Bactérias para controle de insetos

Transcrição

1 Bactérias para controle de insetos Rose Monnerat EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia Goiânia-GO Agosto 2018

2 Coleção de Bactérias de Invertebrados Bacillus spp. Primeira coleção de microrganismos brasileira a ser avaliada e reconhecida segundo as normas para funcionamento de um Centro de Recursos Biológicos - CRB

3 Objetivos Novas estirpes Novos biopesticidas Novos genes Bacteriocinas (antibioticos, antifungicos) Promotores de crescimento Estudos de interações toxina inseto - planta Uso sistêmico

4 Prospecção Saúde pública Culex spp. Anopheles spp. Aedes aegypti Simulium spp. Agrícola Plutella xylostella Anticarsia gemmatalis Spodoptera frugiperda Veterinária Alphitobius diaperinus Stomoxys calcitrans Haematobia irritans

5 Estirpes Spodoptera frugiperda genes cry Outras características LC 50 ng/cm 2 A ( ) cry1aa, cry1ab, cry1c, cry1d, cry1i B 13.3 ( ) cry1aa, cry1ab, cry1b, cry1d, cry1i C 6.3 ( ) cry1aa, cry1b, cry1d, cry1i, cry2 Produção de Thuricina 17 D 12.9 ( ) cry1aa, cry1ab, cry1ac cry1ad, cry1b, cry1d, cry1i, cry2 E ( ) cry1aa, cry1ac, cry1ad, cry1c, cry1d, cry1i F ( ) cry1ab, cry1ac, cry1b, cry1e, cry1g, cry1i, cry2 G 22.9 ( ) cry1aa, cry1b, cry1c, cry1d H ( ) Cry1B Produção de melanina

6 Novos genes Gene cry1ia Proteína tóxica a lepidópteros e coleópteros (patente) Gene cry10 Proteína tóxica a coleópteros (patente) Gene cry1b Proteína tóxica a coleópteros

7 Bioinseticidas desenvolvidos pela Embrapa Cenargen com instituições privadas à base de Bacillus thuringiensis e Lysinibacillus sphaericus da Coleção. Ponto Final (Bthek Biotecnologia Ltda.), Inova Bti (Instituto Matogrossense do Algodão-IMAmt), Strike Bio Bti SC (STRIKE Indústria e Comércio), Bt-horus SC (Bthek Biotecnologia Ltda.), Sphaerico (Geratec do Brasil) e Sphaerus-SC (Bthek Biotecnologia Ltda.).

8 Trabalho social Educação Reordenação ambiental Uso de produtos biológicos Cidadania

9 Bactérias esporulantes aeróbicas como as pertencentes ao gênero Bacillus e correlatos anaeróbicas que pertencem ao gênero Clostridium Bactérias não esporulantes Serratia, Pseudomonas, Streptococus, Xenorhabdus Chromobacterium.

10 Pseudomonas entomophila Patogênica para três ordens de insetos: Diptera (Anopheles gambiae e D. melanogaster), Lepidoptera (Bombyx mori e Galleria mellonella) e Coleoptera (Sitophilus oryzae). Ação é devido a produção de metabolitos

11 Chromobacterium subtsugae Bacteria Gram-negativa apresenta pigmentação violeta e a mobilidade flagelar. Essa é uma bactéria com atividade tóxica quando ingerida oralmente por larvas de coleópteros Leptinotarsa decemlineata e Aethina tumida e de lepidópteros como Diabrotica spp. e Plutella xylostella Apresenta crescimento ótimo a 25 C, em ph 6,5-8,0 com 0-1,5% de NaCl adicionado ao meio. A maior mortalidade de insetos seguiu o tratamento com uma combinação de células vivas com toxinas inseticidas produzidas na fase estacionária de crescimento Além do pigmento violeta, denominado violaceína, que tem atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, C. subtsugae contém um gene que codifica uma proteína inseticida semelhante ao encontrado em P. luminescens e Xenorhabdus nematophilia

12 Gênero Bacillus e correlatos Bacillus cereus Bacillus thuringiensis Lysinibacillus sphaericus Paenibacillus popilliae Paenibacillus lentimorbus Bacillus larvae Bacillus alvei Brevibacillus laterosporus

13 Produzem esporos Forma de resistência - Resiste a altas temperaturas - Vantagem no processo fermentativo Densidade óptica t σ E σ K 0 σ H σ F σ G Fase vegetativa Esporulação Célula mãe Esporo σ A EI EII EIII EIV EV-VI EVII t 0 t 1 t 2 Tempo

14 Paenibacillus popilliae e P. lentimorbus doença leitosa dos tipos A e B em coleopteros O primeiro programa bem sucedido de controle de insetos foi o uso de P. popilliae para controlar larvas do besouro japonês (Popillia japonica). Programa foi frustrado pois a produção continuada de esporos in vitro não era viável

15 Lysinibacillus sphaericus - Tóxica a insetos da Ordem Diptera (larvas de mosquitos) - aplicações ambientais e industriais além do controle biológico como, por exemplo, na biorremediação de metais tóxicos, solubilização de fósforo

16 Brevibacillus laterosporus Patogênica a insetos das Ordens Coleoptera, Diptera e Lepidoptera Utilizado como probiótico humano.

17 Bacillus thuringiensis Bactéria que causa doença em alguns organismos Isolado: : Lepidoptera 1977: Diptera 1983: Coleoptera Pode ser encontrada nos solos, ambientes aquáticos, cadáveres de insetos, etc. Alto nível de especificidade estirpes conhecidas

18 Microscopia de contraste de fases de B. thuringiensis mostrando: (c) cristais; (e) esporos (2.000x). Microscopia eletrônica de varredura de B. thuringiensis mostrando: (c) cristais; (e) esporos (20.000x).

19 Diferentes formas Bioinseticidas Estirpes nativas Estirpes modificadas Plantas transgênicas

20 Toxinas produzidas pelo B. thuringiensis α-exotoxina Atividade citolítica Termolábil Toxicidade a insetos, ratos e outros vertebrados β-exotoxinas (Thuringiensina) Fase vegetativa Efeito teratogênico e mutagênico Termoestáveis Toxicidade a várias ordens de insetos e vertebrados Vip Sip Fase vegetativa; Ativa principalmente contra lepdópteros; Não forma cristais. Fase vegetativa; Ativa principalmente contra coleopteros; Não forma cristais.

21 Proteínas Cry

22 Vip e Sip

23 As proteínas Cry estão classificadas em 75 grupos e diferentes subgrupos e são codificadas por mais de 840 genes cry já sequenciados Cry1 Cry1A Cry1B Cry1Aa Cry1Ab Cry1Aa1 Cry1Aa2 Cry2 Cry2A Cry2B Cry2Aa Cry2Ab Cry2Aa1 Cry2Aa2 45% 78% 95% 98%

24 Modo de ação de Bacillus spp. Composto de várias etapas: Ingestão

25 Solubilização

26 Ativação e ligação aos receptores

27 Inserção na membrana, agregação e formação do poro

28 Alteração da permeabilidade e morte celular Bomba de Na + /K +; H 2 O.

29 Morte do inseto

30 Epitélio intestinal de Aedes aegypti

31 Receptores Moleculares da proteína Cry1A. CADR, receptor caderina; APN, receptor aminopeptidase-n; ALP, receptor fosfatase alcalina; GCR, receptor glicoconjugado de 270 kda (Bravo et al., 2007).

32 Susceptibilidade entre espécies S. cosmioides S. eridania S. frugiperda Proteínas Cry CL 50 (µg/ml) Intervalo de confiança (95%) Cry1Aa 0,58 (0,14 1,52) ab 74,74 (42,83 121,4) c 0,32 (0,14 0,72 ) a Cry1Ab 0,37 (0,12 0,82) a 62,33 (37,34 188,22) c 0,88 (0,40 1,74) a Cry1Ac 2,77 (1,20 6,26) b 21,34 (14,29 33,97) b 10,90 (4,78 30,65) b Cry2A 23,98 (8,91 171,1) c 1,00 (0,42 2,36) a 1,87 (0,70 5,30) ab (Santos et al., 2009)

33 Variabilidade Genética x susceptibilidade x receptores em S.frugiperda Mexico Colombia Brasil 1. Brasil Cry1Ba Cry1Ca Cry1Da México 3. Colombia Toxina México Colombia Brasil LC 50 ng/cm 2 Cry1B > (31-148) 403 ( ) Cry1C 42 (27-55) 21 (6-48) 84 (61-129) Cry1D 80 (66-128) 7 (2-22) >2000 Monnerat et al., 2006

34 Modos de ação diferentes para a protoxina e toxina Bioinseticida ação da protoxina e da toxina Planta Bt ação da toxina

35 Toxicidade das diferentes produtos biológicos para larvas de S. frugiperda das populações susceptível e resistente a plantas Bt (Cry1F, Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac) Produto Susceptivel LC50 ng/cm 2 Resistente Formulado 1 31,74 (26,26-62,29) 15,97 (9,4 53,88) Formulado 2 395,16 (206,57-632) 335,42 (145,97 889,48) Formulado ,21 (1518, ,03) 2283,02 (1172, ,7) Produtos à base de B. thuringiensis podem ser utilizados em insetos resistentes a toxinas de plantas Bt

36 Produção de microrganismos Meio de Cultura Inóculo Fermentação Concentração Controle de qualidade Formulação Envase

37 Fatores limitantes ao processo de produção 1- Meio de Cultura É uma das chaves do sucesso da produção. Na composição básica deve conter carbono, nitrogênio e minerais Composição variável conforme a espécie e a cepa Deve ser sempre esterilizado 2- Inóculo puro só a bactéria

38 Fatores limitantes ao processo de produção 3- Condições fermentativas ph - neutro Oxigenação - alta Agitação temperatura aproximadamente 30º C 4- Controle de qualidade Normalmente as bactérias usadas em controle biológico não são boas competidoras Precisa ser realizado em todas as fases do processo ---- Nunca produzir dois microrganismos juntos...

39 Produção em reator Controle de: - ph - temperatura - oxigenação - agitação Meio de cultura - autoclavado Ar estéril

40 Peso Seso S1450 Peso Seco g/l Tempo (horas) NYSM S1450 Bt I S1450 Bt II S1450

41 Formulação Objetivos 1) Estabilizar o agente microbiano durante a distribuição e estocagem; 2) Melhorar o manuseio e a aplicação do produto; 3) Proteger o agente de fatores ambientais adversos; 4) Melhorar a eficiência do agente microbiano no campo

42 Processo fermentação e recuperação do complexo esporo-cristal

43 Tipos de Formulações Suspensão Concentrada; Concentrado Emulsionável; Pó Molhável; Granulado; Grânulos Dispersíveis em água; Pastilhas ou Tabletes; Gelo.

44 Produção on farm Decreto 4074, alterado pelo Decreto em 2009: Art. 10-D. 8º Ficam isentos de registro os produtos fitossanitários com uso aprovado para a agricultura orgânica produzidos exclusivamente para uso próprio.

45 Produção de microrganismos Meio de Cultura Inóculo On farm Fermentação comercial Concentração Formulação Envase

46 Produção caseira de Bt - Qualidade do produto (instalações inadequadas, inoculo de má qualidade, falta de controle de qualidade)

47 Ações da Embrapa - Manual para controle de qualidade - Prestação de serviços em controle de qualidade - Treinamentos em produção e controle de qualidade

48 Produção de bioinseticidas à base de Bacillus thuringiensis: da bactéria ao produto Outubro-2017

49 Produção em baldes x fermentador x

50 Controle de qualidade de produtos à base de Bacillus thuringiensis Manual em redação 1- Introdução 2. Objetivo 3. A Bactéria Bacillus thuringiensis 4- Produção e formulação de produtos à base de Bacillus thuringiensis 5- Controle de qualidade dos produtos 6- Estrutura mínima para produção

51 1- Procedimento para determinação de ph de produtos biológicos a base de Bacillus thuringiensis

52 2- Procedimento para determinação do teor de ingrediente ativo de produtos biológicos a base de Bacillus thuringiensis Determinação de UFC- unidades formadoras de colônias Células- direto Esporos- choque térmico (80ºC-12 min, gelo- 5 min.) % esporulação- numero de células : número de esporos

53 3- Procedimento para avaliação da eficácia de produtos biológicos a base de Bacillus thuringiensis para o controle de larvas de lepidopteros - Aplicar 100 µl de cada suspensão sobre a dieta - Deixar secar - Colocar a lagarta de segundo instar - Incubar o bioensaio em sala com condições controladas - Efetuar leitura após 48 horas

54 4- Procedimento para determinação de contaminantes em produtos biológicos a base de Bacillus thuringiensis - Semear em cada placa de Petri, 0,1mL de cada uma das amostras - Espalhar com alça de Drigalsky a suspensão sobre toda a superfície do meio de cultura; - Colocar as placas em estufa incubadora; - Após 24 horas de incubação, contar o número de colônias - Utilizar a média de colônias obtidas nas duas placas Microrganismo Especificação Meio de cultura B. thuringiensis Controle Ágar nutritivo Coliformes termotolerantes 500 UFC Ágar Bile Cristal-Violeta Vermelho Neutro Escherichia coli 400 UFC Ágar Macconkey Enterecocos 50 UFC Ágar Confirmatório para Enterococos Estreptococos 0 Agar Seletivo para Estreptococos Salmonella 0 Ágar Verde-Brilhante Fungos 0 Ágar Sabouraud 4%

55 Ágar Macconkey Agar Bile verdebrilhante Ágar Confirmatório para Enterococos Agar Seletivo para Estreptococo s Ágar Verde- Brilhante Ágar Sabouraud 4% celulas esporos Meios Escherichia coli Coliformes termotolerantes Enterecocos Estreptococos Salmonella Fungos 400 UFC 500 UFC 50 UFC A- Fermentador x x A- balde >400 >500 >50 >500 >500 > x ,5 x 10 5 B- balde >400 >500 0 >500 >500 >500 27,5 x ,5 x 10 5 C- balde >400 >500 0 >500 >500 > x ,1 x 10 7 T- balde >400 >500 >50 >500 >500 > x

56 Estrutura mínima 1- Área de utilidades: A área de utilidades pode-se restringir a uma cobertura sob a qual se disponham um gerador de vapor, compressor de ar e sistema de resfriamento (torre de resfriamento e/ou água gelada). 2- Laboratório de controle de qualidade e processo: Este espaço deve conter capela de fluxo laminar, sistema de inoculação, microscópio de contraste de fases, placa aquecedora ou banho-maria, autoclave pequena, estufa de secagem, estufa de crescimento, pipetas de precisão. 3- Salão de fermentação: neste ambiente serão colocados reatores esterilizáveis in sito. 4- Sala de estoque de insumos: nesta sala deverão ser colocados todos os materiais que serão empregados no processo de fermentação. 5- Sala de armazenamento de produto acabado: nesta sala será estocado o produto acabado e de preferencia deverá estar refrigerada. Todas as áreas deverão ser passíveis de limpeza e desinfecção, com acabamento impermeável.

57 Sugestões para produção on farm Uso próprio Cooperativas, associações Cepas limitadas (especificação de referência do MAPA, ou material próprio) Obrigatoriedade de estrutura mínima Responsável Técnico Controle de qualidade (Manual) Cadastramento no MAPA

58 30 especificações de referência 01 Cotesia flavipes 02 Trichogramma galloi 03 Neoseiulus californicus 04 Isca vegetal à base de Tephrosia cândida 05 Baculovírus Anticarsia gemmatalis 06 Baculovírus Condylorrhiza vestigialis 07 Metarhizium anisopliae, isolado IBCB Trichoderma stromaticum, isolado CEPLAC Azadirachta indica 10 - Beauveria bassiana, IBCB Phytoseiulus macropilis 12 Trichogramma pretiosum 13 Regulador de crescimento à base de Ecklonia maxima 14 Terra de Diatomácea (Dióxido de Silício) 15 Paecilomyces lilacinus, isolado UEL Pae Stratiolaelaps scimitus 17 Deladenus (=Beddingia) siricidicola 18 Cryptolaemus montrouzieri 19 Trichoderma asperellum, isolado URM Baculovírus Spodoptera frugiperda 21 Chrysoperla externa 22 Trissolcus basalis 23 Orius insidiosus 24 Trichoderma asperellum, isolado CBMAI 840 (T-211) 25 Bacillus subtilis, isolado UFPEDA Trichoderma harzianum, isolado IBLF Bacillus methylotrophicus, isolado UFPEDA Bacillus thuringiensis var. Kurstaki, isolado HD-1 (S1450) (CCT1306) 29 Beauveria bassiana, isolado CBMAI Beauveria bassiana, isolado IBCB 66 + Metarhizium anisopliae, isolado IBCB 425

59 Obrigada!