomyces e não Saccharomyces presentes no cacau amazônico. 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS Isolamento de leveduras presentes no cacau amazônico; Diferenciação através de testes bioquímicos das leveduras do gênero Saccharomyces e não Saccharomyces presentes no cacau amazônico; Caracterização físico química das amêndoas de cacau fermentadas. 4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 MATERIAL As amêndoas de cacau foram fermentadas nas pequenas propriedades rurais localizadas nos municípios de Medicilândia e Tucumã, correspondendo a diferentes regiões microclimáticas do estado do Pará. Em cada região, as fermentações foram realizadas em duplicatas. 4.2 FERMENTAÇÃO NATURAL DAS SEMENTES DE CACAU Foi utilizado o processo fermentativo padronizado pela Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira (CEPLAC). O método da CEPLAC consiste na fermentação em caixa de madeira composta por três compartimentos que medem de 3 a 6 metros de comprimento, com divisórias a cada metro, e com 1 metro e 20 centímetros de largura por 1 metro de altura Coleta das Amostras Amostras de aproximadamente 100g (compostas por pequenas porções de 10g retiradas de diferentes locais da caixa de fermentação) foram coletadas nos tempos 0h, 24h, 48h, 96h, 144h e 168 horas de fermentação, sendo armazenadas em sacos estéreis de polietileno e transportadas sob congelamento, durante todos os tempos de fermentação foi medida a temperatura das amostras de acordo com Camu et al. (2007) Análises Microbiológicas Para o isolamento das leveduras foram pesados 20 g de amostra de amêndoas de cacau de cada localidade, assepticamente transferida para sacos estéreis de polietileno, e

8 8 homogeneizadas em 180mL de água peptonada a 1%. Em seguida, a partir dessa diluição foram realizadas diluições decimais seriadas, até a diluição 10-7, alíquotas de 1 ml foram semeadas em placas de Petri, estéreis, contendo meio Ágar Dextrose Potato (PDA, SIGMA ) acidificado com ácido tartárico a 10% pela técnica de semeadura por profundidade, e posterior incubação à 25ºCde 1 a 4 dias (DANIEL et al., 2009). Após esse período de incubação, as levedurasforam contadas pelo método de contagem padrão em placas, determinando-se o número de Unidades Formadoras de Colônias por grama de sementes de cacau (UFC/g) conforme Daniel et al., (2009). Em seguida, as cepas foram purificadas em meio Ágar Extrato de Malte acidificado com ácido tartárico a 10% e cloranfenicol a 1% pela técnica de semeadura por profundidade, e posterior incubação à 25ºC de 1 a 2 dias. As leveduras isoladas foram semeadas em tubo de ensaio com tampa rosqueável contendo o meio sólido Yeast Extract Peptone Dextrose 2% (YEPD), colocadas em estufa a 25 ºC, durante 48 horas, e para sua manutenção, foram estocadas a 8ºC.Todas as análises microbiológicas foram realizadas no Laboratório de Microbiologia da Universidade Federal do Pará (UFPA) Testes bioquímicos para a diferenciação do gênero Saccharomyces e não Saccharomyces Testes de assimilação de fontes de carbono Os testes foram feitos utilizando o Meio Yeast Nitrogen Base ou YNB (6,7g/100ml), acrescentado da fonte de carbono a ser testada. Quatro fontes de carbono, que são assimiladas pela levedura Saccharomyces cerevisiae foram testadas: glicose, galactose, sacarose e maltose, todas na proporção de 2 g/100 ml,e uma fonte de carbono não assimilada pela levedura foi também testada (manitol 2g/100ml), antes da sua exclusão. Em todos os testes, foram colocadas em estufa a 30 ºC, durante 72 horas Teste de exclusão por estresse Os testes de exclusão por estresse foram realizados em 4 etapas, utilizando placas de Petri estéreis, organizados da seguinte forma:

9 9 Primeiramente as leveduras foram crescidas em meio sólido YEPD, acidificado com ácido tartárico a 10% e cloranfenicol a 1%, e incubadas a 37 ºC durante 72 horas; As leveduras que cresceram no teste anterior foram transferidas para o meio sólido YEPD, acidificado com ácido tartárico a 10% e cloranfenicol a 1%, contendo 8%, (v/v) de etanol e colocadas em estufa a 30ºC durante 72 horas; As leveduras crescidas na presença de etanol foram semeadas em meio básico (MY) sólido contendo 20 g% (p/v) de glicose e colocadas em estufa a 30ºC durante 72 horas; As leveduras resistentes as estas concentrações de fonte de carbono foram crescidas em meio básico (MY) sólido contendo 20 g% (p/v) de sacarose, adicionado de 8% (v/v) de etanol a 30 ºC durante 72 horas Testes de capacidade fermentativa Os testes de capacidade fermentativa foram realizados a partir das colônias de leveduras resistentes ao teste anterior. Foi inoculado em tubos de ensaio, previamente identificados, contendo em seu interior tubos de Durhan e 10 ml de meio líquido YP, acrescentado da fonte de carbono a ser testada. Os tubos foram colocados em estufa a 30 ºC durante 24 horas e foi observado o crescimento das leveduras, pela turvação dos meios, e a formação de gás (VAUGHAN-MARTINI e MARTINI 1993). As fontes de carbono testadas foram: glicose, manitol e sacarose, todas apresentado a proporção de 2 g% Caracterização físico-química das amostras As análises físico químicas foram realizadas no Laboratório de Processos Biotecnológicos da Universidade Federal do Pará. Foram monitorados os seguintes parâmetros durante a fermentação, de acordo com os Métodos Oficiais para Cacau e Derivados (Capítulo 31) da AOAC (1997); Acidez total titulável ( ); ph da massa das sementes de cacau ( ); Umidade ( ). 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1 IDENTIFICAÇÃO TAXONÔMICA DAS LEVEDURAS Foram isoladas nas duas localidades um total de 76 cepas, distribuídas da seguinte maneira: Tucumã (28) e Medicilândia (48). As colônias crescidas apresentaram diferenças morfológicas na cor (branca e branco-amarelada), aspecto (superfície lisa e rugosa) e brilho

10 10 (brilhante e opaca). Após a observação microscópica das leveduras crescidas, verificou-se que apresentaram as formas redondas e ovais. 5.2 ANÁLISES MICROBIOLÓGICAS TABELA 1: Média da Contagem Total de Leveduras * durante a fermentação do cacau em duas localidades amazônicas. Tempos de fermentação em horas Localidade Tucumã 1,6x10 8 1x10 7 5x10 6 5,1x10 5 1,5x10 7 1x10 7 Medicilândia 1,8x10 6 5,7x10 5 6x10 3 1,3x10 5 3x10 6 1x10 6 * UFC/g de cacau A Tabela 1 apresenta os dados das fermentações realizadas em Tucumã e Medicilândia, onde a contagem de leveduras ficou entre UFC/g no tempo 0 h.nos tempos seguintes, de 24 h e 48 h, houve um decréscimo no número de colônias formadas. Esse decréscimo permaneceu nos tempos posteriores de fermentação das localidades. As leveduras proliferam nos estágios iniciais da fermentação, sendo que sua atividade é intensa nas primeiras 48 h. Posteriormente, sofrem um declínio mediante fermentação prolongada, devido ao esgotamento das fontes de energia adequada (SCHWAN; WHEALS, 2004; CAMU et al., 2007). Os resultados encontrados estão de acordo com o encontrado em muitos estudos, tais quais Jespersen et al. (2005), que encontrou valores de UFC/g depois das primeiras 24 h. Os resultados também estão de acordo com Sanchez et al. (1985), que obteve valores máximos de contagem de leveduras de mais de 10 7 UFC/g. Comparando ainda com os valores encontrados por Ardhana e Fleet (2003), onde a contagem de leveduras oscilou entre UFC/g, mostram que os resultados obtidos no seguinte estudo são bastante positivos e estão dentro da média encontrada na literatura. 5.3 Testes Bioquímicos A partir das cepas isoladas do meio YEPD que foram semeadas em tubos de ensaio, foram obtidas 31 cepas isoladas da localidade de Tucumã e 46 cepas isoladas da localidade de Medicilândia. Estas cepas isoladas foram submetidas aos testes bioquímicos para a diferenciação do gênero Saccharomyces e não Saccharomyces. Este gênero de levedura apresenta grande importância no processo fermentativo do cacau (DE CAMARGO et al, 1963; SCHWAN et al., 1995; ARDHANA; FLEET, 2003), aparecendo como uma das mais predominantes leveduras neste processo, conduzindo como as outras, uma forte fermentação

11 11 alcoólica. Em particular, a espécie Saccharomyces cerevisae apresenta predominância nas primeiras 72 h de fermentação (SCHWAN et al., 1995); porém, sua importância se estende também na fermentação de vinhos e inclusive na produção industrial de álcool combustível. Devido à sua importância, procurou-se isolar e diferenciar este gênero de outros presentes, para melhor compreender os processos bioquímicos que são realizados por esta levedura Testes de assimilação de fontes de carbono Os testes bioquímicos de assimilação de fontes de carbono foram realizados utilizando-se o meio YNB, onde era variada a fonte de carbono a ser testada como nutriente das leveduras, visando-se realizar uma triagem das leveduras, a partir do qual as colônias resistentes que assimilavam as fontes de carbono, eram submetidas ao próximo teste. A partir das 31 cepas isoladas da localidade de Tucumã e das 46 cepas isoladas da localidade de Medicilândia, foram testadas com a fonte de carbono glicose, onde foram obtidas 29 cepas resistentes da localidade de Tucumã e 38 cepas resistentes da localidade de Medicilândia. Em seguida estas cepas foram submetidas à outra fonte de carbono, sendo esta a galactose. Foram obtidas 24 cepas isoladas da localidade Tucumã e permaneceram as 38 cepas resistentes da localidade Medicilândia. Mais uma vez, estas foram testadas, desta vez com a fonte de carbono sacarose, obtendo 23 cepas isoladas da localidade Tucumã e 37 cepas isoladas da localidade de Medicilândia. A próxima fonte de carbono testada foi a maltose, onde nenhuma cepa resistente foi obtida da localidade de Tucumã e apenas 1 cepa foi isolada da localidade de Medicilândia. Uma última fonte de carbono, que não é assimilada pelo gênero Saccharomyces foi testada, sendo o manitol a fonte de carbono. Das 31 cepas isoladas de Tucumã foram obtidas 4 cepas resistentes desta localidade e a partir das 46 cepas isoladas de Medicilândia, foram obtidas 4 cepas resistentes desta localidade Teste de exclusão por estresse Os testes de exclusão por estresse foram realizados a partir de 30 cepas isoladas da localidade de Tucumã e 44 cepas isoladas da localidade de Medicilândia, a partir do teste anterior (5.3.1). Estes foram realizados em 4 etapas, com diferentes meios de cultura, onde o objetivo era realizar uma seleção, a partir das colônias de leveduras resistentes à etapa anterior. Na 1ª etapa, utilizando o meio YEPD acidificado com ácido tartárico e cloranfenicol, foram obtidas 25 cepas isoladas da localidade de Tucumã e 43 cepas isoladas da localidade de Medicilândia. As cepas resistentes foram então submetidas ao próximo teste, com o meio YEPD acidificado com ácido tartárico e cloranfenicol, acrescentado de etanol. Desta etapa,

12 12 permaneceram as 25 cepas isoladas da localidade de Tucumã e as 43 cepas isoladas da localidade de Medicilândia. Na 3ª etapa, foi utilizado o meio MY, acrescentado da fonte de carbono glicose. Nesta etapa, ainda permaneceram as 25 cepas isoladas da localidade Tucumã e as 43 cepas isoladas da localidade Medicilândia. Na última etapa, utilizando o meio MY, acrescentado da fonte de carbono sacarose e de etanol, foram obtidas as 25 cepas isoladas da localidade Tucumã e as 43 cepas isoladas da localidade Medicilândia Testes de capacidade fermentativa Os testes de capacidade fermentativa foram realizados a partir das 25 cepas isoladas de Tucumã e das 43 cepas isoladas de Medicilândia, a partir do teste anterior (5.3.2). Estes foram realizados utilizando-se o meio MY, variando a fonte de carbono a ser testada como nutriente, para determinar em quais houve crescimento da levedura, através da fermentação, que eram determinadas a partir da turvação do meio e formação de gás carbônico, produzido no processo fermentativo. A primeira etapa foi feita utilizando-se glicose como fonte de carbono, onde a partir das 25 cepas isoladas de Tucumã, obteve-se 22 cepas desta localidade, e das 43 cepas isoladas de Medicilândia, foram obtidas 41 cepas, todas apresentando turvações no meio de cultura e formação de bolhas de gás carbônico. Em seguida, foi testada a fonte como manitol, onde a partir das 22 cepas de Tucumã, 18 cepas foram obtidas. Já a partir das 41 cepas de Medicilândia, obteve-se 40 cepas formadas. Por fim, utilizou-se a sacarose como meio nutritivo para as 18 cepas de Tucumã, obtendo-se 6 cepas, e das 40 cepas de Medicilândia, foram obtidas 36 cepas formadas. Observou-se que, embora tenha havido fermentação nessas cepas formadas, apenas em algumas foi observada a formação de gás carbônico. 5.4 CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DAS AMOSTRAS A caracterização físico-química das amostras levaram em consideração os resultados de ph, umidade, cinzas e acidez das amêndoas de cacau. Os resultados de ph e temperatura são apresentados na tabela abaixo.

13 13 Tempo de fermentação (horas) Tabela 1. Média do ph e temperatura, durante a fermentação do cacau município de Tucumã PA ph 5,25±0,50 4,84±0,38 4,53±0,20 5,76±0,36 6,45±0,67 6,07±0,07 6,48±0,20 Temperatura o C , , * Resultados expressos em média±desvio padrão. Tabela 2. Média do ph e temperatura durante a fermentação do cacau município de Medicilândia PA. Tempo de fermentação (horas) ph 5,33± 0,12 4,91±0,11 4,53±0,02 4,63±0,04 4,72±0,02 4,83±0,93 5,27±0,30 Temperatura o C 24, * Resultados expressos em média±desvio padrão. A tabela 1 mostra os resultados de ph da localidade Tucumã. Os resultados mostram que houve uma queda no valor do ph nas primeiras 48 h de fermentação, que coincide com o aumento de temperatura e acúmulo de ácido acético na polpa, assim mostrando que este irá se difundir na polpa. Estes resultados estão de acordo como encontrado por Thompson et al. (2001). Os valores oscilaram entre 5,2 e 6,48, e de acordo com os encontrados por Ardhana e Fleet (2003), já que o ph da polpa normalmente aumenta quando começa a fermentação. O mesmo se pode concluir da localidade de Medicilândia, que oscilou os valores de ph entre 5,33 e 5,27; porém demonstrando que a acidez desta localidade é ligeiramente maior que da localidade de Tucumã, o que pode ser devido a uma maior produção de compostos ácidos pelas espécies microbianas que atuam na microflora desta localidade. Assim, o decréscimo constante do ph encontrado, caracterizou uma acidez elevada no início e termino da fermentação, sendo a acidez inicial de 37,67 e 25,63 (ml Na OH/ 100g), com valor médio final de 19,75 e 21,10 (ml Na OH/ 100g) para o cocho 1 e 2 de Medicilândia, respectivamente. No município de Tucumã os valores das médias encontradas para o cocho

14 14 1 e 2 foram no início de fermentação 12,24 e 17,63 (ml Na OH/ 100g), com valores médio final de 3,47 e 8,57. Os altos valores de acidez durante o processo fermentativo são atribuídos, aos ácidos acético e láctico, resultantes da oxidação do etanol. Foi observado uma elevada acidez durante a fermentação realizada nas três localidades estudadas, com exceção do cocho 2 Tucumã. Lefeber et al. (2011), encontrou um constante aumento na acidez durante a fermentação, realizada na Bélgica. Com relação aos valores de umidade, os resultados estão expressos na tabela abaixo: Tabela 3 - Média da umidade durante a fermentação do cacau município de Medicilândia e Tucumã PA. Parâmetro Valores (%) ± DP* Tempo 0 horas Valores (%) ± DP* Tempo 168 horas Umidade Tucumã 37,48±0,89 37,11±1,77 Umidade - Medicilândia 38,60±1,53 36,80±0,23 O teor de umidade ficou entre 36.8 % e %, para as duas localidades estudadas que de acordo com o método da AOAC, está dentro dos parâmetros, considerando valores de 30 % a 40 %, para o cacau fermentado e seco em estufa. Foi notado, que a medida que se aumentava os tempos de fermentação, o teor de umidade diminuía, já que os açúcares da polpa eram consumidos, sofrendo hidrólise, para produzir outros compostos bioquímicos. 6 CONCLUSÃO Apesar da fermentação ser um processo bastante heterogêneo, as leveduras exercem um papel crucial, e o gênero Saccharomyces é um dos mais predominantes, portanto, exercendo grande importância na obtenção do aroma característico do chocolate produzido. Através dos testes bioquímicos foi possível revelar que, a partir do total inicial de 76 cepas, 42 cepas deram resultado positivo para este gênero e 34 cepas deram resultados negativos. Isso mostra que há uma leve predominância deste gênero de levedura atuando na microflora da região amazônica. Os valores físico-químicos das amêndoas de cacau também revelaram que o cacau encontrado nestas localidades apresentava um maior teor de acidez, em comparação com que outros encontrados em diferentes estudos; já o teor de umidade apresentou um valor razoável dentro dos parâmetros seguidos pela metodologia. Portanto, devido à importância deste gênero de levedura, em um processo crucial para a formação de um cacau de qualidade, pode-se melhor compreender sua participação

15 15 nesta etapa, bem como sua atividade bioquímica; assim como também foi possível avaliar como este gênero atua na microflora amazônica, para através disso aprimorar a qualidade do chocolate produzido. REFERÊNCIAS AFOAKWA, E.O. ;PATERSON, A. ; FOWLER, M. ; RYAN, A., Flavour formation and character in cocoa and chocolate: a critical review. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 48, ARDHANA, M.M.; FLEET, G.H., 2003.The microbial ecology of cocoa bean fermentations in Indonesia. Int. J. Food Microbiol. 86, ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists, 16th ed. Arlington: A.O.A.C., BATISTA, N.N.; RAMOS, C.L.; RIBEIRO, D.D.; PINHEIRO, A.C.M.; SCHWAN, R.F., Dynamic behaviour of Saccharomyces cerevisae, Pichia kluyveri and Hanseniaspora uvarum during fermentation spontaneous and inoculated cocoa fermentations and their effect on sensory characteristics of chocolate. LWT Food Science and Technology 63, BIEHL, B., BRUNNER, E., PASSERN, D., QUESNEL, V.C., ADOMAKO, D., Acidification, proteolysis and flavor potential in fermenting cocoa beans. J. Sci. Food Agric. 36, CAMU, N. ; DE WINTER, T. ; VERBRUGGHE, K. ; CLEENWERK, I. ; VANDAMME, P. ; TAKRAMA, J.S. ; VANCANNEYT, M. ; DE VUYST, L., Dynamics and biodiversity of populations of lactic acid bacteria and acetic acid bacteria involved in spontaneous heap fermentation of cocoa beans in Ghana. Applied and Environmental Microbiology 73, DANIEL, H.M. ; VRANCKEN, G. ; TAKRAMA, J.F. ; CAMU, N. ; DE VOS, P. ; DE VUYST, L., Yeast diversity of Ghanaian cocoa bean heap fermentations. FEMS Yeast Research 9,

16 16 DA VEIGA MOREIRA, I.M. ; DA CRUZ PEDROZO MIGUEL, M.G. ; DUARTE, W.F. ; DIAS, D.R. ; SCHWAN, R.F., Microbial sucession and the dynamics of metabolytes and sugars during the fermentation of three different cocoa (Theobroma cacao L) hybrids. Food Research International 54, DE CAMARGO, R. ; LEME, J. ; MARTINELLI, A., 1963.General observations on the microflora of fermenting cocoa beans (Theobroma cacao) in Bahia (Brazil). Food Technol. 17, DE VUYST, L.; CAMU, N. ; DE WINTER, T. ; VANDEMEULEBROECKE, K. ; VAN DE PERRE, V. ; VANCANNEYT, M. ; DE VOS, P. ; CLEENWERCK, I., Validation of the (GTG), rep PCR fingerprinting technique for rapid classification and identification of acetic acid bacteria, with a focus on isolates from Ghanaian fermented cocoa beans. Int. J. Food Microbiol. 125, HANSEN, C.E. ; DEL OLMO, M. ; BURRI, C., Enzyme activities using cocoa beans during fermentation. J. Sci. Food Agric. 77, HO, V.; ZHAO, J.; FLEET, G., Yeasts are essential for cocoa bean fermentation.int. J. Food Microbiol. 174, JESPERSEN, L.; NIELSEN, D.S.; HONHOLT, S.; JAKOBSEN, M., Occurrence and diversity of Yeast involved in fermentation of West African cocoa beans. FEMS Yeast Research 5, KRATZER, U., FRANK, R., KALBACHER, H., BIEHL, B., WOSTEMEYER, J., VOIGT, J., Subunit strucuture of the vicilin-like globular storage protein of cocoa seeds and the origin of cocoa and chocolate specific aroma precursors. Food Chemistry 113, LIMA, L.J.R.; ALMEIDA, M.H.; NOUT, M.J.R.; ZWIETERING, M.H., Theobroma cacao L., The Food of the Gods : quality determinants of commercial cocoa beans with particular reference to the impact of fermentation. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 51, NIELSEN, D.S.; HONHOLT, S.; TANO-DEBRAH, K.; JESPERSEN, L., Yeast population associated with Ghanaian cocoa fermentations analysed using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). Yeast 22,

17 17 NIELSEN, D.S.; TENIOLA, O.D.; BAN-KOFFI, L.; OWUSU, M. ANDERSSON, T. ; HOLZAPFEL, W.H., The microbiology of Ghanaian cocoa fermentations analysed using culture dependent and culture independent methods. International Journal of Food Microbiology 114, PAPALEXANDRATOU, Z.; CAMU, N.; FALONY, G.; DE VUYST, L., Comparison of the bacterial species diversity of spontaneous cocoa bean fermentation carried out at selected farms in Ivory Coast and Brazil. Food Microbiology 28, PAPALEXANDRATOU, Z.; LEFEBER, T.; BAHRIM, B.; LEE, O.S.; DANIEL, H.M.; DE VUYST, L., Hanseniaspora opuntiae, Saccharomyces cerevisae, Lactobacillus fermentum and Acetobacter pasteurianus predominate during well-performed Malaysian cocoa bean box fermentations, underlining the importance of these microbial species for a successful cocoa bean fermentation process. Food Microbiology 35, QUESNEL, V.C., Agents induncing the death of cocoa seeds during fermentation. J. Sci. Food Agric. 16, SALTINI, R., AKKERMAN, R., FROSCH, S., Optimizing chocolate production through traceability: a review of the influence of farming practices on cocoa bean quality. Food Control 29, SANCHEZ, J.; DAGUENET, G.; GUIRAUD, J.P.; VINCENT, J.C.; GALZY, P., A study of the yeast flora and the effect of pure culture seeding during the fermentation process of cocoa beans. Lebensm.-Wiss.. Technol. 18, SCHWAN, R.F.; ROSE, A.H. BOARD, R.G., Microbial fermentation of cocoa beans, with emphasis on enzymatic degradation of the pulp. J. Appl. Bact. 79, SCHWAN, R.F.; WHEALS, A.E., The microbiology of cocoa bean fermentation and its role in chocolate quality. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 44, THOMPSON, S.S. ; MILLER, K. ; LOPEZ, A.S., Cocoa and coffee. In: Doyle, M.J., Beuchat, L.R., Montville, T.J. (Eds.), Food Microbiology fundamentals and Frontiers. ASM Press, Washington, D.C., pp

18 18 VOIGT, J., HEINRICHS, H., VOIGT, C., BIEHL, B., Cocoa-specific aroma precursors are generated by proteolytic digestion of the vicilin-like globulin of cocoa seeds. Food Chemistry 50, ZIEGLEDER, C., Flavour development in cocoa and chocolate. In: Beckett, S.T. (Ed.), Industrial Chocolate Manufacture and Use. Blackwell Publishing Ltd., pp DIFICULDADES As atividades do projeto foram realizadas de forma plena, não havendo dificuldades a relatar. PARECER DO ORIENTADOR O bolsista MARIANO HENRIQUE COIMBRA RODRIGUES teve desempenho excelente no decorrer do projeto. DATA:10/08/2015 Alessandra Santos Lopes ORIENTADORA Mariano Henrique Coimbra Rodrigues BOLSISTA