Biofísica. Transporte Ativo. Prof. Dr. Walter F. de Azevedo Jr Dr. Walter F. de Azevedo Jr.

Transcrição

1 2018 Dr. Walter F. de Azevedo Jr. Biofísica Transporte Ativo Prof. Dr. Walter F. de Azevedo Jr. 1

2 Método Científico O método científico é um conjunto de procedimentos que possibilita a análise de fenômenos naturais com um olhar crítico e sistemático. A aplicação do método científico visa extrair modelos de observações experimentais que permitam o entendimento dos fenômenos da natureza. O método científico envolve a observação de fenômenos, levantamento de hipóteses sobre o fenômeno, experimentação para verificar a validade ou não das hipóteses levantadas e uma conclusão que valida ou não as hipóteses. Resumindo, o método científico é um guia para descobertas científicas, é a luz que nos separa da superstição e das trevas da ignorância. O fluxograma ao lado ilustra os principais passos para a aplicação do método científico. Não Identificação de um problema Coleta de dados Elaboração de hipótese(s) Teste de hipótese(s) (experimento) Novos dados confirmam as hipótese(s)? Sim 2

3 Estrutura Básica do Neurônio No nosso estudo de fenômenos elétricos da célula, focaremos na membrana celular, boa parte desses fenômenos serão discutidos para entendermos o funcionamento elétrico dos neurônios. Os neurônios são células nucleadas, que apresentam um corpo central, chamado soma. Essas células apresentam grandes variações de forma, assim para os propósitos dos nossos estudos, vamos considerar que o neurônio apresenta a estrutura básica, mostrada no diagrama esquemático ao lado. No diagrama temos, além do corpo celular, dendritos e um terminal único, chamado axônio. O axônio é responsável pela transmissão do impulso nervoso. Podendo ser bem extenso, comparado com o resto do neurônio. Núcleo Corpo celular Axônio Terminais axonais Diagrama esquemático de um neurônio. 3

4 Bomba de Sódio e Potássio Vimos que a célula apresenta proteína intrínsecas, responsáveis pelo transporte passivo de íons pela membrana. Especificamente, vimos, em detalhes, o funcionamento do canal de potássio. Além dos canais iônicos, relacionados ao transporte passivo de íons, ou seja, sem gasto de energia e descritos pelos fenômenos de difusão e osmose, temos, também, o transporte ativo de íons na membrana. Nesse tipo de transporte, a proteína envolvida é a bomba iônica. Na aula de hoje veremos a bomba de sódio e potássio, representada no diagrama abaixo. K + Bomba de Sódio e Potássio Meio extracelular Na + Meio intracelular ATP 4

5 Bomba de Sódio e Potássio A bomba de sódio e potássio é uma proteína intrínseca com atividade enzimática. Ela catalisa a clivagem da molécula adenosina trifosfato (ATP), atividade de ATPase. ATP (mostrado nas figuras abaixo) é um nucleotídeo contendo 3 grupos fosfatos. ATP é uma reserva de energia química para o metabolismo celular. a) ATP (Estrutura 2D) b) ATP (estrutura 3D) 5

6 Bomba de Sódio e Potássio A ação da bomba de Na + /K + segue as seguintes etapas: 1) A bomba de Na + /K + liga-se a 3 íons de Na + intracelulares. 2) ATP é hidrolisado, causando a fosforilação de um resíduo de aspartato, da bomba de Na + /K + com a liberação de uma molécula de adenosina difosfato (ADP). 3) A mudança estrutural da bomba de Na + /K + leva a uma exposição os íons de Na + que, por apresentarem baixa afinidade pela bomba de Na + /K +, são liberados para o meio extracelular. 4) A bomba de Na + /K + liga-se a 2 íons de K + extracelulares, o que causa a desfosforilação da bomba, trazendo-a de volta à sua conformação anterior, transportando K + para dentro da célula. 5) A forma desfosforilada da bomba de Na + /K + apresenta afinidade mais alta por íons de Na +, os íons de K + são liberados, a molécula de ATP liga-se à bomba. 6) O sistema está pronto para um novo ciclo. 6

7 Bomba de Sódio e Potássio Na + Meio extracelular Meio extracelular Meio extracelular 1 2 Na + Meio intracelular Meio intracelular Meio intracelular ATP ADP P I P I 6 3 Meio extracelular ATP Meio extracelular P I K + Meio extracelular 5 4 Meio intracelular Meio intracelular Meio intracelular ATP P I 7

8 Potencial de Repouso da Célula Na ausência de estímulos, o meio intracelular de um neurônio apresenta um potencial elétrico negativo com relação ao meio extracelular, chamado potencial de repouso. Proteínas intrínsecas, chamadas canais de K +, apresentam-se abertos, permitindo a saída de íons de K +. Assim, a saída de íons K+ deixa um excesso de carga negativa no interior da célula e, como resultado, um potencial negativo. A ação conjunta da bomba de Na + /K + e do canal de K + leva a um acúmulo de carga positiva no meio extracelular. Essa situação tem como consequência uma diferença de potencial negativa do meio intracelular com relação ao meio extracelular. Se colocarmos um eletrodo no interior de um neurônio em repouso, teremos um potencial elétrico de algumas dezenas de milivolts negativos. K + Meio extracelular Na + Meio intracelular P I Bomba de Na + /K + canal de K + 8

9 Potencial de Repouso da Célula Aproximadamente um terço de todo ATP da célula é usado para o funcionamento da bomba de Na + /K +, o que indica a importância para o metabolismo celular da bomba de Na + /K +. Em 2007 foi elucidada a estrutura tridimensional da bombam de Na + /K +, mostrada na figura ao lado (Morth et al., 2007). A análise da estrutura indicou uma divisão clara de regiões hidrofóbicas e hidrofílicas, que sugerem a inserção na bomba de Na + /K + na membrana, conforme o modelo mostrado no próximo slide. Referência: Morth JP, Pedersen BP, Toustrup-Jensen MS, Sørensen TL, Petersen J, Andersen JP, Vilsen B, Nissen P. Nature. 2007;450(7172):

10 Potencial de Repouso da Célula A bomba de Na + /K + apresenta um domínio rico em hélices, que estão em contato com a parte hidrofóbica na bicamada, como indicado abaixo. Meio extracelular Citoplasma Referência: Morth JP, Pedersen BP, Toustrup-Jensen MS, Sørensen TL, Petersen J, Andersen JP, Vilsen B, Nissen P. Nature. 2007;450(7172):

11 Potencial de Membrana Como vimos anteriormente, o potencial de repouso é resultado da ação conjunta da bomba de Na + /K + e do canal de K +. A bomba de Na + /K + envia 3 íons de Na + para o meio extracelular e 2 íons de K + para o meio intracelular, com gasto de uma molécula de ATP (adenosina trifosfato). Aproximadamente um terço do ATP gasto pela célula é usado pela bomba Na + /K + para manter este fluxo iônico. O canal de K + permite que o excesso de K + seja expelido da célula, sem gasto de ATP. A ação conjunta das duas proteínas intrínsecas leva a uma perda de carga positiva pela célula, causando o aparecimento de um potencial negativo no meio intracelular, este potencial é chamado de potencial de repouso, pois não precisamos de estímulo externo para gerá-lo. Na + K + Meio extracelular Bomba de Na + /K + Canal de K + Citoplasma K + 11

12 Modelo de Hodgkin-Huxley O modelo de Hodgkin-Huxley foi proposto em 1952 (Hodgkin & Huxley, 1952) para explicar o potencial de ação do axônio de sépia. Os dados sobre a corrente iônica foram obtidos a partir do uso da técnica de voltage clamp. Nessa técnica, o potencial elétrico da célula é mantido constante, independente das concentrações iônicas. Na situação abaixo as correntes iônicas são medidas. O diagrama esquemático abaixo ilustra a técnica. Um sistema de retroalimentação permite que o potencial seja mantido num valor de referência, onde toda vez que o potencial de membrana desvia-se um pouco do valor ajustado, uma tensão adicional leva o potencial de membrana de volta ao valor ajustado. Amplificador do potencial de membrana Fonte de tensão Eletrodo intracelular Eletrodo extracelular Amplificador de retroalimentação Axônio Amperímetro 12

13 E Potencial de membrana Modelo de Hodgkin-Huxley O modelo de Hodgkin-Huxley (Hodgkin & Huxley, 1952) usa o conceito de condutância (g), para elaborar uma equação diferencial que mostra o potencial de membrana em função do tempo E(t). Não é objetivo do presente curso detalhar a dedução desse modelo, iremos somente ilustrar a equação, destacando as principais características. O neurônio em repouso tem um comportamento elétrico similar a um circuito resistivocapacitivo (circuito RC) simples, ilustrado abaixo. I +Q Q R -Q 0 Tempo(ms) Circuito RC Potencial limiar Potencial de repouso 13

14 Modelo de Hodgkin-Huxley Na figura ao lado, temos o circuito elétrico equivalente da membrana celular durante o potencial de ação, chamado de modelo de Hodgkin-Huxley (Hodgkin & Huxley, 1952). No circuito temos 3 tipos de correntes iônicas, a corrente do Sódio (I Na ), a corrente do Potássio (I K ) e uma terceira corrente chamada em inglês de leak current (I L ), que é composta principalmente de íons de cloro. A principal contribuição do modelo Hodgkin- Huxley, foi a introdução das condutâncias na análise do comportamento elétrico do axônio. A condutância (g) é o inverso da resistência elétrica (R), conforme a equação abaixo: g A unidade de condutância é o Siemens (1 S = 1/Ohm). 1 R C m I C I Meio extracelular I Íon I Na I K I L g Na g K g L E Na E K E L Meio intracelular Circuito elétrico equivalente a membrana celular, segundo o modelo de Hodgkin-Huxley (Hodgkin & Huxley, 1952). 14

15 Modelo de Hodgkin-Huxley Ao incluirmos as condutâncias (g), temos a possibilidade de modelar o potencial de ação, considerando o circuito equivalente ao lado. Temos as condutâncias para Sódio (g Na ), Potássio (g K ) e uma terceira para o termo leak (g L ), ou seja, vazamento de íons. A corrente total (I) é a soma da corrente iônica (I íon ) e a corrente capacitiva (I C ), como segue: C m I C I Meio extracelular I Íon I Na I K I L g Na g K g L I = I C + I íon. E Na E K E L A corrente iônica total (I ion ) é dada pela soma de todas as correntes devido a cada canal (I Na e I K ) e a terceira corrente (I L ) é constante e minoritária. Assim temos, Meio intracelular I ion = I Na + I K + I L Circuito elétrico equivalente a membrana celular, segundo o modelo de Hodgkin-Huxley (Hodgkin & Huxley, 1952). 15

16 Modelo de Hodgkin-Huxley Vemos no circuito equivalente a presença de 3 fontes de potencial, nominalmente E na, E K e E L, relativas ao Sódio, Potássio e vazamento (leak). Assim, temos as seguintes equações para as correntes que formam a corrente iônica, I Na = g Na (V - E Na ), C m I C I Meio extracelular I Íon I Na I K I L g Na g K g L e I k = g k (V - E k ) I l = g L (V - E L ) E Na E K E L onde V é o potencial da membrana. Veja no circuito que as condutâncias do Sódio (g Na ) e do Potássio (g K ) são variáveis e a condutância de vazamento é constante. Meio intracelular Circuito elétrico equivalente a membrana celular, segundo o modelo de Hodgkin-Huxley (Hodgkin & Huxley, 1952). 16

17 Modelo de Hodgkin-Huxley Usando o circuito equivalente, vemos que na fase de despolarização temos a condutância do Na + alta, o que permitirá entrada de íons de Na + na célula, elevando a corrente I Na e o potencial de membrana (V). Na fase repolarização, teremos aumento condutância do K +, o que levará K + para o meio extracelular e diminuirá potencial de membrana. I Meio extracelular I C I Íon 2 3 I Na I K I L C m g Na g K g L 1 4 E Na E K E L Gráfico do potencial contra o tempo (linha vermelha), gerado pelo HHSim ( Meio intracelular 17

18 Modelo de Hodgkin-Huxley O modelo de Hodgkin-Huxley (Hodgkin & Huxley, 1952) é um modelo computacional, sendo considerado o primeiro modelo da abordagem de biologia de sistemas. Esse modelo descreve a resposta do axônio de sépia a diferentes estímulos elétricos. Temos a implementação do modelo computacional de Hodgkin-Huxley (modelo HH) em diversos programas. Apresentaremos aqui um que foi implementado na linguagem MatLab, chamado HHSim que está disponível no site Esse simulador do potencial de ação possibilita testarmos diferentes tipos de estímulos elétricos aplicados ao axônio, bem como o efeito de moléculas que interagem com os canais iônicos. Diagrama esquemático de uma seção do axônio de sépia. Axônio pré-sináptico da sépia, colorido em rosa para destaque. Disponível em: USCRC/resources_methods_squid.shtml 18 Acesso em: 10 de setembro de 2018.

19 Modelo de Hodgkin-Huxley O diagrama esquemático abaixo ilustra o arranjo experimental, simulado no HHSim. Temos o cilindro representando uma seção do axônio da sépia, onde foram inseridos 2 eletrodos. Temos o eletrodo 1 responsável pelo estímulo, que será medido em unidades de corrente elétrica, na (nanoampére, 10-9 A). Gerador de corrente elétrica (estímulo) Eletrodo 1 Seção do axônio de sépia. 19

20 Modelo de Hodgkin-Huxley Temos um segundo eletrodo (eletrodo 2), inserido após o eletrodo 1. O posicionamento de eletrodo 2 indica que ele está mais próximo do terminal axonal que o eletrodo 1. Assim, o estímulo gerado no eletrodo 1 pode propagar-se ao longo do axônio e ser registrado no eletrodo 2. O eletrodo 2 está ligado a um voltímetro, que registra o potencial de membrana em mv em função do tempo (eixo horizontal). Gerador de corrente elétrica (estímulo) Voltímetro (eixo vertical em mv) Eletrodo 1 Eletrodo 2 Seção do axônio de sépia. 20

21 Modelo de Hodgkin-Huxley Na situação ilustrada abaixo, temos que o voltímetro mostra a evolução temporal do potencial de membrana, num período de 20 ms, suficiente para vermos todas as fases do potencial de ação (despolarização, repolarização e hiperpolarização). Gerador de corrente elétrica (estímulo) Voltímetro (eixo vertical em mv) Eletrodo 1 Eletrodo 2 Seção do axônio de sépia. 21

22 Modelo de Hodgkin-Huxley Vamos usar o HHSim para destacar as características do potencial de ação. Na figura abaixo temos a situação de potencial de repouso. A linha vermelha indica o potencial da membrana (em repouso), a linha roxa indica o estímulo aplicado, a linha amarela a condutância do Na + e a verde a condutância do K +. Gráfico do potencial contra o tempo (linha vermelha), gerado pelo HHSim ( Acesso em: 10 de setembro de

23 Modelo de Hodgkin-Huxley Aplicamos um estímulo, linha roxa, temos que o potencial de membrana atinge uma valor acima do potencial limiar (linha vermelha). Em tal situação, abrem-se os canais de Na + dependentes de voltagem. Cofirmarmos a situação, verificando a condutância do Na + (linha amarela), que começa a subir, indicado o influxo de Na +. O eixo horizontal é o do tempo. Todo evento está registrado em pouco mais de 20 ms. Gráfico do potencial contra o tempo (linha vermelha), gerado pelo HHSim ( Acesso em: 10 de setembro de

24 Modelo de Hodgkin-Huxley Comparando-se as condutâncias, vemos que a condutância do Na + (g_na)(linha amarela) atinge o valor máximo, antes da a condutância do K + (g_k)(linha verde). O comportamento distinto das condutâncias, deve-se ao fato do canal de Na + dependente de voltagem abrir-se antes do canal de K + dependente de voltagem. Gráfico do potencial contra o tempo (linha vermelha), gerado pelo HHSim ( Acesso em: 10 de setembro de

25 Modelo de Hodgkin-Huxley Depois de poucos milisegundos, ambos canais estão fechados, como vemos com as condutâncias retornando para o valor zero. Depois de mais alguns milisegundos, o potencial de membrana (linha vermelha) retorna ao valor de repouso. Gráfico do potencial contra o tempo (linha vermelha), gerado pelo HHSim ( Acesso em: 10 de setembro de

26 Cérebro Humano O cérebro humano é considerado por muitos como o mais capaz entre os animais do planeta Terra. Considerandose que, um maior número de neurônios significa maior poder cognitivo, espera-se que o cérebro humano seja o campeão entre os animais em número de neurônios. Na verdade, apesar de muitos livros textos estabelecerem o número redondo de 100 bilhões de neurônios no cérebro (10 11 ) ( Williams & Herrup, 1988), tal número ainda é motivo de grande debate. Fonte: Williams RW, Herrup K. The control of neuron number. Annu Rev Neurosci. 1988;11: Imagem de CAT scan do cérebro. Disponível em : < ungs_breathing_organ_animations.htm#.uxky4rxvusp >. Acesso em: 10 de setembro de

27 Cérebro Humano Se considerarmos que o cérebro humano é formado por aproximadamente neurônios, sendo que cada uma dessas células pode formar até conexões, temos que o cérebro humano pode apresentar até sinapses. Tomamos um valor médio de 10 3 sinapses por neurônio. Um estudo sobre o assunto (Azevedo et al., 2009), estimou o número em 86,1 ± 8,1 bilhões de neurônios ( 8, ) num adulto do sexo masculino. Revisões posteriores, sobre o número de neurônios no cérebro humano, ficam entre 75 e 124 bilhões (Lent, 2012), assim, o número de 100 bilhões, é um valor médio das estimativas. Concepção artística do cérebro humano. Disponível em : < > Acesso em: 10 de setembro de Fonte: Azevedo FA, Carvalho LR, Grinberg LT, Farfel JM, Ferretti RE, Leite RE, Jacob Filho W, Lent R, Herculano-Houzel S. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain J Comp Neurol. 2009;513(5):

28 Cérebro Humano A complexidade dos pensamentos e do tráfego de sinais no organismo humano são resultados da interação entre neurônios conectados. O impressionante número de conexões entre os neurônios cria um sistema altamente complexo envolvendo sinapses. Os resultados da ação desse sistema vemos a cada segundo de nossas vidas, pensando, criando e aprendendo... As interações, que geram padrões complexos, são resultados das sinapses entre as células. Resumindo, tudo que pensamos e lembramos é resultado das interações dessa rede complexa de sinapses. Iremos ver as principais características das sinapses. Segundo alguns autores, o cérebro humano tem aproximadamente sinapses, uns apresentam um número menor... Fonte da imagem: Brain-X-Ray-the-simpsons-60337_1024_768.jpg Acesso em: 10 de setembro de

29 Material Adicional O modelo de Hodgkin-Huxley descreve a variação do potencial de membrana em função do tempo. O modelo usa uma equação para a descrição do potencial. Há diversos programas que podem ser usados para termos uma visão do que ocorre com a membrana. Abaixo temos o site do HHSim, um programa gratuito para simulação computacional do potencial de membrana. O programa está disponível em: 29

30 Referências HODGKIN, ALAN L; HUXLEY, ANDREW F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. Journal of Physiology, 1952; 117 (4): OLIVEIRA, Jarbas Rodrigues de; WACHTER, Paulo Harald; AZAMBUJA, Alan Arrieira. Biofísica para ciências biomédicas. Porto Alegre: EDIPUCRS, p. OKUNO, Emiko; CALDAS, Iberê Luiz; CHOW, Cecil. Física para ciências biológicas e biomédicas. São Paulo: Harper & Row do Brasil, p. PURVES, W. K., SADAVA, D., ORIANS, G. H., HELLER, H. G. Vida. A Ciência da Biologia. 6a ed. Artmed editora