MANUAL DE APOIO AO PREENCHIMENTO DO FORMULÁRIO UNIFICADO PARA SOLICITAÇÃO DE AUTORIZAÇÃO PARA USO DE ANIMAIS EM ENSINO E PESQUISA
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- Walter Castelhano Barbosa
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1 MANUAL DE APOIO AO PREENCHIMENTO DO FORMULÁRIO UNIFICADO PARA SOLICITAÇÃO DE AUTORIZAÇÃO PARA USO DE ANIMAIS EM ENSINO E PESQUISA CEUA / SLMANDIC 2013
2 PREFÁCIO Existem normas nacionais e internacionais que regem a experimentação animal. Entre elas está à submissão dos projetos de pesquisa que utilizarão animais à Comissão de Ética em Uso Animal da instituição a que pertencem. Cabe à Comissão analisar, emitir parecer e expedir certificado sobre os protocolos de experimentação realizados na instituição de acordo com critérios preestabelecidos de princípios éticos na experimentação animal e compatíveis com a legislação vigente. Essa comissão tem o poder de aprovar ou não os protocolos experimentais analisados segundo o cumprimento das normas éticas. O objetivo deste Manual é orientar professores e pesquisadores da Faculdade São Leopoldo Mandic quanto à forma de preencher o Formulário Unificado para Solicitação de Autorização para Uso de Animais em Ensino e Pesquisa. Este Manual será constantemente construído a partir das idéias e necessidades dos usuários de animais, em função do dinamismo com que evoluem a ciência e a bioética. Caso conserve outras dúvidas, o usuário deverá entrar em contato com a CEUA, através do ceua@slmandic.edu.br. Cabe ressaltar que o protocolo apresentado à CEUA/SLMandic constitui um documento que, embora sigiloso, poderá ser solicitado pelo Ministério Público a qualquer momento, em função de denúncias de maus tratos aos animais. Dessa forma, há de se entender que o preenchimento completo e detalhado do mesmo representa um instrumento de defesa da Instituição e do próprio pesquisador, este último, responsável integral pelo que consta no protocolo e pela sua fiel execução.
3 PRINCÍPIO DOS 3R s Na obra The principles of humane experimental tecnique (William, Russel e Rex Burch, 1959) surgiu o PRINCÍPIO DOS 3 R s da experimentação animal, no qual estabeleceu-se o princípio dos 3 Rs, o que trouxe avanços para a pesquisa com animais e estabeleceu um grande marco para a Ciência em Animais de Laboratório. Os autores conseguiram sintetizar o princípio humanitário de experimentação animal em três palavras importantes: Reduce, Replacement, Refinement, o qual deve ser seguido no momento da elaboração dos projetos de pesquisas com animais. Reduce consiste na redução do número de animais para o objeto de investigação. Isso pode ser conseguido com, por exemplo, com cálculos amostrais bem definidos, e com o desenvolvimento de técnicas genéticas ou de aparelhagem que permitam a geração de animais com menor variabilidade de respostas, reduzindo a necessidade de mais animais para se conseguir resultados confiáveis. Replacement consiste na substituição do uso de animais por modelos alternativos sempre que possível, ou por animais com sistema nervoso menos desenvolvido. Alguns modelos alternativos de investigação são, por exemplo, cultura de células e modelos computacionais. Refinement propõem que as técnicas e os procedimentos realizados nos animais sejam menos invasivos e o mais refinados possível, sendo capazes de reduzir a dor, a angústia e o sofrimento animal. Como exemplo, podemos falar do aperfeiçoamento da aparelhagem dos biotérios (de criação, manutenção etc), desenhos experimentais, e técnicas que possam proporcionar o menor nível de aversão (dor, estresse e afins) possível.
4 Portanto, quanto mais conhecimento sobre comportamentos específicos e fisiologia da espécie, bem como treinamentos sobre procedimentos práticos, mais experimentos serão conduzidos com o intuito de diminuir a dor, a angústia e o estresse dos animais. Conseqüentemente, teremos resultados mais confiáveis. DÚVIDAS MAIS FREQUENTES: A - No item 1 (Tempo de Experimento) deve constar uma data hipotética, já que a data correta será estipulada conforme a disponibilidade do Biotério. Porém, deve ser levado em consideração o tempo total da experimentação descrita no projeto. B - No item 3 (Pesquisador Responsável), deve ser preenchidos TODOS os itens. A experiência prévia não é exigida, mas é extremamente desejável. Por enquanto, o Treinamento é desejável, mas, será imprescindível a partir de 01 de agosto de Deverá ser realizado previamente ao experimento, sob pena da não autorização de entrada no Biotério. Obs: O treinamento é ministrado pelo Biotério e abrange conhecimentos básicos de cuidados e manejo de animais de laboratório. C - No item 4 (Colaboradores) devem ser fornecidos todos os detalhes que permitam a verificação da capacitação pessoal para a manipulação dos animais; D - No item 5 (Resumo do Projeto) deve relatar o projeto de forma resumida, mas completa, indicando objetivo, material e método e hipóteses do trabalho. E - O item 6 (Objetivos) o pesquisador deve descrever qual o propósito do projeto e o que deseja atingir com sua realização. Informar em itens. F - O item 7 e 8 (Justificativa e Relevância) devem estar bem claros. A justificativa deve relatar a importância do projeto e a necessidade de seu
5 desenvolvimento. A relevância deve relatar como ele interferirá na área científica e na sociedade. Cabe ressaltar que a relevância científica do projeto está diretamente ligada aos aspectos éticos (uso desnecessário de animais). Por exemplo, a repetição de experimento que seja consagrado na literatura sem justificativa plausível, fere a ética, uma vez que não acrescenta nenhuma contribuição ao conhecimento científico. G- No item 9 (Modelo Animal) relatar a espécie (Ex: Rattus Norvegicus) que será utilizada no experimento e sua linhagem (Ex.: Wistar). A justificativa do uso dos procedimentos e da espécie animal é imprescindível a aprovação do projeto. A espécie dos animais utilizados deve ser apropriada para o fim científico ou didático. A escolha deve ser realizada considerando suas características biológicas, comportamentais, constituição genética, estado nutricional, estado sanitário, etc Citar o nome do biotério de origem dos animais. Responder em sim ou não para a pergunta se o modelo animal de escolha é um animal silvestre e se é geneticamente modificado. Descrever os métodos de captura, em caso de animais silvestres. Caso contrário, somente utilizar a frase: não se aplica Apenas preencher as lacunas referentes à espécie do modelo animal utilizada no experimento (ex: rato heterogênico, Wistar, 15, g, 20). Obs.: Rato Isogênico: São animais obtidos a partir de cruzamentos entre irmãos, assegurando um alto grau de consangüinidade (98,6%) e mesmo material genético. Rato Heterogênico: São animais de constituição genética variada, por serem obtidos através de cruzamentos aleatórios, evitando acasalamento entre parentes próximos. Com isso, possuem um baixíssimo grau de consangüinidade (1%). Rato Transgênico e Rato Knockout: São animais geneticamente projetados que possuem mutações induzidas através da manipulação in vitro de DNA podendo se construir DNA transgênico ou mutações pontuais (knockouts).
6 9.3- Recomenda-se a leitura dos artigos: 1- Damy SB, Camargo RS, Chammas S, Figueiredo LF. Aspectos fundamentais da experimentação animal aplicações da cirurgia experimental. Rev Assoc Med Bras. 2010;56(1): John Eng J.Sample size estimation: how many individuals should be studied. Radiology May;227(2): OBS: Os artigos encontram-se disponíveis no site: GRAU DE INVASIVIDADE (GI) - definições segundo o CONCEA GI1 = Experimentos que causam pouco ou nenhum desconforto ou estresse (ex.: observação e exame físico; administração oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, ou intramuscular de substâncias que não causem reações adversas perceptíveis; eutanásia por métodos aprovados após anestesia ou sedação; deprivação alimentar ou hídrica por períodos equivalentes à deprivação na natureza). GI2 = Experimentos que causam estresse, desconforto ou dor, de leve intensidade (ex.: procedimentos cirúrgicos menores, como biópsias, sob anestesia; períodos breves de contenção e imobilidade em animais conscientes; exposição a níveis não letais de compostos químicos que não causem reações adversas graves). GI3 = Experimentos que causam estresse, desconforto ou dor, de intensidade intermediária (ex.: procedimentos cirúrgicos invasivos conduzidos em animais anestesiados; imobilidade física por várias horas; indução de estresse por separação materna ou exposição a agressor; exposição a estímulos aversivos inescapáveis; exposição a choques localizados de intensidade leve; exposição a níveis de radiação e compostos químicos que provoquem prejuízo duradouro da função sensorial e motora; administração de agentes químicos por vias como a intracardíaca e intracerebral). GI4 = Experimentos que causam dor de alta intensidade (ex.: Indução de trauma a animais não sedados). Os materiais biológicos que serão utilizados para outros experimentos devem ser descritos, assim como o protocolo do projeto que os receberá. Caso não for coletado material para ser usado em outro projeto, apenas responda negativamente.
7 9.5- Condições padronizadas de alojamento e alimentação dos animais realizadas no Biotério SLMandic: Alimentação: É oferecido a ração industrial para rato marca Nuvilab CR-1, de forma ad libitum e sem restrição alimentar na fase pré cirúrgica. Fonte de água: É fornecida água filtrada em bebedouros ad libitum, sem restrição pré cirúrgico. Lotação: Ficam hospedados de 2 a 3 animais em cada gaiola para que se evite níveis de estresse significativos. Exaustão do ar: Os animais são mantidos em gaiolas dentro de uma Estante Ventilada, submetidos a trocas de ar por hora, assegurando assim, a diminuição substancial de alérgenos (amônia) no ambiente. Temperatura: A sala de animais possui ar condicionado com temperatura regulada a 21 C ± 2 graus e assegurada pela estante ventilada. Ciclo circadiano: Os animais são mantidos em ciclo circadiano de claro/escuro, com 12 horas de luz em baixa intensidade e 12 horas de escuro, respeitando a necessidade fisiológica e comportamental dos ratos. Ambiente de alojamento: Gaiola Número de animais por gaiola: 2-3 animais Tipo de cama: Maravalha H- O item 10 (Procedimentos experimentais do projeto) trata do esclarecimento de quais fármacos serão administrados nos animais e os cuidados adicionais durante a cirurgia e no pós-operatório preencher a lacuna referente à intenção do projeto: o objetivo do projeto será avaliar a dor ou estresse? O uso de fármacos anestésicos em procedimentos cirúrgicos ou que envolvam dor e extremo estresse no animal é fundamental por questões de melhor manejo e, acima de tudo, humanitária. No campo Fármaco, deve-se informar o nome do princípio ativo com sua respectiva Denominação Comum Brasileira (DCB). Informe dose e via de administração. Não serão necessários anestésicos quando não ocorrer os procedimentos citados acima, como em procedimentos que incluem administração de fluidos, imunização, medicação oral, coleta de sangue (exceto intracardíaca e plexo orbital). Mas, será necessário justificar.
8 10.3- O uso de relaxante muscular é dependente do protocolo anestésico de escolha, podendo ser necessário em alguns casos de associação O uso de analgésico concomitante a anestesia é dependente do protocolo anestésico de escolha podendo ser desnecessário em alguns casos, porém, deve sempre ser justificado a não utilização. Protocolos anestésicos envolvendo barbitúricos (Tiopental, propofol e etomidato) são utilizados para induzir e manter a anestesia geral, porém, não possuem ação analgésica logo devem ser utilizados associados com um analgésico. Diferente disso, o protocolo que utiliza a cetamina, induz estado de sedação e analgesia no rato sem causar dor em sua administração Todos os animais devem ser corretamente imobilizados para que sua manipulação seja conduzida sem risco para o pesquisador ou animal. Considerando que qualquer fator externo pode alterar a homeostase, e ainda ser apontado como um fator estressante é fundamental que se aguarde tempo suficiente para que o animal se adapte a manipulação e torne-se familiarizado com o pesquisador. A manipulação incorreta ou brusca pode implicar em estresse e, conseqüentemente, desequilíbrio de funções orgânicas, o que determina a ocorrência de alterações fisiológicas. O método utilizado para a contenção dos animais de laboratório é dependente do comportamento, conformação física e tamanho de cada espécie. A maioria dos roedores possui cauda e esta pode ser utilizada para suspender o animal, desde que se trate de uma manobra rápida e cuidadosa, e que ele seja prontamente colocado em uma superfície de apoio, como por exemplo, a tampa da gaiola. Ratos maiores devem ser contidos firmemente, porém de forma gentil, colocando-se a mão sobre o dorso e a caixa torácica. A cabeça pode ser segura com o polegar e o indicador, imediatamente atrás da mandíbula Roedores não vomitam, sendo desnecessária a restrição alimentar e hídrica. Quando for o caso, o jejum alimentar e hídrico não deve ultrapassar 6 horas (exceto sob justificativa) Relatar qual o tipo de cirurgia que o animal será submetido durante o experimento, especificando o membro, quadrante e diâmetro, quando for o caso O pós-operatório exige, no mínimo, 24 horas de observação clínica dos animais em atenção aos sintomas de dor e estresse. O uso de analgesia
9 é fundamental no pós-operatório. No campo Fármaco, deve-se informar o nome do princípio ativo com sua respectiva Denominação Comum Brasileira (DCB). Informe dose e via de administração. Meloxicam, ibuprofeno, fenilbutazona e cetoprofeno são antiinflamatórios não esteróides que possuem como principal efeito a ação analgésica. A analgesia é importante no controle da dor pós-operatória e para evitar o fenômeno conhecido como hipersensibilização periférica, que é devido à lesão tecidual e à liberação de várias substâncias inclusive as prostaglandinas. O não uso de analgésicos no pós-operatório deve ser muito bem justificado. Outros cuidados pósoperatórios devem ser relatados: o pesquisador deve preocupar-se com a possibilidade de qualquer efeito adverso, como por exemplo, inflamação tecidual. A assepsia com solução de iodopovidona diariamente deve ser considerado Todo e qualquer material que seja inoculado (Injeção de vírus ou outros germes, mortos ou atenuados, biomaterial), administrado ou exposto ao animal devem ser relatado, especificando a dose e via de administração, assim como a freqüência. I - No item 11(Extração de material biológico) deve ser especificado o material biológico que será retirado do animal mesmo após a eutanásia (fragmento de calvária, tíbia, etc.). Relatar a quantidade da amostra, a frequência ou o momento da extração e o método de coleta (como será feita a retirada desse material). J - O item 12 (Finalização) é referente ao método de eutanásia e ao descarte das carcaças. A eutanásia é um procedimento que envolve considerações técnicas e éticas. O método deve garantir a inconsciência antes de qualquer sofrimento físico e mental. Portanto, é importante no item 12.1, citar a forma de como o animal será eutanasiado, qual a substância que será utilizada e em qual dosagem. De forma geral, o melhor método é o uso de sobredosagem de anestésicos gerais, principalmente os barbitúricos, iniciando-se a partir de três vezes a dose necessária para a anestesia da espécie alvo, com o aumento da dose caso necessário até a observação do óbito. O Concea e o CFMV possuem resoluções que dispõe sobre procedimentos e métodos de eutanásia onde definem os métodos
10 aceitáveis e os métodos restritos (Diretrizes da Prática de Eutanásia e Resolução n 1000, de 11 de maio de 2012, respectivamente). Todo pesquisador deve estar ciente das Leis que está submetido O destino dos animais após o experimento será impreterivelmente a eutanásia. É preciso lembrar que é vedada a reutilização de animais convencionais no protocolo original ou em novo protocolo; casos particulares devem ser apresentados à CEUA para verificação das condições éticas da solicitação que serão verificadas individualmente. A única possibilidade de doação será quando o animal não passou por nenhuma manipulação A forma de descarte da carcaça será segundo orientações do Concea: depois de diagnosticada a morte do animal pelo Responsável Técnico do Biotério, as carcaças serão acondicionados em sacos plásticos bancos identificados com símbolo de risco biológico e levados ao freezer onde permanecem congeladas até serem autoclavadas. A coleta das carcaças será feita pela Empresa responsável pela coleta de resíduos infectantes e levada ao incinerador. L - No item 13 (Resumo de Procedimentos) deve estar especificado de forma clara todas as etapas do experimento e da manipulação animal. Solicita-se ainda indicar em qual momento do experimento e como os animais serão manipulados, quantos e quais grupos recebem tratamentos, etc. O plano pode ser apresentado como texto, tabela, organograma etc., desde que permita uma visualização do protocolo como um todo e do real número de animais usados. A intenção é que o avaliador do projeto consiga acompanhar de forma claro todo movimento com o animal. M- Nenhuma das partes do protocolo deve ser deixada em branco. Quando não couber resposta mencionar: Não se aplica. N- Os animais para uso em experimentação são classificados em: a - Animais convencionais- camundongos, ratos, coelhos, cobaias e hamsters b - Animais não convencionais - qualquer animal que não pertença ao item (a)
11 como cães, gatos, aves, peixes, primatas não humanos, animais silvestres de qualquer espécie etc. c - Os animais não convencionais seguem regras específicas restritivas quanto ao procedimento e quantidades permitidas para a experimentação; d - Animais não convencionais silvestres requerem a licença do IBAMA, além da licença da CEUA para que sejam utilizados em experimentação; uma licença não exclui a outra; O- A CEUA/SLMandic estimula os pesquisadores a manter um programa de enriquecimento ambiental. P- É preciso lembrar que as normas para o uso de animais em experimentação são dinâmicas e, sempre que houver atualizações, estas estarão disponíveis na página da CEUA até que uma nova revisão do Manual seja publicada. Portanto, quando for necessário, devem-se verificar as possíveis atualizações on line deste manual.
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