ESTUDO DA DISTRIBUIÇÃO DOS GENÓTIPOS SEGUNDO O VNTR DO GENE NUMA AMOSTRA DE HOMEMS E MULHERES DA UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS-RS

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1 ESTUDO DA DISTRIBUIÇÃO DOS GENÓTIPOS SEGUNDO O VNTR DO GENE PER3 E DOS CRONOTIPOS PELO QUESTIONÁRIO HORNE E ÖSTBERG (HO) NUMA AMOSTRA DE HOMEMS E MULHERES DA UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS-RS SANTOS, Betânia Rodrigues; SANTOS, Fabiana Fonseca; ALAM, Autor(es): Marilene Farias; PEDRAZZOLI, Mario; ÁREAS, Roberta; MENNA- BARRETO, Luiz; OLIVEIRA, Isabel Oliveira Apresentador: Betânia Rodrigues dos Santos Orientador: Isabel Oliveira de Oliveira Revisor 1: Beatriz Helena Gomes Rocha Revisor 2: Antônio Costa de Oliveira Instituição: Universidade Federal de Pelotas ESTUDO DA DISTRIBUIÇÃO DOS GENÓTIPOS SEGUNDO O VNTR DO GENE PER3 E DOS CRONOTIPOS PELO QUESTIONÁRIO HORNE E ÖSTBERG (HO) NUMA AMOSTRA DE HOMEMS E MULHERES DA UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS-RS SANTOS, Betânia Rodrigues 1 ; SANTOS, Fabiana Fonseca 2 ; ALAM, Marilene Farias 3 ; PEDRAZZOLI, Mario 4 ; ÁREAS, Roberta 5 ; MENNA-BARRETO, Luiz 5 ; OLIVEIRA, Isabel Oliveira 3 1- Universidade Federal de Pelotas (UFPel), Acadêmica de Ciências Biológicas, Laboratório de Fisiologia Molecular,DFF.Pelotas,RS-Brasil. 2- Universidade Federal de Pelotas (UFPel), Biológa, Laboratório de Fisiologia Molecular,DFF,Pelotas,RS-Brasil. 3- Universidade Federal de Pelotas (UFPel), Professor adjunto, Laboratório de Fisiologia Molecular, DFF, Pelotas, RS-Brasil. 4- Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Instituto do Sono, Departamento de Psicobiologia, São Paulo, SP-Brasil. 5- Universidade de São Paulo (USP), São Paulo, SP-Brasil. betaniabio@yahoo.com.br 1) INTRODUÇÃO A cronobiologia inclui o estudo dos ritmos biológicos caracterizados pela recorrência, a intervalos regulares, de eventos bioquímicos, fisiológicos e comportamentais (Aschoff, 1965). Ela traz uma das mais importantes contribuições relativas ao tempo: a noção de variabilidade das funções biológicas ao longo das 24 horas do dia, mostrando que as pessoas tendem a responder diferentemente à mesma situação conforme o momento do dia em que ela ocorra. Logo, a ritmicidade circadiana é resultante da atuação de fatores endógenos (relógio biológico) e de fatores ambientais (relógio solar e relógio social), (Gaspar, Moreno & Menna- Barreto, 1998). A população humana pode ser classificada em três cronotipos básicos: os matutinos, os vespertinos e os indiferentes, de acordo com as diferenças individuais 1

2 na preferência pelos horários de vigília e de sono avaliadas pelo questionário de Horne & Ostberg (HO) (Horne & Ostberg, 1976). O HO é um instrumento internacionalmente validado, sendo amplamente utilizado para identificação dos cronotipos do espectro matutino/vespertino (Ceolim & Menna-Barreto, 2000). Atualmente muitos estudos moleculares vêm se desenvolvendo sobre os ritmos circadianos, facilitando análises genéticas de fisiopatologias do sono e tendências à matutinidade ou à vespertinidade. Um dos primeiros estudos genéticos identificou o gene period (Per) como o primeiro componente essencial para a oscilação circadiana, e foi seguido pelo isolamento de vários genes relógio (Per 1/2/3, Clock, Cry 1/2), não somente em Drosophila, mas em muitas espécies incluindo mamíferos (Dunlap, 1999). Mutações naturais nesses genes relógio podem modular os ritmos circadianos em hamsters e ratos (King & Takahashi, 2000; Lowrey & Shimomura, 2000); e provavelmente possuam um papel importante na regulação circadiana da nossa espécie (Ebisawa & Uchiyama, 2001; Cermakian & Boivin, 2003). O gene period 3 (Per3) é expresso no Núcleo Supraquiasmático do Hipotálamo, estando localizado em humanos no cromossomo 1 e possuindo 23 éxons. No seu éxon 18 foi detectada a presença de um polimorfismo de repetição (VNTR) de 54pb. Pesquisas demonstraram uma forte associação desse polimorfismo de repetição com a Síndrome da Fase do Sono Atrasada (DSPS) (Archer & Robilliard, 2003; Pereira & Tufik, 2005). Estudos feitos no Japão (Ebisawa & Uchiyama, 2001) e na Inglaterra (Archer & Robilliard, 2003) demontraram que 4 repetições de 54pb caracterizam um genótipo homozigoto vespertino (4/4) e 5 repetições de 54pb caracterizam um genótipo homozigoto matutino (5/5), sendo a preferência diurna observada na população inglesa. É de extrema importância que se realizem pesquisas crono-genéticas que avaliem variação cronotípica e genotípica entre os gêneros, pois atualmente as diferenças entre homens e mulheres quanto ao rendimento profissional têm sido atribuídas a fatores culturais (mulheres possuem dupla jornada de trabalho), e não a características biológicas (Härma, 1995; Nachreiner, 1998). O objetivo do trabalho foi avaliar a distribuição do VNTR do gene Per3 e dos cronotipos pelo HO em uma amostra de universitários da Universidade Federal de Pelotas e suas variações entre os gêneros feminino e masculino. 2) MATERIAL E MÉTODOS O trabalho foi realizado no laboratório de Fisiologia pertencente ao Departamento de Fisiologia e Farmacologia do Instituto de Biologia/Universidade Federal de Pelotas. O período de coletas se estendeu de Dezembro de 2006 até Junho de 2007, e teve como população alvo 79 alunos da UFPel, sendo 42 homens e 37 mulheres. Os voluntários responderam ao questionário HO e, através da pontuação obtida, foram classificados entre os diferentes cronotipos propostos por Horne e Östberg (1976). Posteriormente, os indivíduos foram submetidos à coleta de material genômico através de fricção de escova citológica na superfície interna da mucosa oral. Na extração do DNA, foi utilizado o Kit comercial Puregene TM (Buccal Cell Kit), que sugere a utilização de uma solução de lise celular; uma solução para 2

3 precipitação protéica e uma solução de hidratação para homogeneizar o material genômico extraído. A genotipagem do VNTR foi realizada por meio da reação de PCR com 38 ciclos, gerando fragmentos 635pb e/ou 689pb, e posterior visualização em gel de agarose 2,0%. Um indivíduo pode ter os dois alelos com 4 repetições de 54pb (homozigoto 4/4 - vespertino), um alelo com 4 e outro com 5 repetições de 54pb (heterozigoto 4/5 - intermediário) e ainda os 2 alelos com 5 repetições de 54pb (homozigoto 5/5 - matutino). Os resultados obtidos foram analisados pelo Teste T para Amostras Independentes e pelo Teste do Qui-quadrado, pelo programa SPSS versão para windows 10. 3) RESULTADOS E DISCUSSÃO A pontuação média do HO na população foi de 44,14, com uma distribuição de 43,04% para o cronotipo vespertino, 46,83% para o cronotipo intermediário/indiferente e de 10,13% para o cronotipo matutino. Comparando os gêneros, a pontuação média feminina apresentou-se mais elevada (48,05) em relação à masculina (40,51). Porém, a diferença na distribuição dos cronotipos entre os gêneros não foi estatisticamente significante (Teste T para Amostras Independentes, p=0,737). Referente ao estudo genético, a população encontra-se em Equilíbrio de Hard-Weinberg (EHW), com freqüências de 0,69 para o alelo de 4 repetições e de 0,31 para o alelo de 5 repetições. Na distribuição dos genótipos encontramos uma freqüência de 0,46 para o homozigoto 4/4; de 0,47 para o heterozigoto 4/5; e de 0,08 para o homozigoto 5/5. Na análise dos gêneros, foi observada igualdade nas freqüências alélicas para mulheres e homens, sendo de 0,69 para o alelo com 4 repetições e de 0,31 para o alelo com 5 repetições. Na distribuição genotípica foi encontrada uma variação quanto ao genótipo predominante em cada gênero, sendo no feminino o mais freqüente o heterozigoto 4/5 com 51,35%, e no masculino o homozigoto 4/4 com 47,62%. Quando realizada a análise estatística para avaliar a distribuição do VNTR do gene Per3 não se observou diferença significativa entre os gêneros (Qui-quadrado, pearson =0,537). As freqüências alélicas e genotípicas da população estudada foram similares às apresentadas por Pereira & Tufik (2005), autores que sugerem que a distribuição dos genótipos pode ser influenciada pela latitude em que as populações estudadas se encontram, em decorrência à variação da incidência solar nas diferentes localidades. As freqüências alélicas encontradas dentro de cada cronotipo observado corroboram com os resultados encontrados por Archer & Robilliard (2003) e Pereira & Tufik (2005), que apontam uma forte associação do gene Per3 com a Síndrome da Fase do Sono Atrasada (DSPS). A não significância encontrada na distribuição do VNTR do gene Per3 e dos cronotipos pelo HO entre os gêneros sugere não haver diferença na adaptação aos horários de sono/vigília entre homens e mulheres estudados. Portanto, fatores culturais e/ou outros fatores genéticos independentes do gene Per3, podem ser apontados como uma possível causa para diferenças de rendimento em horários alternativos de trabalho (Härma, 1995; Nachreiner, 1998). 3

4 4) CONCLUSÃO Nos resultados preliminares obtidos, o rendimento profissional diferenciado entre os gêneros para os horários alternativos de trabalho não se apresentou relacionado ao cronotipo e ao genótipo dos indivíduos estudados. Entretanto, pretende-se dar continuidade ao estudo aumentando o número de indivíduos analisados para que os resultados possam ser confirmados. 5) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ARCHER, S. N., ROBILLIARD, D. L.; SKENE, D. J., SMITS, M., WILLIAMS, A., ARENDT, J., SCHANTZ, M. A length polymorphism in the circadian clock gene Per3 is linked to delayed sleep-phase syndrome and extreme diurnal preference. Sleep, 2003, 26, p ASCHOFF, J. Circadian rhythms in man. Science, 1965, 148, p CEOLIM, M. F., MENNA-BARRETO, L. Sleep/ Wake cycle and Physical activity in healthy elderly people. Sleep Research Online, 2000, 3, p CERMAKIAN, N., BOIVIN, D. B. A molecular perspective of human circadian rhythm disorders. Brain Res Rev, 2003, 42, p DUNLAP, J. C. Molecular basis for circadian clocks. Cell, 1999, 96, p EBISAWA, T., UCHIYAMA, M., KAJIMURA, N., MISHIMA, K., KAMEI, Y., KATOH, M., WATANABE, T., SEKIMOTO, M., SHIBUI, K., KIM, K., KUDO, Y., OZEKI, Y., SUGISHITA, M., TOYOSHIMA, R., INOUE, Y., YAMADA, N., NAGASE, T., OZAKI, N., OHARA, O., ISHIDA, N., OKAWA, M., TAKAHASHI, K. YAMAUCHI, T. Association of structural polymorphisms in the human period3 gene with delayed sleep phase syndrome. EMBO Rep., 2001, 15, p GASPAR, S., MORENO, C., MENNA-BARRETO, L. Os Plantões Médicos, o Sono e a Ritmicidade Biológica. Rev. Ass. Med. Brasil, 1998, 44, p HÄRMÄ, M. Sleepiness and shiftwork: Individual differences. Journal of Sleep Research, 1995, 4(Sup. 2) p HORNE, J. A., OSTBERG, O. A self-assesment questionnaire to determine morningness/eveningness in human circadian rhythms. Int J Chronobiol, 1976, 4, p KING, D. P., TAKAHASHI, J. S. Molecular genetics of circadian rhythms in mammals. Annu. Rev. Neurosci., 2000, 23, p LOWREY, P. L., SHIMOMURA, K., ANTOCH, M. P., YMAZAKI, S., ZEMENIDES, P. D., RALPH, M. R., MENAKER, M., TAKAHASHI, J. S. Positional syntenic cloning and functional characterization of the mammalian circadian mutation tau. Science, 2000, 288, p NACHREINER, F. Individual and social determinants of shiftwork tolerance. Scandinavian Journal of Work and Environmental Health, 1998, 24 (Sup. 3) p PEREIRA, D. S., TUFIK, S., LOUZADA, F. M., BENEDITO-SILVA, A. A., LOPEZ, A. R., LEMOS, N. A., KORCZAK, A. L., D ALMEIDA, V., PEDRAZZOLI, M. Association of the Length Polymorphism in the Human Per3 Gene with the Delayed Sleep-Phase Syndrome: Does Latitude Have an Influence Upon It? SLEEP, 2005, 28, P

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