CULTIVO IN VITRO DE ANTERAS DE MAMONA: RESULTADOS PRELIMINARES. Daiane Peixoto Vargas 1, Vera Lucia Bobrowski 1 e Sérgio Delmar dos Anjos e Silva 2

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1 CULTIVO IN VITRO DE ANTERAS DE MAMONA: RESULTADOS PRELIMINARES Daiane Peixoto Vargas 1, Vera Lucia Bobrowski 1 e Sérgio Delmar dos Anjos e Silva 2 1 Universidade Federal de Pelotas, vera.bobrowski@ufpel.tche.br, 2 Embrapa Centro de Pesquisa Agropecuária Clima Temperado RESUMO - A mamona é uma cultura de grande importância econômica no Brasil na produção de Biodiesel. Na busca por novas cultivares que atendam os interesses econômicos, a cultura de anteras apresenta-se como grande ferramenta, por reduzir o tempo para a obtenção de linhagens homozigóticas. Para tanto, correlacionaram-se tamanhos de botão floral, antera e pólen, coletados das cultivares: IAC-80, Cafelista e AL-Guarany 2002, classificadas por tamanho: < 2,0; 2,0-2,9; 3,0-3,9; 4,0 4,9; 5,0 5,9; > 6,0 mm, fixados em Carnoy e analisadas em microscopia óptica. As relações entre as medidas das anteras e de pólen apresentaram diferenças significativas, o que evidenciou variação morfológica entre as cultivares. Na cultura de antera, os botões florais de todas as classes da cv. IAC- 80 desinfestados foram colocados em meios de cultivo, variando adição de carvão ativado (0 e 5g.L -1 ); 2,4-D (0 e 2mg. L -1 ) e ácido ascórbico (50 e 100mg. L -1 ). As anteras foram retiradas em ácido ascórbico sob esteriomicroscópio. Ocorreu a formação de calos em todos os meios de cultura e nas diferentes classes de botão floral sugerindo que o estádio de desenvolvimento da microsporogênese não influenciou a indução de calos. A adição de carvão ativado e o uso de ácido ascórbico atuaram como antioxidantes. INTRODUÇÃO Dentre as técnicas auxiliares do melhoramento a cultura de anteras apresenta-se como uma ferramenta de grande utilidade, principalmente por reduzir o tempo necessário para a obtenção de linhagens homozigóticas (SARTORETTO et al.,1999; PALÚ, 2004). Três pontos são de fundamental importância na obtenção de plantas através da cultura de anteras através da androgenese indireta: (1) formação de calos a partir de anteras; (2) formação de gemas a partir de calos e (3) obtenção de plantas a partir das gemas. A primeira etapa é essencial e devemos considerar alguns fatores como o genótipo o meio de cultivo e o estágio de desenvolvimento do grão de pólen, que podemos correlacionar com o tamanho do botão floral em muitas espécies (BOBROWSKI et al., 1995; PETERS et al., 1998). A maior dificuldade do uso de cultura de antera nas espécies, consiste na adequação do meio de cultura apropriado, para que ocorra a divisão celular, o processo de ativação e desativação dos genes, no momento e local apropriado e para tanto ajustes na concentração e tipo de reguladores de crescimento, uso de vitaminas e carvão ativado além de outros parâmetros físicos devem ser realizados (TEIXEIRA e TORRES, 1998; INGRAM et al., 2000; SALOMOM, 2003).

2 Este experimento foi realizado visando avaliar o efeito de diferentes meios de cultivo na indução de calos a partir de anteras com diferentes tamanhos. MATERIAL E MÉTODOS Os botões florais de mamona da cultivar IAC-80 utilizados neste estudo foram procedentes de uma população em cultivo no campo experimental da Embrapa Clima Temperado, altitude 60m, latitude Sul e longitude Oeste, localizada em Pelotas, RS. Os botões coletados foram medidos com auxilio de paquímetro e separados em seis classes de acordo com o tamanho: < 2,0; 2,0-2,9; 3,0-3,9; 4,0-4,9; 5,0-5,9; > 6,0 mm. Os botões florais foram lavados em água destilada por 5 minutos, desinfestados por imersão em álcool 70% por 3 segundos e após, em solução de 20% de hipoclorito comercial por 10 minutos. A seguir, o material foi lavado por três vezes em água destilada esterilizada, permanecendo nesta até a transferência para o meio de cultura. Todos os procedimentos de desinfestação e transferência para o meio de cultura foram realizados em câmara asséptica de fluxo laminar horizontal. Imediatamente após a inoculação das anteras as diferentes concentrações de ácido ascórbico filtrada foram adicionadas sobre os meios M1(50mg. L -1 ); M2 (100mg. L -1 ; M4 (100mg. L -1 ) e M5 (50mg. L -1 ) na quantidade de 2 ml conforme Tabela 1. O meio mineral básico utilizado para formação de calos foi o meio MS (MURASCHIGE & SKOOG, 1962), variando os tratamentos pela adição de 2,4-D (0 e 2mg. L -1 ), acido ascórbico (vitamina C) e carvão ativado ( 0 e 5g.L -1 C.A.) de acordo com a Tabela 1 Os meios de cultura tiveram o ph ajustado para 5,7 ± 1utilizando NAOH(Hidróxido de sódio) 1N ou HCl (Ácido clorídrico) 1N e autoclavados a 120 C e 1,2 atm. de pressão por 20 minutos. Logo após o meio foi transferido para placas de Petri estéreis em câmara de fluxo laminar. Após inoculação o material foi mantido em câmara de crescimento a 25 ± 1 C no escuro por 30 dias. RESULTADOS E DISCUSSÃO A avaliação de formação de calos aos 30 dias de cultura não foi possível devido ao alto índice de contaminação dos meios de cultura. Como neste experimento as coletas foram realizadas a partir de plantas mantidas a campo estas estão sujeitas a ação de agentes exógenos e devemos considerar também que o uso de substâncias desinfestantes em concentrações muito altas podem comprometer a viabilidade dos tecidos.

3 A maior freqüência de anteras oxidadas ocorreu nos meio M3, M4 e M5 quando consideramos todos os tratamentos avaliados. No entanto, o uso de carvão ativado e ácido ascórbico nos meios M1 e M2 demonstrou uma menor oxidação quando comparados os resultados com os outros meios de cultura, onde foram avaliados os efeitos do ácido ascórbico e carvão ativado independentes, porém não há uma diferença qualitativa quando comparado com do meio M6 (Tab. 2). De acordo com Custódio et al. (2005) a oxidação das anteras pode inibir totalmente a indução de calos podendo este efeito ser minimizado pelo uso de agente antioxidantes ou transferindo a cultura para meio fresco, neste experimento o uso de carvão ativado e solução de ácido ascórbico, a interação destes dois compostos auxiliou prevenindo a oxidação rápida que normalmente ocorre em explantes de mamona. Porém estes autores citam também que o tipo de auxina pode interferir, sendo o uso de TDZ melhor em relação a oxidação mas para indução de calos o 2,4 D é mais eficiente. Isto pode explicar a ausência de oxidação no meio M6, sem adição de carvão ativado ou ácido ascórbico, e também sem 2,4D (Tabs.1 e 2). Podemos visualizar na Tabela 2 que houve formação de calos em quase todos os meios testados e tamanhos de botões florais, sendo as classes extremas (>6mm e < 2,0 mm) as que menos produziram calos. Porém, de acordo com Lannes et al. (2004) outros fatores podem influenciar no desempenho da indução de calos como comprimento do dia, radiação solar e temperaturas noturnas às quais estavam submetidas às plantas doadoras de pólen. Quanto a coloração dos calos em meio de cultura, aos 30 dias de cultivo, observou-se que nos meios M1, M5 e M6 apresentavam-se com aspectos translúcido, nos meios M3 e M4 com aspecto amarelo-translucido e no meio M2 a amarelados. Com relação a textura os calos formados apresentavam-se globulosos (Fig. 2B) Ashok-Kumar et al. (2003) observaram que calos com aspecto amarelado induziam maior regeneração que os demais. Há necessidade de maiores estudos quanto ao potencial de regeneração destes calos e a utilização de outros agentes antioxidantes para evitar a oxidação dos explantes no meio de indução, mas estes resultados preliminares indicam a potencialidade da técnica para a mamona. CONCLUSÕES Há variações morfológicas entre as cvs. Cafelista, AL-Guarany 2002 e IAC-80 com mesmo tamanho apresentam anteras e grãos de pólen de tamanhos diferentes evidenciando variação morfológica entre elas.

4 Para indução de calos de anteras de mamona cv. IAC-80 o uso de ácido ascórbico e carvão ativado no meio e secção de anteras em solução de ácido ascórbico é importante por diminuir a oxidação das anteras. A partir de diferentes tamanhos de botões florais em mamona- cv. IAC-80 ocorre formação de calos. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ASHOK-KUMAR, H. G.; MURTHY, H. N.; PAEK, K. Y. Embryogenesis and plant regeneration from anther cultures of Cucumis sativus L., Scientia Horticulturae, v.98, nº 3,p , BOBROWSKI, V. L.; PETERS, J. A.; AUGUSTIN, E. e VIÉGAS, J. Efeitos de meios de cultura na formação de calos a partir de anteras de aspargo (Asparagus officinalis L). Acta Bot. Bras., v.9, nº 1, p ,1995. CUSTÓDIO, L., CARNEIRO, M. F., ROMANO, A., Microsporogenesis and anther culture in carob tree (Ceratonia siliqua L.) Scientia Horticulturae, n 104, p , INGRAM, H.M.; POWER, J.B.; LOWE, K.C.; DAVEY, M.R. Microspore-derived embryo induction from cultured anthers of wheat, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, v. 60,p , LANNES, S. D.; ZIMMER, P. D.; OLIVEIRA, A. C. de; CARVALHO, F. I. F. de; VIEIRA, E. A.; MAGALHÃES JR, A. M. DE; KOPP, M. M.; FREITAS, F. A. DE. Regeneração in vitro de anteras de arroz irrigado (Oryza sativa L.) e mapeamento de QTL associado, Ciência Rural, Santa Maria, v. 34, n 5, p , MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tabacco tissue cultures. Physiol. Plantarum, 15: ,1962. PALÚ, E. G.; SILVA, A.B. DA; PASQUAL, M. Calogênese in vitro em anteras de Coffea arabica L. Ciênc. agrotec., Lavras, v. 28, n 4, p , jul./ago., 2004 PETERS, J.A.; BOBROWSKI, V.L.; ROSINHA, G.M.S. Produção de haplóides e duplohaploides.in: Torres. A.C.; Caldas, L.S.; Buso, J.A.. Cultura de tecidos e transformação de plantas. Brasilia, DF: EMBRAPA/SPI.v.1, p SALOMOM, M. V. Trigo: avaliação de linhagens diplóides obtidas via cultura de anteras f. Dissertação (Mestrado em Agronomia) - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz. Universidade de São Paulo, Piracicaba.

5 SARTORETTO, L.M.; BOBROWSKI, V.L.; AUGUSTIN, E; PETERS, J.A. Influência do estado físico do meio de indução de calos e de diferentes meios de regeneração na formação de brotos de aspargo. Agropecuária Clima Temperado, Pelotas, v.2, n 1, p.5-11,1999. TEIXEIRA,S.L. & TORRES, A.C. Organização de laboratório de cultura de tecidos de plantas. In: Cultura de Tecidos e Transformação Genética de Plantas. Brasília: Embrapa, v. 2, 864p, Tabela 1. Meios de cultura utilizados no cultivo de anteras de mamona (Ricinus comunnis L.). Meio Composição M1: MS+ 2mg. L -1 2,4-D + 50mg. L -1 vit. C +5g.L -1 C.A. M2: MS+2mg. L -1 2,4-D + 100mg. L -1 vit. C + 5g.L -1 C.A. M3: MS+ 2mg. L -1 2,4-D + 5g.L -1 C.A M4: MS + 2mg. L -1 2,4-D + 100mg. L -1 vit. C M5: MS+2mg. L -1 2,4-D + 50mg. L -1 vit. C. M6: MS básico Tabela 2. Teste preliminar para avaliação do efeito do tamanho de botão floral utilizado e do meio de cultivo na produção de calos aos 15 dias a partir de aglomerados de anteras em cultura. Meio Classe (mm) Formação de calo oxidação M1 < 2,0 X* X 4,0-4,9 5,0-5,9 > 6,0 M2 < 2,0 X 4,0-4,9 X X 5,0-5,9 M3 < 2,0 X X X X 4,0-4,9 X X 5,0-5,9 X X M4 < 2,0 X 4,0-4,9 X X 5,0-5,9 X M5 < 2,0 X

6 X 4,0-4,9 X 5,0-5,9 X M6 < 2,0 X X 4,0-4,9 X 5,0-5,9 X